Summary
Здесь мы описываем процедуру изображения вирусных комплексов в жидкости при разрешении нанометров с помощью электронного микроскопа передачи.
Abstract
Исследователи регулярно используют радиоэлектронные микроскопы (ТЭМ) для изучения биологических сущностей и оценки новых материалов. Здесь мы описываем дополнительное приложение для этих инструментов - просмотр вирусных сборок в жидкой среде. Этот захватывающий и новый метод визуализации биологических структур использует недавно разработанный микрофлюидный держатель образца. Наша видео статья демонстрирует, как собрать и использовать микрофлюидный держатель для изображения жидких образцов в TEM. В частности, в качестве нашей модельной системы мы используем симианские ротавирусные двухслойные частицы (DLPs). Мы также описываем шаги, чтобы покрыть поверхность жидкой камеры с сродством биопленок, которые привязывают DLPs к окну просмотра. Это позволяет нам изображения сборки таким образом, что подходит для определения 3D-структуры. Таким образом, мы представляем первый взгляд на подвирусные частицы в родной жидкой среде.
Introduction
Общей целью биологов и инженеров является понимание внутренней работы молекулярных машин. Передача Электронные микроскопы (ТЭМ) являются идеальными инструментами для визуализации этих сложных деталей при почти атомномразрешении 1-2. Для того, чтобы поддерживать высокую вакуумную систему TEM, биологические образцы, как правило, встроенные в тонкие пленки стекловидногольда 3,сахара 4, солитяжелых металлов 5, или некоторые комбинациииз них 6. В результате изображения встроенных образцов могут выявить лишь ограниченные снимки динамических процессов.
Ранние попытки сохранить биологические образцы гидратированных в экологических жидких камерах были предприняты Парсонс и его коллеги с использованием дифференциальных этапов перекачки. Электронные дифракционные узоры неоближенных кристаллов каталазы были успешно записаны с разрешением 3 евро в гидратированномсостоянии 7-8. Кроме того, фазополученные липидные области могут быть исследованы в гидратированных мембранахэритроцитов человека 9-10. Однако движение, вызванное распространением жидкости и ее вмешательством в электронный луч, привело к серьезной потере разрешения, и дальнейшие эксперименты с использованием биологических образцов не были предприняты до недавнего времени.
Недавно были введены недавно разработанные держатели микрофлюидных образцов, которые используют полупроводниковые микрочипы для формирования микро-масштабной экологической камеры. Эти устройства могут поддерживать образцы в жидкости, пока они расположены в столбцеTEM 11-12. Этот технический прорыв в визуализации TEM позволил исследователям впервые просмотреть прогрессивные события на молекулярном уровне13. Мы называем эту новую модальность«молекулярной микроскопией на месте», так как эксперименты теперь могут проводиться «внутри» столбца14-15. Общая цель этого метода заключается в изображении биологических сборок в жидкости для того, чтобы наблюдать их динамическое поведение при разрешении нанометра. Смысл разработанной методики заключается в том, чтобы записывать наблюдения в режиме реального времени и изучать новые свойства биологического механизма в растворе. Эта методология расширяет использование ТЭМ для более широких целей в клеточной и молекулярнойбиологии 12-16.
В текущей видео-статье мы представляем всеобъемлющий протокол для сборки и использования коммерчески доступного держателя микрофлюидных образцов. Эти специализированные держатели используют микрочипы кремния нитрида, произведенные с интегрированными проме сторонами, чтобы сформировать жидкую камеру, которая заключает мельчайшие объемы раствора. Тонкие прозрачные окна выгравированы в микрочипах для целей визуализации12. Мы демонстрируем правильное использование микрофлюидного держателя для изучения симиановых ротавирусных двухслойных частиц (DLPs) в жидкости с помощью TEM. Для обеспечения того, чтобы биологические сборки, такие как DLPs, не быстро рассеиваются на большие расстояния во время визуализации, мы используем подход Affinity Capture, чтобы привязать их к поверхности микрофлюиднойкамеры 16. Этот молекулярный шаг захвата имеет большое преимущество перед альтернативными методами для визуализации биологических образцов в жидкости, поскольку он позволяет приобретение изображений, которые будут использоваться для обработки вниз по течению процедур. Этот шаг захвата, используемый в сочетании с микрофлюидной визуализацией, уникален для нашихпроцедур 17. Читатели, использующие структурные биологические приложения с использованием TEM или микрофлюидных камер визуализации, могут рассмотреть вопрос об использовании методов сродства захвата, когда динамические наблюдения на молекулярном уровне являются конечной целью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Affinity Захват устройства16
- Очистите кремниевые нитридные E-чипы, инкубируя их в 15 мл ацетона в течение 2 мин, а затем 15 мл метанола в течение 2 мин (Рисунок 1A). Разрешить чипы высохнуть под ламинарным потоком воздуха.
