Summary
כאן אנו מתארים הליך כדי לדמיין מתחמים ויראליים בנוזל ברזולוציית ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.
Abstract
חוקרים משתמשים באופן קבוע במיקרוסקופים אלקטרונים (TEMs) כדי לבחון ישויות ביולוגיות ולהעריך חומרים חדשים. כאן, אנו מתארים יישום נוסף עבור מכשירים אלה- צפייה במכלולים ויראליים בסביבה נוזלית. שיטה מרגשת וחדשנית זו של הדמיה של מבנים ביולוגיים מנצלת מחזיק דגימה מיקרופלואידית שפותחה לאחרונה. מאמר הווידאו שלנו מדגים כיצד להרכיב ולהשתמש במחזיק מיקרופלואידי כדי לדמות דגימות נוזליות בתוך TEM. בפרט, אנו משתמשים בחלקיקים דו שכבתיים simian rotavirus (DLPs) כמערכת המודל שלנו. אנו מתארים גם צעדים לציפוי פני השטח של התא הנוזלי בביופילמים של זיקה הקושרים DLPs לחלון הצפייה. זה מאפשר לנו לצלם הרכבות באופן שמתאים לקביעת מבנה תלת מימדי. לכן, אנו מציגים הצצה ראשונה של חלקיקים תת-ויראליים בסביבה נוזלית מקומית.
Introduction
מטרה נפוצה של ביולוגים ומהנדסים היא להבין את הפעילות הפנימית של מכונות מולקולריות. מיקרוסקופי אלקטרוני שידור (TEMs) הם מכשירים אידיאליים כדי לדמיין את הפרטים המורכבים האלה ברזולוציה כמעט אטומית1-2. על מנת לקיים את מערכת ואקום גבוהה של TEM, דגימות ביולוגיות מוטבעות בדרך כלל בסרטים דקים של קרח זגוגי3, סוכרים4, מלחי מתכת כבדה5, או שילוב כלשהו של6. כתוצאה מכך, תמונות של דגימות מוטבעות עשויות לחשוף רק תמונות מוגבלות של תהליכים דינמיים.
ניסיונות מוקדמים לשמור על דגימות ביולוגיות hydrated בתאי נוזלים סביבתיים בוצעו על ידי פרסונס ועמיתיו באמצעות שלבי שאיבה דיפרנציאליים. דפוסי עקיפת אלקטרונים של גבישי קטלאז לא מוכתמים נרשמו בהצלחה לרזולוציה של 3 Å במצב hydrated7-8. בנוסף, תחומי השומנים מופרדים פאזה ניתן לבדוק קרום hydrated של אריתרוציטים אנושיים9-10. עם זאת, תנועה הנגרמת על ידי פיזור נוזל והפרעתו לקרן האלקטרונים, גרמה לאובדן רזולוציה חמור וניסויים נוספים באמצעות דגימות ביולוגיות לא נוסו עד לאחרונה.
לאחרונה פותחו מחזיקי דגימה מיקרופלואידית שמשתמשים בשבבים מוליכים למחצה כדי ליצור תא סביבתי בקנה מידה זעיר. התקנים אלה יכולים לשמור דגימות בנוזל בזמן שהם ממוקמים בעמודה TEM11-12. פריצת דרך טכנית זו בהדמיית TEM אפשרה לחוקרים להציג, לראשונה, אירועים מתקדמים ברמה המולקולרית13. אנו מתייחסים לאופן חדש זה כמו " במיקרוסקופיה מולקולריתsitu " כמו ניסויים יכולים להתבצע כעת "בתוך" עמוד EM14-15. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לדמיין מכלולים ביולוגיים בנוזל כדי להתבונן בהתנהגויות הדינמיות שלהם ברזולוציית ננומטר. הרציונל מאחורי הטכניקה המפותחת הוא לתעד תצפיות בזמן אמת ולבחון תכונות חדשות של מכונות ביולוגיות בתמיסה. מתודולוגיה זו מרחיבה את השימוש ב- TEMs למטרות רחבות יותר בביולוגיה תאית ומולקולרית12-16.
