Summary
Estabelecimento de modelos humanos da barreira sangue-cérebro (BBB) pode beneficiar de pesquisa em condições cerebrais associadas com insuficiência certificação. Descrevemos aqui uma técnica melhorada para a preparação de um modelo de certificação de contacto, o que permite coculturing de astrócitos e células endoteliais cerebrais sobre os lados opostos de uma membrana porosa.
Abstract
A barreira sangue-cérebro (BBB) compreende impermeáveis mas adaptáveis capilares do cérebro que controlam o ambiente fortemente cérebro. A falha da certificação tem sido implicada na etiologia de várias patologias cerebrais, criando uma necessidade de desenvolvimento de humano em modelos in vitro de BBB para ajudar na investigação clinicamente relevante. Entre os numerosos modelos de BBB, até agora descritos, uma estático (sem fluxo), contactar modelo certificação, em que os astrócitos e as células endoteliais do cérebro (CEBs) são co-cultivadas nos lados opostos de uma membrana porosa, emergiu como um sistema ainda autêntica simplificado para simular o BBB com capacidade de rastreio de alto rendimento. No entanto, a geração de tal modelo apresenta alguns desafios técnicos. Aqui, descrevemos um protocolo para a elaboração de um modelo de certificação contato humano, utilizando uma nova combinação de BECs humanos primários e astrócitos humanos imortalizados. Especificamente, detalhamos um método inovador para a célula-semeadura em inserções invertidas, bem como especificar insert técnicas de coloração e exemplificar como usamos o nosso modelo de investigação relacionada com a certificação.
Introduction
A certificação é uma interface especializada entre a circulação de sangue periférico e o sistema nervoso central, fundamentalmente responsável para a manutenção da homeostasia do cérebro. Ele compreende células distintas cerebrais microvasculares endoteliais (BEC), que são funcionalmente influenciada por alguns componentes celulares e acelulares (abaixo) para formar uma passagem apertada e dinâmico para o cérebro. Sob condições fisiológicas, a certificação restringe a passagem de células do sangue, componentes do plasma e de substâncias nocivas, todos potencialmente neurotóxicos, no cérebro. Em paralelo, a certificação troca selectivamente iões e nutrientes essenciais (glucose e aminoácidos) e produtos residuais do metabolismo entre o cérebro e a circulação de manter com precisão o ambiente cerebral 1,2. Em anos recentes torna-se evidente que a falha da certificação ocorre numa variedade de patologias cerebrais crónicas, tais como as doenças neurodegenerativas ou inflamatórias relacionadas com (por exemplo, doença de Alzheimer e multiple esclerose, respectivamente) 3, bem como em condições agudas, como acidente vascular cerebral isquémico 4.
As propriedades únicas BBB de células endoteliais cerebrais (CEBs) são largamente induzida pelo ambiente cerebral 5, e em particular por astrócitos 6,7. Existe um consenso crescente de que outros tipos de células, tais como pericitos 8, neurónios e microglia 1,3, bem como a membrana de base 9, suportar BEC e formam em conjunto uma unidade funcional denominada "unidade neurovascular" (NVU) que simultaneamente casais neuronal demandas metabólicas aos seus capilares que abastecem 10.
O envolvimento do BBB em situações patológicas subjaz inúmeras tentativas de desenvolver em modelos in vitro de BBB para ajudar na investigação relacionada com a certificação 11,12. Estes modelos pretendem imitar o mais próximo possível in vivo de BBB características de acordo com o princípio NVU. In vitro 13, humano 14, 15 rato, rato 16 e suínos 17,18 origens), cultivadas em uma membrana porosa, juntamente com astrócitos apoio (extensivamente revistos por Deli et al., 2005 11).
Os astrócitos podem ser cultivadas em condições de não-contacto na parte inferior de uma cultura de tecidos bem, separado BEC (cultivadas na superfície superior da membrana) pelo meio de cultura ainda comunicar com CEBs através factores solúveis 16. Em modelos mais avançados que melhor se assemelham à estrutura anatómica do BBB in vivo, os astrócitos são mantidas em condições de contacto e cultivadas directamente no lado oposto da membrana em estreita proximidade com CEBs 13,15,17 (Figura 1). Esta configuração permite o contato físico entre BEC e astrócitos, criado quando o projeto astrócitosseus processos, através da membrana porosa. É importante ressaltar que para um verdadeiro contato para ocorrer os poros devem ser ≥ 1 Hm de diâmetro, desde astrocitárias finais pés não podem passar por poros menores (ou seja, 0,4 mM) 14,15. Notavelmente, os sistemas de contato de BBB são demonstradas em alguns estudos a ser superiores aos seus equivalentes não-contato em relação à sua resistência elétrica trans-endotelial (TEER) e valores de permeabilidade endoteliais de vários traçadores 13,17,18. Uma dimensão adicional de fluxo de meio foram adicionadas recentemente em um certo número de modelos in vitro de BBB para aplicar forças de cisalhamento ao endotélio para a simulação mais próxima da vasculatura cerebral 12,19.
