Summary
Istituzione di modelli umani della barriera emato-encefalica (BBB) può beneficiare la ricerca sulle condizioni del cervello connesse con il fallimento BBB. Descriviamo qui una tecnica migliorata per la preparazione di un modello BBB contatto, che consente coculturing di astrociti e cellule endoteliali cervello sui lati opposti di una membrana porosa.
Abstract
La barriera ematoencefalica (BBB) comprende impermeabili ma adattabili capillari cerebrali che controllano saldamente l'ambiente cervello. Fallimento della BBB è stato implicato nell'eziologia di molte patologie cerebrali, creando la necessità di sviluppare umano in vitro BBB per assistere nella ricerca clinicamente rilevante. Tra i numerosi modelli BBB finora descritti, statica (assenza di flusso), contattare modello BBB, dove astrociti e cellule endoteliali cerebrali (BECS) vengono co-coltivate sui lati opposti di una membrana porosa, è emerso come un sistema ancora autentica semplificato per simulare l' BBB con elevato throughput capacità di screening. Tuttavia, la produzione di tale modello presenta alcune sfide tecniche. Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di un modello di BBB contatto umano utilizzando una nuova combinazione di BECs umani primari ed astrociti umani immortalati. In particolare, i dettagli di un metodo innovativo per la cella-semina su inserti rovesciati così come specificato inserit tecniche di colorazione e esemplificano come usiamo il nostro modello per la ricerca BBB-correlati.
Introduction
Il BBB è un'interfaccia specializzata tra la circolazione del sangue periferico e il sistema nervoso centrale, fondamentalmente responsabile del mantenimento dell'emostasi cervello. Esso comprende cerebrali cellule endoteliali microvascolari distinti (BECS) funzionalmente influenzato da pochi componenti cellulari e acellulari (sotto) per formare un gateway stretto e dinamico nel cervello. In condizioni fisiologiche la BBB limita il passaggio di cellule del sangue, componenti del plasma e sostanze nocive, tutti potenzialmente neurotossico, nel cervello. In parallelo, la BBB scambia selettivamente ioni principali e nutrienti (glucosio e amminoacidi) e dei prodotti di scarto del metabolismo tra il cervello e la circolazione di mantenere con precisione l'ambiente cervello 1,2. Negli ultimi anni sta diventando evidente che fallimento della BBB verifica in una varietà di patologie cerebrali croniche, come le malattie neurodegenerative infiammatorie o anormalità (come morbo di Alzheimer e multiple sclerosi rispettivamente) 3, nonché in condizioni acute come l'ictus ischemico 4.
Le proprietà uniche BBB di cellule endoteliali cerebrali (BECS) sono in gran parte indotte dal loro ambiente cerebrale 5, ed in particolare dagli astrociti 6,7. Vi è una crescente comprensione che altri tipi di cellule, come i periciti 8, neuroni e microglia 1,3, così come la membrana basale 9, supportano BECs e formano insieme una unità funzionale definita "unità neurovascolare" (NVU) che simultaneamente coppie neuronale richieste metaboliche ai loro capillari che riforniscono 10.
Il coinvolgimento della BBB in situazioni patologiche alla base di numerosi tentativi di sviluppare modelli in vitro di BBB per aiutare nella ricerca di BBB-correlato 11,12. Questi modelli mirano a simulare il più vicino possibile in vivo caratteristiche BBB secondo il principio NVU. In vitro 13, umano 14, 15 ratto, topo 16 e suini 17,18 origini), coltivate su una membrana porosa con astrociti di supporto (ampiamente recensione di Deli et al. 2005 11).
Astrociti possono essere coltivate in condizioni di non-contatto sul fondo di una coltura di tessuti e, separato da BECs (coltivate sulla superficie superiore della membrana) dal mezzo di coltura pur comunicanti BECs tramite fattori solubili 16. In modelli più avanzati che meglio ricordano la struttura anatomica della BBB in vivo, astrociti sono mantenute in condizioni di contatto e coltivate direttamente sul lato opposto della membrana in prossimità BECs 13,15,17 (Figura 1). Questa configurazione consente il contatto fisico tra BEC e astrociti, stabilita quando progetto astrocitiloro processi attraverso la membrana porosa. Importante, per un vero contatto a verificarsi i pori devono essere ≥ 1μm di diametro, dal momento che astrociti finali piedi non può passare attraverso dimensioni dei pori più piccoli (cioè 0,4 micron) 14,15. In particolare, i sistemi di contatto BBB sono dimostrate in alcuni studi di essere superiore alle loro controparti non-contatto per quanto riguarda il loro trans-endoteliale resistenza elettrica (TEER) e valori di permeabilità endoteliali dei vari traccianti 13,17,18. Un'ulteriore dimensione della portata media è stato recentemente inserito in una serie di modelli in vitro BBB per applicare forze di taglio all'endotelio più stretta simulazione del sistema vascolare cerebrale 12,19.