במאמר הווידאו הנוכחי, אנו מציגים פרוטוקול מקיף להרכבה ושימוש במחזיק דגימה מיקרופלואידית זמינה מסחרית. מחזיקים מיוחדים אלה משתמשים שבבי סיליקון ניטריד המיוצרים עם מרווחים משולבים כדי ליצור תא נוזלי המקיף כמויות זעירות של פתרון. חלונות דקים ושקופים חרוטים בשבבים למטרות הדמיה12. אנו מדגימים את השימוש הנכון של מחזיק microfluidic לבחון חלקיקים דו שכבתיים simian rotavirus (DLPs) בנוזל באמצעות TEM. כדי להבטיח כי מכלולים ביולוגיים, כגון DLPs, לא להתפזר במהירות על פני מרחקים גדולים בעת הדמיה, אנו משתמשים בגישה לכידת אהדה לקשור אותם אל פני השטח של התא microfluidic16. שלב לכידה מולקולרית זה יש יתרון גדול על פני טכניקות חלופיות להדמיית דגימות ביולוגיות בנוזל מכיוון שהוא מאפשר רכישת תמונות שישמשו לשגרות עיבוד במורד הזרם. שלב לכידה זה המשמש בשילוב עם הדמיה מיקרופלואידית הוא ייחודי להליכים שלנו17. קוראים המשתמשים ביישומים ביולוגיים מבניים באמצעות TEM או תאי הדמיה מיקרופלואידיים עשויים לשקול את השימוש בטכניקות לכידת אהדה כאשר תצפיות דינמיות ברמה המולקולרית הן המטרה הסופית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכן התקני לכידת קירבות16
- נקו את שבבי הסיליקון nitride E על ידי דגירה שלהם ב 15 מ"ל של אצטון במשך 2 דקות ואחריו 15 מ"ל של מתנול במשך 2 דקות(איור 1A). אפשר לשבבים להתייבש תחת זרימת אוויר למינארית.
- דגירה את השבבים המיובשים על צלחת ערבוב מחוממת (ללא ערבוב) במשך 1.5 שעות ב 150 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- השתמש מזרקים המילטון להלחין תערובות שומנים בצינורות זכוכית קטנים כדי להכיל 25% כלורופורם, 55% DLPC (1,2-דילאורויל-פוספוצ'ולן) בכלורופורם (1 מ"ג/מ"ל) ו-20% שומנים Ni-NTA (1,2-דיאולויל-אימינודיאקטי חומצה-סוציניל-ניקל מלח) בכלורופורם (1 מ"ג/מ"ל) בנפח כולל של 40 מיקרוגרם.
- החל 1 μl aliquot של התערובת על כל טיפה 15 μl של מים מילי-Q על חתיכת Parafilm בצלחת פטרי לחה(איור 1B). דגימות דגירה על קרח לפחות 60 דקות.
2. לכידת מקרומולקולות17
- הניחו שבב E עם מרווח משולב של 150 ננומטר מעל דגימת מונולאייר והדגירה למשך דקה(איור 1C).
- הרימו בעדינות את השבב מהדגימה והוסיפו אליקאוט של 3 מיקרומטר של חלבון A. דגירה למשך דקה בטמפרטורת החדר(איור 1D).
- כתם את הירידה העודפת באמצעות Whatman #1 נייר סינון ומיד להוסיף aliquot 3 μl של פתרון נוגדנים. דגירה במשך דקה בטמפרטורת החדר.
- הסר את הפתרון העודף באמצעות מזרק המילטון ומיד להוסיף 1 μl aliquot של DLPs rotavirus (0.1 מ"ג / מ"ל) בתמיסת חיץ המכיל 50 מ"מ HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 ו 10 mM CaCl2. דגירה לפחות 2 דקות בטמפרטורת החדר. הכנת DLPs תוארה בעבר18.
3. להרכיב את התא המיקרופלואידי ולטעון את מחזיק דגימת in situ
- טען את שבב ה-E הרטוב המכיל את הדגימה הנגיפית לקצה מחזיק הדגימה המיקרופלואידית. פריקה זוהרת של שבב E שטוח שני למשך דקה אחת ולאחר מכן נטענת על גבי שבב המרווח(איור 2, לוחות 1.5).
- לחלופין, כדי להגדיל את הניגודיות של מקרומולקולות ביולוגיות, ניתן להוסיף כתם מתכת כבדה(למשל 0.2% אורניל) לדגימות רטובות לפני הנחת השבב האלקטרוני השני על הדגימה הרטובה. עם זאת, שבב E המכיל את הדגימה יהיה צורך לשטוף עם מים מילי-Q לפני הוספת ריאגנט ניגודיות.
- כריך את ההרכבה כולה יחד כדי ליצור מארז אטום, מוחזק במקום מכני בתוך המחזיק על ידי 3 ברגים פליז(איור 2,לוחות 6-8).