Um dos obstáculos técnicos que superada quando a gerar um modelo de contacto certificação é a semeadura de astrócitos contra a gravidade na superfície abluminal da membrana porosa. 13,20 protocolos anteriores, em que os astrócitos foram simplesmente semeadas numa gota de meios no topo de uma eminserção convertida, permitiu vezes só curto semeadura (isto é, 10 min 13 ou 2 horas 20) que foram encontrados em nossas mãos para ser insuficiente para a fixação das células adequado. Usando este método básico, um período mais longo apego astrocyte requer monitoramento constante das inserções de abertura freqüente da incubadora (causando flutuações de temperatura, pH e umidade) e também é propenso a semeadura de células irregulares devido a fugas de meios através dos poros, especialmente se poros maiores do que 1 mícron são empregues.
Aqui, nós descrevemos um protocolo geral para a elaboração de um modelo de certificação contato. Nosso procedimento inclui um método alternativo para a célula-semeadura em inserções invertidos, que trata das limitações acima mencionadas. O método permite a adesão sem perturbações dos astrócitos na superfície abluminal membrana, num incubador equilibrado, por um período de tempo prolongado. Como resultado, uma sementeira uniformes de astrócitos é alcançada o que aumenta a qualidade de barreirae minimiza as variações de permeabilidade basais entre inserções.
Como o uso de células humanas é importante para a investigação humana relevante 21, que adicionalmente demonstrar neste artigo a utilização específica de uma nova combinação de BECs humanos primários e imortalizado astrócitos humanos para a criação de um modelo de certificação contato humano com uma capacidade de rastreio de alto rendimento . Desde a visualização de células em membranas porosas podem ser difíceis, nós também técnicas de coloração de detalhes que podem ajudar na determinação da confluência e morfologia das células nas membranas porosas. Finalmente, exemplificam como nosso modelo de certificação humano pode ser utilizado para examinar o efeito do tipo de ativador do plasminogênio tecidual (t-PA) - uma enzima coágulo rebentando que serve como uma opção de tratamento único para o AVC isquêmico agudo - no BBB.
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Protocol
1. Cultura de Células (3-7 dias antes da Assembleia-BBB)
1.1. Células Cérebro humano microvascular endoteliais primárias (BEC)
CEBs foram obtidos comercialmente. As células foram produzidas por dissociação de dispase de tecido do córtex cerebral humano normal e forneceu congeladas a passagem 3 (<12 duplicações da população).
- Substrato: vasos Brasão de cultura de tecidos com "Fator de Fixação" de acordo com as instruções do fabricante.
- Manutenção celular: Manter BECs em meio completo contendo soro. Para a experimentação, a cultura CEBs em meio isento de soro completo. Manter as células numa atmosfera húmida de 5% de CO 2, 21% de O 2 incubadora a 37 ° C
Observação: Como uma alternativa aos reagentes especializados, 0,1% (w / v), soluções de gelatina pode servir como um reagente de revestimento ao mesmo tempo DMEM/F-12 suplementado com HEPES 15 mM, 10% (v / v) de soro fetal de vitelo (FCS), 2 mM de L-glutamina, 50 ug/ Ml de gentamicina, 20 ug / ml de heparina e 20 ug / ml de suplemento de crescimento de células endoteliais pode ser utilizado para a manutenção BEC. - Sub-cultura de experimentação: CEBs confluentes divididos na proporção de 1:03 - 01:06, dependendo do tempo pretendido para a utilização seguinte (3-7 dias). Altere o meio de manutenção a cada 3 dias. Use BECs até 15 passagens.
1.2. SVG Human Fetal astroglial-line celular
SVG células gliais fetais humanas 22 foram originalmente derivadas de culturas primárias de cérebro fetal humano transformada com o vírus símio 40 deficiente em replicação.
