Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

På stedet TEM af biologiske samlinger i væske

Published: December 30, 2013 doi: 10.3791/50936
Automatic Translation
*1, *2, *2, 2, 2
1Applications Science, Protochips, Inc., 2Virginia Tech Carilion Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en procedure for at billedet virale komplekser i væske ved nanometer opløsning ved hjælp af en transmission elektron mikroskop.

Abstract

Forskere bruger regelmæssigt Transmission Electron Microscopes (TEMs) til at undersøge biologiske enheder og til at vurdere nye materialer. Her beskriver vi en ekstra applikation til disse instrumenter - visning af virale samlinger i et flydende miljø. Denne spændende og nye metode til visualisering af biologiske strukturer anvender en nyligt udviklet mikrofluidisk-baseret prøveholder. Vores videoartikel viser, hvordan man samler og bruger en mikrofluidisk holder til at afbilde flydende prøver inden for en TEM. Vi bruger især simian rotavirus dobbeltlagspartikler (DDP'er) som vores modelsystem. Vi beskriver også trin til at belægge overfladen af det flydende kammer med affinitetsbiofilm, der bindes DDLP'er til visningsvinduet. Dette giver os mulighed for at billedsamlinger på en måde, der er egnet til bestemmelse af 3D-struktur. Således præsenterer vi et første glimt af subvirale partikler i et indfødt flydende miljø.

Introduction

Et fælles mål for biologer og ingeniører er at forstå de indre funktioner af molekylære maskiner. Transmission Electron Mikroskoper (TEMs) er ideelle instrumenter til at visualisere disse indviklede detaljer på nær-atomare opløsning1-2. For at opretholde et TEM's høje vakuumsystem er biologiske prøver typisk indlejret i tynde film af glasagtig is3, sukker4, tungmetalsalte5eller en kombinationheraf 6. Som følge heraf kan billeder af indlejrede prøver kun afsløre begrænsede snapshots af dynamiske processer.

Tidlige forsøg på at opretholde biologiske prøver hydreret i miljømæssige flydende kamre blev udført af Parsons og kolleger ved hjælp af differentialpumpestadier. Elektron diffraktion mønstre af uhæmmet katalase krystaller blev med succes registreret til en opløsning på 3 Å i en hydreret tilstand7-8. Derudover kunne faseseparerede lipiddomæner undersøges i hydrerede membraner af menneskelige erythrocytter9-10. Men bevægelse forårsaget af spredende væske og dens interferens med elektronstrålen, resulterede i alvorlige opløsning tab og yderligere forsøg med biologiske prøver blev ikke forsøgt indtil for nylig.

Nyudviklede mikrofluidiske prøveholdere er blevet introduceret, der bruger halvledermikrochips til at danne et mikroskaleret miljøkammer. Disse anordninger kan opretholde prøver i væske, mens de er placeret i en TEMkolonne 11-12. Dette tekniske gennembrud i TEM-billeddannelse har gjort det muligt for forskere for første gang at se progressive begivenheder på molekylært niveau13. Vi henviser til denne nye modalitet som"in situ molekylær mikroskopi", som eksperimenter nu kan udføres "inde" EM kolonne14-15. Det overordnede mål med denne metode er at billedet biologiske forsamlinger i væske for at observere deres dynamiske adfærd ved nanometer opløsning. Rationalet bag den udviklede teknik er at registrere realtidsobservationer og undersøge nye egenskaber ved biologiske maskiner i opløsning. Denne metode udvider brugen af TEMs til bredere formål inden for cellulær og molekylær biologi12-16.

I den aktuelle videoartikel præsenterer vi en omfattende protokol til at samle og bruge en kommercielt tilgængelig mikrofluidisk prøveholder. Disse specialiserede holdere bruger siliciumnitridmikrochips produceret med integrerede afstandsstykke til at danne et flydende kammer, der omslutter små mængder opløsning. Tynde, gennemsigtige vinduer ætses ind i mikrochips tilbilledbehandlingsformål 12. Vi demonstrerer korrekt brug af en mikrofluidisk holder til at undersøge simian rotavirus dobbeltlagspartikler (DDLP'er) i væske ved hjælp af en TEM. For at sikre, at biologiske samlinger, såsom DDLP'er, ikke hurtigt spredes over store afstande, mens vi billeddannelse, anvender vi Affinity Capture-tilgangen til at binde dem til overfladen af det mikrofluidiske kammer16. Dette molekylære indfangningstrin har en stor fordel i forhold til alternative teknikker til billeddannelse af biologiske prøver i væske, fordi det giver mulighed for erhvervelse af billeder, der vil blive brugt til downstream-behandlingsrutiner. Dette indfangningstrin, der bruges sammen med mikrofluidisk billeddannelse, er unikt for vores procedurer17. Læsere, der anvender strukturelle biologiapplikationer ved hjælp af TEM eller mikrofluidiske billeddannelseskamre, kan overveje brugen af affinitetsfangeteknikker, når dynamiske observationer på molekylært niveau er det endelige mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered affinitetsregistreringsenheder16

