Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Høy gjennomstrømming Fluorometrisk Måling av mulig Jord Ekstracellulære enzymaktivitet

Published: November 15, 2013 doi: 10.3791/50961
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1
1Natural Resource Ecology Laboratory, Colorado State University, 2Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Bioengineering, University of Colorado

Summary

For å måle mulige priser av jord ekstracellulære enzymaktivitet, er syntetiske substrater som er bundet til et fluorescerende fargestoff lagt til jordprøver. Enzymaktiviteten blir målt som den fluorescerende fargestoff frigjøres fra substratet ved en enzym-katalysert reaksjon, hvor høyere fluorescens indikerer mer substrat degradering.

Abstract

Mikrober i jord og andre miljøer produserer ekstracellulære enzymer for å depolimerisering og hydrolyserer organiske makromolekyler slik at de kan bli assimilert for energi og næringsstoffer. Måling jord mikrobiell enzymaktivitet er avgjørende for å forstå jordøkosystemet funksjonelle dynamikk. Det generelle konsept for den fluorescens enzymanalysen er at syntetisk C-, N-eller P-rike substrater som er bundet med et fluorescent farvestoff tilsettes til jordprøver. Når intakt, trenger de merkede underlag ikke fluoresce. Enzymaktiviteten blir målt som økningen i fluorescens som fluorescerende fargestoffer spaltes fra sine substrater, noe som tillater dem til å fluorescere. Enzym målinger kan uttrykkes i enheter av molariteten eller aktivitet. For å utføre denne analyse er jord oppslemminger fremstilt ved å kombinere jordsmonn med en pH-buffer. PH-buffer (typisk en 50 mM natrium-acetat, eller 50 mM Tris-buffer), er valgt for bufferen er spesiell syre dissosiasjonskonstant (pKa) for å tilpasse jord sample pH. Jord oppslemminger blir inokulert med en ikke begrensende mengde av fluorescensmerkede (dvs. C-, N-eller P-rik) substrat. Ved å bruke jord oppslemminger i analysen, tjener til å minimalisere begrensninger på enzym-og substrat diffusjon. Derfor er denne analysen kontroller for forskjeller i underlaget begrensning, diffusjon priser, og jord pH-betingelser, således oppdage potensielle enzymaktivitetsnivå som en funksjon av forskjellen i enzymkonsentrasjoner (per prøve).

Fluorescens enzym analyser er vanligvis mer følsomme enn spektrofotometriske (dvs. fargemetriske) analyser, men kan lide av forstyrrelser forårsaket av urenheter og ustabilitet i mange fluorescerende forbindelser når de utsettes for lys, så forsiktighet er nødvendig ved håndtering av fluoriserende underlag. Likeledes vurderer denne metoden bare potensielle enzymaktivitet under laboratorieforhold når underlag som ikke er begrensende. Det bør utvises forsiktighet ved tolkning av data som representerer korset-site sammenligninger med ulike temperaturer eller jordtyper, som in situ jordtype og temperatur kan påvirke enzymkinetikk.

Introduction

Ekstracellulære enzymer (EØS) produsert av jordbakterier, sopp og archaea er involvert i utallige biogeokjemiske prosesser, og står sentralt i behandlingen, stabilisering og destabilisering av organisk materiale i jord og næringsstoffer sykling i terrestriske økosystemer en. Ved å produsere EES, jord mikrober bryter ned og forvandle polymere organisk materiale i mindre løselige molekyler, og dermed frigjøre tidligere bundet mikro-og makronæringsstoffer, noe som gjør at planter og mikrober for å assimilere tilgjengelige næringsstoffer fra jorda. EES har blitt studert i flere tiår, først og fremst ved å måle deres aktiviteter i laboratorieanalyser 2-4, siden det er svært vanskelig å direkte oppdage og kvantifisere enzymer.