- Manutenção: células Cultura SVG em meio mínimo essencial com solução salina equilibrada de Earle suplementado com 20% (v / v) FCS (mesma percentagem de soro utilizado para manter as células primárias progenitoras 22), 2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina. Manter as células numa atmosfera húmida de 5% de CO 2, 21% de O2
- Sub-cultura de experimentação: SVGs confluentes Dividir a uma proporção de 1:5 a 1:10, dependendo do tempo pretendido para a utilização seguinte (3-7 dias). Remoção de tripsina não é necessário, devido ao alto teor de soro no meio. Troca da mídia a cada 3 dias. Use SVGs até 20 passagens.
2. Montagem e Coculturing da In vitro BBB Modelo Humano (Dia 0)
Comentário: O ser humano em contato modelo BBB vitro é preparado de acordo com protocolos publicados 13,23, com modificações.
2.1. Revestimento de inserções
- Coloque inserções de cultura de tecidos (6,5 mm de diâmetro, com poliéster membrana porosa, de 3 um de tamanho dos poros) nos poços da placa de 24 poços fornecidas. Revestir a superfície luminal das inserções
Nota: A membrana basal dos capilares do cérebro não contém colágeno I, mas principalmente lamininas, isoformas de colágeno tipo IV, nidogens e proteoglicanos de heparan sulfato 9. Por este motivo, alguns pesquisadores utilizam agentes de revestimento como o colágeno IV, fibronectina 13, ou Matrigel (BD Biosciences) 16 para uma modelagem BBB mais autêntica.
2.2. SVGs Sementeira na parte de baixo (abluminal) superfície da membrana
- Inverta a inserção e ajustar suavemente em torno da borda da membrana porosa a uma curta peça de tubagem de silicone elástico ("tubo externo", 8 mm de diâmetro interno ~ 10 mm de comprimento, 1,6 mm de parede), criando essencialmente um novo bem acima da superfície abluminal (Figura 2A).
- A parte inferior da inserção needs para ser selado para evitar vazamento de mídia. Em primeiro lugar, preparar um bujão (Figura 2A e 2B), feita de um tubo de silicone (denominado "tubo interno"; ~ 8 mm de comprimento, 3,2 mm de diâmetro interno, parede de 1,6 milímetros; Figura 2B), selado numa das extremidades, com um cone de vedação de plástico (~ 3 mm de comprimento; preparado pelo corte da parte inferior de uma reacção em cadeia com 0,2 ml de polimerase (PCR) do tubo e a figura 2B). Este cone não só sela o lúmen dos tubos internos, mas também aumenta a sua aresta para encaixe apertado dentro do inserto. Em seguida, utilizando um fórceps estéril, inserir a ficha de silicone na cavidade luminal e avançar até que ele chegue até a ~ 1-2 mm a partir da membrana (Figura 2A).
- Em seguida, as sementes 4 x 10 4 células SVG em 200 mL SVG meio de manutenção (SEcção 1.2.2 acima) directamente para o silicone bem acima da superfície da membrana abluminal (Figura 2A). Permitir SVGs a aderir por pelo menos 4 horas na incubadora.
Nota: Para manter a esterilidade transportar as inserções montadas entre duas placas de 6 poços (uma placa invertida sobre a outra; Figura 2C), para minimizar a exposição ao ar não filtrado, durante o procedimento. Os tubos de silicone e os tampões são lavadas em etanol e autoclavado para uso posterior.
Nota: Utilize plugs (seção 2.2.2) apenas para pastilhas com poros da membrana com tamanho superior a 1 mícron. As membranas com poros de diâmetro de 1 um ≤ raramente vazar e requerem apenas a montagem do tubo de silicone externa (secção 2.2.1). Além disso, alguns outros do que o colágeno agentes de revestimento I (ver nota a seção 2.1) pode impedir leakiness mesmo através de 3 mM poros. Determinar esta empiricamente. - A fim de monitorar o estado adesão de seus astrócitos, semear em paralelo emde 96 cavidades de um volume idêntico padrão da célula-suspensão dos astrócitos. Este poço tem a mesma área de superfície que a inserção 6,5 milímetros (0,33 cm 2) e permite a fácil visualização das células por microscopia de contraste de fase do que a membrana de inserção. Quando se verificar a adesão suficiente dos astrócitos no controlo de 96 poços, os astrócitos foram aderidas adequadamente também a inserção da membrana.
- Quando astrócitos têm suficientemente respeitado no controle de 96 poços, transferir os conjuntos de inserção para a capa de cultura de tecidos (ver nota acima) e retire cuidadosamente o tubo de silicone externa e plugues. Retornar inserções para a orientação normal (ou seja, na vertical) nas cavidades fornecidas contendo 800 ul / poço de meio de manutenção BEC (secção 1.1.2, supra).
