Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

Summary

Denne protokollen detaljer en metode for å isolere antigen-presenterende celler fra human thymus via ulike trinn av enzymatisk nedbrytning av vevet etterfulgt av tetthetssentrifugering av enkeltcellesuspensjonen og til slutt magnetisk og / eller FACS sortering av cellepopulasjoner av interesse.

Abstract

I denne protokollen gir vi en metode for å isolere dendrittiske celler (DC) og epitelceller (TEC) fra den menneskelige thymus. DC og TEC er de store antigen-presenterende celle (APC) typer som finnes i normal thymus, og det er velkjent at de spiller forskjellige roller under thymisk markering. Disse cellene er lokalisert i forskjellige microenvironments i thymus og hver APC typen utgjør bare en mindre populasjon av celler. For å forstå biologien til disse celletypene videre, er karakteriseringen av disse cellepopulasjoner meget ønskelig, men på grunn av deres lave frekvenser, isolering av noen av disse celletyper kreves en effektiv og reproduserbar fremgangsmåte. Denne protokollen detaljer en metode for å oppnå celler som er egnet for karakterisering av ulike cellulære egenskaper. Thymisk vev er mekanisk avbrutt og etter ulike trinn av enzymatisk oppslutning, blir den resulterende cellesuspensjonen anriket ved hjelp av en Percoll tetthetssentrifugeringstrinnet. For isolering av myeloid DC (CD11c <sup> +), celler fra low-density fraksjon (LDF) er immunoselected av magnetisk cellesortering. Anrikning av TEC-populasjoner (MTEC, CTEC) oppnås ved reduksjon av hematopoetiske (CD45 ^hi) celler fra lav tetthet Percoll cellefraksjon slik at deres påfølgende isolering via fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) under anvendelse av spesifikke cellemarkører. De isolerte celler kan brukes for forskjellige nedstrøms applikasjoner.

Introduction

I thymus er det organ, der forekommer T-celleutvikling. Den relative og absolutte størrelse avtar med alderen når den blir suksessivt erstattet av fett, selv om thymisk aktivitet kan fremdeles påvises i høy alder. Dens betydning for immunrespons ble vist i begynnelsen av 1960-tallet ^en.

T-celle repertoar er formet gjennom samspillet av T-celle reseptorer med peptid-MHC komplekser på ulike typer thymic APC, som gir overlevelse eller død signaler for å utvikle T-celler, noe som resulterer i en funksjonell og i stor grad selv tolerant T celle repertoar ^to.

Omtrent 98% av cellene i en human thymus utvikler T-celler omtales som thymocytter. De resterende 2% bestå av en rekke forskjellige celletyper, inkludert en rekke TEC (cortical, medullær, subkapsulær), myeloid-og plasmacytoid DC (MDC, PDC), makrofager, B-celler, modne re-sirkulerende T-celler, granulocytter, fibroblasts, endotelceller og meget sjeldne epitelceller med et uttrykk fenotype som ligner på celler fra andre vev som muskel, nerveceller og respiratorisk epitel (figur 1). Av disse TEC og DC er de store APC typene som finnes i en normal thymus. I de senere årene, har rensingen av disse APC typer for kultur og molekylær profilering fått mer og mer interesse. På grunn av deres lave frekvens, isolering av en hvilken som helst av disse celletypene for detaljert analyse krever en effektiv, reproduserbar og kostnadseffektiv fremgangsmåte. Metoden som presenteres her er en modifikasjon fra tidligere publiserte studier ^3,4.

Som med alle andre vev, kan celleutvinning fra thymus oppnås ved enzymatisk disaggregating celle-celle og celle-matriks-interaksjon nettverk, for å oppnå en suspensjon av enkeltceller. Det er visse parametre som god dissosiasjon effektivitet, celleytelse celleviabilitet og oppbevaring av celle surface markører som er avgjørende, og må være optimalisert for en vellykket isolering av disse sjeldne cellepopulasjoner.

I denne protokollen, er isolasjon av DC og TEC-undergrupper utføres ved å lage en enkeltcellesuspensjon av vev ved mekanisk forstyrrelse og enzymatisk oppslutning. Vi bruker Collagenase A fra Clostridium histolyticum, som har et balansert forhold mellom forskjellige enzymaktivitet, for å bryte ned de opprinnelige kollagen som inneholder vev sammen. DNase I er inkludert i enzymløsningen for å redusere celle aggregering på grunn av fri-DNA fra døde celler (thymocytter er svært følsomme). Vi har også en alternativ tilnærming til den typiske enzymatisk fordøyelse vev involverer mekanisk og enzymatisk behandling vev assistert av en vev dissociator. Enkeltcellesuspensjonen blir deretter utsatt for en enkelt densitet Percoll sentrifugering for anriking av lavtetthets fraksjon (LDF) av celler. Fra denne fraksjonen av celler, kan like isoleres ved farging feller DC-overflatemarkører (dvs. CD11c ⁺⁾ og ved hjelp av magnetisk separasjon eller fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). I motsetning til de lymfoide celler som utgjør det store flertallet av celler i thymus, trenger TEC ikke uttrykke CD45 på høye nivåer, men er positivt for epithelial celleadhesjonsmolekylet EpCAM. CTEC kan skilles fra medullær TEC av uttrykket av en udefinerbar antigen gjenkjennes av CDR-2 (kortikale dendrittiske retikulocytter-2) antistoff ^4,5 og noe lavere EpCAM uttrykk. Differensial co-uttrykk for EpCAM og CDR2 tillater effektiv isolering av disse TEC undergrupper via høyhastighets celle sortering ^seks.