Un ostacolo tecnico da superare nella generazione di un modello di contatto BBB è la semina di astrociti contro gravità sulla superficie abluminale della membrana porosa. Protocolli precedenti 13,20, dove astrociti erano semplicemente seminate in una goccia di supporti in cima a unInserto convertito, ammesso volte solo a breve seeding (vale a dire 10 min 13 o 2 ore 20), che sono stati trovati nelle nostre mani per essere insufficiente per l'adesione delle cellule corretta. Usando questo metodo di base, un periodo più lungo attacco astrociti richiede un monitoraggio costante degli inserti di frequente apertura dell'incubatore (causando sbalzi di temperatura, pH e umidità) ed è anche incline a semina delle cellule irregolare a causa di perdita di mezzi di comunicazione attraverso i pori, soprattutto se pori più grandi di 1 um sono impiegati.
Qui, descriviamo un protocollo generale per la preparazione di un modello di contatto BBB. La nostra procedura prevede un metodo alternativo per cellula-semina su inserti invertiti, che affronta le limitazioni di cui sopra. Il metodo permette di adesione indisturbata degli astrociti sulla superficie della membrana abluminale, in un incubatore equilibrata, per un periodo di tempo prolungato. Come risultato, una semina uniforme di astrociti si ottiene che aumenta la qualità barrierae riduce al minimo le variazioni di permeabilità basali tra inserti.
Come l'uso di cellule umane è importante per la ricerca umana rilevanti 21, abbiamo inoltre dimostriamo in questo articolo l'utilizzo specifico di una nuova combinazione di BECs umani primari e immortalata astrociti umani per l'istituzione di un modello BBB contatto umano con un elevato throughput capacità di screening . Poiché la visualizzazione di cellule su membrane porose può essere difficile, abbiamo anche particolare tecniche di colorazione che possono aiutare a determinare la confluenza e la morfologia delle cellule sulle membrane porose. Infine, rappresentiamo come il nostro modello BBB umano può essere utilizzato per esaminare l'effetto del tessuto di tipo plasminogeno (t-PA) - un enzima trombolitico che serve come opzione di trattamento unico per l'ictus ischemico acuto - sul BBB.
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Protocol
1. Colture Cellulari (3-7 giorni prima BBB Assembly)
1.1. Primarie cellule cerebrali umane endoteliali microvascolari (BEC)
BECs stati ottenuti commercialmente. Le cellule sono state prodotte dalla dissociazione dispasi del normale tessuto corteccia cerebrale umana e purché congelati a passaggio 3 (<12 raddoppi popolazione).
- Substrato: navi Coat tessuto-coltura con "Fattore Allegato" secondo le istruzioni del produttore.
- Mantenimento delle cellule: Mantenere BECs in mezzo completo contenente siero. Per la sperimentazione, la cultura BECs in terreno privo di siero completo. Mantenere le cellule in un umidificata al 5% di CO 2, 21% O 2 incubatore a 37 ° C
Nota: In alternativa ai reagenti specializzati, 0.1% (w / v) di gelatina può servire come reagente di rivestimento mentre DMEM/F-12 supplementato con 15 mM HEPES, 10% (v / v) di siero fetale bovino (FCS), 2 mM L-glutammina, 50 mcg/ Ml di gentamicina, 20 ug / ml di eparina e 20 ug / ml cellule endoteliali supplemento di crescita possono essere utilizzati per la manutenzione BEC. - Sub-coltura per la sperimentazione: BECs confluenti Spalato con un rapporto di 1:03-01:06, a seconda del tempo previsto per un uso successivo (3-7 giorni). Modificare il terreno di mantenimento ogni 3 giorni. Utilizzare BEC fino a 15 passaggi.
1.2. SVG umano fetale astrogliali Cell-linea
SVG cellule fetali umane astrogliali 22 sono stati originariamente derivati da colture primarie di cervello fetale umano trasformato con la replica carenti virus delle scimmie 40.
- Manutenzione: cellule Culture SVG in mezzo essenziale minimo con la soluzione salina bilanciata di Earle supplementato con 20% (v / v) FCS (stessa percentuale siero utilizzato per mantenere i loro genitori pile 22), 2 mM L-glutammina, 50 U / ml di penicillina e 50 streptomicina mcg / ml. Mantenere le cellule in un umidificata al 5% di CO 2, O 2 21%
- Sub-coltura per la sperimentazione: SVG confluenti Spalato con un rapporto da 1:5 a 1:10 a seconda del tempo previsto per un uso successivo (3-7 giorni). Rimozione di tripsina non è necessaria a causa dell'elevato contenuto di siero nel mezzo. Cambia il mezzo ogni 3 giorni. Usare SVG fino a 20 passaggi.