  1. Siliciumnitrid E-chips renses ved at inkubere dem i 15 ml acetone i 2 minutter efterfulgt af 15 ml methanol i 2 min. Lad spånerne tørre under laminar luftstrømmen.
  2. De tørrede spåner inkuberes på en opvarmet omrøringsplade (uden omrøring) i 1,5 timer ved 150 °C, hvorefter de afkøles til stuetemperatur før brug.
  3. Brug Hamilton sprøjter til at komponere lipid blandinger i små glasrør til at indeholde 25% kloroform, 55% DLPC (1,2-dilauroyl-phosphocholine) i chloroform (1 mg/ml) og 20% Ni-NTA lipid (1,2-dioleoyl-iminodiacetic acid-succinyl-nikkel salt) i chloroform (1 mg/ml) for et samlet volumen på 40 μl.
  4. Påfør en 1 μl aliquot af blandingen over hver 15 μl dråbe Milli-Q vand på et stykke parafilm i en fugtig petriskål (Figur 1B). Inkuber prøver på is i mindst 60 min.

2. Indfang makromolekyler17

  1. Placer en E-chip med en 150 nm integreret afstandsstykke oven på en monolagsprøve, og inkuber i 1 min.
  2. Spånen løftes forsigtigt af prøven, og der tilsættes en 3 μl aliquot af his-mærket protein A. Inkuberes i 1 min ved stuetemperatur (Figur 1D).
  3. Udvis det overskydende fald ved hjælp af Whatman #1 filtrerpapir og tilsæt straks en 3 μl aliquot antistofopløsning. Inkuber i 1 min ved stuetemperatur.
  4. Den overskydende opløsning fjernes ved hjælp af en Hamilton-sprøjte, og der tilsættes straks en 1 μl aliquot rotavirus-DDLP'er (0,1 mg/ml) i bufferopløsning, der indeholder 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 og 10 mM CaCl2. Inkuber i mindst 2 minutter ved stuetemperatur. Udarbejdelsen af DDLP'er er tidligere beskrevet18.

3. Saml det mikrofluidiske kammer, og lad in situ-prøveholderen

  1. Den våde E-chip, der indeholder virusprøven, hældes i spidsen af den mikrofluidiske prøveholder. Glow-udledning en anden flad E-chip i 1 min derefter læsset på toppen af afstandschippen(Figur 2, paneler 1-5).
  2. Alternativt kan der for at øge kontrasten mellem biologiske makromolekyler tilsættes tungmetalplet(f.eks. 0,2% uranylformat) til våde prøver, inden den anden E-chip placeres på den våde prøve. Den E-chip, der indeholder prøven, skal dog vaskes med Milli-Q-vand, før kontrastreagenset tilsættes.
  3. Klem hele samlingen sammen for at danne et forseglet kabinet, der holdes mekanisk på plads i holderen af 3 messingskruer(Figur 2, paneler 6-8).
  4. Efter montering pumpes holderens spids til 10-6 Torr ved hjælp af en turbopumpet tør pumpestation, før holderen placeres inde i TEM.