Ekstracellulær enzymaktivitet (EØS) er det meste sterkt kontrollert ved konsentrasjonen av enzymer og de tilsvarende substrater. Utbredelsen av forskjellige C-, N-og P-nedbrytende enzymer i jord blir styrt av en rekke faktorer including mikrobiell biomasse, samfunnet komposisjon, substrat tilgjengelighet, mikroklima, og støkiometriske krav 5,6. Men in situ EEAS innenfor jordmiljøet er også påvirket av temperaturen 7,8, binding av enzymer til jord leire og humusegenskaper to, og diffusjon begrensninger 9, som til slutt regulerer aktivt enzym bassenget, i forhold til størrelse, substrat tilgjengelighet , og avgang 10-12. Derfor erkjenner in situ grunnforhold er avgjørende når du bruker laboratorie enzym analyser for å tolke jord mikrobiell funksjon på tvers av ulike miljømessige sider.

Mange forskjellige klasser av EØS kan kvantifiseres i laboratorieanalyser ved hjelp av en rekke syntetiske substrater (se "Liste av reagenser Table" for flere detaljer). Noen protokoller benytte substrater i assays som er koplet til en kolorimetrisk reaksjon som kan detekteres med et spektrofotometer, while andre, inkludert protokoll beskrives her, utnytter substrater som er bundet til en fluorescerende rest. Fluorescens EE assays er vanligvis mer følsom (av en størrelsesorden) enn kolorimetriske assays (som anvender et kromogent rest bundet med en syntetisk substrat) 12-14. Følsomhet i EEA deteksjon omfatter to deler: en er relatert til mengden av forbindelsen av interesse påvises, og den andre er relatert til den lavest påvisbare potensial enzymaktivitet. Fremgangsmåter for kolorimetrisk p-nitrofenol (PNP)-baserte analyser kan finnes i fortiden virker 15,16. I korte trekk, jord (typisk siktet til <2 mm, og lufttørket) inkuberes ved optimal eller felt-relevant temperatur og pH. Hastigheten ved hvilken reaksjonsproduktet frigjøres bestemmes kolorimetrisk med et spektrofotometer 14. Jo høyere sensitiviteten til den fluorescens enzymanalyser er delvis på grunn av den mer følsomme påvisning av det fluorogene moiety separasjon forbundet med SUBSTRspiste nedbrytning i stedet for opptak av absorbans etter separasjonen av et spesifikt kromogent resten ved en bestemt bølgelengde. De to mest brukte syntetiske fluorescerende indikatorer er 4-methylufilbelli (MUB) 17 og 7-amino-4-methylcoumarin (MUC) 18,19. MUC-bundne substrater er vanligvis forbundet med N-rik syntetiske substrater slik som proteiner og / eller aminosyrer. Fluorescent teknikker ble først utviklet for vannlevende prøver 20,21, og deres søknad til jord krever kontroller for signal leskende og forstyrrelser 22,23. Analyser kan enten foregå ved hjelp av tradisjonell "benk topp" kjemi med store volumer, eller kan være ansatt i mikrobaserte protokoller, med økt gjennomstrømning, men muligens høyere målefeil. Mens det er flere viden sitert protokoller for fluorescerende påvisning av EEAS i jord 24, mange laboratorier benytter subtile variasjoner på disse protokollene, ofte utilsiktet eller på grunn av forskjellens i laboratorieutstyr eller reagenser. Tilsynelatende små forskjeller i detaljene i protokollene kan sterkt påvirke målt EEAS 25,26 og mangelen på standardiserte enzymer som gjør det utfordrende å kalibrere analyser mellom ulike laboratorier. Dermed er det et viktig behov for formidling av detaljerte protokoller for å oppmuntre til standardisering av EØS-analyser.

I vår-protokollen, jordprøver fremstilt ved å kombinere jordprøver med en pH-buffer og homogeniseres med en blender. De oppslemminger blir så inokulert med en begrensende mengde av fluorescensmerkede C-, N-eller P-rikt substrat, velges avhengig av den spesielle problemstilling av interesse. Ved å bruke jord oppslemminger i enzymanalyser tjener som en kontroll for å minimalisere substratet diffusjonsbegrensninger. De fluorescerende grupper blir slukket før de blir spaltet fra sine respektive substrater, og dermed enzymaktivitet kan bli detektert som det fluorescerende fargestoff er frigjort fra substratet by en enzym-katalysert reaksjon. Den økende fluorescens intensitet over tid reflekterer graden av den enzym-katalyserte reaksjon.