Protokollen presenteres her er optimalisert for menneskelig thymic vev. Varigheten av fremgangsmåten er avhengig av mengden av vev og evne til experimenter, så vel som hastigheten av cellesortering, hvis FACS sortering benyttes. Normalt kan protokollen for isolering av DC være fullført innen 5-6 Hr, og for isolering av TEC i 8-10 timer. Isolasjon av DC og TEC undergrupper fra thymic vev er tid sensitive. Jo raskere isolasjonsprosedyren, jo bedre tilstanden til cellene. Endelig kan de isolerte celler benyttes for videre undersøkelser som sammenlignende studier av mRNA og protein ekspresjon, PCR-eksperimenter, protein isolert molekyl profilering (dvs. transcriptomics, mikro-RNA-analyse), samt cellekultur ^6..

Etikk Erklæring

For å kunne arbeide med menneske thymus vevet trenger forskeren å få godkjenning fra den lokale etikkutvalg eller ansvarlige myndigheter så vel som et informert skriftlig samtykke fra donor (eller vanligvis hans eller hennes foreldre, siden vevet er som regel hentet fra mindreårige barn). Videre bør alle menneskelige vev behandles som potensielt smittefarlige og passende tiltak bør iverksettes, for eksempel jobbe med hansker, etc.

Protocol

En. Utarbeidelse av Verktøy, Enzym Solutions, og buffere

Utfør følgende fremstillingsmåten før start av protokollen.

1. Verktøy
   Ren, tørr og autoklav følgende verktøy og holde dem i sterile emballasjen før bruk.
   1. Små skarpe sakser med enten buet eller rett tips for skjæring thymus vev. Små buet tang med taggete tips for håndtering av vevet.
   2. 50 ml Oak Ridge sentrifugerør, PC, for Percoll-tetthet sentrifuge trinn.
2. Enzym løsninger
   Klargjør Collagenase / DNase I enzym blandes (2 mg Collagenase / ml og 0,1 mg DNase I / ml) som følger:
   1. Oppløs 500 mg lyofilisert Collagenase A (Roche) i 250 ml RPMI 1640-ren (ingen FCS) for å oppnå en 2 mg / ml Collagenase-løsning. Kollagenase er ganske vanskelig å oppløse, så det anbefales å la det litt tid på en berg-shaker på RT.
   2. Oppløs 100 mg DNase I (Roche) i10 ml sterilt destillert vann. 2,5 ml alikvoter kan lagres ved -20 ° C. Til 2,5 ml av 10 mg DNase I løsningen i 2 mg Collagenase En oppløsning.
   3. Steril filter collagenase / DNase miks ved hjelp av en Stericup filterenhet (0,22 mikrometer). Oppbevares i 10-20 ml deler ved -20 ° C inntil bruk.
3. Buffere og løsninger
   1. 1,5 M NaCl lageroppløsning: Oppløs NaCl i destillert sterilt vann til en endelig konsentrasjon på 1,5 M. Filtrer løsningen gjennom et 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved RT.
   2. 10x MACS buffer: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-free)} som inneholder 5% BSA og 20 mM EDTA. Sterile filter løsningen med et 0,22 mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C. Før bruk forberede en 1x løsning ved å fortynne 10x lager til 1x i kaldt sterilt 1x PBS.
   3. FACS-buffer: 1 x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-fri)} inneholdende 1% BSA og 0,02% NaN _3.
   4. FACS buffer for celle sortering: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg

2. Utarbeidelse av Tissue

Behandlingen av vevet bør utføres ved hjelp av sterile reagenser og arbeider i en laminær strømningsskap. Før prosedyren starter, utarbeide følgende reagenser og utstyr:

1. 1. Varm følgende til RT: RPMI 1640 komplett medium (RPMI 1640, 10% kalvefosterserum, 1% pen / strep), RPMI 1640-ren, Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-fri} PBS og 2x Collagenase / DNase enzymløsning.
   2. Varm termisk inkubator med rotasjonsenhet til 37 ° C og kjølig fast vinkelrotor sentrifuge til 4 ° C.
   3. Forbered en boks med is.

Merk: varigheten av dette trinn er avhengig av tilstanden og størrelsen av vevet. Ca 20-30 min er rimelig tid som trengs for en middels stor bit av tissue i god stand (~ 5 cm i bredde).

2. Plasser vevet i en petriskål inneholdende sterilt PBS og skylle av en hvilken som helst gjenværende blod.
   1. Legg frisk PBS for å hindre at vev fra tørking og bruk pinsett og saks rense vevet fra blodpropper, bindevev og fettvev og noen del som ikke ser sunt.
   2. Pass på å fjerne nekrotisk vev som vil øke mengden av rusk.
   3. Etter rengjøring, veie vev for referanse.
   4. Skjær vevet i ca 1 cm ³ stykk / blokker. Legg tilstrekkelig PBS for å dekke vevet.

Merk: For reproduserbarhet av resultater, bør vev kuttes i biter av lik størrelse.

3. Ved hjelp av baksiden av en steril sprøyte (10-20 ml) legge press (ikke altfor sprek eller langvarig) på thymic vev stykker. Denne fremgangsmåten vil fjerne mesteparten av thymocytter, og dermed redusere vev-volumet som skal fordøyes senere. Utfør dette trinnet på isen og arbeide raskt.
4. Løsningen vil bli synlig regn som thymocytter er løslatt. Rør fatet forsiktig og deretter ved hjelp av en 5 ml pipette eller et glass vifte fjern supernatanten inneholder thymocytter tar seg ikke tilfeldigvis aspirer vevet stykker.

Tip: En steril cellekultur skraper kan brukes til å konsentrere alle vev-stykker på den ene siden av fatet da vippe fatet (45 ° vinkel) og suge supernatanten. Erstatt med frisk PBS og gjenta denne prosedyren til supernatanten er relativt gjennomsiktig. Utfør siste vask med RPMI vanlig.

5. Finhakk vev stykker ved hjelp av skarp saks (så fint som mulig, bør fragmenter være minst 2-4 mm). Fragmentene bør være liten nok til å legge inn en 5-ml pipette.

Tre. Utarbeidelse av enkelt celle suspensjon fra Thymus Tissue

Herto alternative tilnærminger for dette trinnet er beskrevet. Den første tilnærmingen beskriver en typisk enzymatisk vev fordøyelsen (pkt. 3.1), mens den andre innebærer mekanisk og enzymatisk vev behandling assistert av en vev dissociator (pkt. 3.2).

Denne protokollen er optimalisert for behandling av vevsprøver som veier 5 g. For større eller mindre vevsprøver, justere enzymvolumer tilsvarende.

3.1 Typisk enzymatisk vev fordøyelsen å få en enkelt celle suspensjon

1. Plasser moste vevet inn i 50 ml rør med 10 ml kollagenase / DNase-løsning pr 5 g vev. Legg RPMI vanlig å gi et totalt volum på 20 ml.

Merk: I et 50 ml rør fordøye opp til 10 gram vev. Juster enzymet volum tilsvarende.

2. Inkuber vevet suspensjonen i 40 min ved 37 ° C under langsom rotasjon i et termisk inkubator.

Merk:

3. Enzymet løsningen vil bli uklar som celler blir sluppet inn i det. Ved slutten av fordøyelsen, sentrifugerør ved 110 x g i 2 min for å sediment vev fragmenter.
4. Samle supernatanten fra denne fordøyelsen runde. Pellet cellesuspensjonen i 10 min ved 400 x g. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 10-50 ml RPMI komplett, avhengig av størrelsen av cellepelleten.
5. Hold cellesuspensjon i 37 ° C inkubator med lokket løs.
6. Dersom større celletall er ønskelig, kan fordøyelsen trinn gjentas med de gjenværende vev fragmenter og den første og den andre fordøye oppsamlet. Også, hvis TEC bør isoleres, to runder med digestions bør utføres.
7. Fortynn en aliquot av cellesuspensjonen i trypan blått (1:10-1:100), og telle levedyktige celler ved hjelp av et hemocytometer. Hold celler ved 37 ° C i inkubator før du er klar til å gå videre til Percoll tetthet sentrifugering (§ 4). Påfølgende isolering av DC undergrupper (§ 5) vil bli utført fra disse cellene.

Merk: thymic vev kan variere i sin sammensetning, spesielt med alder, som påvirker fordøyelseseffektivitet og generering av en enkelt-cellesuspensjon.

9. For den påfølgende isolering av thymic epitelceller (TEC) en tredje runde med enzymatisk fordøyelse er nødvendig. Resuspender vev rester i 10 ml frisk Collagenase / DNase oppløsning pluss 10 ml RPMI ren og tilsett Trypsin / EDTA (1:50 fra 2,5% lager) i løsningen.
10. Inkuber ved 37 ° C i 40 min med forsiktig rotasjon. I løpet av de siste 10 - 15 min for inkuberingen legge FCS (01:05) til å nøytralisere aktiviteten av trypsin.
11. Sentrifuger ved 110 xg for 2 min ved RT å sedimentere vev fragmenter.

12. Samle cellen supernatanten og kast sedimentert vev fragmenter.
13. Sentrifuger cellen supernatanten ved 400 xg i 10 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellen pellet i RPMI komplett.

Tips: Cellepelleter er ganske løs, så vær forsiktig når du kasserer / aspirere supernatant.

14. Telle levedyktige celler ved hjelp av en hemocytometer. Plasser cellene i et 37 ° C inkubator inntil fortsetter til Percoll separasjon (seksjon 4). Etterfølgende pre-anrikning av TEC celler ved uttømming av CD45 ^hi celler vil bli utført fra disse cellene (§ 6).

3.2 Mekaniske og enzymatisk vev behandling assistert av en vev dissociator

7,8.

1. Overføring av 5 g av hakket vev stykker (trinn 2.5) til en C Rør inneholdende 10 ml Collagenase / DNase-løsning.
2. Adapt C tube på vev dissociator og kjøre programmet m_spleen_02 (10 sek). Gjenta dette programmet 4-5x (40-50 sek).
3. Inkuber med forsiktig rotering i 20 min ved 37 ° C.
4. Sentrifuger ved 110 x g i 2 min ved RT.
5. Samle supernatanten og fortsett som i trinn 3.1.4. Tilsett 10 ml av frisk Collagenase / DNase-løsning.
6. Adapt C tube på vev dissociator og kjøre programmet m_spleen_01 (56 sek).
7. Inkuber ved 37 ° C i 20 min med forsiktig rotasjon.
8. Sentrifuger ved 110 x g i 2 min ved RT.
9. Samt celle supernatant og pellet av cellesuspensjonen i 10 min ved 400 x g. Fortsett som i trinn 3.1.4.
10. Som beskrevet i 3.1.9 en tredje runde med fordøyelsen er nødvendig for den etterfølgende isolering av thymic epitelceller (TEC). For dette, resuspender vev rester i 10 ml av frisk Collagenase / DNase-løsning pluss Trypsin / EDTA (1:50 fortynning av stam 2,5%)
11. Inkuber ved 37 ° C i ytterligere 20 min med forsiktig rotasjon. Legg FCS (01:05) og inkuberes i ytterligere 10 min.

Merk: Ved hjelp av denne tilnærmingen, etter denne siste fordøyelse trinn vevet er som regel helt dissosiert og ingen ufordøyde vev fragmenter er observert.

12. Fortsett som i trinn 3.1.11-3.1.14.

4. Anrikning av LDF av celler Bruke Percoll-density Separasjon

Etter at enzymatisk nedbrytning av vevet er samlede thymic enkeltcellesuspensjoner underkastet en enkelt densitet Percoll centrifugation skritt å berike for LDF celler. Den LDF av celler er sterkt anriket for APC. Både DC og TEC er påvist i denne fraksjonen av celler.

1. Bruk enkelt celle suspensjon innhentet fra ^1. og ^2. fordøyer for MDC isolasjon (sammenslåtte celler, se trinn 3.1.8) eller 3 ^rd digest (for TEC isolasjon) (3.1.14). Centrifuge enkeltcellesuspensjon erholdt fra hvert fordøyelse trinn ved 400 xg i 10 min.
2. Tilbered en Percoll-løsning med en endelig densitet på 1,07 g / ml i løpet av dette vasketrinn (se eksempel i tabellen nedenfor).

   Fremstilling av Percoll-løsning til en slutt-tetthet på 1,07 g / ml (ρ = 1,07)
   Tube Nei.	1	2	3	4
   Ufortynnet Percoll (ρ = 1,130) (ml)	2,96	5,92	8.88	11.84
   1,5 M NaCl (ml)	0.6	1,20	1,8	2.4
   destillert H2O (ml)	2,44	4,88	7,32	9.76
   Volum av endelig arbeids fortynning	6 ml	12 ml	18 ml	24 ml

3. Antallet Percoll rør er avhengig av celletall bestemt i trinn 3.1.8 og / eller 3.1.14. Kombiner de sterile løsninger og bland godt. For optimal isolasjon, kan 0,6-1 x 10 ⁹ celler lastes per tube av Percoll. Kombiner de sterile løsninger og bland godt.

Tips Percoll er lysfølsom og i tillegg bør det holdes kaldt. Forbered først blandingen inneholdende NaCl og _H2O (RT) og tilsett ufortynnet Percoll sist, like før resuspendering av cellene i Percoll-løsning.

telt "> Merk:! Percoll tetthet kan variere mellom ulike leverandører og batcher Dersom tettheten av ufortynnet Percoll løsningen er ikke lik 1,130 g / ml, bruker du instruksjonene gitt av produsenten for å beregne de eksakte mengder Percoll og H ₂ O nødvendig for å få en endelig densitet på 1,07 g / ml.

4. Resuspender opp til 1 x 10 ^9-celler i 6 ml av oppløsningen fremstilt Percoll (ρ = 1,07), blandes i tilstrekkelig grad til å få en homogen suspensjon, og overføring til en 50 ml Oak Ridge polykarbonat skrukork sentrifugerør.
5. Nøye lag 30 ml RPMI komplett per rør med en pipette på toppen av Percoll-løsning / cellesuspensjonen. Laste mediet langsomt, slik at den forblir på toppen av suspensjonen, og tar seg ikke å forstyrre sjiktet.
6. Vei rørene for å sørge for at de har lik vekt, slik at de er balanserte under sentrifugering. Hvis de ikke er, nøye legge mer middels til lettere tube (under sterile forhold).
7. Nøye overføre rørene til en på forhånd avkjølt sentrifuge med en rotor med fast vinkel, og sentrifugering ved 3500 xg i 35 min, ved 4 ° C med bremsen på. Sørg for at temperaturen i sentrifugen i ikke høyere enn 4 ° C.
8. Fjern rør fra sentrifugen og nøye samle anriket APC, funnet ved interfase mellom Percoll og medium (low-density fraksjon) fra hvert rør ved hjelp av en steril Pasteur-pipette. Overfør celler i en 50 ml tube med kaldt RPMI komplett. Fyll opp røret for å fortynne ut den gjenværende Percoll.
9. Sentrifuger cellesuspensjonen i 10 min ved 300 x g ved 4 ° C. Kast supernatanten og gjenta vask.
10. Resuspender cellepelleten i medium og bestemme celletallet (ved hjelp av trypan blå og et hemocytometer). Etter vår erfaring er den prosentandel av LDF-celler omtrent 2-20% av den totale enkeltcellesuspensjonen oppnådd etter enzymbehandling. En typisk yield av lav tetthet beriket celler (fra en ung thymus, rekkevidde en dag-2 år) er 1x10 ⁸ celler per 1 x 10 ^9, som representerer en 10% av totale enkelt celle suspensjon celler.

Merk: På dette stadiet, kan du observere at cellene samles i suspensjon (spesielt med prøver fra barn i eldre alder). Celle klumper er indikasjon på celledød og resultat fra utgivelsen av DNA fra døende celler som kan feste cellene sammen. I et slikt tilfelle, tilsett DNase I i prøven (50 pg / ml) og inkuberes det i opp til 20 minutter ved RT (sakte å vende hver 5 min) for å fordøye de frie DNA-molekyler.

5. Isolering av thymic MDC

Etter APC anrikning (via Percoll separasjon) kan MDC være effektivt isolert fra LDF etter den første og andre runden med enzymatiske fordøyelse. Den følgende protokollen er en modifisert versjon av magnetisk celleseparasjon for isolering av MDC (CD11c

1. Centrifuge APC anriket celler isolert fra enkeltcellesuspensjon erholdt fra det sammenslåtte første og andre enzymatiske fordøyelse ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C og resuspender cellepelleten i 100 ul MACS-buffer per 10 ⁷ celler.
2. Tilsett 5 mL av CD11c-PE antistoff per 10 ⁷ celler.

Merk: Titrering eksperimenter anbefales for optimale resultater.

3. Bland godt og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C, beskyttet mot lys.
4. Vask cellene ved tilsetning av 1 til 2 ml MACS-buffer per 10 ⁷ celler og sentrifuger ved 300 xg i 10 min.
5. Aspirer supernatanten helt og resuspender opptil 10 ⁷ celler i 80 mL av MACS buffer.
6. Legg 20 mL anti-PE microbeads per 10 ⁷ celler.
7. Bland godt (ikke Vortex) og inkuberes i 15 min ved 4 ° C beskyttet mot lys.
8. Gjenta som i trinn 5.4. Resuspender opptil 10 ⁸ celler i 500 ul buffer.
9. Om nødvendig kan filtercellesuspensjonen med en 40 mikrometer celle sil for å fjerne rusk og celleaggregater som kan hindre strømmen av kolonnen.
10. Bruk en LS kolonne siden thymus cellesuspensjonene flyte bedre gjennom LS kolonner. Forbered LS spalten etter produsentens anvisninger. Pipette cellesuspensjonen langsomt inn i kolonnen unngå generering av bobler. Bruk én kolonne for hver 1 x 10 ⁸ celler.
11. Vask kolonnen etter produsentens anvisninger. Fjern kolonne fra magnet og legg den i en steril 12 ml runde nederst polypropylen rør. Tilsett 3 ml MACS-buffer til kolonnen, og samle magnetisk merkede celler ved å sette inn og fast å skyve stempelet inn i kolonnen.
12. Samle elueres brøkdel representerer CD11c ⁺ MDC og sentrifuger ved 400 xg i 6 min.
13. Bestem celle nummer og bekreft renheten av den valgte cellen befolkningenpå ved flowcytometrisk analyse. Forslag markører CD45, CD11c, og HLA-DR.

Merk: CD11c ⁺ MDC kan også bli isolert ved hjelp av en FACS sorter.

6. Anrikning av CD45 ^{lo / neg} Cells for celle sortering av TEC

For isolering av TEC, celler kan forhånds beriket av uttømming av CD45 ^hi celler ved hjelp av CD45 microbeads, for å fremskynde sin isolasjon gjennom cellesortering.

Bruk enkel cellesuspensjon erholdt fra det ^3. fordøyelse trinn (3.1.14) og deretter separert ved sentrifugering Percoll.

1. Sentrifuger cellesuspensjon ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C og resuspender cellepelleten i 80 mL MACS-buffer per 10 ⁷ celler.
2. Bruk CD45 microbeads på 1/3 av den anbefalte mengden (6,7 mL) per 10 ⁷ celler.

Merk: Ved å bruke en mindre mengdeav mikro vi pre-berike celler for både CD45 ^lo og CD45 ^neg celler. Titrering anbefales for optimale resultater.

3. Bland godt ved forsiktig flicking røret (Do Not Vortex) og inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C.
4. Vask ubundne mikroperler ved tilsetning av 10 ml MACS-buffer og sentrifuger i 10 min ved 300 x g ved 4 ° C. Aspirer supernatanten helt.
5. Resuspender opptil 10 ⁸ celler i 500 ul buffer.
6. Om nødvendig kan filtercellesuspensjon ved bruk av en 70 mikrometer celle sil for å fjerne rusk og celleaggregater som kan hindre strømmen av kolonnen.
7. Bruk en LS kolonne siden thymus cellesuspensjonene flyte bedre gjennom LS kolonner. Forbered LS spalten etter produsentens anvisninger. Pipette cellesuspensjonen langsomt inn i kolonnen unngå generering av bobler. Bruk én kolonne for hver 10 ⁸ celler.
8. Samle umerkede celler (gjennomstrømnings og vasker) som inneholderCD45 ^{lo / neg} cellefraksjonen og vask kolonnen etter produsentens anvisninger.
9. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C og resuspender cellepelleten i sterilt FACS-buffer for å bestemme celleantallet og videre til farging for cellesortering.

7. Stain Cells for fluorescens Aktivert Cell Sorting

1. Utfør FcR blokkerer før cellefarging, for å redusere ikke-spesifikk antistoffbinding. Inkuber cellesuspensjon med sammenslåtte humane immunglobuliner løsning i 15 min ved RT. Disse reagensene er kommersielt tilgjengelige (f.eks Gammunex 10% oppløsning).
2. Vask cellene ved å legge kaldt sterilt FACS buffer. Sentrifuger ved 400 x g i 6 minutter ved 4 ° C.
3. Kast supernatanten og resuspender celler i kaldt sterilt FACS buffer. Forbered fem prøver i henhold til følgende eksempel:
   

   * SCC; enkelt fargekontroll

   Inkuber cellene med antistoff i 30 minutter, på is i mørket.
   Vask to ganger med FACS-buffer ved sentrifugering cellene ved 400 x g i 6 minutter ved 4 ° C.
   Juster cellekonsentrasjonen i prøven som skal sorteres til 1 x 10 ⁷ celler / ml (eller til konsentrasjonen anbefalt av cellen sorteringsanlegg) ved hjelp av sterile FACS buffer for cellesortering (dvs. uten NaN _3).
   Passere celleprøve gjennom en 70 mikrometer celle sil for å fjerne eventuelle celleklumper som kan tette cytometeret under sortering.
   Resuspender kontrollprøver i 200-400 pl av buffer. Hold rørene på is og beskyttet mot lys.
   Forbered samling rør med medium.

   Merknader:

   • Utfør titrering av antistoffene for optimal farging.
   • I én prøve for sortering, kan opp til 50 x 10 ⁶ celler farges i et totalt reaksjonsvolum på500 mL.
   • Utfør farging av prøven som skal sorteres i 5 ml Falcon Polystyren rundbunnede rør. De enkelte fargekontroller kan farges i separate brønner i en 96-brønns plate.
   • Siden TEC undergrupper er sjeldne populasjoner, er det tilrådelig å bruke en annen positiv markør (høy frekvens) for hver fluorochrome å lette fastsettelse av riktig FACS innstillinger og for å kontrollere at du har riktig kompensasjon dersom valget av fluorokromer krever kompensasjon. Celler fra CD45 ⁺ brøkdel kan farges med markører som CD45, CD3 eller CD8 for de forskjellige fluorokromer og etter farging ufargede CD45 ⁺ celler kan legges til prøven.

   8. Isolering av TEC av fluorescens Aktivert Cell Sorting

   TEC undergrupper kan sorteres fra CD45 ^{lo / neg} brøkdel som EpCAM ^hi CDR2 ^- (Mtec) eller EpCAM ^lo CDR2 ⁺ (CTEC).

   1. Kjør prøven viddh de ufargede celler og justere frem og side scatter for å plassere den aktuelle populasjonen i skala. Juster spenningen på hver detektor, slik at cellene er synlige, men som ligger i den ytterste venstre hånd del av histogrammet.
   2. Kjør hver enkelt farget prøve og justere kompensasjon for hver farge.
   3. Etter justering av spenning og kompensasjon for de ufargede og enkelt farget kontroller kjøre prøven som skal sorteres og bruk gating verktøy for å definere populasjonen av interesse. Bruk en bred frem og side scatter gate for å sikre inkludering av alle stromal cellestørrelser, mens unntatt celleavfall.
   4. På prikkplott med CD45-Pacific Blue versus Forward Scatter gate på CD45 ^lave og CD45 ^neg celler.
   5. Bruk denne porten til en EpCAM versus CDR2 prikkplott og avgjøre ved gating bestandene å bli sortert.
   6. Når portene er fastlagt, velger du portene som inneholder bestander av interesse og starte sortering.

   Merk: Under sortering for å hindre at cellene fester seg til sidene av oppsamlingsrøret, røret kan være forhåndsbelagt ved å fylle den opp med 50% FCS i PBS og inkubert ved RT i 30 min. Kast beleggsløsningen før tilsetning av samling media.

   Representative Results

   Som utgangsmateriale i denne protokollen vi bruker thymus vev fjernet fra barn som gjennomgår korrigerende hjerte-kirurgi (Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Universitetet Clinic Tuebingen) oppnås etter informert samtykke og under institusjonelle retningslinjer. Dette kasserte materialet kan variere sterkt i størrelse 2-30 g eller mer. Antallet MDC og TEC-undergrupper (CTEC og MTEC) som er fremstilt avhenger av størrelsen og alderen av thymus vevsprøve som brukes for isolasjon.

   Fig. 2 viser et temmelig stort stykke vev (~ 9 cm) oppnådd fra en seks år gamle barn. Et viktig første forberedende skritt i denne protokollen er rengjøring av vev fra uønskede deler (markeres med hvite piler).

   Thymus vev ble behandlet som beskrevet i avsnitt 2 og 3.1 i protokollen for å oppnå en enkel cellesuspensjon som ble separert ved hjelp av en enkelt densitet Percoll sentrifuge step Mens enkeltcellesuspensjonen inneholder ca 3% av HLA-DR + celler (fig. 3A), etter sentrifugering Percoll denne prosentandel øker i low-density fraksjon (LDF), inneholdende store store celler, til 15-40%, mens den høy tetthet brøkdel (HDF) som hovedsakelig består av ensartede små-sized thymocytter inneholder nesten ingen slike celler (Figur 3B). Fraksjonen av interesse (LDF), ble inneholdende anriket APC deretter oppsamlet og vasket for å samle celler for bruk i etterfølgende isolerings-trinn.

   Mens thymic MDC kan identifiseres av uttrykket av en rekke overflatemarkører, inkludert CD11c9, 10, PDC uttrykke markører som BDCA-2, BDCA-4, CD45RA og CD123 ^11,12. Etter anrikning av de LDF-celler, begge celletyper som utgjør 2-10% av denne fraksjon, slik at de blir effektivt isolert også i større antall, enten ved magnetisk celleseparasjon eller strømnings sortering av CD11c ⁺ eller BDCA-4 ⁺celler ^seks.

   Figur 4 viser effektiv isolering av CD11c ^+-celler ved hjelp av den modifiserte magnetisk celleseparasjons protokoll som er beskrevet i avsnitt 5. Etter isolasjon, renheten av CD11c ⁺ DC var 93% som etablert ved farging av isolerte celler. I gjennomsnitt, er utvinning av isolerte CD11c ⁺ DC 5 x 10 ⁵ -5 x 10 ⁶ MDC per 10 ⁹ totalt thymic celler. Tabell 1 viser data innhentet fra flere individuelle thymus prøver av forskjellig alder og vev i vekt med en rekke innspill singel Cellesuspensjonene samt total LDF tall og den påfølgende CD11c ⁺ yield og renhet.

   I APC anriket fraksjon, bare omtrent 0,5% av cellene er CD45 ^lo EpCAM ⁺ eller CD45 ^neg EpCAM ^+. CTEC og Mtec kan sorteres fra trypsinlignende fordøyd CD45 ^{lo / neg} beriket stromale celler som EpCAM ^l o CDR2 ⁺ og EpCAM ^hi CDR2 ^-, henholdsvis som vist i figur 5..

   
   Figur 1. Et forenklet diagram av den cellulære organisasjon og sammensetningen av human thymus. Thymus består av thymocytter, ved forskjellige modningstrinn, og en heterogen cellenettverk referert til som thymisk stroma danner thymisk miljø. De viktigste celletyper i thymic stroma er MDC og PDC, epitelceller (delt inn i to hovedkategorier i henhold til deres lokalisering innenfor lobule: hjernebark, og medullær) og makrofager Forkortelser: DC, dendrittiske celler, MDC, myeloide dendrittiske celler;. PDC, plasmacytoid dendrittiske celler, Mii, makrofag, mono, monocytter, CTEC, kortikale epitelceller, Mtec, marg epitelceller.

   telt "fo: keep-together.within-page =" always ">
   Figur 2. Første preparative trinn av vevet for encellede preparat. Piler peker på de uønskede vev-deler som må kasseres før utførelse av protokollen.

   
   Figur 3. Rensing av thymisk APC. FACS analyse av forskjellige faser av renseprosedyren. Enkeltcellesuspensjoner av thymus vev ble innhentet av mekanisk avbrudd og serie enzymatiske digestions og APC beriket (LDF celler) av Percoll-tetthet separasjon. Celler før (A) og etter (B) på Percoll-tetthetsseparasjon ble farget med HLA-DR-PE-antistoff for å se etter APC anrikning. Prosentvis spekter av HLA-DR + celler vanligvis observert er anmerket ed.

   
   Figur 4. Isolering av CD11c ⁺ MDC. Thymus vev ble spaltet ved hjelp av Collagenase A / DNase I til å skape en enkelt cellesuspensjon. CD11c ⁺ MDC representerer bare en mindre bestand av den enkelt celle suspensjon (0,6%). Etter anrikning av de LDF-celler via Percoll-tetthetsseparasjon prosentandelen av CD11c ^+-celler øker til ~ 9%. De LDF-celler ble merket med CD11c-PE-antistoff og deretter isolert ved anvendelse av magnetiske kuler (anti-PE). Reanalyse av CD11c ⁺ befolkningen rett etter magnetisk celle separasjon ved FACS indikerte 93% renhet. Klikk her for å se større figur .

   0951/50951fig5.jpg "/>
   Figur 5. Anrikning av CD45 ^{lo / neg} celler og påfølgende sortering av TEC undergrupper. A) Representative Prikkplott som viser prosenter av CD45 negative / lave thymic stromale celler i sum enkeltcellesuspensjoner før og etter Percoll tetthet separasjon (9% og 16,2%, henholdsvis). B) De LDF celler ble tømt av CD45 ^hi celler ved hjelp av magnetiske kuler og TEC undergrupper sortert fra utarmet brøkdel som EpCAM ^hi CDR2 ^- (Mtec) eller EpCAM ^lo CDR2 ⁺ (CTEC).

   Sample	Prøvetype Antistoff	Cell Number	Totalt volum
   En. unstained	kontroll		1 x 10 6	50 mL
   2.scc *-Pacific Blue	kontroll	CD45-Pacific Blue	1 x 10 6	50 mL
   Tre. SCC-APC	kontroll	CD3-APC	1 x 10 6	50 mL
   4.scc-Alexa 488	kontroll	CD8-Alexa 488	1 x 10 6	50 mL
   5. Cell sortering	analytt	CD45-Pacific Blue EpCAM-APC CDR2-Alexa 488	10 x 10 6-50 x 10 6	500 mL 10 x 10 6 cells/100 mL

   CD11c + MDC frekvenser, celleutbytte og renhet på ulike givere
   Donor	Age	Tissue vekt	Totalt antall celler per prøve	LDF celler per prøve	CD11c+%	CD11c + isolert per prøve	CD11c + renhet
   1	5 dager	7 g	1,45 x 10 9	9,5 x10 7	12.6	2,4 x 10 6	89%
   2	3 år	15 g	2 x 10 9	6,5 x10 7	4,3	1,9 x 10 6	81%
   3	21 dager	9 g	2,6 x 10 9	22 x10 7	10.3	3,6 x 10 6	93%
   4	6 år	13 g	1,4 x 10 9	25,4 x10 7	4.2	5,7 x 10 6	82%
   5	5 dager	6,5 g	1,3 x 10 9	16,2 x10 7	6	2,9 x 10 6	91%
   6	39 dager	3 g	0,6 x 10 9	8 x10 7	3.4	1,3 x 10 6	80%

   Tabell 1. Totale antallet enkelt celle suspensjon celler utgitt etter to runder med fordøyelsen samt avkastning av LDF celler etter Percoll separasjon vises for isoleringer utført i thymus prøver av seks personer med ulik alder og vev vekt. Frekvenser MDC ble bestemt av flowcytometri basert on CD11c ekspresjon i totale LDF-celler (APC anriket). utbytte og renhet av CD11c ^+-celler etter magnetiske kuler separasjon er vist for hver enkelt donor.

Discussion

Protokollen er beskrevet her er en modifikasjon av protokollen utgitt av Gotter et al ^fire. Kritiske trinnene i protokollen er tilstanden og innledende fremstilling av vev, så vel som den Percoll densitetsseparasjon. Vi anbefaler på det sterkeste til å behandle vevet så snart som mulig etter innsamling. Det er viktig å jobbe raskt, men grundig ved rengjøring og kutte vevet. Under thymocyte vask beskrevet i trinn 2.3, er det viktig å finne den rette balansen når du søker press med baksiden av sprøytestemplet på vev stykker som altfor kraftig og langvarig press kan skade stromale celler. Lagdeling mediet på toppen av Percoll løsning / celle suspensjon uten å forårsake forstyrrelser kan også kreve litt øvelse. Etter sentrifugering, er det viktig å samle alle de lav tetthet fraksjons celler så raskt som mulig fra Percoll-lag med et minimum av Percoll-løsning.

Densamlede celleutbytte og relative APC tall kan være svært variabel (se tabell 1), og er avhengig av donoren (spesielt med hensyn til alder) og den preparative ferdigheter av experimenter. For en kort oversikt, kan cellesuspensjoner bli farget med HLA-DR og / eller andre markører følgende ulike trinn i protokollen som ønsket. Alle antistoffer som brukes for fenotypeanalyser bør kontrolleres for å oppnå optimale resultater.

På grunn av den relativt lave mengde av APC typer i thymus forhold til thymoctyes, kan større deler av thymus være nødvendig dersom høyere antall isolerte celler er ønsket.

Hvis en vev dissociator er tilgjengelig i laboratoriet, vil dette betraktelig fremskynde vev behandling, men begge variantene er beskrevet her fungerer like godt. En relativt hyppig problem kan være klumper av cellene, spesielt i trinn mellom Percoll separasjon og MACS / FACS sortering. I dette tilfellet er en kort DNase I graveestion som beskrevet i protokollen vil vanligvis løse problemet. Siden thymus vev er suksessivt erstattet av fettvevet i løpet av aldring, Thymi fra voksne givere kan inneholde noe fett, som vil svømme på toppen av røret etter sentrifugering av enkeltcellesuspensjoner fremstilt fra de forskjellige nedbrytningstrinn. I et slikt tilfelle bør fettet fjernes med en pipette før fortsetter protokollen. For optimale resultater, så vel som økonomi grunner vi råd til å titrere ikke bare antistoffer men også anti-PE microbeads (§ § 5 og 6). For isolering av TEC fra mus thymus, har alternative enzymblandinger blitt beskrevet å forbedre TEC avkastning ^8,13, men vi har ikke testet dem med menneskelig vev.

I prinsippet kan andre thymiske APC og stromale celler som B-celler og PDC også bli isolert fra LDF-celler (disse kollagenase / DNase fordøyelse og Percoll) ved FACS / MACS sortering dersom de respektive markører er kjent. For eksempel, for PDC, BDCA-2, BDCA-4 og CD123 er blitt beskrevet som markører ^6,14. Hvis analyse eller isolering av thymocyte undergrupper er ønskelig, anbefaler vi at du bruker cellene frigjøres ved å klemme (trinn 2,3), siden de er ganske ren, og har gjennomgått minimal manipulering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
RPMI 1640	PAA	E15-842
Dulbecco's PBS	PAA	H15-002
Fetal Bovine Serum-Gold	PAA	A15-151
Bovine Serum Albumin	PAA	K41-001
Collagenase A	Roche	10 103 586 001
DNase I, grade II bovine pancreatic	Roche	10 104 159 001
Trypsin-EDTA 10x in PBS	PAA	L11-001	stock conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit	Molecular Probes	A-10235
anti-human CDR2 (purified)	Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany		labeled with Alexa Fluor 488
anti-human CD45 (Pacific Blue)	Biolegend	304022
anti-human EpCAM (APC)	Miltenyi Biotec	130-091-254
anti-human CD11c (PE)	Miltenyi Biotec	130-092-411
anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
anti-CD45 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-801
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	for tissue dissociator
Percoll (density 1.130 g/ml)	GE Healthcare, Life Sciences	17-0891-01
Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free)	GIBCO	10977-035
Gamunex 10%	Tajecris-Biotherapeutics	G120052	1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells
0.22 μm filter	Millex GS	SLGS033SS	Syringe driven
Stericup filter unit	Millipore	SCGPU05RE	Pump driven
50 ml PC oak ridge centrifuge tubes	Nalgene	3118-0050	50 ml
50 ml PP conical tubes	Becton Dickinson	352070
12 mm x 75 mm 5 ml test tubes	Becton Dickinson	352058	FACS stainings
Cell strainer 70 μm	Becton Dickinson	352350
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)	Becton Dickinson
Sorvall Evolution R6 (rotor)	Kendro
Rotator REAX 2	Heidolph
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093 235	tissue dissociator