- לאחר ההרכבה, קצה המחזיק נשאב ל-10-6 טור באמצעותתחנת שאיבה יבשה עם משאבת טורבו לפני הנחת המחזיק בתוך ה-TEM.
4. הדמיה בנוזל באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור
- טען את מחזיק הדגימה במקום למיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (FEI Company) המצויד בסיבי LaB6 ופועל במהירות של 120 kV.
- הפעל את חוט ה- TEM והתאם את הגובה האוצנטרי של שלב המיקרוסקופ ביחס לדגימה באמצעות פונקציית הרטט כדי להטות את המדגם מ- -15° ל- +15° הלוך ושוב בעמודה. הליך זה מתאים את השלב בכיוון z כדי לסייע להסביר את העובי הנכון של התא הנוזלי. שלב זה גם מבטיח שנעשה שימוש בהגדלה מדויקת בעת הקלטת תמונות.
- הקלט תמונות לאורך הקצוות ובאזורים הפינתיים של התא המיקרופלואידי תחילה. אזורים אלה מכילים בדרך כלל את הפתרון הדק ביותר. הקלט תמונות של דגימות בתנאים במינון נמוך (1-3 אלקטרונים / Å2) באמצעות מצלמת CCD. השתמש בהגדלות נומינליות של 6,000X - 30,000X.
- קבע את ערך ההיתוך הנכון על-ידי התמקדות בקצה התא הנוזלי. השתמש בערך של -1.5 מיקרומטר כדי להקליט תמונות בהגדלה של פי 30,000. אם יתקל בתמיסה עבה או אם לא נעשה שימוש בסוכן ניגודיות בהכנת הדגימה, השתמש בערכי defocus גבוהים יותר בטווח של -2 עד -4 מיקרומטר.
- כדי להבטיח שהפתרון ייכלל בתא המיקרופלואידי לאורך כל הניסויים, מקד את קרן האלקטרונים עד שהבועות ייווצרו בנוזל שבתוך המכשיר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמונות מייצגות של DLPs בנוזל באמצעות שבבי E ששוחררו בזוהר (איור 3A) מציגות פחות DLPs באזור צפייה נתון, ככל הנראה עקב דיפוזיה, בהשוואה ל- DLPs המועשרים במכשירי לכידת קירבה (איור 3B). התוספת של אורניל מתא ההדמיה משפרת את הניגודיות של הדגימה ומכאן את הנראות של DLPs בודדים בתמיסה (איור 3C, הלוח העליון). ניגודיות טובה יותר מאפשרת עיבוד תמונה במורד הזרם כגון ממוצע חלקיקים(איור 3C, לוח תחתון) ושגרות שחזור תלת-ממדיות(איור 3C, inset) כפי שתואר קודם לכן17. בקצרה, לשחזור 3D בחרנו 600 חלקיקים של DLPs באמצעות חבילת תוכנת SPIDER19. חלקיקים נבחרים היו מעודנים נגד מודל ראשוני של DLP rotavirus20 שסונן לרזולוציה 80 Å. השתמשנו בחבילת התוכנהRELION 21 כדי לחשב שחזור תלת מימדי ברזולוציה של כ 25 Å. מפת 3D שלנו בהסכמה טובה עם המודל הראשוני עם שחזור קריו-EM עצמאי שחושב באמצעות אותם פרמטרים מדגם DLP17.
איור 1. הכנת שבבי סיליקון ניטריד להדמיה נוזלית. A) שבבי סיליקון nitride מנוקים על ידי שקוע במשך 2 דקות באצטון ואחריו 2 דקות במתנול כדי להסיר פוטורסיסט שיורית המשמש בתהליך הייצור. B) דגימות מונולאייר השומנים מוכנות על טיפות מים מילי-Q שנוספו לפרפילם בצלחת פטרי לחה17. C) שבבים נקיים ממוקמים על גבי המונוליירים ומסירים לאחר צעד דגירה של דקה. D) מתאמים מולקולריים(כלומר חלבון A ונוגדנים בתמיסה) מתווספים ישירות לשבבים מצופים המונולאייר והפתרון העודף מוסר לפני הוספת DLPs. שבב הדגימה הרטובה נטען לאחר מכן למחזיק המיקרופלואידי.
איור 2. הרכבת התא הנוזלי של מחזיק דגימה מיקרופלואידית. קצה תא הדגימה מורכב על ידי הוספת אביזרי O-ring לקצה הריק (שלבים 1-2). שבב הדגימה הרטוב המכיל מרווחים משולבים ממוקם בעדינות לתוך אביזרי המכונה בקצה המחזיק (שלבים 3-4). שבב שטוח משוחרר זוהר ממוקם מעל שבב הדגימה (שלב 5). לאחר מכן ההרכבה מכוסה בלוח פנים מתכתי(שלב 6)המוחזק במקום על ידי 3 ברגים מפליז (שלבים 7-8).
