Summary
هنا نصف إجراء لتصوير المجمعات الفيروسية في السائل في قرار نانومتر باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال.
Abstract
يستخدم الباحثون بانتظام المجاهر الإلكترونية الإرسال (TEMs) لفحص الكيانات البيولوجية وتقييم المواد الجديدة. هنا، ونحن نصف تطبيق إضافي لهذه الصكوك- عرض التجمعات الفيروسية في بيئة سائلة. هذه الطريقة المثيرة والجديدة لتصور الهياكل البيولوجية تستخدم حامل عينة microfluidic المتقدمة مؤخرا. يوضح مقال الفيديو الخاص بنا كيفية تجميع واستخدام حامل microfluidic لتصوير العينات السائلة داخل TEM. على وجه الخصوص، نستخدم جزيئات ثنائية الطبقات من فيروس الروتا سيميان (DLPs) كنظام نموذج لدينا. كما نقوم بوصف الخطوات اللازمة لتغطية سطح الغرفة السائلة بأغشية بيولوجية تقارب تربط DLPs بنافذة المشاهدة. هذا يسمح لنا لتصوير التجميعات بطريقة مناسبة لتحديد هيكل 3D. وهكذا، نقدم لمحة أولى عن الجسيمات شبه البيئية في بيئة سائلة أصلية.
Introduction
الهدف المشترك لعلماء الأحياء والمهندسين هو فهم الأعمال الداخلية للآلات الجزيئية. المجاهر الإلكترونية انتقال (TEMs) هي أدوات مثالية لتصور هذه التفاصيل المعقدة في القرار شبه الذري1-2. من أجل الحفاظ على نظام فراغ عالية من TEM، وعادة ما تكون جزءا لا يتجزأ من العينات البيولوجية في أفلام رقيقة من الجليد الزجاجي3،والسكريات4، والأملاحالمعدنية الثقيلة5،أو مزيج من بعض من6. ونتيجة لذلك، قد تكشف صور العينات المضمنة عن لقطات محدودة فقط للعمليات الديناميكية.
قام بارسونز وزملاؤه بمحاولات مبكرة للحفاظ على العينات البيولوجية المرطبة في الغرف السائلة البيئية باستخدام مراحل ضخ تفاضلية. تم تسجيل أنماط الحيود الإلكترون من بلورات كاتالاز غير ملطخة بنجاح إلى قرار من 3 Å في حالةرطبة 7-8. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن فحص مجالات الدهون المنفصلة مرحليا في الأغشية المائية من كرات الدم الحمراء البشرية9-10. ومع ذلك ، فإن الحركة الناجمة عن نشر السائل وتدخله في شعاع الإلكترون ، أدت إلى فقدان شديد للقرار ولم تتم محاولة إجراء المزيد من التجارب باستخدام العينات البيولوجية حتى وقت قريب.
وقد تم إدخال أصحاب العينات الدقيقة الفلورية المطورة حديثا التي تستخدم رقائق أشباه الموصلات لتشكيل غرفة بيئية صغيرة الحجم. يمكن لهذه الأجهزة الحفاظ على عينات في السائل في حين يتم وضعها في عمود TEM11-12. وقد سمح هذا الاختراق التقني في التصوير TEM الباحثين لعرض، للمرة الأولى، الأحداث التقدمية على المستوى الجزيئي13. نشير إلى هذه الطريقة الجديدة باسم"في الموقع المجهر الجزيئي" كما يمكن الآن إجراء التجارب "داخل" العمود EM14-15. الهدف العام لهذه الطريقة هو تصوير التجمعات البيولوجية في السائل من أجل مراقبة سلوكياتها الديناميكية بدقة نانومتر. والأساس المنطقي وراء هذه التقنية المتقدمة هو تسجيل الملاحظات في الوقت الحقيقي ودراسة الخصائص الجديدة للآلات البيولوجية في الحل. هذه المنهجية توسع استخدام TEMs لأغراض أوسع في البيولوجيا الخلوية والجزيئية12-16.