2.3. Sementeira do BEC para a Câmara Luminal acima dos astrócitos
Semente 2x10 4 BECs em 200 mL até a superfície luminal da revestido de colágeno e voltar a insegurançarts na incubadora.
2.4. Coculturing
Co-cultura das inserções SVG / BEC-semeados durante 3 dias em meio BEC sem mudança mídia antes de experimentação.
3. Experimentação com o modelo de certificação Humano (Dia 3)
- Para estimular as células in vitro de BBB primeira lavagem, substituindo os meios de comunicação abluminais e luminais com 600 mL e 100 mL de meio BECs sem soro, respectivamente.
- Aspirar o meio do lúmen de novo e substituir com 100 ul de meio isento de soro, com agentes estimulantes.
Nota: Se a estimulação da câmara abluminal é necessária (para ativar o in vitro a certificação do compartimento astrocitária), aspirar o meio abluminal e substituir com 600 ul de meio sem soro com agentes estimulantes. - Teste cada grupo experimental em triplicado (daí, se a estimulação luminal é realizada, o que requer 3 x 100 mL, recomendamos diluir o re Os agentes para as suas concentrações finais em 350 ul de meio isento de soro em cada grupo para minimizar erros de pipetagem entre poços).
- Realizar paracelular padrão e / ou ensaios de permeabilidade transcelular dos marcadores marcados 16,24 (para o último usamos isotiocianato de fluoresceína (ITCF) conjugadas com albumina) e / ou medição de TEER 13,16,25 como descrito anteriormente.
Para ter em conta as flutuações na permeabilidade da linha de base entre os experimentos, analisar alterações na permeabilidade em relação a uma inserção de revestimento sem células (que serve como uma referência para a permeabilidade máxima) e para o grupo tratado com o veículo utilizando a fórmula: permeabilidade (% de máximo) = ( valor de permeabilidade de inserção experimental - valor médio permeabilidade do grupo do veículo) / (valor de permeabilidade do inserto em branco - valor médio permeabilidade do grupo do veículo) X 100.
4. A visualização de células em membranas porosas
nt "> Comentário: células não coradas em membranas de inserção são difíceis de observar por contraste de fase ou de contraste de interferência diferencial microscopia (DIC) desde a membrana é bastante opaca e interfere com a transmissão de luz para lidar com esta questão, desenvolvemos vários procedimentos de coloração de células em. pastilhas, que melhoram grandemente a aparência de células sobre a membrana. Geralmente, manchar as membranas de inserção enquanto ainda ligados à inserção, nas cavidades. As membranas devem ser removidos apenas no fim do procedimento de coloração para fins de montagem.4.1. Coloração Hematoxilina
- Fix inserções com gelado a 4% (w / v) de paraformaldeído (PFA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS; NaCl 130 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 10 mM de NaH 2 PO 4, pH 7,2) durante 20 min. Lavar uma vez com PBS.
- Mergulhe a inserção em solução de hematoxilina 0,1% de Mayer por 2 min.
- Delicadamente, lave a inserção com água da torneira (submergindo as insert em um copo contendo água da torneira e cuidado pipetando o excesso de água). Transferir a solução para inserção de Scott água de torneira (2 g / l de NaHCO3, 20 g / L de MgSO 4) para ~ 20 segundos até que a cor azul desejada desenvolve. Lave a inserção de novo com água da torneira (seção 4.1.3). Uma mancha de eosina opcional pode ser introduzida aqui por imersão em solução a inserção eosina 1% durante 10 segundos seguido por uma lavagem com água da torneira.
- Ar seco a membrana de inserção. Usando um bisturi (corte ao redor da borda da membrana) remover a membrana e montá-lo em uma lâmina de vidro para imagens de campo claro
Nota: Se o di-N-butylphthalateinxylene (DPX) o meio de montagem é utilizada a inserção lavar com etanol a 100% seguido de xileno antes da remoção e a montagem da membrana.
4.2. Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)
- Fix inserções com gelado a 4% (w / v) de PFA em PBS durante 20 min. Lavar três vezes em PBS.
- Pós-fixar as membranas durante 30 min em 1% (w / v) De tetróxido de ósmio em 2 O. MQH
- Lavar as inserções em água (secção 4.1.3) e desidratar em um gradiente crescente de etanol (50%, 70%, 90% durante 5 min cada, em seguida 3x com etanol a 100% durante 10 min cada intervalo).