Det generelle konsept for den fluorescens enzymanalysen er at syntetiske substrater som er bundet med en fluorogene gruppe (fluorescerende fargestoff), tilsettes til jordprøver 27. Ved enzym-katalysert nedbrytning substrat, bryter bindingen mellom det fluorescerende fargestoff og substratet. Det fluorescerende fargestoffet frigjort fra substratet blir følgelig brukt som en indirekte evaluering av enzymaktivitet, og kan kvantifiseres ved bruk av en mikroplate-leser til å registrere fluorescens-intensiteten av fargestoffet. I korte trekk, blir fluorescens kvantifisering utført som den frigjorte fargestoff avgir lys av en bølgelengde etter absorpsjon av lys av en annen bølgelengde. Fluorescens-intensiteten er registrert av et plateavleseren i stand til både eksitering og deteksjon. Enzymaktiviteten kan deretter kvantifisert basert på den kjente fluorescerende fargestoff-concentrations av substratet (dvs. kjente mengder av syntetisk substrat tilsatt til jordprøver) i tillegg til å referere til en standardkurve fortynning av fluorescens-intensitetene for det spesifikke fluorogene gruppe av substratet som brukes i analysen, (dvs. 4-methylufilbelli (MUB) eller 7-amino -4-methylcoumarin (MUC)). (Vennligst referer til protokollen seksjon for spesifikke detaljer om enzymaktivitet kvantifisering).

Laboratory jord enzym analyser er nyttige for å vurdere mikrobiell samfunnsfunksjon, men det er flere tekniske begrensninger som brukerne bør kjenne ti. Fluorescens analyser kan lide av forstyrrelser forårsaket av urenheter og / eller ustabilitet i mange fluorescerende forbindelser når de utsettes for lys, så forsiktighet er nødvendig ved håndtering av fluorescerende substrater 25. Jord partikler og / eller organisk materiale i jorda slam kan også forstyrre fluorescensintensiteter, kjent som slukkeeffekt 26.Videre laboratorieenzymanalyser bare vurderer potensielle EEAS under laboratorieforhold. In vitro-undersøkelser måler EEAS under forhold hvor underlaget diffusjon og overflod er ikke-begrensende. Derfor kan det hende at dataene som tilbys av disse analysene ikke være en god proxy for EEAS henhold in situ grunnforhold 10. Totalt sett er svært nyttig for relative sammenligninger der jordtyper ligner enzymaktivitet. Men når du bruker denne metoden for å sammenligne aktiviteter blant jordsmonn som varierer i fysiske eller kjemiske egenskaper, må det utvises forsiktighet. Dette skyldes det faktum at forskjeller i jordtype og temperatur kan drastisk å endre tilstanden av in situ-enzymkinetikk. En annen begrensning er at relativt få substrater er kommersielt tilgjengelige (sammenlignet med det naturlige miljøet). Videre er de syntetiske substrater som brukes for enzymanalyser er relativt enkle, (lett oppløselig) ikke nøyaktig representerer jord-substrater til stede eller available in situ. En annen faktor å vurdere er at bruk av jord slam vil innlemme aktiviteten til enkelte stabiliserte enzymer (dvs. immobilisert av organisk materiale eller leire) som kanskje ikke er aktiv i henhold til in situ forhold to. Laboratory enzymanalyser heller ikke gi informasjon om utholdenhet av enzymer i jorda (enzym omsetning priser) eller informasjon om de spesifikke mikrobielle arter som produserer jord enzymer.