في مقال الفيديو الحالي ، نقدم بروتوكولا شاملا لتجميع واستخدام حامل عينة microfluidic متاح تجاريا. يستخدم هؤلاء أصحاب المتخصصة رقاقات نيتريد السيليكون المنتجة مع الفواصل المتكاملة لتشكيل غرفة السائل الذي يحيط أحجام دقيقة من الحل. يتم حفر رقيقة وشفافة النوافذ في الرقائق الدقيقة لأغراض التصوير12. نحن نثبت الاستخدام السليم لحامل microfluidic لفحص جزيئات فيروس الروتا سيميان ذات الطبقات المزدوجة (DLPs) في السائل باستخدام TEM. لضمان أن التجمعات البيولوجية ، مثل DLPs ، لا تنتشر بسرعة على مسافات كبيرة أثناء التصوير ، نستخدم نهج التقاط التقارب لربطها بسطح الغرفةالدقيقة 16. هذه الخطوة التقاط الجزيئية له ميزة كبيرة على التقنيات البديلة لتصوير العينات البيولوجية في السائل لأنه يسمح للحصول على الصور التي سيتم استخدامها لروتين معالجة المصب. هذه الخطوة التقاط المستخدمة جنبا إلى جنب مع التصوير microfluidic فريدة من نوعها لإجراءاتنا17. القراء الذين يستخدمون تطبيقات البيولوجيا الهيكلية باستخدام TEM أو غرف التصوير microfluidic قد تنظر في استخدام تقنيات التقاط تقارب عندما الملاحظات الديناميكية على المستوى الجزيئي هي الهدف النهائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد أجهزة التقاط التقارب16
- تنظيف رقائق السيليكون نيتريد E عن طريق احتضان لهم في 15 مل من الأسيتون لمدة 2 دقيقة تليها 15 مل من الميثانول لمدة 2 دقيقة (الشكل 1A). السماح للرقائق لتجف تحت تدفق الهواء صفح.
- احتضان رقائق المجففة على لوحة اثارة ساخنة (دون اثارة) لمدة 1.5 ساعة في 150 درجة مئوية، ثم السماح لهم لتبرد لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
- استخدام المحاقن هاملتون لتكوين خليط الدهون في أنابيب زجاجية صغيرة لاحتواء 25٪ الكلوروفورم، 55٪ DLPC (1،2-dilauroyl-phosphocholine) في الكلوروفورم (1 ملغ / مل) و 20٪ ني-NTA الدهون (1،2-dioleoyl-iminodiacetic حمض-سكرينيل-النيكل الملح) في الكلوروفورم (1 ملغ/مل) لحجم إجمالي قدره 40 ميكرولتر.
- تطبيق 1 ميكرولتر aliquot من الخليط على كل قطرة 15 ميكرولتر من الماء ميلي كيو على قطعة من بارا فيلم في طبق بيتري الرطبة (الشكل 1B). احتضان عينات على الجليد لمدة 60 دقيقة على الأقل.
2. التقاط الجزيئات الكلية17
- ضع رقاقة E مع فاصل متكامل 150 نانومتر على رأس عينة أحادية الطبقة واحتضان لمدة 1 دقيقة(الشكل 1C).
- رفع بلطف رقاقة الخروج من العينة وإضافة aliquot 3 ميكرولتر من له الموسومة البروتين A. حضانة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة(الشكل 1D).
- لطخة بعيدا إسقاط الزائدة باستخدام Whatman #1 ورقة تصفية وإضافة على الفور aliquot 3 ميكرولتر من حل الأجسام المضادة. حضانة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الحل الزائد باستخدام حقنة هاملتون وإضافة على الفور 1 ميكرولتر aliquot من DLPs فيروس الروتا (0.1 ملغ / مل) في محلول عازلة تحتوي على 50 م م HEPES (درجة الحموضة 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 و 10 mM CaCl2. حضانة لمدة 2 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. وقد وصفت إعداد DLPs سابقا18.
3. تجميع غرفة Microfluidic وتحميل حامل عينة في الموقع
- تحميل الرطب E-رقاقة تحتوي على عينة الفيروسية في غيض من حامل العينة microfluidic. توهج التفريغ الثانية شقة E-رقاقة لمدة دقيقة واحدة ثم تحميلها على رأس رقاقة المسافة(الشكل 2، لوحات 1-5).
- بدلا من ذلك، لزيادة التباين من الجزيئات البيولوجية، يمكن إضافة وصمة عار المعادن الثقيلة(على سبيل المثال 0.2٪ أورانيل formate) إلى عينات الرطب قبل وضع الشريحة E الثانية على العينة الرطب. ومع ذلك، فإن الشريحة E التي تحتوي على العينة تحتاج إلى غسلها بماء ميلي كيو قبل إضافة كاشف التباين.
- ساندويتش التجميع بأكمله معا لتشكيل الضميمة مختومة، التي عقدت في مكان ميكانيكيا داخل حامل من قبل 3 مسامير النحاس(الشكل 2،لوحات 6-8).
- بعد التجميع، يتم ضخ طرف الحامل إلى10-6 تور باستخدام محطة ضخ جافة بضخ توربو قبل وضع الحامل داخل TEM.