2. Montaggio e Coculturing di umani in vitro BBB Model (giorno 0)
Commento: L'essere umano in vitro modello di contatto BBB viene preparato secondo protocolli pubblicati 13,23, con modifiche.
2.1. Rivestimento di Inserti
- Posizionare gli inserti di tessuto-cultura (6,5 millimetri di diametro con poliestere membrana porosa, a 3 micron pori-size) nei pozzetti della piastra da 24 pozzetti in dotazione. Ricoprire la superficie luminale degli inserti
Nota: membrana basale dei capillari cerebrali non contiene collagene I, ma soprattutto laminine, isoforme di collagene di tipo IV, nidogens, e proteoglicani eparan solfato 9. Per questo motivo, alcuni ricercatori utilizzano agenti di rivestimento quali collagene IV, fibronectina 13, o Matrigel (BD Biosciences) 16 per una più autentica modellazione BBB.
2.2. SVG semina sul lato inferiore (abluminale) membrana di superficie
- Invertire l'inserto e montare intorno al bordo della membrana porosa un breve pezzo di tubo in silicone elastico ("tubo esterno"; ~ lunga 10 mm 8 mm diametro interno 1,6 mm Parete), essenzialmente creando un nuovo pozzo di sopra della superficie abluminale (Figura 2A).
- La parte inferiore del nee dell'insertods da sigillare per evitare perdite media. In primo luogo, preparare un tappo (Figura 2A e 2B) in un tubo di silicone ("tubo interno" definito; ~ lunghezza 8 3,2 mm di diametro interno 1,6 mm Parete; Figura 2B), sigillato ad una estremità con un cono di tenuta di plastica (~ 3mm lungo; preparata tagliando il fondo di una reazione a catena 0,2 ml della polimerasi (PCR) tubo; Figura 2B). Questo cono sigilla non solo il lume tubi interni, ma anche allarga il suo bordo per stretto raccordo nell'inserto. Successivamente, utilizzando una pinza sterile, inserire la spina silicone nella cavità luminale e farlo avanzare fino a raggiungere fino ad ~ 1-2 mm dalla membrana (Figura 2A).
- Avanti, sementi 4 x 10 4 cellule SVG in 200 microlitri SVG terreno di mantenimento (section 1.2.2 sopra) direttamente nel silicone ben al di sopra della superficie della membrana abluminale (Figura 2A). Consentire SVG di aderire per almeno 4 ore in incubatrice.
Nota: Per preservare la sterilità trasportare gli inserti assemblati tra due piastre da 6 pozzetti (una piastra capovolta rispetto all'altra; Figura 2C) per minimizzare l'esposizione all'aria non filtrata durante la procedura. Tubi di silicone e le spine vengono lavati in etanolo e sterilizzati in autoclave per un uso successivo.
Nota: Usare tappi (paragrafo 2.2.2) solo per inserti con membrana pori di dimensioni superiori a 1 micron. Membrane con diametro dei pori ≤ 1 micron raramente perdite e richiedono solo il raccordo del tubo in silicone esterno (punto 2.2.1). Inoltre, alcuni agenti di rivestimento diversi da collagene I (vedi nota la sezione 2.1) possono impedire leakiness anche attraverso 3 micron pori. Determinare questo empiricamente. - Al fine di monitorare lo stato di aderenza delle vostre astrociti, seminare in parallelo ina 96 pozzetti un volume identico standard della astrociti cellule sospensione. Questo bene ha la stessa superficie dell'inserto 6,5 millimetri (0,33 cm 2) e permettere una più facile visualizzazione di cellule al microscopio a contrasto di fase rispetto alla membrana inserto. Quando si osserva sufficiente aderenza del astrociti nel controllo a 96 pozzetti, astrociti hanno adeguatamente aderito anche alla membrana inserto.
- Quando gli astrociti hanno sufficientemente aderito nel controllo a 96 pozzetti, trasferire le assemblee di inserimento alla cappa coltura tissutale (vedi nota sopra) e rimuovere delicatamente il tubo in silicone esterno e le spine. Inserti tornare alla (cioè verticale) orientamento normale nei pozzetti forniti contenenti 800 ml / pozzetto di BEC terreno di mantenimento (precedente paragrafo 1.1.2).
2.3. Semina del BECs in Aula al di sopra delle astrociti Luminal
Seed 2x10 4 BECs in 200 microlitri sulla superficie luminale collagene rivestita e restituire l'inserts nell'incubatrice.