Protocol

En. Analysen Set-up

  1. Etikett 3 dypbrønnsplater: "Sample", "MUB standard", og "MUC standard".
  2. Hell hver standard (MUB av 0, 2,5, 5, 10, 25, 50, og 100 mm) og substrat (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) i separate rene, prelabeled reservoarer (orientert i rader) .
  3. Pipetter hensiktsmessig MUB-standarden til tilsvarende brønner av MUB standard plate (tabell 1).
    1. Pipetter 200 mL av 0 mikrometer MUB inn rad A i MUB standard plate.
    2. Pipetter 200 mL av 2,5 mikrometer MUB inn rad B av MUB standard plate.
    3. Pipetter 200 mL av 5 mikrometer MUB inn rad C for MUB standard plate.
    4. Pipetter 200 pl av 10 mM MUB i rad D av MUB standard plate.
    5. Pipetter 200 mL av 25 mikrometer MUB inn rad E for MUB standard plate.
    6. Pipetter 200 pl av 50 pM MUB inn i raden F av MUB standard plate.
    7. Pipetter 200 pl av 100 μM MUB inn rad G av MUB standard plate.
    8. Gjenta trinn 1.3.1 - 1.3.8 for MUC standarder i tilsvarende brønner i MUC standard plate.
  4. Prep jord slam for hver jordprøve.
    1. Vei 2,75 g av feltet fuktig jord i blender.
    2. Til 91 ml 50 mM buffer. Blend på høy for 1 min.
    3. Hell blender innholdet i en ren glassbolle minst like bredt som 8-kanals pipette med en rørepinne.
    4. Plasser på stir plate, bland jord slurry på lav.
    5. Pipetter 800 mL av jord slurry i første kolonne av prøveskilt (tabell 2).
    6. Gjenta i en st kolonne av MUB standard og MUC standard plater (Tabell 1).
    7. Skyll blender, stir plate og rør bar med DI H 2 O eller buffer mellom jordprøver.
    8. Gjenta trinn 1.4.1 - 1.4.7) for hver prøve, flytte til neste kolonne med hver påfølgende jordprøve (tabell 1 og2).
  5. Pipetter passende substrat (i dette eksempelet 200 uM-konsentrasjoner) i tilsvarende brønner av prøveplaten (tabell 2).
    1. Pipetter 200 pl av BG substrat til rad A i prøve-plate.
    2. Pipetter 200 mL av CB underlaget i rad B Prøve plate.
    3. Pipetter 200 mL av NAG underlaget i rad C Prøve plate.
    4. Pipetter 200 mL av PHOS underlaget i raden D Prøve plate.
    5. Pipetter 200 mL av XYL underlaget inn rad E Prøve plate.
    6. Pipetter 200 mL av AG underlaget i rad F Prøve plate.
    7. Pipetter 200 mL av LAP underlaget inn rad G Prøve plate.
    8. Gjenta trinn 1.5.1 - 1.5.7 for hver inkubasjonstemperaturen prøveskilt.

2. Inkubasjon av analyse Plates

  1. Tett dyp-brønn plater ("Sample", "MUB standard", og "MUC standard4 ;) med platematter.
  2. Snu hver (forseglet) plate for hånd inntil løsningen er godt blandet (~ 10x).
  3. Plasser platene i passende inkubator i nødvendig inkubasjonstid periode (tabell 3).
  4. Spill første gang som Time 0. Også ta opp de aktuelle inkubasjonstidene slik at du vet når du skal fjerne platen fra inkubatoren (Tabell 3).
  5. Ved slutten av hver inkubasjonsperiode sentrifuge de forseglede plater for tre minutter ved ~ 2900 x g.
  6. Etter-sertifisering, overføre 250 ul fra hver brønn med de inkuberte dypbrønnsplater i tilsvarende brønner i sorte flatbunnede 96-brønners plater (en sort plate vil bli brukt for hver inkubert dyp brønn plate). Det er viktig å overføre prøver fra de inkuberte dypbrønnsplater inn i de samme brønnene (dvs. A1 ... A12, etc.) i de sorte flatbunnede 96-brønners plater (tabell 1, 2).

Tre. Fluorescent Målinger påen Mikro Fluorometer

  1. Etter produsentens instruksjoner for fluorometrisk plateleser benyttes, stiller eksitasjonsbølgelengde til 365 nm og utslipp bølgelengde til 450 nm (eller bruke egnede filtre).
  2. Les de tre plater på fluor. Viktig: prøver og standard plater (dvs. MUB eller MUC) må leses med den samme gevinsten.
    1. Sett spektrofotometer til automatisk gevinst og lese MUC og MUB Standard plater.
    2. Set gain til manuell, og redusere verdien fra optimal til det nest laveste antallet, avrundet til nærmeste fem, for hver Standard plate. Gjenta 2x for hver plate.
    3. Sett gain til automatisk og kjøre Sample plate. Kjør Sample plate manuelt for å matche den høyeste gevinst for hver av de Standard plater (dvs. MUB og MUC).