4. Billeddannelse i væske ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop

  1. Bærrenser på stedet indlæses i et transmissionselektronmikroskop (FEI Company), der er udstyret med en LaB 6-glødetråd, og som arbejder ved 120 kV.
  2. Tænd TEM-glødetråden, og juster mikroskopstadiets eucentriske højde i forhold til prøven ved at bruge wobblerfunktionen til at vippe prøven fra -15° til +15° frem og tilbage i kolonnen. Denne procedure justerer scenen i z-retningen for at hjælpe med at tage højde for den korrekte tykkelse af væskekammeret. Dette trin sikrer også, at der bruges en nøjagtig forstørrelse ved optagelse af billeder.
  3. Optag billeder langs kanterne og i hjørneområderne i det mikrofluidiske kammer først. Disse områder indeholder typisk den tyndeste løsning. Optag billeder af prøver under lavdosisforhold (1-3 elektroner/Å2)ved hjælp af et CCD-kamera. Brug nominelle forstørrelser på 6.000X - 30.000X.
  4. Bestem den korrekte defokusværdi ved at fokusere på kanten af fluidic kammer. Brug en værdi på -1,5 μm til at optage billeder ved 30.000X forstørrelse. Hvis der opstår tyk opløsning, eller hvis der ikke anvendes kontraststof i prøveforberedelsen, skal der anvendes højere defokuseringsværdier i området -2 til -4 μm.
  5. For at sikre, at opløsningen er indeholdt i det mikrofluidiske kammer under hele forsøgene, skal du fokusere elektronstrålen, indtil boblerne dannes i væsken i enheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative billeder af DDLP'er i væske ved hjælp af E-chips, der blev glødeafladet (Figur 3A), viser færre DDLP'er i et givet visningsområde, formentlig på grund af diffusion, sammenlignet med DDLP'er, der er beriget på Affinity Capture-enheder (Figur 3B). Tilsætningen af uranylformat i billedkammeret øger prøveemnets kontrast og dermed synligheden af individuelle DDLP'er i opløsning (Figur 3C, øverste panel). Bedre kontrast giver mulighed for downstream-billedbehandling, f.eks. Kort, for 3D-rekonstruktionen valgte vi 600 partikler af DDP'er ved hjælp af SPIDER-softwarepakken19. Udvalgte partikler blev raffineret mod en indledende model af rotavirus DLP20, der blev filtreret til 80 Å opløsning. Vi brugte RELION-softwarepakken21 til at beregne en 3D-rekonstruktion med en opløsning på ca. 25 Å. Vores 3D-kort i god overensstemmelse med den oprindelige model og med en uafhængig kryo-EM-rekonstruktion, der blev beregnet ved hjælp af de samme parametre og DLP-prøve17.

Figure 1
Figur 1. Forberedelse siliciumnitrid mikrochips til flydende billeddannelse. A)Siliciumnitridmikrochips rengøres ved nedsænkning i 2 min. i acetone efterfulgt af 2 min. i methanol for at fjerne restfotoresist, der anvendes i fremstillingsprocessen. B)Lipid monolayerprøver fremstilles på dråber Milli-Q vand tilsat Parafilm i en fugtig petriskål17. C) Rensede mikrochips placeres oven på monolayers og fjernes efter et 1 min inkubationstrin. D) Molekylære adaptere (dvs. protein A og antistoffer i opløsning) tilsættes direkte til de monolagsbelagte chips, og den overskydende opløsning fjernes, inden der tilsættes DDLP'er. Den våde prøvechip indlæses derefter i den mikrofluidiske holder.

Figure 2
Figur 2. Samling af væskekammeret på en mikrofluidisk prøveholder. Spidsen af prøvekammeret samles ved at tilføje O-ringbeslag til den tomme spids (trin 1-2). Den våde prøvechip, der indeholder integrerede afstandsstykker, placeres forsigtigt i de bearbejdede beslag i holderens spids (trin 3-4). En glødafladet flad chip placeres over toppen af prøvechippen (trin 5). Samlingen er derefter dækket med en metal ansigtsplade (trin 6), der holdes på plads af 3 messingskruer (trin 7-8).

Figure 3
Figur 3. Repræsentative resultater for DDLP'er i væske. A)Glødeudledte mikrochips binder meget få DDLP'er i opløsning i forhold til affinitetsdekorerede mikrochips (B). Skalastænger, 2 μm. C) Repræsentativt billede (øverste panel) og 3D-rekonstruktion (indsat) af DDLP'er i væske indeholdende kontrastreagens. Skala bar, 150 nm. Diameteren af rekonstruktionen er 80 nm. Klasse gennemsnit af DDLP'er i flydende (bundpanel) afslører pænt definerede funktioner langs deres ydre overflade. Individuelle paneler er 110 nm.