4. التصوير في السائل باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال
- قم بتحميل حامل العينة في الموقع في مجهر إلكترون ناقل الحركة (FEI Company) المجهز بخيوط LaB6 ويعمل بمعدل 120 كيلو فولت.
- قم بتشغيل خيوط TEM وضبط الارتفاع المتمحور حول مرحلة المجهر فيما يتعلق بالعينة باستخدام وظيفة المتذبذب لإمالة العينة من -15 درجة إلى +15 درجة ذهابا وإيابا في العمود. هذا الإجراء يضبط المرحلة في الاتجاه z للمساعدة في حساب سمك السليم للغرفة السائلة. تضمن هذه الخطوة أيضا استخدام تكبير دقيق عند تسجيل الصور.
- تسجيل الصور على طول حواف وفي مناطق الزاوية من غرفة microfluidic أولا. تحتوي هذه المناطق عادة على الحل أنحف. تسجيل صور العينات في ظل ظروف جرعة منخفضة (1-3 الإلكترونات / Å2)باستخدام كاميرا CCD. استخدام التكبير الاسمي من 6000X - 30000X.
- تحديد قيمة ديفوكوس المناسبة من خلال التركيز على حافة غرفة السوائل. استخدم قيمة -1.5 ميكرومتر لتسجيل الصور عند تكبير 30,000X. إذا واجه حل سميك أو إذا لم يتم استخدام عامل التباين في إعداد العينة، استخدم قيم defocus أعلى في نطاق -2 إلى -4 ميكرومتر.
- لضمان احتواء الحل في غرفة microfluidic في جميع أنحاء التجارب ، ركز شعاع الإلكترون حتى تتشكل الفقاعات في السائل داخل الجهاز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر الصور التمثيلية ل DLPs في السائل باستخدام الرقائق الإلكترونية التي تم تفريغها توهج(الشكل 3A)أقل DLPs في منطقة عرض معينة، ويفترض أن يكون ذلك بسبب الانتشار، بالمقارنة مع DLPs التي يتم إثراء على أجهزة التقاط التقارب(الشكل 3B). إضافة أورانيل formate في غرفة التصوير يعزز التباين من العينة، وبالتالي رؤية DLPs الفردية في الحل(الشكل 3C،لوحة أعلى). أفضل التباين يسمح لمعالجة الصور المصب مثل متوسط الجسيمات(الشكل 3C، لوحة أسفل) و 3D إجراءات إعادة الإعمار(الشكل 3C، inset) كما وصف سابقا17. لفترة وجيزة ، لإعادة الإعمار 3D اخترنا 600 جزيئات DLPs باستخدام حزمة برامج سبايدر19. تم صقل الجسيمات المختارة مقابل نموذج أولي من الفيروس العجلي DLP20 الذي تمت تصفيته إلى دقة 80 Å. استخدمنا حزمة برامج RELION21 لحساب إعادة بناء ثلاثية الأبعاد بدقة 25 Å تقريبا. لدينا خريطة 3D في اتفاق جيد مع النموذج الأولي ومع إعادة بناء التبريد و EM المستقلة التي تم حسابها باستخدام نفس المعلمات وDLP عينة17.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 إعداد رقاقات نيتريد السيليكون للتصوير السائل. أ)يتم تنظيف رقائق نيتريد السيليكون عن طريق الغمر لمدة 2 دقيقة في الأسيتون تليها 2 دقيقة في الميثانول لإزالة مزيلات ضوئية متبقية تستخدم في عملية التصنيع. ب)يتم إعداد عينات أحادية الطبقة الدهون على قطرات من المياه ميلي كيو تضاف إلى بارا فيلم في طبق بيتري الرطب17. ج)يتم وضع رقائق تنظيفها على رأس monolayers وإزالتها بعد خطوة حضانة 1 دقيقة. د)يتم إضافة محولات الجزيئية(أي البروتين A والأجسام المضادة في الحل) مباشرة إلى رقائق المغلفة أحادية الطبقة ويتم إزالة الحل الزائد قبل إضافة DLPs. ثم يتم تحميل رقاقة العينة الرطب في حامل microfluidic.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم تجميع الغرفة السائلة لحامل عينة ميكروفلويديك. يتم تجميع طرف غرفة العينة عن طريق إضافة تجهيزات O-ring إلى الطرف الفارغ (الخطوات 1-2). يتم وضع رقاقة العينة الرطبة التي تحتوي على الفواصل المتكاملة بلطف في التجهيزات المهيأة داخل طرف الحامل (الخطوات 3-4). يتم وضع رقاقة مسطحة توهج تفريغها على رأس رقاقة العينة (الخطوة 5). ثم يتم تغطية الجمعية مع لوحة الوجه المعدنية(الخطوة 6)التي عقدت في مكان من قبل 3 مسامير النحاس (الخطوات 7-8).