4. Data Analysis

  1. Oppgi standard kurve fluorescens data i regneark for MUB (Tabell 4a) Og MUC standard (Tabell 4b)
    1. Konverter (uM) konsentrasjoner til (pmol) (Tabellene 4a og 4b).
  2. For hver prøve standardkurve fluorescens data, beregne skråningen, y-aksen, og R 2 verdier for MUB og MUC (mikromol) standard konsentrasjoner. Akseptable R 2 verdier bør overstige 0,98 for hver prøve (Tabellene 4a og 4b). Det kan være nyttig for å visualisere standardkurver i et spredningsdiagram, med fluorescens-leser plottet som den avhengige variable (y-aksen), og standard konsentrasjon (umol) plottet som den uavhengige variable (x-aksen) (figur 1).
  3. Du vil bruke MUB og MUC standard kurvehelling og y-skjæringspunktet for å beregne prøven + substrat rå fluorescens data til potensielle EEAS. Du må først oppgi eksempel + underlaget rå fluorescens data inn i et nytt regneark (Tabell 5a (Tabell 5b). Legg merke til, de tidsverdier som er angitt i dette eksemplet er tre timer, for prøvene ble inkubert ved 25 ° C (tabell 3).
    1. Trekk fra standardkurven skjæringspunktet fra de tilsvarende fluorescens verdier og deretter dele på skråningen av det tilsvarende standardkurve (Tabell 5c). For å oppnå dette, omorganisere standard linje ligningen for å løse for prøve enzym konsentrasjon (x), x = (yb) / m der: [y = fluorescens rå lese; b = skjærings fra MUB eller MUC Standard kurve; m = skråningen fra MUB eller MUC Standard kurven].
    2. Multipliser prøven umol, fra trinn 4.3.1 ovenfor, ved 91 ml (buffervolum som brukes i jord slurry) (tabell 5d).
    3. Divide verdi innhentet i trinn 4.3.2 av prøven spesifikke inkubasjonstid og tørr jord masse (Tabell 5e): [enzym amt. (& #956; mol) x 91 ml x inkubasjon (hr) x tørr jord (g) x 0,8 ml x 1000]
      Merk: 0,8 ml er volumet av slam som brukes i hver brønn, og 1,000 korrigerer for den faktiske mengde jord i hver brønn.
    4. Multipliser verdien oppnådd i trinn 4.3.3 av 1000 for å få de ønskede enheter (nmol aktivitet / g tørr jord / time) (Tabell 5f).

Representative Results

Enzymatiske analyser kan anvendes til å kvantifisere potensielle EEAS og å sammenligne aktivitetene mellom lignende prøver. Her presenterer vi representative resultater fra en eksperimentell klima studie som sammenlignet jordsmonn som opplevde omgivelsesklimaforhold (ACN) til jord som ble eksponert for forhøyede CO 2 og varmebehandlinger (EHN) (figur 2-6). Plantedekke i alle tomter var karakteristisk for en nordlig blandet gress prærien dominert av C4 gress Bouteloua gracilis (HBK) Lag. og to C3 gress, Hesperostipa comata Trin og Rupr. og Pascopyrum smithii (Rydb.); ca 20% av vegetasjonen består av starr og urter. Mer informasjon om nettstedet beskrivelse og feltet eksperimentell design kan bli funnet i referanser 28-30. Jordsmonn ble samlet fra to forskjellige dybder (0-5 cm og 5-15 cm) i hver av behandlings plott ved hjelp av en 1,5 cm diameter kjerne for å vurdere jord EEAS i respons til endrede Fakonditions. I våre eksempler (dvs. Figurene 2-6), er størrelsen på utvalget (N = 3). Uavhengig av dette minimal utvalgsstørrelsen, er variasjonen relativt små i de fleste tilfeller (som demonstrert av feilfelt) og robust gjenspeiler variasjon i potensielle EEAS blant behandlings tomter. Analyse av varians (ANOVA) og Tukey post hoc flere sammenligninger ble brukt til å identifisere vesentlige endringer i enzymaktivitet blant behandlings tomter og jorddybder.