- Инкубировать сушеные чипсы на нагретой тарелке перемешать (без перемешивания) в течение 1,5 часа при температуре 150 градусов по Цельсию, а затем дать им остыть до комнатной температуры перед использованием.
- Используйте шприцы Гамильтона для составления липидных смесей в маленьких стеклянных трубках, чтобы содержать 25% хлороформа, 55% DLPC (1,2-дилауроил-фосфохолин) в хлороформе (1 мг/мл) и 20% липид ni-NTA (1,2-диолеоил-иминодиадиатический кислотно-сукцинил-никелевая соль) в хлороформе (1 мг/мл) при общем объеме 40 л.
- Нанесите 1 зл алицит смеси на каждую каплю воды Милли-З на кусок Парафильма во влажной чашке Петри(рисунок 1B). Инкубация образцов на льду не менее 60 мин.
2. Захват макромолекул17
- Поместите E-чип с интегрированным спейсером 150 нм поверх образца монослой и инкубировать в течение 1 мин(рисунок 1С).
- Аккуратно свяжите чип с образца и добавьте 3 йл алицита его помеченного белка A. Incubate в течение 1 мин при комнатной температуре(рисунок 1D).
- Пятно от избыточного падения с помощью Whatman #1 фильтровальной бумаги и сразу же добавить 3 йл aliquot раствора антител. Инкубация в течение 1 мин при комнатной температуре.
- Удалите избыток раствора с помощью шприца Гамильтона и немедленно добавьте 1 йл алицит ротавирусных DLPs (0,1 мг/мл) в буферный раствор, содержащий 50 мМ HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 и 10 mM CaCl2. Инкубация в течение не менее 2 минут при комнатной температуре. Подготовка DLPs была описана ранее18.
3. Соберите микрофлюидную камеру и загрузите держателя образца in situ
- Загрузите мокрый E-чип, содержащий вирусный образец, в кончик держателя микрофлюидного образца. Свечение разряда второй плоский E-чип в течение 1 мин, а затем загружены на верхней части чипаспейсера (рисунок 2, панели 1-5).
- Кроме того, для увеличения контрастности биологических макромолекул, тяжелых металлических пятен (например,0,2% уранал-мэта) можно добавить к влажным образцам до размещения второго E-чипа на мокром образце. Тем не менее, E-чип, содержащий образец, должен быть промыт водой Милли-З до добавления контрастного реагента.
- Сэндвич всю сборку вместе, чтобы сформировать запечатанный корпус, удерживаемый на месте механически в держатель на 3 латунныхвинта (рисунок 2, панели 6-8).
- После сборки кончик держателя перекачивается до 10-6 Torr с помощью турбо-накачиваемой сухой насосной станции перед размещением держателя внутри TEM.
4. Изображение в жидкости с помощью электронного микроскопа передачи
- Загрузите держатель образца in situ в электронный микроскоп передачи (компания FEI), оснащенный нитью LaB6 и работающий на 120 кВ.
- Включите нить TEM и отрегулируйте эвцентрическую высоту стадии микроскопа по отношению к образцу, используя функцию воблера, чтобы наклонить образец от -15 до 15 градусов взад и вперед в столбце. Эта процедура регулирует этап в z-направлении, чтобы помочь объяснить правильную толщину жидкой камеры. Этот шаг также обеспечивает точное увеличение используется при записи изображений.
- Запись изображений по краям и в угловых областях микрофлюидной камеры в первую очередь. Эти области обычно содержат тончайшее решение. Запись изображений образцов в условиях низких доз (1-3 электрона /No 2) с помощью камеры CCD. Используйте номинальные увеличения 6000X - 30,000X.
- Определите правильное значение дефокуса, сосредоточив внимание на краю жидкой камеры. Используйте значение -1,5 мкм для записи изображений при увеличении на 30 000X. Если при подготовке образца не используется толстый раствор или если контрастный агент не используется, используйте более высокие значения дефокуса в диапазоне от -2 до -4 мкм.