איור 3. תוצאות מייצגות עבור DLPs בנוזל. A) שבבים משוחררים זוהר לאגד מעט מאוד DLPs בתמיסה בהשוואה שבבים מעוטרים זיקה (B). סרגלי קנה מידה, 2 מיקרומטר. C) תמונה מייצגת (לוח עליון) ושחזור תלת-ממדי (כניסה) של DLPs בנוזל המכיל מגיב ניגודיות. סרגל קנה מידה, 150 ננומטר. קוטר השחזור הוא 80 ננומטר. ממוצעי מחלקה של DLPs בנוזל (הלוח התחתון) לחשוף תכונות מוגדרות יפה לאורך פני השטח החיצוניים שלהם. לוחות בודדים הם 110 ננומטר.
איור 4. תוצאות מייצגות להיווצרות בועה בדגימות נוזליות ב- TEM. תמונות של בועות שנוצרו בדגימות נוזליות עם החשיפה המתמשכת של קרן האלקטרונים ב 5 אלקטרונים /Å 2 במשך כ 2 דקות (A) ו 5 דקות(B). סרגל קנה המידה הוא 100 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבודה המוצגת שלנו, השתמשנו בגישת לכידת הזיקה לקשור DLPs rotavirus לפלטפורמה מיקרופלואידית. זה איפשר הדמיה situ של קומפלקסים מקרומולקולריים במיקרו-וירוס נוזלי. גישת הלכידה היא משמעותית ביחס לטכניקות הדמיה מיקרופלואידיות אחרות מכיוון שהיא ממקמת דגימות ביולוגיות לחלון ההדמיה כדי לשלול בעיות דיפוזיביות גדולות המתעוררות בעת הקלטת תמונות בנוזל. עם זאת, אחד הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול שלנו כרוך בהעברת הביופילם של השומנים למשטח השבב. אם המונולאייר השומנים לא יצליח להתפשט באופן שווה על הרשת, זה יגרום לניסוי פגום. אינדיקציה לצעד העברה גרוע היא כי מעט עד שום הרכבות ויראלי יהיה קשור לשבב הנוזלי. מגבלה בשלב ההעברה היא יציבות תרמית המתייחסת לנזילות של שכבת השומנים. אם שלב ההעברה אינו מספק, כפי שהוערך על ידי התפשטות לא אחידה של הירידה, שכבות השומנים צריכות להדגיר על קרח זמן רב יותר או בחדר קר ללא רטט. כמו כן, צלחת פטרי חייב להיות אטום כראוי עם Parafilm כדי לשמור על הלחות הנכונה.
עודף של קומפלקסים ויראליים או חלבונים מתאם בדגימות שבב יכול להוביל קיבוץ מוגזם של החלקיקים. זוהי מגבלה בפרוטוקול שניתן לנהל בקלות. כדי למזער את אפקט הקיבוץ באשכולות, ניתן לדגור את גורמי החלבון לפרק זמן קצר יותר או לדלל עוד יותר את דגימת הנגיף. אם מתגלה עודף של חלבונים לא ספציפיים, הכללת imidazole שהוכן טרי (כ 50 מ"מ) בתמיסת החיץ יכול להקטין את הרקע. השימוש imidazole טרי הוא צעד מכריע בפרוטוקול. כמו כן, אין להעמיס על השבבים חלבונים מטוהרים שכן הדבר לא יבטיח כריכה ספציפית ויגרום לניסוי פגום. התמונות יכילו עודף של חלבוני רקע ולא יתאימו לשגרת עיבוד במורד הזרם. טווח ריכוז אופטימלי לחלבונים מטוהרים הוא בערך 0.01-0.1 מ"ג/מ"ל. עם זאת, אם טווח זה אינו מספק את הרמה הצפויה של חלקיקים, יש להגדיל את ריכוז המדגם עד שהושגה רמה אופטימלית. העשרה של חלקיקים נגיפיים צריכה להתרחש ביחס לדגימות בקרה שליליות חסרות מתאמים מולקולריים, כגון נוגדנים. כמויות קטנות של כריכה לא ספציפית בשליטה השלילית שלך עלולות להתרחש לעתים רחוקות, עם זאת, השבבים המעוטרים בזיקה צריכים תמיד לשמש להעשרת החלקיקים הנגיפיים. במקרה של rotavirus, אין כיום מערכת גנטית הפוכה כדי להציג את התגים שלו לתוך חלבונים capsid כאמצעי ישירות לכידת מתחמים ויראליים על משטחים מעוטרים Ni-NTA. ריבוזומים מתויגים שלו, לעומת זאת, גויסו בהצלחה מ lysates חיידקי על Ni-NTA מעוטר E-שבבים עבור ניסויים הדמיהנוזלית 16. לפיכך מתן ראיות, אם כי מוגבל בשלב זה, עבור אינטראקציות ביולוגיות יליד להתרחש בתאים נוזליים בעוד בעמודה TEM.