Følgende representative resultatene har blitt gitt for å demonstrere hvordan dette høy gjennomstrømning, kan fluorometriske analyse brukes til å teste (1) generelle EØS i jord, (2) hvordan EØS støkiometri kan være en indikasjon på økosystem-nivå prosesser og (3) forholdet mellom inkubasjonstemperaturen og EØS. Jord Byråets blir ofte studert for å relatere endringer i mikrobiell funksjon til jord næringsstoff sykling, nyttige indikatorer for å vurdere mikrobielle næringsbehov i respons på klimaendringer, plantesamfunn shifts, og mer generelt økosystemenes funksjon 31-33. EØS støkiometri har mer nylig blitt vedtatt som en indeks for å vurdere jord biokjemiske næringsstoff sykling ved kryssende økologisk støkiometrisk teori og metabolske teorien om økologi for å vurdere mulige mikrobielle nærings ubalanser tilsvarende miljøforhold fem. Tallrike studier har antydet at brede støkiometriske forhold er tegn på næringsvekstbegrensninger 34-36, og som jord og næringsstoffer blir begrenset, mikrober svare ved å allokere metabolske ressurser til å produsere spesifikke enzymer for å skaffe seg mangelfulle næringsstoffer 37. Ecoenzymatic C: N: P støkiometri forholdstall er derfor nyttig å identifisere relative skift i potensielle mikrobielle samfunnet næringsbehov i respons på ulike miljø forstyrrelsene fem. Til slutt, kan temperatur følsomheten til EEAS være nyttig å vurdere hvordan jord mikrobielle samfunn funksjonelle mangfold er sannsynligvis påvirket av temperatur skift <sup> 7,38. Enzymtemperatur sensitiviteter kan variere mye mellom jord for en enkelt enzym klasse, og mikrobielle samfunn produserer enzymer har vist endringer i enzymaktivitet tilsvarende endringer i klima fra historiske forhold 7. Dermed enzymaktivitet spørsmål knyttet til termisk økologien i EØS kan være en nyttig måte å vurdere mikrobielle funksjonelle dynamikk og belowground økosystemprosesser i respons på klimaendringer 39,40.

I dette eksemplet potensial C-, N-og P-enzymaktiviteter innhentings analysert på 0-5 cm jord dybder skilte seg ikke ved eksperimentell behandling (figur 2a). Men på 5-15 cm jord dybder, gjorde flere potensielle EEAS signifikant forskjellig (Figur 2b). For eksempel C-nedbrytende enzymer β-1 ,4-glukosidase og β-D-cellobiohydrolase var lavere i de Ehn plott (p ≤ 0.038; Figur 2b) sammenlignet med ACN tomter. N og P mineralizing enzymer (β-1 ,4-N-acetylglucosaminidase og fosfatase, henholdsvis) var også lavere i ehn plott (p ≤ 0.012, figur 2b) i forhold til ACN på 5-15 cm jord dybder.

Å beregne og plotte summen av alle C-, N-eller P-sykling potensielle EEAS kan være en nyttig metode for å observere bredere mønstre vedrørende potensialet jord C-, N-og / eller P-sykluser (figur 3). I dette eksempel ble summen av β-1 ,4-glucosidase, β-D-cellobiohydrolase, β-Xylosidase og α-1 ,4-glucosidase potensielle EEAS beregnet til å representere potensielle C sykling aktiviteter. Summen av β-1 ,4-N-acetylglucosaminidase og L-leucin-aminopeptidase ble beregnet til å representere potensielle N sykling aktiviteter. Fosfatase ble brukt til å representere potensielle P sykling aktiviteter. I dette eksempelet, potensielle EEAS for total C-, N-og P-sykling tendert lavere i EHN tomter i forhold til ACN tomter på de 5-15 cm jorddybde (Figure 3). Men denne trenden var bare betydning for total N og P sykling aktiviteter (p ≤ 0.046, figur 3). Jord EEAS ikke signifikant forskjellige i de ulike behandlings tomter på 0-5 cm jord dypet (figur 3). Resultatene for dette eksempel foreslår kontraster trender i enzymaktiviteten funksjonell gruppe (dvs. C-, N-eller P-nedbrytende enzymer) mellom behandlings-plott (ACN g. EHN) som reaksjon på jorddybde. For eksempel, C-, N-og P-nedbrytende jord EEAS i omgivelses plott (ACN) tendert høyere ved lavere dybder i forhold til jord som er utsatt for forhøyet CO2 og oppvarming (EHN), som demonstrerte en invers mønster (figur 3a-c ).