- Чтобы обеспечить раствор, содержащийся в микрофлюидной камере на протяжении всех экспериментов, сосредоточьте электронный луч до тех пор, пока пузырьки не образуются в жидкости внутри устройства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативные изображения DLPs в жидкости с использованием E-чипов, которые были светятся разрядки (Рисунок 3A) показывают меньше DLPs в данной области просмотра, предположительно из-за диффузии, по сравнению с DLPs, которые обогащены на устройствах Affinity Capture (Рисунок 3B). Добавление уранила-formate в камеру визуализации повышает контрастность образца и, следовательно, видимость отдельных DLPs в растворе(рисунок 3C, верхняя панель). Лучший контраст позволяет вниз по течению обработки изображений, таких какусреднение частиц (рисунок 3C, нижняя панель) и 3D реконструкции процедур(рисунок 3C, вставка), какописано ранее 17. Короче говоря, для 3D-реконструкции мы выбрали 600 частиц DLPs с помощью пакета программного обеспечения SPIDER19. Выбранные частицы были усовершенствованы на основе первоначальной модели ротавируса DLP20, которая была отфильтрована до 80 разрешений. Мы использовали пакет программного обеспечения RELION21 для вычисления 3D-реконструкции с разрешением примерно 25 евро. Наша 3D карта в хорошем согласии с первоначальной моделью и с независимой крио-EM реконструкции, которая была рассчитана с использованием тех же параметров и DLPобразца 17.
Рисунок 1. Подготовка микрочипов кремниевых нитридов для жидкой визуализации. )Микрочипы кремниевого нитрида очищаются путем погружения в течение 2 мин в ацетоне, а затем 2 мин в метаноле для удаления остаточного фоторезист, используемого в процессе производства. B) Липидный монослойные образцы готовятся на каплях воды Милли-З, добавленной в Parafilm во влажной чашкеПетри 17. C) Очищенные микрочипы помещаются поверх монослой и удаляются после 1 мин инкубации шаг. D) Молекулярные адаптеры(т.е. белок А и антитела в растворе) добавляются непосредственно к монослойным чипам с покрытием, а избыток раствора удаляется до добавления DLPs. Влажный чип образца затем загружается в микрофлюидный держатель.
Рисунок 2. Сборка жидкой камеры держателя микрофлюидного образца. Кончик камеры образца собирается путем добавления фитингов O-кольца к пустому кончику (шаги 1-2). Влажный чип образца, содержащий интегрированные спейсеры, аккуратно помещается в обуговители в кончике держателя (шаги 3-4). Над верхней частью чипа образца (шаг 5) помещается разряженный свечениями плоский чип. Сборка затем покрыта металлической лицом пластины(шаг 6), который проводится на месте 3 латунные винты (шаги 7-8).
Рисунок 3. Репрезентативные результаты для DLPs в жидкости. A) Светящиеся микрочипы связывают очень мало DLPs в растворе по сравнению с микрочипами, украшенными сродством(B). Шкала баров, 2 мкм. C)Представительное изображение (верхняя панель) и 3D-реконструкция (вставка) DLPs в жидкости, содержащей контрастный реагент. Шкала бар, 150 нм. Диаметр реконструкции составляет 80 нм. Средние классы DLPs в жидкости (нижняя панель) показывают красиво определенные особенности вдоль их внешней поверхности. Индивидуальные панели 110 нм.
Рисунок 4. Репрезентативные результаты формирования пузырьков в жидких образцах в TEM. Изображения пузырьков, образовавав в жидких образцах при непрерывном воздействии электронного луча на5 электронов/No 2 в течение примерно 2 мин (A) и 5 мин (B). Масштабная планка составляет 100 нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В нашей представленной работе мы использовали подход к захвату сродства, чтобы привязать ротавирусные DLPs к микрофлюидной платформе. Это позволило на месте изъястить макромолекулярные комплексы в жидкой микрооквидеоронии. Подход к захвату имеет важное значение по отношению к другим методам микрофлюидной визуализации, поскольку он локализует биологические образцы в окне изображения, чтобы свести на нет большие диффузные проблемы, возникающие при записи изображений в жидкости. Однако одним из важнейших шагов в нашем протоколе является перенос липидной биопленки на поверхность микрочипа. Если липидный монослой не сможет равномерно распространиться по сетке, это приведет к дефекту эксперимента. Признаком плохого шага передачи является то, что практически нет вирусных сборок будет связан с жидким чипом. Ограничением в этапе передачи является тепло стабильность, которая относится к текучести липидного слоя. Если шаг переноса является недостаточным, как оценивается неравномерным распространением капли, липидные слои должны инкубировать на льду дольше или в свободном от вибрации холодном помещении. Кроме того, чашка Петри должна быть адекватно запечатана с Parafilm для поддержания надлежащей влажности.