יש להימנע משימוש בחומרי ניקוי, גליצרול ורמות גבוהות של סוכרוז להדמיית situ. השימוש ריאגנטים אלה תיצור חפצים בתמונות EM הכוללים מבעבע מוגזם תכונות מושתקות בחלקיקים, וכתוצאה מכך תמונות באיכות ירודה. אם ריאגנטים אלה משמשים בהכנות וירוסים, ניתן לחייג את הדגימה לפתרון מאגר חסר רכיבים אלה. התקני לכידת קירבות יכולים לעמוד במידה מסוימת של חומרי ניקוי לתקופה קצרה של זמן, אם כי זה צריך להיקבע על בסיס כל מקרה לגופו. נא עיין ברשימת ריאגנטים תואמים שתוארו בעבר22.
כדי לאפשר רוטינות עיבוד תמונה במורד הזרם, ניתן להוסיף ריכוז נמוך של ריאגנט ניגודיות לתא המיקרופלואידי. מגיב זה אינו מתקן דגימות חלבון, כמו הליכי הכתמה מסורתיים17. כדי להבטיח שהנוזל נמצא בתא ההדמיה לאורך כל מהלך הניסויים, מקד את קרן האלקטרונים עד שתתרחש היווצרות בועה (איור 4). זהו מדד פשוט כדי לציין את הדגימות להישאר hydrated. דגימות נוזליות נתקלות בנזק חמור בתוך 2 דקות (איור 4A) של חשיפה מתמשכת של קרן האלקטרונים ב 5 אלקטרונים / Å2. חשיפה ממושכת לקרן אלקטרונים רציפה למשך 5 דקות (איור 4B) ומעבר לכך במינון זה תגרום להיווצרות בועה מוגזמת באזור ההדמיה.
באתרו מיקרוסקופ מולקולרי המשמש בשילוב עם התקני לכידת זיקה מאפשר בדיקה של קומפלקסים ביולוגיים בתמיסה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. פיתוחים טכניים אלה מתאפשרים על ידי שימוש במחזיקי דגימה מיקרופלואידית שפותחו לאחרונה. מכשירים כאלה משתמשים בקרומי סיליקון ניטריד דקים כדי ליצור תא הדמיה מיקרו-קנה מידה. בהתבסס על העבודה החלוצית של פרסונס ועמיתיו7-10 אנו מספקים אסטרטגיה שימושית כדי לדמות הרכבות ויראליות בודדות בפתרון. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר מתודולוגיות התואמות לשגרת עיבוד תמונה של חלקיק יחיד ולחישובי שחזור תלת-ממדי. יישומים עתידיים הנובעים מאסטרינג טכניקות אלה עשויים לכלול הדמיה LIVE-EM של מקרומולקולות. אנו צופים כי בהדמיית situ עשויים לחשוף צעדים להרכבה ויראלית, תקנת שעתוק או פלישה לתאים מארחים. לסיכום, השימוש בפרוטוקולים אלה אמור לאפשר לחוקרים לחקור תהליכים דינמיים בפתרון באופן חדש לחלוטין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברת, מדלין ג'יי דיוקס, היא עובדת של פרוטוצ'יפס בע"מ.
Acknowledgments
המחברים מכירים ד"ר מייקל ג 'פרידלנדר, מנהל מכון המחקר וירג'יניה טק Carilion לעידוד מאמצי המחקר שלנו. פרויקט זה נתמך על ידי קרנות פיתוח ל- S.M.M ו- D.F.K. ובחלקו על ידי יוזמת ננו-ביו של המכון לטכנולוגיה קריטית ומדע יישומי בווירג'יניה טק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
References
- Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
- Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C.
- Dubochet, J., et al.
- Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R.
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
- Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
- Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
- Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
- Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
- Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
- Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).