- Trate inserções desidratadas com uma mistura de hexametildisilazano (HMDS): etanol (1:2, em seguida, 02:01 por 5 min).
- Trate inserções com 100% de HMDS para 5 min, ar seco e armazenar em condições dessecadas.
- Retirar a membrana utilizando um bisturi (corte em torno do bordo da membrana). Examine as membranas por microscopia eletrônica de varredura.
4.3. Imunofluorescência
- Fix inserções com gelado a 4% (w / v) de PFA em PBS durante 20 minutos, lavar uma vez em solução salina tamponada com Tris (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 154 mM, 0,22 um filtrado).
- Realizar imunocoloração das células na membrana de inserir tal como previamente descrito 26.
- Retirar a membrana utilizando um bisturi (corte em torno do bordo da membrana) e montá-lo em agslides moça com fluorescência meio de montagem. Examinar membrana por microscopia fluorescente.
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Representative Results
A fim de estabelecer um ser humano, o modelo de contato BBB tínhamos de cultivar SVGs e BEC em membranas porosas com um 3 mM poros de tamanho, mostrado para permitir a passagem de astrócitos finais pés para o contato com as células endoteliais 14,15,27,28. Uma representação esquemática do modelo de contacto completa está ilustrada na figura 1 (figura da esquerda). O principal desafio técnico apresentado por um sistema de contacto é a necessidade de semear astrócitos contra a gravidade na superfície abluminal da membrana. Conseguimos esta tarefa principalmente a criação de um silicone removível bem em cima da superfície da membrana enquanto abluminal impedindo a fuga dos meios com um tampão de silicone adicional inserido na cavidade luminal (Figura 2). O método permitiu um período óptimo, ininterrupta semeadura de SVGs (pelo menos 4 h), o qual por sua vez, tornou-se fortemente ligado à superfície porosa com a perda de células mínima. Na verdade, 3 dias após a semeadura e os dois SVGs BECs aplicativoorelhudo confluente e cobriu a membrana de maneira uniforme, a julgar a partir de imagens de inserções manchado de hematoxilina (ver secção 4.1; Figura 3A, painéis esquerdos). Além disso, ambos os tipos de células mantiveram seus marcadores específicos de células de membranas porosas (um padrão de coloração difusa de proteína ácida fibrilar glial nas SVGs 22 e expressão de factor de von Willebrand em corpos Wiebel-Palade e vesículas citoplasmáticas em CEBs; Figura 3A, painéis direitos) , observado por imunofluorescência (seção 4.3). Além disso, a partir de imagem MEV (seção 4.2), tornou-se evidente que SVGs e CEBs foram capazes de crescer diretamente sobre os poros da membrana (Figura 3A, painéis médios, cabeças de seta), um fenômeno que contribui artificialmente para a função de in vitro BBB barreira física contato models1 3,28. Funcionalmente, na presença de SVGs o valor da permeabilidade endotelial (Pe) 16,24 fluorescente de albumina 28 improved ~ 4 vezes em relação aos CEBs isoladamente (P <0,01, n = 4), a partir de 0,574 ± 0,199 x10 -3 a 0,126 ± 0,028 x10 -3 cm / min, na ausência ou com astrócitos (SVGs), respectivamente. Estes resultados albumina Pe são comparáveis a um outro estudo utilizando BECs rato com células de glioma C6 de ratos 29. Nosso protocolo de semeadura foi aplicado com sucesso também para recém-isolado BECs rato primárias e astrócitos primários de rato cultivadas em 1 mM poros. Neste modelo de contacto do rato obteve-se uma barreira física razoável para o pequeno marcador hidrofílico fluoresceína de sódio (Pe = 0,83 ± 0,22 x 10 -3 cm / min, n = 3). Por isso, o nosso método de semeadura pode ser estendido para a elaboração de modelos de BBB de outras espécies.
A característica mais fundamental de um modelo de contato BBB é a capacidade dos astrócitos para projetar suas finais pés através dos poros da membrana para contactar fisicamente células endoteliais. Alguns estudos fizeram uso de microscopia eletrônica de varredura para identificar os astrócitos processos que passam a partir da superfície da membrana abluminal (onde os astrócitos são semeadas) a superfície luminal, como uma prova de princípio de que o contato entre astrócitos e CE é plausível 14,15,27. Na sequência destes estudos, fotografada por MEV da membrana luminal após a semeadura SVGs na superfície abluminal. Como mostrado na Figura 3B, astrócitos (SVG) finais pés pode ser observado que passa através dos poros 3 mM no compartimento luminal, confirmando que o contacto pode potencialmente existir entre SVGs CEBs e semeadas em poros desta dimensão. Coletivamente, o nosso método de semeadura era simples, eficiente e rendeu um modelo contato BBB autêntico.