Избыток вирусных комплексов или белков адаптера в образцах микрочипов может привести к чрезмерной кластеризации частиц. Это ограничение в протоколе, которым легко управлять. Чтобы свести к минимуму эффект кластеризации, белковые факторы могут быть инкубированы в течение более короткого периода времени или образец вируса должен быть дополнительно разбавлен. При обнаружении избытка неспецифических белков включение свежеприготовленного имидазола (примерно 50 мМ) в буферный раствор может уменьшить фон. Использование свежего имидазола является важным шагом в протоколе. Кроме того, не перегружайте чипсы очищенными белками, так как это не обеспечит специфической привязки и приведет к некорректному эксперименту. Изображения будут содержать избыток фоновых белков и не подойдут для обработки вниз по течению. Оптимальный диапазон концентрации очищенных белков составляет примерно 0,01-0,1 мг/мл. Однако, если этот диапазон не обеспечивает ожидаемого уровня частиц, концентрация выборки должна быть увеличена до достижения оптимального уровня. Обогащение вирусных частиц должно происходить в отношении отрицательных образцов контроля, которые не имеют молекулярных адаптеров, таких как антитела. Небольшое количество неспецифических связывания в вашем отрицательном контроле может нечасто происходить, однако, сродство украшенные микрочипы всегда должны служить для обогащения вирусных частиц. В случае ротавируса, в настоящее время нет обратной генетической системы, чтобы ввести его теги в капсид белков в качестве средства непосредственно захвата вирусных комплексов на Ni-NTA украшенных поверхностей. Его помеченные рибосомы, однако, были успешно набраны из бактериальных лизатов на Ni-NTA украшенные E-чипы для жидких экспериментов изображений16. Таким образом, предоставление доказательств, хотя и ограничено на данный момент, для местных биологических взаимодействий происходит в жидких клетках в то время как в столбце TEM.
Следует избегать использования моющих средств, глицерола и высокого уровня сахарозы для визуализации на месте. Использование этих реагентов создаст артефакты в EM изображениях, которые включают в себя чрезмерное восходящей и приглушенные функции в частицах, в результате чего низкое качество изображений. Если эти реагенты используются в подготовке вируса, образец может быть dialyzed в буферное решение не хватает этих компонентов. Устройства Affinity Capture могут выдерживать определенную степень моющих средств в течение короткого периода времени, хотя это должно быть определено на каждом конкретном случае. Пожалуйста, обратитесь к списку совместимых реагентов, ранее описанных22.
Для обеспечения обработки изображений ниже по течению в микрофлюидную камеру может быть добавлена низкая концентрация контрастного реагента. Этот реагент не фиксирует образцы белка, как традиционные процедуры окрашивания17. Чтобы обеспечить, чтобы жидкость присутствовала в камере визуализации в течение всего времени экспериментов, сосредоточьте электронный луч до образования пузыря(рисунок 4). Это простая мера, указывающая на то, что образцы остаются обезвоженными. Образцы жидкости сталкиваются с серьезными повреждениями в течение2 минут (рисунок 4A) непрерывного разоблачения электронного луча на 5 электронов/No 2. Длительное непрерывное воздействие электронного луча в течение 5 мин (рисунок 4B) и за его пределами в этой дозировке приведет к чрезмерному образованию пузырьков в области изображения.
На месте молекулярная микроскопия, используемая в сочетании с устройствами Affinity Capture, позволяет изукомить биологические комплексы в растворе с использованием трансмиссионной электронной микроскопии. Эти технические достижения возможны благодаря использованию недавно разработанных микрофлюидных держателей образцов. Такие устройства используют тонкие кремниевые нитридные мембраны для формирования микро-масштабной камеры визуализации. Опираясь на новаторскую работу Parsons и коллег7-10, мы предоставляем полезную стратегию для изображения отдельных вирусных сборок в растворе. В описанном здесь протоколе разъясняются методологии, совместимые с режимами обработки изображений отдельных частиц и расчетами 3D-реконструкции. Будущие приложения, которые будут результатом освоения этих методов может включать в себя живой EM изображения макромолекул. Мы ожидаем, что на месте изображения могут выявить шаги для вирусной сборки, транскрипции регулирования или вторжения клеток-хозяина. Таким образом, использование этих протоколов должно позволить исследователям исследовать динамические процессы в решении совершенно по-новому.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор, Мадлен J. Герцоги, является сотрудником Protochips, Inc.
Acknowledgments
Авторы признают д-р Майкл J. Фридландер, директор Вирджинии Tech Carilion научно-исследовательский институт для поощрения наших научных усилий. Этот проект был поддержан фондами развития S.M.M и D.F.K., а также частично инициативой Nano-Bio Института критических технологий и прикладных наук в Virginia Tech.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
References
- Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
- Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
- Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
- Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
- Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
- Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
- Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
- Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
- Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).