2.4. Coculturing
Coculture gli inserti SVG / BEC-teste di serie per 3 giorni in BEC mezzo senza cambiare supporto prima sperimentazione.
3. La sperimentazione del Modello BBB umano (3 ° giorno)
- Per stimolare le vitro BBB prime cellule di lavaggio a sostituendo media abluminale e luminali con 600 ml e 100 ml di serum-free BECs medio, rispettivamente.
- Aspirare nuovamente il mezzo luminale e sostituirlo con 100 ml di terreno privo di siero con agenti stimolanti.
Nota: se è necessaria la stimolazione della camera abluminale (per attivare la vitro BBB dal vano astrociti), aspirare il terreno abluminale e sostituirlo con 600 ul di mezzo privo di siero con agenti stimolanti. - Verifichiamo ogni gruppo sperimentale in triplice copia (quindi, se non si esegue la stimolazione del lume, che richiede 3 x 100 ml, si consiglia di diluire il re agenti alle loro concentrazioni finali in 350 ml di terreno privo di siero per gruppo per ridurre al minimo gli errori di pipettaggio tra pozzi).
- Eseguire paracellular standard e / o saggi transcellulare permeabilità di traccianti marcati 16,24 (per quest'ultimo usiamo isotiocianato di fluoresceina (FITC) coniugato con albumina) e / o misura di TEER 13,16,25 come precedentemente descritto.
Per tenere conto di variazioni nella permeabilità basale tra esperimenti, analizzare variazioni di permeabilità relativa ad un inserto rivestito senza cellule (che serve come riferimento per la permeabilità massima) e al gruppo trattato con veicolo utilizzando la formula: permeabilità (% max) = ( valore di permeabilità di inserto sperimentale - valore medio permeabilità del gruppo veicolo) / (valore di permeabilità dell'inserto blank - valore medio permeabilità del gruppo veicolo) X 100.
4. Visualizzazione di celle porosi Membrane
nt "> Commento: cellule non colorati sulle membrane inserti sono difficili da osservare per contrasto di fase o di contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopio in quanto la membrana è abbastanza opaco e interferisce con la trasmissione della luce Per affrontare questo problema abbiamo sviluppato diverse procedure di colorazione delle celle. inserti, che migliorano notevolmente l'aspetto delle cellule sulla membrana. Generalmente, macchia le membrane inserto mentre ancora attaccati l'inserto, nei pozzetti. Le membrane devono essere rimossi solo al termine della procedura di colorazione per scopi di montaggio.4.1. Ematossilina colorazione
- Fissare con inserti ghiacciata 4% (w / v) paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 130 mM NaCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, pH 7.2) per 20 min. Risciacquare una volta in PBS.
- Immergere l'inserto in soluzione ematossilina 0,1% di Mayer per 2 min.
- Lavare delicatamente l'inserto con acqua di rubinetto (immergendo gli angoliERT in un bicchiere contenente acqua di rubinetto e pipettando delicatamente l'acqua in eccesso). Trasferire l'inserto alla soluzione di Scott acqua di rubinetto (2 g / L NaHCO3, 20 g / L MgSO4) per ~ 20 secondi finché il colore blu desiderato sviluppa. Lavare nuovamente l'inserto con acqua di rubinetto (punto 4.1.3). Un eosina opzionale può essere introdotto qui immergendo l'inserto in soluzione eosina 1% per 10 secondi seguita da un lavaggio con acqua del rubinetto.
- Air-asciugare la membrana inserto. Usando un bisturi (taglio attorno al bordo membrana) rimuovere la membrana e montarlo su un vetrino per l'imaging in campo chiaro
Nota: Se di-N-butylphthalateinxylene (DPX) mezzo di montaggio è utilizzato lavare l'inserto con 100% di etanolo seguito da xilene prima di rimuovere e montare la membrana.
4.2. Microscopio Elettronico a Scansione (SEM)
- Fissare con inserti ghiacciata 4% (w / v) in PBS PFA per 20min. Lavare tre volte in PBS.
- Post-fissare le membrane per 30 min a 1% (w / v) Tetrossido di osmio in MQH 2 O.
- Lavare inserti in acqua (punto 4.1.3) e disidratare in un gradiente crescente di etanolo (50%, 70%, 90% per 5 minuti ciascuno, poi 3x con il 100% di etanolo per 10 min per intervallo).
- Trattare inserti disidratati con un misto di esametildisilazano (HMDS): etanolo (1:02 poi 2:01 per 5 min).
- Trattare gli inserti con il 100% HMDS per 5 minuti, asciugare e conservare in condizioni essiccati.