Figure 4
Figur 4. Repræsentative resultater for bobledannelse i flydende prøver i TEM. Billeder af bobler dannet i flydende prøver ved elektronstrålens kontinuerlige eksponering ved 5 elektroner/Å2 i ca. 2 min (A) og 5 min (B). Skalalinjen er 100 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I vores præsenterede arbejde anvendte vi affinitetsfangstmetoden til at binde rotavirus-DLL'er til en mikrofluidisk platform. Dette gjorde det muligt at in situ billeddannelse af makromolekylære komplekser i et flydende mikromiljø. Fangstmetoden er vigtig med hensyn til andre mikrofluidiske billeddannelsesteknikker, fordi den lokaliserer biologiske prøver til billedvinduet for at ophæve store diffusive problemer, der opstår, mens du optager billeder i væske. Men et af de mest kritiske trin i vores protokol indebærer overførsel af lipidbiofilmen til mikrochipoverfladen. Hvis lipidmonologen ikke spredes jævnt over nettet, vil dette resultere i et fejlbehæftet eksperiment. En indikation af et dårligt overførselstrin er, at lidt til ingen virale samlinger vil være bundet til den flydende chip. En begrænsning i overførselstrinnet er termisk stabilitet i forhold til lipidlagets fluiditet. Hvis overførselstrinnet er utilstrækkeligt, som vurderet ved ujævn spredning af dråben, skal lipidlagene inkuberes på is længere eller i et vibrationsfrit kølerum. Petriskålen skal også forsegles tilstrækkeligt med Parafilm for at opretholde den rette fugtighed.

Et overskud af virale komplekser eller adapterproteiner i mikrochipprøverne kan føre til overdreven klyngedannelse af partiklerne. Dette er en begrænsning i protokollen, der let kan administreres. For at minimere klyngeeffekten kan proteinfaktorerne inkuberes i en kortere periode, eller virusprøven skal fortyndes yderligere. Hvis der påvises et overskud af uspecifikke proteiner, kan inkluderingen af frisklavet imidazol (ca. 50 mM) i bufferopløsningen reducere baggrunden. Brugen af frisk imidazol er et afgørende skridt i protokollen. På samme måde må du ikke overbelaste chipsene med rensede proteiner, da dette ikke vil sikre specifik binding og vil resultere i et fejlbehæftet eksperiment. Billeder vil indeholde et overskud af baggrundsproteiner og vil ikke være egnet til downstream-behandlingsrutiner. Et optimalt koncentrationsområde for rensede proteiner er ca. 0,01-0,1 mg/ml. Hvis dette interval ikke giver det forventede partikelniveau, bør koncentrationen af prøven dog øges, indtil der er opnået et optimalt niveau. Der bør forekomme en berigelse af viruspartikler med hensyn til negative kontrolprøver, der mangler molekylære adaptere, såsom antistoffer. Små mængder af uspecifik binding i din negative kontrol kan sjældent forekomme, men den affinitet-dekoreret mikrochips bør altid tjene til at berige den virale partikler. I tilfælde af rotavirus er der i øjeblikket ikke noget omvendt genetisk system til at introducere hans tags i kapsidproteiner som et middel til direkte at fange virale komplekser på Ni-NTA dekorerede overflader. Hans-mærkede ribosomer er imidlertid med succes blevet rekrutteret fra bakteriel lysater på Ni-NTA dekoreret E-chips til flydende billeddannelse eksperimenter16. Således giver beviser, om end begrænset på dette punkt, for indfødte biologiske interaktioner at forekomme i flydende celler, mens i en TEM kolonne.

Brug af vaske- og rengøringsmidler, glycerol og høje niveauer af saccharose skal undgås ved in situ-billeddannelse. Brugen af disse reagenser vil skabe artefakter i EM-billeder, der omfatter overdreven boblende og dæmpede funktioner i partikler, hvilket resulterer i billeder af dårlig kvalitet. Hvis disse reagenser anvendes i viruspræparater, kan prøven ringes op til bufferopløsning, der mangler disse komponenter. Affinitet Capture-enheder kan modstå en vis grad af rengøringsmidler i en kort periode, selvom dette skal bestemmes fra sag til sag. Se listen over kompatible reagenser, der tidligere er beskrevet22.

For at muliggøre downstream billedbehandling rutiner, en lav koncentration af kontrast reagens kan føjes til mikrofluidic kammer. Dette reagens fastsætter ikke proteinprøver, som traditionelle farvningsprocedurer17. For at sikre, at der er væske til stede i billedkammeret under hele forsøgenes forløb, skal elektronstrålen fokuseres, indtil der opstår bobledannelse (Figur 4). Dette er en simpel foranstaltning for at indikere, at prøverne forbliver hydreret. Flydende prøver udsættes for alvorlige skader inden for 2 min. (figur 4A) for kontinuerlig eksponerelse af elektronstrålen ved 5 elektroner/Å2. Langvarig kontinuerlig elektronstråleeksponering i 5 min.