Nós utilizamos o nosso modelo de contacto certificação humano para explorar o efeito de t-PA, um agente fibrinolítico, com a certificação. Uma série de artigos têm sugerido que o t-PA pode ser capaz de induzir a abertura da BBB, durante a sua administração por via intravenosa para o tratamento de acidente vascular cerebral isquémico agudo 30-33. Essa interação entre o t-PA ea certificação pode contribuir para as complicações hemorrágicas associadas com trombólise induzida por t-PA 4,34,35 e é, portanto, um assunto para os esforços de pesquisa atuais. Os nossos estudos in vitro confirmou que o t-PA, de facto aumentou a permeabilidade da BHE intacto numa concentração (Figura 4A) e de forma dependente do tempo (Figura 4B), que estavam dentro de um intervalo farmacologicamente relevantes 36,37. Além disso, as mudanças morfológicas drásticas de astrócitos SVG pode ser observado nas membranas porosas pós-exposição para o t-PA (Figura 4C), sugerindo que as respostas astrocíticos a t-PA estão subjacentes induzida por t-PA abertura certificação. Investigações posteriores identificaram que t-PA estimula astrócitos através da ativação do plasminogênio - seu substrato natural - para o potente e de amplo espectro plasmina protease. Além disso, o t-PA e a plasmina foram encontrados para activar a Rho-cinase (ROCK) de sinalização em astrócitos, e bloqueio da via ROCHA impedido induzida por t-PA abertura certificação 28. Este é um bom exemplo de como a utilização de modelos de BBB pode levar à identificação de novos processos biológicos e as oportunidades terapêuticas.
Figura 1. Configurações baseadas em Inserir de modelos in vitro BBB. Representações esquemáticas de estática (sem fluxo) em modelos de BBB vitro. Em modelos básicos de células endoteliais cerebrais (CEs; laranja) são cultivados sozinhos em uma membrana porosa (amarelo). Em mais avançado abordagens ECs são co-cultivados com astrócitos (verde). Os astrócitos podem ser produzidas quer em condições de não-contacto, na parte inferior do poço (direita), ou na superfície abluminal da membrana porosa, em condições de contacto (esquerda).nk "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Um método melhorado para astrócitos semeadura sobre a superfície da membrana abluminal para a preparação de um modelo de contacto certificação. (A) A pastilha é invertido, uma pequena peça de tubagem de silicone ("tubo externo") está montado em torno do seu perímetro e de um tampão de silicone encaixada a cavidade luminal. Esta montagem gera um bem em cima da superfície abluminal e impede mídia de vazamento através dos poros. As células podem ser semeadas no poço e deixou-se aderir em repouso por longos períodos de tempo (direita) (B) O tampão de silicone é preparada a partir de uma peça de tubagem de silicone ("tubo interno"), selado numa das extremidades, com um cone de vedação que é inserido em sua cavidade. (C) Uma vez semeadas, omontados inserções são transportados entre duas placas de 6 poços (uma placa invertida sobre a outra) para minimizar o risco de contaminação. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. A visualização de células endoteliais do cérebro (BEC) e astrócitos em um 3 m membrana porosa A) Hematoxilina (painéis à esquerda), microscopia eletrônica de varredura (MEV;. Painéis meio) e imagens de imunofluorescência (painéis à direita) de SVGs (na superfície abluminal, 40.000 por 6,5 milímetros de inserção, painéis superiores) e BEC (20.000 por 6,5 milímetros de inserção no colágeno I-revestido, superfície luminal, painéis de fundo) cultivadas em uma membrana porosa 3 m por 3 dias (sem coculturing). Ambos os tipos de células atingem confluência dentro deste tempo fraeu e manter os seus marcadores específicos de células (proteína ácida fibrilar glial (GFAP) para SVG e factor de von Willebrand (vWF) em organismos Wiebel-Palade de CEBs, painéis direitos) na membrana. Seta cabeças nos painéis SEM mostram ainda a capacidade de ambos os tipos de células que crescem directamente por cima e cobrir os poros, enquanto as setas representam núcleos celulares. Barras de escala em imagens SEM representam 25 mM (em cima) ou 20 mM (em baixo). Barras de escala de imagens de imunofluorescência representam 40 mM. (B) imagens de MEV de SVG finais pés passando por 3 mM poros na luminal (BEC) superfície pós 3d semeadura de SVGs (sozinho) na superfície da membrana abluminal. Estas imagens validar o potencial para o desenvolvimento de uma verdadeira contato entre SVGs e BEC em nosso modelo de certificação humano. Barras de escala representam 6 mM no painel esquerdo e 12 mM no painel da direita. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 4. -activador do plasminogénio tipo tecido aumento (t-PA) mediada por certificação permeabilidade é determinada pelas alterações morfológicas dos astrócitos. (A) O aumento das concentrações de t-PA foram adicionados à câmara de luminal do humano in vitro a certificação e permeabilidade foi avaliada 24 horas depois, por meio de passagem de albumina fluorescente na câmara abluminal. t-PA aumentou a certificação da permeabilidade de uma forma dependente da concentração. n = 4-6 para todos os grupos, mas a t-PA de 10 nM, em que n = 2. *** P <0,001 em comparação com todos os outros grupos por ANOVA com Newman-Keuls post hoc. (B) t-PA (1 uM) foi adicionado à câmara do lúmen do humano emvitro BBB para 8 horas e 24 horas antes da avaliação da permeabilidade. Como mostrado, o t-PA mediada abertura certificação já foi substancial pós 8 horas de estimulação (70.26% do máximo às 24 horas), mas um aumento adicional foi observada às 24 horas. n = 6, *** P <0,001, ** P <0.01compared a zero por um way ANOVA com Newman-Keuls post hoc. Em ambos (A) e (B), os pontos de bares / dados representam a média ± SEM. (C) imagens brilhantes em campo representativas de SVGs Hematoxilina-manchados (painéis superiores) ou microscopia eletrônica de varredura de SVGs (painéis inferiores) em membranas de inserção de poliéster (3 um de tamanho dos poros) 24 horas pós-tratamento com veículo ou t-PA (1 uM). Alterações morfológicas induzidas por t-PA pronunciado e perturbação da integridade monocamada SVG pode ser observada, sugerindo que as respostas astrocíticos a t-PA estão na base do efeito de t-PA em certificação permeabilidade. As imagens são representativos de duas experiências independentes. Barras de escala em imagens SEM repreenviou 61 mM (esquerda) ou 120 mM (direita). Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
A investigação médica em patologias do cérebro sofre muita dificuldade translacional. Na área de acidente vascular cerebral isquêmico agudo, por exemplo, muitas drogas que mostrou uma grande promessa em modelos animais falharam na clínica 38,39. As razões para estes resultados decepcionantes são diversas e incluem infidelidade dos sistemas de testes pré-clínicos com o cenário traçado humana e sobreavaliação dos resultados obtidos a partir de estudos com animais 21. Uma estratégia para melhorar o valor preditivo de resultados pré-clínicos para a fase clínica é o desenvolvimento adicional de humano em modelos in vitro baseada em células, as quais podem fornecer ferramentas potentes e de baixo custo para triagem de novos medicamentos e de mecanismos e permitir uma melhor orientação em avenidas clinicamente relevantes 21. Dentro deste contexto, descrevemos aqui em detalhes o processo realizado em nosso laboratório para a criação de um modelo de certificação contato humano, utilizando uma nova combinação de humano imortalizado astrocitos (SVGs) e BEC primários humanos para exame de fenômenos relacionados ao AVC.
Em condições estáticas (sem fluxo), entre em contato com modelos BBB (Figura 1) assemelham-se melhor a estrutura anatômica vivo e são mostrados para ser superior em suas propriedades de barreira 13,17,18. Importante, verdadeiro contato entre BEC e astrócitos ocorre apenas em membranas com poros de diâmetro maior (≥ 1 mm), que permitem a passagem de astrocitárias finais pés e indução subsequente das mais apertadas (menos permeável) BEC monocamadas 14,15,27. No entanto, a inoculação de astrócitos em inserções invertidas com maior tamanho de poro - o elemento do núcleo técnico na preparação de um modelo de contacto certificação - apresenta um desafio técnico dupla, uma vez que para além do volume de meio limitado, que pode ser adicionado às invertidos 6,5 milímetros inserções (~ 50 ul), as membranas são também propensas a fugas de meio, devido ao seu grande diâmetro de poro. Estas limitações podem fazer a astsemeadura rocytic estranho e inconsistente.