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن النتائج التمثيلية ل DLPs في السائل. أ)رقائق توهج تفريغها ربط DLPs قليلة جدا في الحل بالمقارنة مع رقائق مزينة تقارب(ب). أشرطة المقياس، 2 ميكرومتر. ج)صورة تمثيلية (لوحة علوية) وإعادة بناء ثلاثية الأبعاد (داخلية) من DLPs في سائل يحتوي على كاشف تباين. شريط مقياس، 150 نانومتر. قطر إعادة الإعمار هو 80 نانومتر. المتوسطات فئة DLPs في السائل (لوحة أسفل) تكشف عن ميزات محددة بشكل جيد على طول سطحها الخارجي. لوحات الفردية هي 110 نانومتر.
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال النتائج التمثيلية لتشكيل فقاعة في عينات السائل في TEM. صور الفقاعات التي تشكلت في عينات سائلة عند التعرض المستمر للشعاع الإلكترون في 5 الإلكترونات /Å 2 لمدة 2 دقيقة تقريبا (A) و 5 دقائق (B). شريط المقياس هو 100 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في عملنا المقدم ، استخدمنا نهج التقاط التقارب لربط DLPs فيروس الروتا إلى منصة microfluidic. وقد سمح ذلك بالتصوير الموقعي للمجمعات الجزيئية الكبيرة في بيئة دقيقة سائلة. نهج التقاط كبيرة فيما يتعلق تقنيات التصوير microfluidic أخرى لأنه ي توطين العينات البيولوجية إلى نافذة التصوير لنفي القضايا الانتشار الكبيرة التي تنشأ أثناء تسجيل الصور في السائل. ومع ذلك ، فإن واحدة من أهم الخطوات في بروتوكولنا تنطوي على نقل بيو فيلم الدهون إلى سطح الرقاقة الدقيقة. إذا فشلت الطبقة الأحادية الدهنية في الانتشار بالتساوي عبر الشبكة ، فإن هذا سيؤدي إلى تجربة معيبة. مؤشر على خطوة نقل الفقراء هو أن القليل أو لا الجمعيات الفيروسية سوف تكون ملزمة لشريحة السوائل. وهناك قيود في خطوة نقل الاستقرار الحراري من حيث صلته سيولة طبقة الدهون. إذا كانت خطوة النقل غير كافية ، كما تم تقييمها من خلال الانتشار غير المتكافئ للهبوط ، فيجب احتضان طبقات الدهون على الجليد لفترة أطول أو في غرفة باردة خالية من الاهتزاز. أيضا، يجب أن يكون طبق بيتري مختومة بشكل كاف مع بارا فيلم للحفاظ على الرطوبة المناسبة.
يمكن أن يؤدي وجود فائض من المجمعات الفيروسية أو بروتينات المحول في عينات الرقائق الدقيقة إلى التجميع المفرط للجسيمات. هذا قيد في البروتوكول الذي يمكن إدارته بسهولة. لتقليل تأثير التجميع، يمكن احتضان عوامل البروتين لفترة زمنية أقصر أو ينبغي تخفيف عينة الفيروس. إذا تم الكشف عن فائض من البروتينات غير المحددة ، فإن إدراج إيميدازول الطازج (حوالي 50 مليون متر) في محلول العازلة يمكن أن يقلل من الخلفية. استخدام إيميدازول الطازجة خطوة حاسمة في البروتوكول. وبالمثل، لا الزائد رقائق مع البروتينات المنقى لأن هذا لن يضمن ملزمة محددة، وسوف يؤدي إلى تجربة معيبة. سوف تحتوي الصور على فائض من البروتينات الخلفية ولن تكون مناسبة لروتين المعالجة في المصب. مجموعة تركيز الأمثل للبروتينات النقية هو تقريبا 0.01-0.1 ملغ / مل. ومع ذلك، إذا لم يوفر هذا النطاق المستوى المتوقع من الجسيمات، ينبغي زيادة تركيز العينة إلى أن يتحقق المستوى الأمثل. وينبغي أن يحدث إثراء للجسيمات الفيروسية فيما يتعلق بعينات المراقبة السلبية التي تفتقر إلى محولات جزيئية، مثل الأجسام المضادة. كميات صغيرة من الربط غير محدد في السيطرة السلبية الخاصة بك قد تحدث نادرا، ومع ذلك، ينبغي أن رقائق تقارب زينت تخدم دائما لإثراء الجسيمات الفيروسية. في حالة فيروس الروتا ، لا يوجد حاليا نظام وراثي عكسي لإدخال علاماته في البروتينات capsid كوسيلة لالتقاط المجمعات الفيروسية مباشرة على الأسطح المزينة ب Ni-NTA. له الموسومة ريبوسومات، ومع ذلك، تم تجنيدها بنجاح من الليسات البكتيرية على رقائق ني-NTA زينت E-لتجارب التصوير السائل16. وبالتالي تقديم الأدلة، وإن كانت محدودة في هذه المرحلة، للتفاعلات البيولوجية الأصلية أن تحدث في الخلايا السائلة بينما في عمود TEM.