- Rimuovere la membrana con un bisturi (taglio attorno al bordo della membrana). Esaminare membrane mediante microscopia elettronica a scansione.
4.3. Immunofluorescenza
- Fissare con inserti ghiacciata 4% (w / v) in PBS PFA per 20 min, lavare una volta in soluzione salina tamponata con Tris (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 154 mM NaCl, 0,22 micron filtrato).
- Eseguire immunocolorazione delle cellule sulla membrana inserto come descritto in precedenza 26.
- Rimuovere la membrana con un bisturi (taglio intorno al bordo della membrana) e montarlo sul agdiapositiva lass con mezzo di montaggio fluorescenza. Esaminare membrana mediante microscopia a fluorescenza.
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Representative Results
Al fine di stabilire un essere umano, modello di contatto BBB abbiamo dovuto coltivare SVG e BECs sulle membrane porose con un 3 micron pori di dimensioni, indicato per consentire il passaggio di astrociti finali piedi per il contatto con le cellule endoteliali 14,15,27,28. Una rappresentazione schematica del modello di contatto completo è illustrato nella Figura 1 (illustrazione a sinistra). La principale sfida tecnica presentata da un sistema di contatto è la necessità di inizializzare astrociti contro la gravità sulla superficie abluminale della membrana. Siamo riusciti in questo compito creando principalmente un silicone rimovibile ben sopra della superficie della membrana abluminale evitando perdite di media con un tappo di silicone aggiuntivo inserito nella cavità luminale (Figura 2). Il metodo ha permesso un ottimale, ininterrotto periodo di semina SVG (almeno 4 ore), che a sua volta diventa fortemente attaccata alla superficie porosa con perdita cellula minimale. Infatti, tre giorni dopo la semina sia SVG e BECs apporecchie confluenti e coperto la membrana uniformemente, come giudicato da immagini di inserti ematossilina-macchiato (vedere paragrafo 4.1; la figura 3A, pannelli a sinistra). Inoltre, entrambi i tipi di cellule mantenute loro marcatori cellula-specifici sulle membrane porose (un metodo di colorazione diffusa della proteina gliale fibrillare acida nei SVG 22 e di espressione di fattore di von Willebrand in organismi Wiebel-Palade e vescicole citoplasmatiche in BECs; Figura 3A, pannelli di destra) , osservato da immunofluorescenza (paragrafo 4.3). Inoltre, dalle immagini SEM (paragrafo 4.2), è emerso che SVG e BEC sono stati in grado di crescere direttamente sopra i pori della membrana (Figura 3a, pannelli centrali, punte di freccia), un fenomeno che contribuisce artificialmente la funzione di barriera fisica di vitro BBB in contatto models1 3,28. Funzionalmente, in presenza di SVGs valore permeabilità endoteliale (Pe) 16,24 fluorescente di albumina 28 improved ~ 4 volte rispetto a BECs sola (P <0.01, n = 4), da 0,574 ± 0,199 x10 -3 a 0,126 ± 0,028 x10 -3 cm / min senza o con astrociti (SVG), rispettivamente. Questi albumina risultati Pe sono paragonabili a un altro studio con BEC topo con cellule di ratto C6 di glioma 29. Il nostro protocollo semina è stata applicata con successo anche per appena isolato BECs topo primari e astrociti primari di topo coltivate su 1 micron pori. In questo modello di contatto del mouse abbiamo ottenuto una barriera fisica ragionevole per la piccola idrofilo fluoresceina tracciante sodio (Pe = 0,83 ± 0,22 x10 -3 cm / min; n = 3). Quindi, il nostro metodo di semina può essere esteso per la preparazione di modelli BBB da altre specie.
La caratteristica fondamentale di un modello di contatto BBB è la capacità di astrociti di proiettare i loro finali piedi attraverso i pori della membrana per contattare fisicamente cellule endoteliali. Alcuni studi hanno fatto uso di microscopia elettronica a scansione di idenduare astrociti processi che passano dalla superficie della membrana abluminale (dove astrociti sono teste di serie) sulla superficie luminale, come prova di principio che il contatto tra astrociti e CE è plausibile 14,15,27. A seguito di questi studi abbiamo immaginata dal SEM membrana luminale dopo la semina SVG sulla superficie abluminale. Come mostrato nella Figura 3B, astrociti (SVG) finali piedi potevano essere osservate passando attraverso 3 micron pori nel compartimento luminale, confermando che il contatto può potenzialmente esistere tra SVG e BECs seminato su pori di questa dimensione. Collettivamente, il nostro metodo di semina era semplice, efficiente, e ha prodotto un modello di contatto BBB autentico.