Nossa técnica inovadora para semear astrócitos em inserções invertidos com 3 mM poros oferece uma solução simples, mas eficaz para este procedimento. Através da criação de um, de silicone impermeável removível bem em cima da superfície abluminal que melhorou grandemente a capacidade dos astrócitos para aderir com sucesso para a membrana porosa. Isto permite um crescimento uniforme dos astrócitos na superfície abluminal e permite a preparação reprodutível de um grande número de inserções para o rastreio simultâneo de muitos parâmetros experimentais (por exemplo, a triagem realizada recentemente o efeito de cinco diferentes activadores do plasminogénio-na certificação 28). Assim, apesar de sua simplicidade, encontramos o nosso método para melhorar drasticamente a produtividade ea qualidade da nossa pesquisa usando este modelo contato BBB. Uma limitação do nosso método astrocyte semeadura é a exigência de movimentação manual extra de inserções, que abrigam fina (10 μm de espessura) das membranas. Manuseio excessivo ou áspero pode causar micro-lágrimas e danos à membrana. Assim, a utilização de tubos de silicone macia e flexível é essencial que a montagem / desmontagem tem que ser realizada com uma força mínima.
Em relação ao seu conceito geral, o nosso modelo de certificação humano foi criado com base em um protocolo previamente descrito 14,23 que originalmente utilizado células humanas primárias. Apesar de sua superioridade para a modelagem de BBB, uma desvantagem no emprego de células cerebrais humanas primárias é a incapacidade de acessar rotineiramente tecido do cérebro humano vivo para a produção regular de BECs primários e astrócitos e / ou o custo envolvido na comercialmente obtê-las. Uma vez que muitos modelos de BBB substituir com sucesso astrócitos primários com astrócitos imortalizados (por exemplo com um células de glioma C6 de rato 29), era razoável empregar astrócitos SVG 22 como um romance, opção abundante e de baixo custo para a modelagem BBB humano. A capacidade de SVGs queinfluenciar positivamente a função de barreira BEC validado, em princípio, a sua adequação para estudos de BBB. Por outro lado, optou-se por manter BECs primários em nosso modelo de certificação para o seu papel crítico no BBB in vivo 1,2,9. Importante, a cultura prolongada de CEBs primário pode resultar em desdiferenciação e deterioração do seu fenótipo BBB-specific. Este fato pode ser evidente no nosso sistema por um pouco elevados valores de permeabilidade endoteliais para a albumina. Por este motivo, utilizou-se o nosso modelo de principalmente de uma forma relativa 28 (Figura 4), tendo em conta a sua permeabilidade basal elevada. Se uma monocamada BEC humano muito apertada é desejada a função de barreira pode ainda ser melhorada através da adição de produtos químicos, tais como a hidrocortisona glucocorticóide 17 ou AMP cíclico com inibidores da fosfodiesterase, 13. CEBs humanas imortalizadas, tais como a linha celular hCMEC/D3 40, também poderiam ser empregues para a sua capacidade de manter melhor tijunções ght longo do tempo. No entanto, linhas celulares BEC muitas vezes exibem qualidades de barreira reduzidos em comparação com baixa passagem primário BECs 41,42 e precisa ser cuidadosamente considerada por causa de outras mudanças potenciais (ou seja, expressão alterada de receptores de superfície celular).
Colectivamente, a modificação do tipo de células de astrócitos (isto é, o emprego de SVGs) e a melhoria substancial para o protocolo de astrócitos sementeira resultou na geração de um, fácil de montar e autêntica modelo contacto certificação humano reprodutível. Tendo em conta as suas limitações, este sistema pode servir como uma ferramenta útil para investigação in vitro, não só de acidente vascular cerebral isquêmico agudo, como exemplificado aqui 28, mas também de várias outras patologias cerebrais que envolvem a modulação do BBB.
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Disclosures
Autores têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado por subvenções concedidas aos RLM do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália (concessão # 606658).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attachment Factor | Cell-Systems Corporation | 4Z0-210 | |
| Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Complete medium | Cell-Systems Corporation | 4Z0-500 | Supplemented with CSC JetFuel |
| Complete serum-free medium | Cell-Systems Corporation | SF-4Z0-500 | Supplemented with CSC RocketFue |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| External silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A080.016 | Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| Foetal calf serum | Lonza | 14-501F | |
| Gentamycin sulfate | Life Technologies | 15750-060 | |
| Heparin sodium | Pfizer | 1,000 U/ml | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | H4875 | |
| Human brain microvascular endothelial cells | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Internal silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A032.016 | Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Mayer’s hematoxylin solution | Amber Scientific | MH | |
| Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution | HyClone Laboratories | SH30244.01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Rat collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | Cultrex brand |
| Tissue culture inserts | Corning Life Sciences | 3472 | Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size |
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