يجب تجنب استخدام المنظفات والجلسرين ومستويات عالية من السكروز للتصوير في الموقع. استخدام هذه الكواشف سيخلق القطع الأثرية في الصور EM التي تشمل الفقاعات المفرطة وميزات صامتة في الجسيمات، مما أدى إلى صور ذات نوعية رديئة. إذا تم استخدام هذه الكواشف في تحضيرات الفيروسات، يمكن dialyzed العينة إلى حل المخزن المؤقت تفتقر إلى هذه المكونات. يمكن لأجهزة التقاط القرابة تحمل درجة ما من المنظفات لفترة وجيزة من الزمن ، على الرغم من أن هذا يحتاج إلى تحديد على أساس كل حالة على حدة. يرجى الرجوع إلى قائمة الكواشف المتوافقة التي سبق وصفها22.
لتمكين إجراءات معالجة الصور في المصب ، يمكن إضافة تركيز منخفض من كاشف التباين إلى غرفة microfluidic. هذا الكاشف لا يصلح عينات البروتين، مثل إجراءات تلطيخ التقليدية17. لضمان وجود سائل في غرفة التصوير طوال الدورة الزمنية للتجارب ، ركز شعاع الإلكترون حتى يحدث تشكيل الفقاعة(الشكل 4). هذا هو تدبير بسيط للإشارة إلى العينات لا تزال رطبة. عينات السائل تواجه ضررا بالغا في غضون 2 دقيقة (الشكل 4A) من تعريض مستمر للشعاع الإلكترون في 5 الإلكترونات /Å 2. التعرض المستمر شعاع الإلكترون لفترات طويلة لمدة 5 دقائق (الشكل 4B) وما بعدها في هذه الجرعة سيؤدي إلى تشكيل فقاعة المفرط في منطقة التصوير.
في الموقع المجهري الجزيئية المستخدمة في تركيبة مع أجهزة التقاط تقارب يسمح بفحص المجمعات البيولوجية في الحل باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال. هذه التطورات التقنية ممكنة باستخدام أصحاب العينات الدقيقة الفلورية المطورة حديثا. تستخدم هذه الأجهزة أغشية نيتريد السيليكون الرقيقة لتشكيل غرفة تصوير صغيرة الحجم. بناء على العمل الرائد بارسونز وزملاؤه7-10 ونحن نقدم استراتيجية مفيدة لتصوير الجمعيات الفيروسية الفردية في الحل. يشرح البروتوكول الموصوف هنا المنهجيات المتوافقة مع إجراءات معالجة صورة جسيم واحد وحسابات إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد. قد تتضمن التطبيقات المستقبلية التي ستنجم عن اتقان هذه التقنيات تصوير الجزيئات الكبيرة مباشرة EM. نتوقع في التصوير الموقعي قد تكشف عن خطوات للتجميع الفيروسي، وتنظيم النسخ أو غزو الخلية المضيفة. وباختصار، ينبغي أن يسمح استخدام هذه البروتوكولات للباحثين بالتحقيق في العمليات الدينامية في الحل بطريقة جديدة تماما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
صاحبة البلاغ، مادلين ج. ديوك، موظفة في شركة Protochips.
Acknowledgments
يعترف المؤلفون بالدكتور مايكل ج. فريدلاندر، مدير معهد فرجينيا للتكنولوجيا كاريليون للأبحاث لتشجيعه مساعينا البحثية. وقد تم دعم هذا المشروع من خلال صناديق التنمية لS.M.M وD.F.K. وجزئيا بمبادرة نانو بيو من معهد التكنولوجيا الحرجة والعلوم التطبيقية في جامعة فرجينيا للتكنولوجيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
References
- Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
- Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C.
- Dubochet, J., et al.
- Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R.
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
- Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
- Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
- Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
- Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
- Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
- Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).