Abbiamo utilizzato il modello di contatto BBB umano per esplorare l'effetto di t-PA, un farmaco fibrinolitico, sulla BBB. Alcuni articoli hanno suggerito che t-PA può essere in grado di indurre l'apertura della BBB durante la somministrazione endovenosa per il trattamento di ictus ischemico acuto 30-33. Questa interazione tra t-PA e la BBB può contribuire a complicanze emorragiche associate alla trombolisi t-PA-indotta 4,34,35 ed è quindi un argomento per gli sforzi di ricerca in corso. I nostri studi in vitro hanno confermato che t-PA infatti aumentata permeabilità della BBB intatta in un (Figura 4A) concentrazione e maniera tempo-dipendente (Figura 4B), che erano entrambi all'interno di un intervallo farmacologicamente rilevanti 36,37. Inoltre, drammatici cambiamenti morfologici di astrociti SVG potevano essere osservati sulle membrane porose inserisci esposizione al t-PA (Figura 4C), suggerendo che le risposte astrociti a t-PA sottendono apertura BBB t-PA-indotta. Successiva indagine ha rilevato che il t-PA stimola gli astrociti attraverso l'attivazione del plasminogeno - il suo substrato naturale - nella potente e ad ampio spettro proteasi plasmina. Inoltre, t-PA e plasmina sono stati trovati per attivare Rho-chinasi (ROCK) di segnalazione in astrociti, e il blocco del pathway ROCK impedito t-PA-indotta BBB apertura 28. Questo è un buon esempio di come l'utilizzo di modelli BBB può portare alla identificazione di nuovi processi biologici e le opportunità terapeutiche.
Figura 1. Configurazioni basate Inserire delle vitro modelli BBB a. Rappresentazioni schematiche di statica (senza flusso) in vitro modelli BBB. Nei modelli di base delle cellule endoteliali cerebrali (ECS; arancione) sono coltivati solo su una membrana porosa (giallo). In più avanzati approcci EC sono co-coltivate con astrociti (verde). Astrociti possono essere coltivate in condizioni di non-contatto, sul fondo del pozzo (a destra), o sulla superficie abluminale della membrana porosa in condizioni di contatto (a sinistra).nk "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Un metodo migliorato per astrociti semina sulla superficie della membrana abluminale per la preparazione di un modello di contatto BBB. (A) L'inserto è invertita, un corto pezzo di tubo in silicone ("tubo esterno") è montato attorno al suo perimetro e un tappo di silicone montato in la cavità luminale. Questo assemblaggio forma un pozzo sulla parte superiore della superficie abluminale e impedisce la fuoriuscita mezzi attraverso i pori. Le cellule possono essere seminate nel bene e ha permesso di aderire indisturbato per lunghi periodi di tempo (a destra) (B) Il tappo di silicone vengono preparati da un altro pezzo di tubo in silicone ("tubo interno"), chiuso ad una estremità con un cono di tenuta che viene inserito nella sua cavità. (C) Una volta seminato, lainserti assemblati sono trasportati tra due piastre da 6 pozzetti (una piastra capovolta sull'altra) per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Visualizzazione delle cellule endoteliali cerebrali (BECS) e astrociti su 3 micron membrana porosa A) ematossilina (pannelli a sinistra), microscopio elettronico a scansione (SEM;. Pannelli centrali) e le immagini di immunofluorescenza (pannelli a destra) di SVG (sulla superficie abluminale, 40.000 a 6,5 mm inserto, pannelli superiori) e BEC (20.000 per 6,5 mm inserto sul collagene I rivestite, superficie luminale, pannelli inferiori) coltivate su una membrana porosa 3 micron per 3 giorni (senza coculturing). Entrambi i tipi di cellule raggiungono confluenza entro questo tempo frame e mantenere le loro marcatori specifici delle cellule (proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) per SVG e fattore di von Willebrand (vWF) in organismi Wiebel-Palade per BECs, pannelli a destra) sulla membrana. Le frecce nei pannelli SEM mostrano ulteriormente la capacità di entrambi i tipi di cellule a crescere direttamente sopra e coprire i pori, mentre le frecce rappresentano nuclei cellulari. Barre di scala sulle immagini SEM rappresentano 25 micron (in alto) o 20 micron (in basso). Barre di scala sulle immagini di immunofluorescenza rappresentano il 40 micron. (B) immagini SEM di SVG finali piedi passano attraverso 3 micron pori nella luminale (BEC) superficie 3D postale semina di SVG (solo) sulla superficie della membrana abluminale. Queste immagini convalidano le potenzialità di sviluppo del vero contatto tra SVG e BECs nel nostro modello BBB umana. Barre di scala rappresentano il 6 micron sul pannello di sinistra e 12 micron sul pannello di destra. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. tissutale del plasminogeno aumento (t-PA)-mediata in BBB permeabilità è guidato da cambiamenti morfologici di astrociti. (A) Le concentrazioni crescenti t-PA sono stati aggiunti alla camera luminale della umana in vitro BBB e permeabilità è stata valutata 24 ore dopo dal passaggio di albumina fluorescente nella camera abluminale. t-PA aumentato BBB permeabilità in un modo dipendente dalla concentrazione. n = 4-6 per tutte le ma t-PA 10 nM, dove n = 2. *** P <0.001 rispetto a tutti gli altri gruppi per una ANOVA con Newman-Keuls post hoc. (B) t-PA (1 mM) è stato aggiunto alla camera luminale della umanavitro BBB per 8 ore e 24 ore prima della valutazione permeabilità. Come mostrato, l'apertura BBB t-PA-mediata era già sostanziale stimolazione 8 ore alberino (70,26% del massimo a 24 ore) ma un ulteriore aumento è stato osservato a 24 ore. n = 6, *** p <0.001, ** p <0.01compared a zero da una ANOVA con Newman-Keuls post hoc. In entrambi (A) e (B), punti bar / dati rappresentano media ± SEM. (C) Immagini rappresentative in campo chiaro di SVG ematossilina-macchiati (pannelli superiori) o microscopio elettronico a scansione di SVG (pannelli inferiori) sulle membrane inserti in poliestere (3 micron dimensione dei pori) 24 ore di trattamento post con veicolo o t-PA (1 micron). Cambiamenti morfologici pronunciato t-PA-indotte e interruzione dell'integrità monostrato SVG possono osservare, suggerendo che le risposte astrociti a t-PA alla base dell'effetto di t-PA il BBB permeabilità. Le immagini sono rappresentative di due esperimenti indipendenti. Barre di scala sulle immagini SEM rappreinviato 61 micron (a sinistra) o 120 micron (a destra). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
La ricerca medica in patologie cerebrali soffre molta difficoltà traslazionale. Nella zona di ictus ischemico acuto, per esempio, molti farmaci che hanno mostrato una grande promessa in modelli animali fallito alla clinica 38,39. Le ragioni di questi risultati deludenti sono diversi e comprendono l'infedeltà dei sistemi di test preclinici per lo scenario tratto umano e sovrastima dei risultati ottenuti da studi su animali 21. Una strategia per migliorare il valore predittivo dei risultati preclinici per la fase clinica è un ulteriore sviluppo di cellule umane basati su modelli in vitro, questi possono fornire strumenti potenti ed efficienti per lo screening di nuovi farmaci e meccanismi e consentire una migliore focalizzazione sulle strade clinicamente rilevanti 21. In questo contesto, abbiamo descritto qui in dettaglio il processo intrapreso nel nostro laboratorio per la creazione di un modello di contatto BBB umano utilizzando una nuova combinazione di umano immortalato astrociti (SVG) e BEC umani primari per l'esame dei fenomeni ictus-correlata.
In condizioni statiche (assenza di flusso), rivolgersi modelli BBB (Figura 1) assomigliare al meglio la struttura anatomica in vivo e sono dimostrato di essere superiori nelle loro proprietà di barriera 13,17,18. È importante sottolineare che un vero contatto tra BEC e astrociti si verifica solo su membrane con grande diametro dei pori (≥ 1 micron), che permettono il passaggio di astrocitiche finali piedi e conseguente induzione di più stretto (meno permeabili) BEC monostrati 14,15,27. Tuttavia, la semina di astrociti su inserti invertiti con una maggiore dimensione dei pori - l'elemento tecnico fondamentale nella preparazione di un modello di contatto BBB - rappresenta una sfida tecnica doppio, poiché oltre al volume medio limitata che può essere aggiunto alle invertiti 6,5 millimetri inserti (~ 50 ul), le membrane sono anche soggetti a perdite di mezzo a causa della loro grande diametro dei pori. Queste limitazioni possono fare la astsemina rocytic goffo e incoerente.
La nostra tecnica innovativa per la semina astrociti su inserti invertiti con 3 micron pori offre una soluzione semplice ma efficace per questa procedura. Creando un silicone impermeabile rimovibile bene sulla parte superiore della superficie abluminale abbiamo notevolmente migliorato la capacità degli astrociti 'aderire correttamente alla membrana porosa. Ciò consente una crescita uniforme astrociti sulla superficie abluminale e consente la preparazione riproducibile di un gran numero di inserti per lo screening simultaneo di molti parametri sperimentali (per esempio, la nostra proiezione recentemente eseguito dell'effetto di cinque diversi plasminogeno-attivatori sulla BBB 28). Quindi, nonostante la sua semplicità, abbiamo trovato il nostro metodo per migliorare notevolmente la produttività e la qualità della nostra ricerca che utilizza questo modello di contatto BBB. Un limite del nostro metodo astrociti seeding è il requisito per la gestione supplementare manuale degli inserti, che ospitano sottili (10 μdi spessore) membrane m. Movimenti eccessivi o ruvida può causare micro-rotture e danni alla membrana. Quindi, l'uso di tubi silicone morbido e flessibile è essenziale come il montaggio / smontaggio deve essere eseguita con una forza minima.
Per quanto riguarda la sua concezione generale, il nostro modello BBB umano è stato stabilito sulla base di un protocollo precedentemente descritto 14,23 che originariamente utilizzato cellule umane primarie. Nonostante la loro superiorità per BBB modellazione, uno svantaggio occupazionale di pile cervello umano è l'impossibilità di accedere regolarmente tessuto vivo cervello umano per la produzione regolare di BECs primarie e astrociti e / o il costo coinvolti in essi ottenere commercialmente. Dal momento che molti modelli BBB sostituire con successo astrociti primari con astrociti immortalati (per esempio con un cellule di ratto C6 di glioma 29), era ragionevole assumere astrociti SVG 22 come un romanzo, abbondante e conveniente opzione per la modellazione BBB umana. La capacità di SVG diinfluenzare positivamente la funzione di barriera BEC convalidato in linea di principio la loro idoneità per gli studi BBB. Al contrario, abbiamo scelto di mantenere BECs primarie nel nostro modello BBB per il loro ruolo fondamentale nella BBB in vivo 1,2,9. Importante, coltura prolungata di BECs primarie può provocare de-differenziazione e deterioramento della loro fenotipo BBB-specifico. Questo infatti può essere evidente nel nostro sistema da un piuttosto elevati valori di permeabilità endoteliali di albumina. Per questo motivo, abbiamo utilizzato il nostro modello principalmente in modo relativo 28 (Figura 4), tenendo conto della sua elevata permeabilità basale. Se un molto stretto monostrato BEC umana è desiderata la funzione di barriera può essere ulteriormente migliorata mediante aggiunta di sostanze chimiche come il glucocorticoide idrocortisone 17 o AMP ciclico con inibitori della fosfodiesterasi 13. BECs umane immortalizzate, quali la linea cellulare hCMEC/D3 40, potrebbero essere impiegati anche per la loro capacità di mantenere meglio tigiunzioni GHT nel tempo. Eppure, linee cellulari BEC spesso mostrano le qualità di barriera ridotti rispetto al basso passaggio primario BEC 41,42 e deve essere attentamente considerata causa di altre variazioni possibili (cioè alterata espressione di recettori di superficie cellulare).
Collettivamente, la nostra modifica del tipo di cella astrociti (cioè l'impiego di SVG) e il sostanziale miglioramento del protocollo astrociti semina comportato la generazione di un riproducibile, facile da montare e autentico modello BBB contatto umano. Tenendo presente i suoi limiti, questo sistema può servire come strumento utile per la ricerca in vitro non solo di ictus ischemico acuto, come esemplificato qui 28, ma anche di molte altre patologie cerebrali coinvolgono modulazione della BBB.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni concesse alla RLM della Salute e medicina Consiglio Nazionale delle Ricerche of Australia (sovvenzione # 606658).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attachment Factor | Cell-Systems Corporation | 4Z0-210 | |
| Brain microvascular endothelial cells (BECs), primary, human | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Complete medium | Cell-Systems Corporation | 4Z0-500 | Supplemented with CSC JetFuel |
| Complete serum-free medium | Cell-Systems Corporation | SF-4Z0-500 | Supplemented with CSC RocketFue |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Endothelial cells growth supplement (from bovine origin) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| External silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A080.016 | Pumpsil brand, 8 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| Foetal calf serum | Lonza | 14-501F | |
| Gentamycin sulfate | Life Technologies | 15750-060 | |
| Heparin sodium | Pfizer | 1,000 U/ml | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | H4875 | |
| Human brain microvascular endothelial cells | Cell-Systems Corporation | ACBRI 376 | |
| Internal silicone tubing | Watson-Marlow | 913.A032.016 | Pumpsil brand, 3.2 mm internal diameter, 1.6 mm wall |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Mayer’s hematoxylin solution | Amber Scientific | MH | |
| Minimum essential medium with Earle’s balanced salt solution | HyClone Laboratories | SH30244.01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Rat collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | Cultrex brand |
| Tissue culture inserts | Corning Life Sciences | 3472 | Transwell brand, 6.5 mm in diameter, with polyester porous membrane, 3 µm pore-size |
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