In situ molekylær mikroskopi anvendes i kombination med Affinity Capture udstyr tillader undersøgelse af biologiske komplekser i opløsning ved hjælp af transmission elektron mikroskopi. Disse tekniske fremskridt er muliggjort ved brug af nyudviklede mikrofluidiske prøveholdere. Sådanne anordninger anvender tynde siliciumnitridmembraner til at danne et mikroskaleret billedkammer. Med udgangspunkt i det banebrydende arbejde Parsons og kolleger7-10 leverer vi en nyttig strategi for at billedet enkelte virale forsamlinger i løsning. Den protokol, der er beskrevet her, forklarer metoder, der er kompatible med enkeltpartikelbilledbehandlingsrutiner og 3D-rekonstruktionsberegninger. Fremtidige applikationer, der vil følge af beherskelse af disse teknikker, kan omfatte live-EM-billeddannelse af makromolekyler. Vi forventer in situ billeddannelse kan afsløre skridt til viral samling, transskription regulering eller vært celle invasion. Sammenfattende bør brugen af disse protokoller give forskerne mulighed for at undersøge dynamiske processer i løsning på en helt ny måde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren, Madeline J. Dukes, er ansat hos Protochips, Inc.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender Dr. Michael J. Friedlander, direktør for Virginia Tech Carilion Research Institute for at fremme vores forskning bestræbelser. Dette projekt blev støttet af udviklingsmidler til S.M.M og D.F.K. og dels af Nano-Bio-initiativet fra Institute for Critical Technology and Applied Science på Virginia Tech.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-chips, spacer chip Protochips, Inc. EPB-52TBD 400 μm x 50 μm window
E-chip, top chip Protochips, Inc. EPT-45W 400 μm x 50 μm window
Ni-NTA lipid Avanti Polar Lipids 790404P Powder form
DLPC (12:0) lipid Avanti Polar Lipids 850335P Powder form
Volumetric flasks  Fisher Scientific 20-812A; 20-812C 1 ml; 5 ml 
Hamilton Syringes Hamilton Co. 80300, 80400 1-10 μl; 1-25 μl
Whatman #1 filter paper Whatman 1001 090 100 pieces, 90 mm
Glass Petri dishes Corning 70165-101 100 mm x 15 mm
Glass Pasteur pipettes VWR 14673-010 14673-010
Glass culture tubes VWR 47729-566 6 mm x 50 mm
Acetone Fisher Scientific A11-1 1 L
Methanol Fisher Scientific A412-1 1 L
Chloroform  Electron Microcopy Sciences 12550 100 ml 
His-tagged Protein A Abcam, Inc. ab52953 10 mg
Milli-Q water system EMD Millipore Corp. Z00QSV001 Ultrapure Water
HEPES Fisher Scientific BP310-500 500 g
Equipment 
Poseidon In situ specimen holder Protochips, Inc.  FEI compatible
FEI Spirit BioTwin TEM FEI Co. 120 kV
Eagle 2k HS CCD camera FEI Co. 10 Å/pixel sampling at 30,000X
Gatan 655 Dry pump station Gatan, Inc. Pump holder tip to 10-6 range
PELCO easiGlow, glow discharge unit Ted Pella, Inc.  Negative polarity mode
Isotemp heated stir plate Fisher Scientific Heat to 150 ºC for 1.5 hr

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
  2. Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
  3. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
  4. Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
  5. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
  6. Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
  7. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
  8. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
  9. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
  10. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
  11. Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
  12. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
  13. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
  14. Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
  15. Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
  16. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
  17. Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
  18. Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
  19. Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
  20. Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
  21. Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
  22. Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).

Tags

Bioengineering Problem 82 Mikrofluidics Transmission Electron Mikroskopi (TEM) In situ imaging Rotavirus simian rotavirus dobbeltlag partikler (DLP' er) 3D-struktur bestemmelse
<em>På stedet</em> TEM af biologiske samlinger i væske
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dukes, M. J., Gilmore, B. L.,… More

Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid. J. Vis. Exp. (82), e50936, doi:10.3791/50936 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter