Summary
토양 세포 외 효소 활성의 잠재적 인 속도를 측정하기 위해 형광 염료에 바인딩 된 합성 기판은 토양 샘플에 추가됩니다. 형광 염료는 높은 형광 이상의 기판을 나타내는 분해 효소 - 촉매 반응에 의해 기판으로부터 방출 될 때 효소 활성을 측정한다.
Abstract
토양과 다른 환경에있는 미생물은 에너지와 영양소 흡수 할 수 있도록 유기 고분자를 탈 중합 및 가수 분해하는 세포 효소를 생산하고 있습니다. 토양 미생물의 효소 활성을 측정하는 것은 토양 생태계 기능 역학을 이해하는데 매우 중요하다. 형광 효소 분석의 일반적인 개념은 합성 C-, N-, 또는 형광 염료와 결합 P 풍부한 기판을 토양 샘플에 추가 된 것입니다. 때 그대로 표시 기판은 형광을하지 않습니다. 효소 활성은 형광 염료가 그들을 형광을 할 수 있도록 자신의 기판에서 분해 될 때 형광의 증가로 측정된다. 효소 측정은 몰 농도 또는 활성의 단위로 표현 될 수있다. 이 분석을 수행하기 위하여, 토양 슬러리의 pH 완충액으로 토양을 결합하여 제조된다. pH 완충 (일반적으로 50 mM의 아세트산 나트륨, 50 mM 트리스 완충액)는, 제일 토양 SA 일치하도록 버퍼의 특정 산 해리 상수 (pKa를) 선택됩니다엠플 산도. 토양 슬러리의 찬란 (즉, C-, N-또는 P-리치) 기판 표시 비 제한적인 양의 접종. 분석에서 토양 슬러리를 사용하면 효소와 기질의 확산에 대한 제한을 최소화하는 역할을한다. 따라서, 기판 제한의 차이, 확산 속도 및 토양 pH 조건이 분석 컨트롤, 따라서 (샘플 당) 효소 농도의 차이의 함수로 잠재 효소 활성 속도를 검출.
형광 효소 분석은 일반적으로 분광 (즉, 색채) 분석보다 더 민감 하나, 불순물과 빛에 노출 많은 형광 화합물의 불안정성에 의한 간섭으로 고생 할 수 있습니다, 그래서 형광 기판을 처리 할 때주의가 필요합니다. 기판을 제한하지 않을 때 마찬가지로,이 방법은 실험실 조건 하에서 전위 효소 활성을 평가한다. 크로스를 나타내는 데이터를 해석 할 때주의 표기동일계 토양 유형 및 온도와 같은 상이한 온도 나 토양 유형과 현장 비교는 효소 동력학에 영향을 미칠 수있다.
Introduction
토양 박테리아, 곰팡이 및 고세균에 의해 생산 세포 외 효소 (EES)는 수많은 생지 화학 과정에 참여하고, 처리, 안정화 및 육상 생태계 1 토양 유기물 및 영양 순환의 불안정의 중심에 있습니다됩니다. EES를 생산함으로써, 토양 미생물이 분해하여 식물과 미생물이 토양에서 제공 영양소를 동화 할 수 있습니다 이전에 결합 마이크로 및 다량 영양소를, 해방, 작은 수용성 분자에 고분자 유기 물질을 변환 할 수 있습니다. 직접 효소를 감지하고 정량화하는 것은 매우 어렵 기 때문에 스미스는 주로 실험실 분석 2-4에서 자신의 활동을 측정하여, 수십 년 동안 연구되어왔다.
세포 외 효소 활성 (EEA)을 가장 강하게 효소와 해당 기판의 농도에 의해 제어된다. 의 풍부한 다른 C-, N-및 토양에서 P-분해 효소는 여러 요인에 의해 제어되고 난미생물 바이오 매스, 지역 사회 조성, 기판 가용성, 미기후 및 화학 양 론적 요구 5,6 ncluding. 그러나 토양 환경 내의 동일계 EEAs도 크기, 기판 가용성의 관점에서, 온도가 7,8, 토양 점토 및 부식 성질이 효소의 결합, 그리고 궁극적 활성 효소 풀 조절 확산 제약 09 의해 영향 및 이직률 10-12. 다른 환경 사이트에서 토양 미생물의 기능을 해석하는 실험실 효소 분석을 사용하는 경우 따라서, 현장 토양 조건에서 인정하는 것은 중요합니다.
EEA의 많은 다른 클래스 (자세한 내용은 "시약 표 목록"을 참조하십시오) 합성 다양한 기판을 사용하여 실험실 분석을 정량화 할 수있다. 일부 프로토콜은 w, 분광 광도계로 검출 할 수있는 비색 반응에 결합되어있는 기질 분석법을 이용우리는 형광 부분에 바인딩 된 기판을 사용, 여기에서 설명하는 프로토콜을 포함 hile 다른 사람. 형광 EE의 분석은 일반적으로 비색 분석보다 (크기 순서에 의해) 더 민감 (합성 기판과 연결된 발색 부분을 사용하는) 12-14. 하나는 그 화합물의 양에 관련이 검출 된 가장 낮은 검출 가능성이 효소 활성에 다른 관련 : EEA의 검출 감도는 두 가지 측면을 포함한다. 비색 P-니트로 페놀을위한 방법 (PNP) 기반의 분석은 과거에서 찾을 수는 (15, 16)를 작동합니다. 간단한, 토양에 최적의 또는 필드 관련 온도와 pH에서 배양된다 (일반적으로 <2mm 공기 건조가로 체질). 방출 반응 생성물을 분광 광도계 (14)로 색도계 결정되는 비율. 형광 효소 분석법의 감도가 높을 SUBSTR과 관련된 형광 잔기 분리 민감한 검출에 부분적으로 기인특정 파장에서 특정 발색 부분의 분리 후 분해보다는 기록 흡광도를 먹었다. 이 가장 일반적으로 사용되는 합성 형광 지표 4 - 메틸 움 (MUB) (17) 및 7 - 아미노 -4 - 메틸 쿠마린 (MUC) 18,19이다. MUC-연결된 기판은 일반적으로 단백질 및 / 또는 아미노산 등 N 풍부한 합성 기판과 연결되어 있습니다. 형광 기법은 먼저 수생 샘플 (20, 21)에 대한 개발 및 토양에 자신의 응용 프로그램은 신호 냉각 및 간섭 (22, 23)에 대한 컨트롤을 필요로했다. 시험 법 중 하나를 수행 할 수 있습니다 대량의 전통 "벤치 탑"화학을 사용하여 수행 할 수 또는 처리량이 증가하지만, 가능성이 높은 측정 오류와 함께, 마이크로 기반 프로토콜에 사용할 수있다. 토양 24 EEAs의 형광 검출을위한 몇 가지 널리 인용 프로토콜이 있지만, 많은 실험실은 종종 실수 나 때문에 차에,이 프로토콜에 미묘한 변화를 고용실험실 장비 또는 시약에의. 프로토콜의 세부 사항에 겉으로는 작은 차이는 강하게 EEAs (25), (26)을 측정에 영향을 줄 수있는 표준화 된 효소의 부족은 다른 실험실 간의 분석을 보정하기에 도전합니다. 따라서, 유럽 경제 분석의 표준화를 장려하기 위해 상세한 프로토콜의 보급을위한 중요한 필요가있다.
우리의 프로토콜에서 토양 시료의 pH 버퍼와 토양 샘플을 결합하고 믹서로 균질화에 의해 준비가되어 있습니다. 슬러리는 다음의 형광 표지 비 제한적인 양의 접종 C-, N-또는 P-풍부한 기판, 관심있는 특정 연구 질문에 따라 선택. 효소 분석법에 토양 슬러리를 사용하여 기판 확산 제한을 최소화하기 위해 제어로서 기능한다. 형광 잔기는 이들이 각각의 기판에서 쪼개 질 때까지 급냉하고, 형광 염료가 기판 (B)로부터 방출 될 때, 따라서 효소 활성을 검출 할 수있다Y 효소 - 촉매 반응. 시간을 통해 증가하는 형광 강도는 효소 - 촉매 반응의 속도를 반영한다.
형광 효소 분석의 일반적인 개념은 형광 부분 (형광 염료)와 결합 합성 기판을, 토양 시료 27에 추가 된 것입니다. 효소 - 촉매 기질 분해 도중, 본드는 형광 염료와 기판 사이 나누기. 기판으로부터 해방 된 형광 염료는 결과적으로 효소 활성의 간접적 인 평가로 사용하고, 염료의 형광 강도를 검출하는 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 정량화 될 수있다. 해방 된 염료가 다른 파장의 빛을 흡수 한 후 1 파장의 빛을 방출로 요약하면, 형광 정량을 수행 할 수 있습니다. 형광 강도의 여기 및 검출 가능한 양의 플레이트 판독기에 의해 기록된다. 효소 활동 이후에 알려진 형광 염료 conce을 기준으로 정량화 할 수있다분석 (즉, 4 - 메틸 움 (MUB) 또는 7 - 아미노에 사용되는 기판의 특정 형광 부분에 대한 형광 강도의 표준 희석 곡선을 참조와 함께 기판 (합성 기판의, 즉 공지 된 양이 토양 시료에 첨가)의 ntrations -4 - 메틸 쿠마린 (MUC)). (효소 활성의 정량에 대한 세부 사항은 프로토콜 섹션을 참조하십시오).
실험실 토양 효소 분석은 미생물 군집의 기능을 평가하는 데 유용하지만, 사용자가 10을 인식해야 할 몇 가지 기술적 인 한계가있다. 형광 분석은 빛에 노출되면 불순물 및 / 또는 여러 형광 화합물의 불안정성에 의한 간섭으로 고생 할 수 있으므로 형광 기판 25을 취급 할 때주의가 필요합니다. 토양 슬러리의 토양 입자 및 / 또는 유기 물질은 또한 냉각 효과 26로 알려진 형광 강도, 방해 할 수 있습니다.또한, 실험실 효소 분석 실험은 실험실 조건에서 잠재적 EEAs을 평가한다. 체외 분석 기판의 확산과 풍요를 비 제한되는 상황에서 EEAs을 측정합니다. 따라서 이러한 분석에 의해 제공된 데이터는 동일계 토양 조건 하에서 10 EEAs위한 좋은 프록시 수 없습니다. 전반적으로, 효소 활성은 토양 유형이 유사하는 상대 비교에 매우 유용합니다. 물리적 또는 화학적 특성에 차이 토양 구비 활동과 비교하기 위해이 방법을 사용하는 경우에는주의가 사용되어야한다. 이것은 토양 유형 및 온도 차이가 비약적 시츄 효소 운동학에서의 상태를 변화시킬 수 있다는 사실 때문이다. 또 다른 한계는 상대적으로 적은 기판 (자연 환경에 비해) 상업적으로 사용할 수 있다는 것입니다. 또한, 효소 분석에 사용되는 합성 기판은 정확하게 현재 또는 이용하실 토양 기판을 표현하지 않을 수 있습니다 (쉽게 용해) 상대적으로 간단합니다현장에있는 전자. 고려해야 할 또 다른 요소는 토양 슬러리를 사용하여 현장 조건 2에서 활성화되지 않을 수도 있습니다 (즉, 유기물 또는 점토로 고정 된) 일부 안정화 효소의 활동을 통합하는 것입니다. 실험실 효소 분석은 토양 (효소 회전율) 또는 토양 효소를 생산하는 특정 미생물 종에 대한 정보에있는 효소의 지속성에 관한 정보를 제공하지 않습니다.
Protocol
1. 분석 셋업
- 라벨 3 깊은 우물 플레이트 : "샘플", "MUB 표준"및 "MUC 표준".
- 각 표준 (0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 μM의 MUB) 및 기판 별도의 청소, prelabeled 저수지에 (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) (행 지향)을 붓고 .
- MUB 표준 플레이트 (표 1)의 해당 우물에 적절한 MUB 표준을 피펫.
- MUB 표준 플레이트 행에 0 μM의 MUB의 피펫 200 μL.
- 피펫 (200) MUB 표준 플레이트의 행 B에 2.5 μM MUB ㎕의.
- MUB 표준 플레이트의 행 C에 5 μM의 MUB의 피펫 200 μL.
- MUB 표준 플레이트의 행 D에 10 μM의 MUB의 피펫 200 μL.
- MUB 표준 플레이트의 행 E에 25 μM의 MUB의 피펫 200 μL.
- MUB 표준 플레이트의 행 F에 50 μM의 MUB의 피펫 200 μL.
- 100 μ의 피펫 200 μLMUB 표준 플레이트의 행 G에 M의 MUB.
- MUC 표준 플레이트의 해당 우물에 MUC 표준에 대한 1.3.8 - 반복 1.3.1 단계를 반복합니다.
- 각각의 토양 샘플에 대한 준비 토양 슬러리.
- 믹서기에 필드 습한 토양의 2.75 g의 무게.
- 50 mM의 버퍼의 91 ML을 추가합니다. 1 분 동안 높은에 혼합.
- 적어도 넓은 교반 막대와 8 채널 피펫으로 깨끗한 유리 그릇에 믹서 내용을 붓는다.
- 저에 토양 슬러리를 혼합, 교반 접시에 놓습니다.
- 피펫 샘플 플레이트 (표 2)의 첫 번째 열으로 토양 슬러리의 800 μL.
- MUB 표준 및 MUC 표준 플레이트 (표 1)의 1 차 컬럼에 반복합니다.
- DI H 2 O와 믹서, 볶음 접시와 교반 막대를 씻어 또는 토양 샘플 사이의 버퍼.
- 이후의 각 토양 시료 (표 1과 다음 칼럼으로 이동, 각각의 샘플에 대해) 1.4.7와 -를 반복 1.4.1 단계2).
- 샘플 플레이트 (표 2)의 해당 우물에 (이 예에서는 200 μM 농도) 적절한 기판을 피펫.
- 샘플 판의 행에 BG 기판의 피펫 200 μL.
- 피펫 샘플 판의 행 B에 CB 기판의 200 μL.
- 샘플 판의 행 C에 NAG 기판의 피펫 200 μL.
- 피펫 샘플 판의 행 D에 PHOS 기판의 200 μL.
- 피펫 샘플 판의 행 E에 XYL 기판의 200 μL.
- 샘플 판의 행 F에 AG 기판의 피펫 200 μL.
- 샘플 판의 행 G에 LAP 기판의 피펫 200 μL.
- 각 배양 온도 샘플 플레이트 1.5.7 - 반복 1.5.1 단계를 반복합니다.
2. 분석 플레이트의 배양
- 깊은 - 웰 플레이트 ( "샘플", "MUB 표준"및 "MUC 표준을 밀봉4 ;) 플레이트 매트와.
- 용액이 완전히 혼합 될 때까지 손으로 각 (밀봉) 판을 반전 (~ 10 배).
- 필요한 배양 기간 (표 3)에 적합한 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
- 시간 0으로 초기 시간을 기록합니다. 당신은 인큐베이터 (표 3)에서 접시를 제거 할 때 알 수 있도록 또한 적절한 배양 시간을 기록합니다.
- 각 인큐베이션 기간 동안, 원심 ~ 2900 개의 x g에서 3 분 동안 밀봉 판의 끝에.
- 인증 후, (하나의 검은 판은 각 배양 깊은 우물 플레이트에 사용됩니다) 블랙 평면 바닥 96 - 웰 플레이트에 해당하는 우물에 배양 깊은 웰 플레이트의 각 웰에서 250 μl를 전송합니다. 그것은 검은 평면 바닥 96 - 웰 플레이트에서 같은 우물 (예 : A1 ... A12 등)로 배양 깊은 웰 플레이트에서 샘플을 전송하는 것이 중요하다 (표 1, 2).
3. 형광 측정에마이크로 플레이트 형광 계
- 사용 된 형광 플레이트 리더에 대한 제조 업체의 지침, 450 nm의 365 nm의 발광 파장에 여기 파장을 설정 (또는 적절한 필터를 사용)를 다음과 같습니다.
- 형광 분석기에 3 개의 판을 읽어보십시오. 중요 : 샘플 및 표준 플레이트 (즉 MUB 또는 MUC)는 같은 이득을 사용하여 읽을 수 있어야합니다.
- 자동 이득에 분광 광도계를 설정하고 MUC 및 MUB 표준 플레이트를 참조하십시오.
- 설정 설명서에 이득, 최적의 다음으로 낮은 숫자로 값을 감소 각 표준 플레이트에 가장 가까운 다섯 반올림. 각각의 판에 배를 반복합니다.
- 자동으로 게인을 설정하고 샘플 판을 실행합니다. 표준 플레이트 (즉 MUB 및 MUC) 각각에 대한 가장 높은 이득에 맞게 수동으로 샘플 판을 다시 실행하십시오.
4. 데이터 분석
- MUB에 대한 스프레드 시트로 표준 곡선 형광 데이터를 입력합니다 (표 4A) 및 MUC 표준 (표 4B)
- (μmol)을 (μM)의 농도 변환 (표 4a 및도 4b).
- 각 샘플의 표준 곡선 형광 데이터의 경우, 기울기, y 절편, 및 R MUB 및 MUC (μmol) 표준 농도에 2 값을 계산합니다. 사용 가능한 R 2 값은 각 샘플에 대한 0.98을 초과한다 (표 4a 및도 4b). 형광 종속 변수 (y 축) 및 표준 농도 (μmol) 독립 변수 (X 축) (그림 1)과 같이 플롯으로 플롯 읽기와 함께, 그것은 산점도 표준 곡선을 시각화하는 것이 유용 할 수 있습니다.
- 당신은 잠재적 인 EEAs에 샘플 + 기판 원시 형광 데이터를 계산하는 MUB 및 MUC 표준 곡선의 기울기와 y 절편 값을 사용합니다. 먼저 새로운 스프레드 시트에 샘플 + 기판 원시 형광 데이터를 입력 (표 5A합니다 (표 5B)를 입력해야합니다. 샘플은 25 ° C (표 3)에서 배양 되었기 때문에이 예에서 입력 한 시간 값이, 3 시간이며, 주.
- 해당 샘플의 형광 값의 표준 곡선의 절편 값을 빼기 후 해당 표준 곡선 (표 5C)의 경사에 의해 나눕니다. [Y = 샘플 형광 원시 읽기, MUB 또는 MUC 표준 곡선에서 B = 절편, m = MUB의 기울기 : X = (YB) / M,이 작업을 수행하기 위해 샘플 효소 농도 (X)을 해결하기 위하여 표준 라인 방정식을 재 배열 또는 MUC 표준 곡선].
- 91 ㎖ (토양 슬러리에 사용 된 버퍼의 양) (표 5D)에 의해, 위의 단계 4.3.1에서, 샘플 μmol를 곱합니다.
- [효소 AMT : 분할 값은 샘플 특정 배양 시간 및 건조 토양 질량 (표 5E)에 의해 단계 4.3.2에서 획득. (& #956; 몰) ML X 1,000 × 0.8 91 ML의 X 보육 (시간이) 건조한 토양 (g) × X]
참고 : 0.8 ㎖를 각 웰에 사용되는 슬러리의 양이며, 1000 각 웰의 실제 토양 금액을 수정합니다. - 원하는 단위 (nmol의 활동 / g 건조 토양 / 시간) (표 5 층)을 얻기 위해 1,000에 의해 단계 4.3.3에서 얻은 값을 곱합니다.
Representative Results
효소 분석은 잠재적 EEAs을 정량화하고 유사한 샘플들 사이의 활동을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에, 우리는 높은 CO 2 및 가열 처리 (EHN) (그림 2-6)에 노출 된 토양에 주위 기후 조건 (ACN)을 경험 한 토양을 비교 실험 기후 연구에서 대표적인 결과를 제시한다. 모든 플롯 식물 덮개가 지연 C4 잔디 Bouteloua 박근 (HBK)에 의해 지배 북부 혼합 잔디 프레리의 특징이었다. 두 C3 잔디, Hesperostipa comata 트리니티와 Rupr. 및 Pascopyrum smithii (Rydb.은) 식물의 약 20 %는 사초와 forbs으로 구성되어있다. 사이트 설명 및 현장 실험 설계에 대한 자세한 정보는 참조 28-30에서 찾을 수 있습니다. 프라이머는 변경 기후 C에 응답 토양 EEAs을 평가 1.5 cm 직경의 코어를 사용하여 치료 플롯 각각 내의 두 개의 다른 깊이 (0~5센티미터 5-15 CM)로부터 회수onditions. 우리의 예에서 (즉, 2-6 피규어), 표본의 크기는 (N = 3). 에 관계없이이 최소 샘플 크기에 변화는 대부분의 경우에 상대적으로 작은 (오차 막대에 의해 설명되는 것과 같이)와 견고하게 처리 플롯 사이에 잠재적 인 EEAs의 변화를 반영한다. 차이 (ANOVA)와 Tukey에 사후 다중 비교 분석은 치료의 플롯과 토양의 깊이 사이에서 효소 활성에 상당한 변화를 식별하는 데 사용되었다.
아래의 대표적인 결과가이 높은 처리량, 형광 분석 (2) 방법 EEA 화학량 (3)의 관계 생태계 레벨 프로세스 나타낼 수 수, 토양 (1) 전체적인 EEA를 테스트하는 데 사용할 수있는 방법을 보여주기 위해 제공되었다 배양 온도와 EEA 사이. 토양 EEA의는 일반적으로 토양의 영양 순환에 미생물 기능의 변화를 관련시키는 연구되며, 기후 변화, 식물 사회의에 대한 응답으로 미생물의 영양 요구를 평가하는 유용한 지표hifts, 그리고 더 넓게 31-33를 작동 생태계. EEA 화학 양론은 최근에 환경 조건 5에 해당하는 잠재적 인 미생물의 영양 불균형을 평가하기 위해 생태 화학 양 론적 이론과 생태의 신진 대사 이론을 교차하여 토양의 생화학 적 영양의 순환을 평가하는 지표로 채택되었다. 많은 연구는 다양한 화학 양론 비는 영양이 성장의 한계 34-36 나타내는 것을 제안하고, 토양의 영양분이 제한됨에 따라, 미생물 부족한 영양소 (37)를 취득하는 특정 효소를 생산하는 대사 자원을 할당하여 응답. Ecoenzymatic C : N : P 화학 양론 비는 다양한 환경 교란에 대한 응답으로 잠재적 인 미생물 군집의 영양 요구에 상대의 변화를 확인하는 것이 유용하다 5. 마지막으로, EEAs의 온도 민감도는 토양 미생물의 커뮤니티 기능 다양성 가능성이 온도 변화에 의해 영향을 어떻게 평가하는 것이 유용 할 수있다 <> 7,38 한모금. 효소 온도 민감도 널리 단일 효소 클래스의 토양에 따라 다를 수 있고, 효소를 생산하는 미생물 지역 사회는 역사적 조건 7에서 기후 변화에 대응하는 효소 활성의 변화를 증명하고있다. 따라서 EES의 열 생태 관련 효소 활성의 질문은 39,40 변경 기후에 대응하여 미생물의 기능 역학과 belowground 생태계 과정을 평가하는 유용한 방법이 될 수 있습니다.
이 예에서, 잠재적 인 C-, N-, 0-5 센티미터 토양 깊이에서 정량 P-효소 수집 활동은 실험 치료 (그림 2a)로 차이가 없었다. 그러나 5 ~ 15 센티미터 토양 깊이에서, 몇 가지 잠재적 인 EEAs 크게 (그림 2b)에 차이가 없었다. 예를 들어, β-1 C-분해 효소는, 4 - 글루코시다 아제 및 β-D-cellobiohydrolase는 (0.038 ≤ P는 그림 2B) EHN 플롯에서 낮았다 ACN 플롯에 비해. N과 P 광부효소 (각각 β-1, 4-N-acetylglucosaminidase 및 포스 파타 아제) alizing하면 (0.012 ≤ P는 그림 2B) EHN 플롯도 낮았다 5~15센티미터 토양 깊이에 ACN 비교.
의 합계를 계산하고 음모를 꾸미고 모든 C-, N-또는 P-순환 가능성 EEAs 잠재적 토양 C-, N-, 및 / 또는 P-사이클 (그림 3)에 대한 폭 넓은 패턴을 관찰 할 수있는 유용한 방법이 될 수 있습니다. 이 예에서, β-1, 4 - 글루코시다 아제, β-D-cellobiohydrolase, β-Xylosidase 및 α-1, 4 - 글루코시다 가능성 EEAs의 합은 잠재적 인 C 순환 활동을 표현하기 위해 계산되었다. β-1 ,4-N-acetylglucosaminidase과 L-로이신 아미노 펩 티다 제의 합은 잠재적 N 순환 활동을 표현하기 위해 계산되었다. 포스 파타 아제는 잠재적 P 순환 활동을 나타내는 데 사용되었다. 이 예에서는 전체 C-, N-및 P-자전거에 대한 잠재적 EEAs는 EHN 5-15 센티미터 토양 깊이에서 ACN 플롯에 비해 플롯 (Figu 더 낮은 추세다시 3). 그러나,이 추세는 (0.046 ≤ P, 그림 3) 총 N과 P 순환 활동 만 중요했습니다. 토양 EEAs 크게 (그림 3) 0~5cm 토양 깊이에서 치료 플롯 사이에 차이가 없었다. 이 예제의 결과는 토양의 깊이에 대한 응답으로 효소 활성 기능 그룹의 대조 동향 치료 플롯들 (즉, C-, N-또는 P-분해 효소) (EHN 대 ACN)를 제안한다. 예를 들어, C-, N-및 주변 플롯 (ACN)의 P-굴욕 토양 EEAs는 역 패턴 (그림 3a-C을 보여 높은 CO 2 및 난방 (EHN)에 노출 된 토양에 비해 낮은 깊이에서 높은 추세 ).
효소 화학 양론 환경 (그림 4)에서 잠재적 인 효소의 활동을 평가하는 또 다른 유용한 방법입니다. 영양소에 대한 미생물의 수요는 환경 관련 미생물 바이오 매스의 원소 화학 양론에 의해 결정된다영양 가용성 32. 마찬가지로, 미생물은 생태 화학량 41이라고 그들의 토양 환경 내의 영양소의 요구를 충족하는 특정 효소 (즉, C-, N-또는 P-분해 효소)를 생산한다. 잠재적 EEAs의 비율은 미생물의 영양 요구를 평가하는 하나의 방법입니다. 예를 들어, 둘 사이에 1:1의 비율 (C의 예를 들면 : N 영양 취득) 작용기를 효소 미생물 바이오 매스 C 고려할 때 N에 대한 수요가 C에 대한 수요가 높은 기준으로 제안했다 : 지역 사회 수준에서 N 비율을 일반적으로 8시 1분 42입니다. 이 예에서, 토양 효소의 화학 양론의 C : N, C : P 또는 N : P의 활동은 크게 0-5cm 토양 깊이 (그림 4a-C)에서 치료 플롯 사이에 차이가 있습니다. 그러나, 잠재적 인 효소 C : P 및 N : P 비율은 EHN 높았다 5-15 센티미터 토양 깊이에서 ACN 플롯에 비해 플롯 (P = 0.05;도 4B 및 4C). 이 관측은 제안하는이상대적으로 높은 P 광물의 EEAs는 C와 N EEA 비교된다 5-15 센티미터 토양 깊이에서 (EHN에 비해) ACN 플롯. 효소 C : N 인해 EHN에 비해 낮은 깊이에서 ACN 플롯의 높은 잠재적 인 C EEAs에 (그림 4a) : N 인수 활동 비율이 높은 C와 총 C EEAs에 의해 증명과 유사한 경향을 보여 주었다.
온도 강하게 토양 EEAs 영향을 미칠 수있다. 그러나, 일반적인 실험실 분석에서, 토양 효소는 현장 온도 조건에 일치하지 않을 수 있습니다 단일 온도에서 측정한다. 우리의 형광 효소 분석 방법은 우리가 비교를 위해 여러 실험실 배양 온도를 통합하여 현장 온도 효과를 고려 할 수 있습니다. 여러 온도에서 실험실 배양을 사용하여 우리는 아 레니 우스 플롯 및 Q (10) 계산을 사용하여 온도에 따라 효소 반응 속도의 데이터를 분석 할 수 있습니다. 아 레니 우스 플롯는 활성화 에너지를 시각화하는 데 사용되며, 우리를 꾸몄다x-축에 켈빈 (1 / K)로 전환 역 온도의 함수로서 효소 활성의 대수 (Y 축 종속 변수)를 보내고 (즉, 독립 변수,도 5a-c). 활성화 에너지는 일반적으로 화학 반응 (즉, 더 작은 제품에 관련 기판을 저하)를 촉진하기 위해 필요한 최소한의 에너지로서 정의된다. 우리의 목적을 위해, 활성화 에너지는 효소 촉매 반응의 온도 감도에 대한 프록시로서 기능한다. 높은 활성화 에너지는 효소의 온도 민감도를 나타냅니다. 마찬가지로, 활성화 에너지 (즉,도 5D-F)가 직접 Q 10 값 (즉,도 6a-C)에 해당합니다. 활성화 에너지와 실제적인 응용을 계산하는 데 사용되는 식의 추가적인 설명이 많은 과거에서 찾을 수 40,43-45 작품. 아 레니 우스 플롯, 활성화 에너지 및 Q 10 플롯은 중복 된 정보와하지 말아야 제공모든 간행물에 대한 데이터를 제시 동일 원고에 사용될 수 (도 5 및 6). 역학 데이터 10 - 이러한 기술을 사용하는 경우 따라서, 당신의 효소 온도에 가장 적합한 플롯 유형을 선택하는 것이 필요하다. 모든 플롯 유형 (아 레니 우스와 Q 10) 데모 용으로 여기에 소개 된, 효소의 결과를 제시하는 방법을 시각적으로 예제를 제공 할 수 있습니다.
우리의 예에서, 우리는 잠재적 인 C-, N-, 두 토양 깊이에서 모두 처리 플롯 사이에 P-EEAs 가능성 효소 동력학 평가 (그림 5, 그림 6). 발견은 EEAs의 온도 감도는 아 레니 우스 플롯 (도 5a-C) 및 해당 활성화 에너지 (그림 DF)와 (당연히) Q 용에서와 같이 활성화 에너지에 대한 토양 깊이 하나의 치료 플롯 사이에 유의 한 차이가 있었다 시연 10 PLO(;도 6a-C 15 ° C와 25 ° C의 실험실 배양 사이의 예에서) TS. 이 효소의 반응 속도가이 특정 연구 분야의 실험 처리에 의해 영향을하지 않은 것이 좋습니다.
표 1. 이전의 배양에 깊은 우물 판에 토양 샘플 조직 및로드 형광 표준 (MUB 또는 MUC)에 대한 토양 시료와 형광 표준 농도에 대한 깊은 우물 플레이트 디자인. 템플릿. 참고 : 열은 같은 토양 시료 (토양 슬러리 추가 800 μL)를 나타냅니다. 형광 표준 농도 구배 각 행 (200 μL를 추가)에로드됩니다. 각 셀은 형광 표준 농도 플러스 토양 슬러리의 추가를 나타냅니다. 예를 들어, S1 - S12은 토양 시료 (토양 슬러리의 800 μL)를 나타냅니다; MUB ~ 100 μM = 4 Methylumbelliferone 농도 (200 μL를 추가). 이 예에서, 행 H가 열려, 필요한 경우 더 높은 형광 표준 농도를 포함 결과적으로 사용할 수 있습니다. 표준 곡선의 농도를 증가하는이 결정은 특정 토양 샘플에 대한 높은 잠재 효소 활성 (및 / 또는 사용되는 기질 농도)에 대한 필요가있다. 귀하의 샘플에 대한 잠재적 인 효소 활성은 표준 곡선 값의 범위 내에 있어야합니다. 큰 테이블을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
표 2. 조직과 사전 배양에 깊은 우물 판에 토양 샘플 및 기판을로드하기위한 기판. 템플릿으로 토양 시료에 대한 깊은 우물 플레이트 디자인. 참고 : 열은 같은 토양 시료 (그래서 800 μl를 나타냅니다일리노이 슬러리 추가). 다른 기판은 (200 μL의 추가는) 각 행에서로드됩니다. 각 셀은 토양 시료 플러스 기판의 추가를 나타냅니다. 예를 들어, S1 - S12은 고유 한 토양 시료 (토양 슬러리의 800 μL)를 나타냅니다. 기판 (200 μL의 추가는) 다음을 포함한다 : BG = 4 - 메틸 움의 β-D-글루 코피 라노를, CB는 = 4 - 메틸 움의 β-D-cellobioside, NAG는 4 - 메틸 움 N-아세틸-β-D-glucosaminide을 =; PHOS = 4 - 메틸 움 인산 : XYL = 4 - 메틸 움-β-D-xylopyranoside, AG = 4 - 메틸 움의 α-D-글루 코피 라노, 그리고 LAP = L-류신-7-아미도 -4 - 메틸 쿠마린 염산염. 이 예에서, 행 H가 열려, 원하는 경우 다른 잠재적 인 효소 활성을 평가하는 다른 기판을 포함 결과적으로 사용할 수 있습니다. 큰 테이블을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
| 온도 | 시간 |
| 4 ° C | ~ 23 시간 |
| 15 ° C | 6 시간 |
| 25 ° C | 3 시간 |
| 35 ° C | 1.5 시간 |
표 3. 인큐베이터 온도 인큐베이션 기간을 대응 필요한. 인큐베이션 온도와 효소 분석 과정에 대한 대응하는 시간주기.
표 4. MUB 및 MUC 표준 곡선의 계산. 구성하는 방법을 보여줍니다) MUB와 b) MUC 원시 형광 데이터 (μmol) 이후 기울기, y 절편, 및 R-제곱 값을 계산합니다. , 표준 농도 곡선의 기울기, y 절편, 및 R-제곱 값을 계산 선택 (또는 그래프)MUB 및 / 또는 독립 변수 (X 축)와 종속 변수 (y 축) 및 표준 농도 (μmol)로 MUC 원시 형광 데이터. 참고 :. MUB = 4 - 메틸 움을, MUC = 7 - 아미노 -4 - 메틸 큰 테이블을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
표 5. . μmol 활동 / g 건조 토양 / 시간 : 효소 활성 계산) 샘플 원시 형광 데이터를 정리하고 이후에 EEAs을 계산하는 (BF)에 필요한 단계를 수행하는 방법을 보여줍니다. 참고 : S1 - S12 고유의 토양 샘플을 나타냅니다. 기판은 다음을 포함한다 : BG = 4 - 메틸 움의 β-D-글루 코피 라노를, CB는 = 4 - 메틸 움의 β-D-cellobioside, NAG는 4 - 메틸 움 N-아세틸-β-D-glucosaminide을 =; PHOS = 4 - 메틸 움 포라고sphate : XYL = 4 - 메틸 움-β-D-xylopyranoside, AG = 4 - 메틸 움의 α-D-글루 코피 라노, 그리고 LAP = L-류신-7-아미도 -4 - 메틸 쿠마린 염산염. 큰 테이블을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 1. 독립 변수 (X 축)와 종속 변수 (y 축) 및 표준 농도 (μmol)와 같은 원시 형광 데이터 표준 곡선의 MUB 표준 곡선의 줄거리. 산점도 시각화.
그림 2. C, N 및 P 순환 효소 활성. 프레리 난방 및 상승 CO 2 욕실에서 잠재적 EEAs제어 플롯 richment (PHACE) 사이트 (ACN : 주변 기후 조건에 노출)과 치료 플롯 (EHN : 온도 상승과 높은 CO에 노출 2). 토양 효소) 0-5cm 토양의 깊이와 b) 5~15센티미터 토양 깊이에서 측정 하였다. 수직 막대는 ± SE 주를 의미 대표 : ACN = 대기 - 기후 플롯을, EHN는 = 높은 CO 2 및 난방 플롯. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 총 C, N과 P의 자전거는 화학 양론 비 효소) C, B) N의 인수에 참여 가능성 EEAs의 합, 및 C) PHACE 실험에서 두 치료 그룹 P-에를 0-5cm 5시. - 15cm의 토양 안쪽. Vertical 바 ± SE 주를 의미 대표 : ACN = 대기 - 기후 플롯을, EHN는 = 높은 CO 2 및 난방 플롯. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. (: 기후 조건, 주위에 노출 ACN) 및 치료 플롯 (EHN. 총 C, N 및 P 순환 효소 활성 프레리 난방 및 상승 CO 2 농축 제어 플롯 (PHACE) 사이트에서 효소 수집 활동 화학 양론 비에 대한 효소의 화학 양론 : 온도 상승에 노출 높은 CO 2). 총 토양) C : N, B) C : P와 C) N : P는 0-5cm 5-15 센티미터 토양 깊이에서 두 치료 그룹을 꾸몄다. 수직 막대는 평균 ± SE 주 대표 : ACN= 대기 - 기후 플롯, EHN = 높은 CO 2 및 난방 플롯. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. . C)뿐만 아니라 전체 D에 대한 해당 활성화 에너지 값; 전위 EEAs의 전체 C, N 및 P 순환 효소 활성화 에너지 온도 감도 다운로드) C, b) N에 대한 아 레니 우스 플롯을 사용하고, c) P 분해 효소 카달로그 , E) N, 및 F) P 프레리 난방 및 상승 CO 2 농축 (PHACE) 사이트에서 처리 플롯과 토양의 깊이 사이 분해 효소. ACN = : 활성화 에너지 (즉, DF)를위한 수직 막대는 ± SE 주를 의미하는 표현mbient - 기후 플롯, EHN = 높은 CO 2 및 난방 플롯. 출판의 경우, 저자는 일반적으로 아 레니 우스 플롯 (즉, AC) 또는 활성화 에너지 값 (즉, DF),하지만 두 플롯 유형 중 하나를 제시하는 것을 선택할 것이 중요합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 6. 총 C, N과 P 순환 효소 Q10 (15 ~ 25 ° C). 온도 총) C, B) N 15 ° C와 25 ° C에서 실험실 배양에 따라 Q (10)로 측정 가능성 EEAs의 민감도 및 C) P 프레리 난방 및 상승 CO 2 <에 치료 플롯과 토양의 깊이 사이 분해 효소/ 서브> 농축 (PHACE) 사이트. Q10를위한 수직 막대는 ± SE 주를 의미 대표 : ACN = 대기 - 기후 플롯을, EHN는 = 높은 CO 2 및 난방 플롯. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
잠재적 인 토양 EEAs의 실험실 기반의 측정은 생태계의 기능에 중요한 자신의 비 생물 적 환경에 대한 미생물의 반응에 대한 통찰력, 그 결과를 제공 할 수 있습니다. 이 예제 데이터 세트의 결과는 최소한의 차이가 기후 처리 플롯 사이 토양 효소의 활동이나 반응 속도에 존재하는 것이 좋습니다. 그러나, 플롯 사이에 역 추세는 토양 수분, 토양의 pH 또는 식물 성장 등의 미생물 EEAs의 생산에 영향을 미칠 수있는 공변량의 추가 조사를 바랍니다. 전반적으로, 토양 (1) 전체적인 EEA, (2) EEA 화학량 (3) 아 레니 우스 플롯 / 활성화 에너지, 및 (4) Q 10은 에코 레벨 프로세스를 나타낼 수있다 접근법의 넓은 스펙트럼을 제공의 측면에서 EEAs을 평가 견고 토양 생태계 기능 역학의 특성을있는.
높은 처리량의 형광 기반의 유럽 경제 분석은 널리 토양의 잠재적 EEAs을 검사하는 데 사용되는 유용한 도구다른 환경. 중요한 것은, 잠재적 인 활동은 효소 풀 크기를 반영하고, 스스로 효소 생산 매출 비율 46의 양을하지 않습니다. 기술은 비교적 간단하지만, 실험실 프로토콜 사이에 겉으로는 약간의 차이가 결과 (13)의 비교를 방해 할 수 있습니다. 불행하게도, 우리는 현재 EEAs에 적합한 표준화 된 양성 대조군이 없습니다. 화학 양론 비의 사용은 이러한 문제를 극복하기위한 하나의 접근 방법이다. 그렇지 않으면, 높은 처리량 기술의 출현은 환경 소재 효소의 연구를 진행했다. 이러한 분석법에 의해 생성 된 데이터의 신중한 해석 미생물 활성의 중요한 경향을 명료있다.
프로토콜의 안정성은 개별 샘플에 특정 조건을 선택할 수있는 능력에서 유래하지만,이 또한 제한 될 수 있습니다. 변형 시리즈 샘플이 정확하게 측정되도록해야 할 것이다 개별 필드 사이트 :
완충기
당신이 선택하는 버퍼는 토양의 pH에 따라 달라집니다. 버퍼링은 27,47 높은 산도 의존 형광 표준의 형광 강도를 안정화시킨다. 샘플의 pH 레벨 - 우리가 일반적으로 토양 슬러리를 만들기 위해 사용하는 pH 완충는 베스트 매치 토양 버퍼의 특정 산 해리 상수 (pKa가)에 대해 선택된다하는 50 mM 소듐 아세테이트 또는 트리스 완충액이다. 나트륨 아세테이트 4.76의 pKa를 가지며, 트리스 8.06의 pKa가 마련되어 있으므로 이들 두 버퍼의 양이 각각의 샘플에 대해 소망의 pKa에 도달하기 위해 변화 할 것이다. 인산 버퍼 (의 pKa = 7.2) 중립 / 약간 기본 토양을 위해 제안되었다. 그러나, 우리는 높은 인산염 농도가 효소 활성을 방해 할 수 있으므로,이 버퍼를 사용하기 전에 예비 연구에서 분석 변동성을 테스트하기 위해주의.
형광 기판의 취급 및 저장 방법
jove_content "> 형광 분석은 빛에 노출되면 불순물 및 / 또는 여러 형광 화합물의 불안정성에 의한 간섭으로 고생 할 수 있으므로 형광 기판을 처리 할 때주의가 필요합니다. 우리는 강력하게 형광 기판과 MUB 및 MUC 기준을 표시 할 수있는 빛의 노출을 최소화하는 것이 좋습니다 . 호박색 유리 병을 사용하거나 형광 기판과 표준을 만들고 저장하는 데 사용되는 유리 용기를 커버하는 것이 좋습니다, 유리 및 용기 포장에 알루미늄 호일은 잘 작동 마찬가지로 효율적으로 번호판을 접종하고 어두운 창업 보육 센터에 전송하는 가장 좋은 방법은 우리가하는 것이 좋습니다.. (-20 ° C)에 대한 더 이상 2 개월 (빛으로부터 보호하면서) 기판과 표준을 저장하고, 해동 기판 (5 ° C) ~ 전에 효소 분석 (들)을 시작으로 24 ~ 48 시간.디자인 및 복제
뿐만 아니라 샘플 변화에 negativ 구현하기위한 최선의 계정에전자 분석 컨트롤과는 분석 복제 (가능이있는 경우)을 추천합니다. 변이는 전형적으로 각 웰에있는 토양 입자의 양의 차이와 피펫 팅의 오차로 발생한다. 따라서, 강한 혼합과 좋은 피펫 팅 기술은 실질적으로 잘 변화에 잘 최소화 할 수 있습니다. 또한, 우리는 강력하게 시간이 지남에 따라 기판의 일관성을 모니터링하는 음의 분석 제어 (버퍼 + 기질 용액)을 구현하는 것이 좋습니다. (우리는 일반적으로 96 - 웰 플레이트 상에 마지막 열을 사용하여) 음성 대조군 웰과 비교하여 효소 플레이트를 읽을 때 이는 쉽게 모니터링 할 수있다. 네가티브 기판 컨트롤 따라서 확실히 검출 한계 이상 신호가 증가, 그것은 기판 및 / 또는 표준 용액의 보충을 필요로하는, 오염 또는 기판 불안정성 나타낸다 전형적 안정하다.
다른 프로토콜은 한 종류의를 수행하지만 처리량을 최대화하기 위해, 우리의 프로토콜은 하나의 깊은 우물 마이크로 플레이트에 몇 가지 잠재적 인 EEAs을 포함다른 EEAs 이후 판 (플레이트 당 즉, 하나의 기판) 당 분석은 서로 다른 속도로 발생합니다. 에 관계없이, 효소 최적화 방법 또는 단판 방식을 통해 높은이를 수행하기 전에 토양에서 수행해야합니다. 반응 속도는 배양 기간 내에 각 효소에 대해 상대적으로 일관성있는 경우 다중 기판은 단판에 사용될 수있다.
~ 1g 다른 프로토콜 (24)에 추천 동안 우리의 프로토콜은, ~ 슬러리 용액을 2.75 g의 토양을 권장합니다. 우리는 더 많은 토양 (가능한 경우)를 사용하여 내 샘플 효소 활성 수준의 토양 변화 잘 포착 할 수있는 효과적인 방법입니다하는 것이 좋습니다. 다른 사람은 기판의 50 μL와 토양 슬러리 200 μl를 배양하는 동안이 프로토콜에서는, 우리는 200 μL 기판과 토양 슬러리 800 μl를 품어. 이것은 단순히 궁극적으로 측정 활동을 변경하지 않는 것을 업 스케일링 기능입니다. 실제적인 장점도 있습니다큰 볼륨을 사용하십시오. 하나는, 그것은 형광 분석기에 강도를 촬영하기 전에 블랙 평면 바닥 96 - 웰 플레이트 대응에 피펫 팅하는 동안 토양 입자를 방지하는 것이 더 쉽습니다. 효소 관련 형광 강도를 기록하기 전에 형광 분석기에 검은 색 바닥이 평평한 96 - 웰 플레이트를 전송하는 동안 둘째, 추가 볼륨이 실수로 유출하는 경우에 유용합니다. 볼륨도 약간의 편차가 크게 우물 사이에서 형광을 감소합니다. 마지막으로,이 때문에 프로토콜의 높은 처리량 자연, 우리는 일반적으로 오히려 분석은 복제 수행하는 것보다 효소 활성 수준의 변화를 표현하기 위해 실험적인 복제에 의존 선출. 항상 분석은 복제를 포함하는 가장 좋은 방법이지만, 실제로, 우리는 우리의 프로토콜은 제한된 자원 주어진 분석 및 실험은 복제 사이의 균형 균형을 제공합니다 생각합니다. 마찬가지로, 우리의 접근 방식은 내재하는 분석 (25) 당 상대적으로 더 잘 균질화 토양 (2.75 g)을 사용하여ntly 내 토양의 변화 감소한다. 분석 복제물을 사용하는 결정은 신중하게 예비 연구 (48)에 분석 오차를 테스트하여 고려되어야한다. 그러나, 우리는 4 개 미만 치료 그룹은 복제와 실험적인 디자인이 강하게 분석을 복제 사용을 고려해야하는 것이 좋습니다.
토양, 버퍼 볼륨 및 기질 농도 최적화
토양 버퍼 : 기판 농도비는 효소 분석을 수행 할 때 강하게 형광 측정에 영향을 미치는 중요한 변수이다. 슬러리 중의 토양의 양을 검정 또는 기판의 농도는 토양 샘플에서 효소의 활성에 따라 조정해야 할 수도 덧붙였다. 이 예를 들어 선택한 금액이 그 기판의 가용성이 우리가 분석 조건 (V 최대)에서 최대 잠재력 속도를 측정 한 것을 비 제한적인 되었나요 보장하기 위해 이러한 토양의 이전의 테스트를 기반으로했다 44,45. 그러나, 효소의 높은 농도가 토양 샘플에 대해, 토양 기질 농도의 양이 증가되어야한다. 우리는 기질 농도가 증가 (및 그에 따라 표준 곡선을 조정하기) 곡선의 선형성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 발견 하였다. 따라서, 우리는 필요에 따라 볼륨을 버퍼링하는 토양의 양 및 / 또는 비례 조정을 줄이는 것이 좋습니다. 상관없이, 그것이 측정 EEAs 포화 및 서브 포화 기질 농도 (26) 사이의 큰 강도의 순서에 따라 다를 수 있기 때문에, 각 정량 토양 유형에 대한 기질 농도를 최적화하는 것이 중요하다. 따라서 실험먼트 (등) 간의 차이는 유형 II 통계 오류 및 하위 포화 조건에서 검출 될 가능성이 적습니다, 통계 오류 27,35에 감염 될 수 있습니다. 기질 농도를 최적화하기 위해, 예비 효소 분석법은 기질 농도의 넓은 범위를 사용하는 대표적인 토양 샘플에서 수행한다. 후형광을 기록하는 것은, 단순히 (마찬가지로 표준 곡선을 실시 예,도 1)의 데이터를 플롯 활성 (Y 축) 효소 대응 기질 농도 (x-축)를 식별하는 곳에 경사 레벨 오프 (~ 0). 마찬가지로, 경사 레벨 오프 (~ 0) 특정 토양에 대한 최적의 기질 농도의 좋은 지표 인 점에 대응하는 기질 농도.
이 분석은 궁극적 효소 - 중재 기판 해중합의 결과로서 기판으로부터 절단되고 형광 부분에 의해 생성 된 관련 시간에 따른 형광을 측정한다. 그 때문에, 5 단계 (기판 가산) 중요하며 기판 토양에 첨가 될 때 분석법이 인큐베이션 때 사이의 시간을 최소화하기 위해 가능한 효율적으로 수행되어야한다. 기판 샘플과 접촉하면 마찬가지로, 효소 반응이 발생하기 시작합니다. 우리는 멀티 채널을 사용하는 것이 좋습니다이러한 이유로 피펫. 그것은 강력하게 이전에 하루에 당신이 당신의 효소 분석을 수행하는 멀티 채널 피펫을 사용하여 효율적으로하는 것이 좋습니다. 당신은 쉽게 피펫으로 96 - 웰 플레이트에 볼륨을 전송할 수있을 때까지이 작업을 수행하기 위해, 당신은 물을 피펫 팅을 연습 할 수 있습니다.
토양 담금질
담금질은 토양 슬러리 - 배양 26, 분진 및 / 또는 유기 물질에 의한 형광 강도의 감소를 의미한다. 버퍼 비율 25 : 소광 토양을 조정함으로써 영향을받을 수있다. 때문에 각각의 샘플에서 배경 형광, 그것은 배경 (담금질) 형광을 설명하는 샘플 표준을 실행하는 것이 중요합니다. 일부 프로토콜 신호가 선형 것을 테스트 한 후 하나의 농도를 사용하지만, 우리는 강력하게 냉각의 영향에 가장 컨트롤에 각각의 샘플에 대한 표준 담금질 제어를 구현하는 것이 좋습니다. 이렇게하지 않으면 서 발생합니다샘플에 적용 할 수없는 ARD 곡선, 그리고 효소 활동의 잘못된 추정. 또 표준 샘플의 형광 배경에 영향을주지 않는 한 토양 슬러리에 표준의 추가는, 시간에 민감하지 않다.
NaOH를 추가
NaOH를 첨가 합성 기질로부터 방출 형광 염료> pH에서 9.0 26,49을 피크 형광을 나타내는 형광 때문에 효소 활성 측정을 최적화하기 위해 어떤 프로토콜이 사용된다. 이 제안을 고려할 때, 토양 슬러리의 pH (즉, pH를> 15까지)에 필요한 수산화 나트륨의 농도는 특히 토양에 의존 될 것이다 pH 완충 26을 사용했다. 그러나, 다른 신호의 강도가 더 낮은 pH에서 일반적으로 매우 높고, 때문에 측정 오차의 추가 소스를 도입하기 때문에 수산화 나트륨이 필요하지 않을 수 있다고 주장한다. 예를 들어, 슬러리의 pH 따라서 MUB 또는 MUC fluore에서의 NaOH의 첨가 효과시간 25 내려와 변경. 최대 60 분 (26)에 형광을 감소 MUC 꾸준한 시연하면서, MUB 연결 기판 레벨은 테이퍼 전에 수산화 나트륨의 추가에 따라 20 분 동안 일관된 증가 형광을 설명하기 위해 표시되었습니다. 따라서, NaOH를 첨가하고 형광 측정의 시간을 표준화하는 것이 중요하다. 형광 수준의 NaOH를 첨가하지 않고 분석을 수행하는, 첨가하지 않고 충분히 검출되는 경우 또는, 동등하게 허용 가능한 대안 26로서 제시되었다.
온도
배양 온도를 결정할 때 온도 감도가 고려되어야한다. 주요 관심사는 도시 된 바와 같이 (결과 섹션에서) 아 레니 우스 플롯을 사용하여 세 개 이상의 온도를 사용하여, 효소 반응 속도론을 승낙하는 경우 강력한 방법이다. 샘플 사이트는 다음 영구 동토층의 토양, duratio 같은 특징적으로 저온이있는 경우배양 n은 추운 배양 온도에서 반응하는 효소를 허용하도록 확장해야 할 수도 있습니다. 기존의 효소 반응 속도는 온도의 증가는 증가 된 효소 활성 될 것을 제안하는 동안, 우리는 효소가 온도 감도 (50)의 측면에서 특정 사이트가 될 수 있다는 것을 발견했다. 따라서 부위 특이 적 효소 활성 전위를 이해하기 때문에 배양 온도 및 지속 시간은 필드 위치 값을 반영하도록 조정하는 것이 중요하다.
결론
EES는 토양에서 생지 화학 과정의 중요한 드라이버이며, 따라서 우리는 그들의 활동을 측정 할 수 있어야합니다. 간섭 억제 등의 토양에서 EEAs을 측정하는 많은 도전이 있습니다. 이러한 어려움에도 불구하고, (여기서 설명 된 것과 같은) 표준 프로토콜은 보편적 효소의 광범위한 EEAs을 측정하기 위해 적용될 수있다. 그것에서보기 이러한 프로토콜 다음의 품질 데이터를 생성하기 위해 매우 쉽지만생태 학적 맥락에서이 데이터의 terpretation는 이러한 분석을 실제로 측정하는 것을 신중하게 고려를 필요로하는 방법과 분석 조건에서 EEAs는 현장 조건에 따라 다를 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
본 자료는 미국 국립 과학 재단 (DEB 번호 1021559)에 의해 지원되는 환경 연구 조정 네트워크 연구에서 효소에 의해 투자되었다. 이 연구는 미국 국립 과학 재단 (DEB 번호 1,021,559), 과학의 에너지 사무실 (생물 환경 연구)의 미 교육부에 의해 지원되었다. 이 자료에 표현 된 의견, 연구 결과, 결론 또는 권장 사항은 저자의 것이며, 반드시 미국 NSF의 의견을 반영하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (AG) | Sigma Aldrich | M9766 | Sugar degradation |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside (BG) | Sigma Aldrich | M3633 | Sugar degradation |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside (CB) | Sigma Aldrich | M6018 | Cellulose degradation |
| L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP) | Sigma Aldrich | L2145 | Protein degradation |
| 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide (NAG) | Sigma Aldrich | M2133 | Chitin degradation |
| 4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS) | Sigma Aldrich | M8883 | Phosphorus mineralization |
| 4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside (XYL) | Sigma Aldrich | M7008 | Hemicellulose degradation |
| 4-Methylumbelliferone (MUB) | Sigma Aldrich | M1381 | |
| 7-Amino-4-methylcoumarin (MUC) | Sigma Aldrich | A9891 | |
| 50 mM Sodium acetate anhydrous buffer | Fisher Scientific | S210-500 | acidic and neutral soils |
| 50 mM Tris base buffer | Fisher Scientific | BP154-1 | basic soils |
| Equipment | |||
| Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs | Fisher Scientific | 14-512-65 | pipetting reservoir |
| Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel | Fisher Scientific | 13-684-265 | 8-channel pipette, range: 50-1,200 μl |
| TipOne 101-1,250 μl extended length natural tips | USA Scientific | 1112 - 1720 | 10 racks of 96 tips (960 tips) |
| Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in. | Fisher Scientific | 11-100-100SH | Lab disc magnetic stir plate |
| Waring blender | Fisher Scientific | 14-509-7P | Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container |
| BRAND Dispensette III bottle-top dispensers | Fisher Scientific | 13-688-231 | Dispenser; range: 5-50 ml |
| Wheaton Unispense μP peristaltic pumps | Fisher Scientific | 13-683-7 | Optional dispenser |
| Fisherbrand magnetic stir bar | Fisher Scientific | 1451363SIX | Used to stirr soil slurry afer blending |
| Pyrex glass bowls | World Kitchen | 5304218 | Pyrex 10 oz rimmed custard cup |
| Costar 96-well black solid plates | Fisher Scientific | 07-200-590 | Used for plate reader step |
| Costar 96-well assay blocks | Fisher Scientific | 07-200-700 | V-bottom; 2 ml; sterile |
| Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats | Fisher Scientific | 14-387-93 | Sterile 96-well cap mat for square wells |
| Centrifuge equipped with holders for deep-well plates | Thermo Scientific | 3121 | Centra-GP8 (this model is no longer available) |
| Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader | Tecan | 30016058 | Plate reader (this model is no longer available) |
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