Enzyme støkiometri er en annen nyttig tilnærming for å vurdere potensielle enzymaktivitet i miljøet (figur 4). Den mikrobielle behov for næringsstoffer er bestemt av den elementære støkiometrien av mikrobiell biomasse i forhold til miljønæringsstoffer 32. Likeledes mikrober produsere spesifikke enzymer (dvs. C-, N-eller P-nedbrytende enzymer) for å dekke næringsbehov innenfor sine jord miljøer, også referert til som økologisk støkiometri 41.. Forholdet mellom potensielle EEAS er en måte å vurdere mikrobielle næringsbehov. For eksempel, et 1:1-forhold mellom to enzym funksjonelle grupper (for eksempel i C: N nærings oppkjøp) vil foreslå at etterspørselen etter N er høy i forhold til etterspørselen etter C når de vurderer mikrobiell biomasse C: N forhold på samfunnsnivå er vanligvis 08:01 42. I dette eksempelet jord enzym støkiometri C: N, C: P eller N: P-aktivitets signifikant forskjellig mellom de behandlingsplottene på 0-5 cm jord dybder (figurene 4a-c). Men potensialet enzym C: P og N: P forholdstall var høyere i EHN tomter i forhold til de ACN tomter på de 5-15 cm jord dybder (p = 0,05; Tall 4b og 4c). Denne observasjonen tyder på at deter relativt høyere P mineralise EEAS sammenlignet med C og N EØS ACN tomter (sammenlignet med EHN) på de 5-15 cm jord dypet. Enzyme C: N oppkjøpsaktivitet forholdstall viste en tilsvarende trend til at demonstrert av total C EEAS med høyere C: N grunnet høyere potensielle C EEAS i ACN tomter på nedre dybde i forhold til EHN (figur 4a).

Temperaturen kan sterkt påvirke jord EEAS. Likevel, i typiske lab analyser, er jord enzymer måles på et enkelt temperatur som ikke samsvarer med in situ temperaturforhold. Vår fluorescens enzym assay metoden tillater oss å vurdere in situ temperatureffekter ved å innlemme flere laboratorie inkubasjonstemperaturer for sammenligning. Ved hjelp av laboratorie inkubasjoner ved flere temperaturer tillater oss å analysere temperaturavhengig enzymkinetikk data ved hjelp av Arrhenius tomten og Q 10 beregninger. Arrhenius plottet blir brukt til å visualisere aktiveringsenergi, og er plottet ossing logaritmen av enzymaktivitet (y-aksen avhengig variabel) som en funksjon av den inverse temperatur omdannes til grader Kelvin (1 / K) på x-aksen (dvs. uavhengig variabel, figurene 5a-c). Aktiveringsenergien er vanligvis definert som den minste energi som kreves for å katalysere en kjemisk reaksjon (f.eks degradere et gitt substrat i mindre produkt). For vårt formål, serverer aktivering energi som en proxy for temperaturfølsomheten av enzym katalyserte reaksjoner. Høyere aktiveringsenergien indikerer enzym temperaturfølsomhet. Likeledes aktiverings energier (dvs. fig 5d-f) direkte tilsvare Q 10 verdier (dvs. Fig. 6a-c). En nærmere forklaring av formler som brukes til å beregne aktiveringsenergi og praktisk anvendelse kan finnes i mange tidligere arbeider 40,43-45. Arrhenius tomter, aktivisering energi, og Q 10 tomter gi overflødig informasjon og bør ikkealle brukes i samme manuskriptet til å presentere data for publikasjon (figurene 5 og 6). Derfor, når du bruker disse teknikkene, er det nødvendig å velge den mest hensiktsmessige plottype for din enzym temperatur - kinetikk data 10. Alle typer plot (Arrhenius og Q 10) ble presentert her for demonstrasjonsformål, for å gi visuelle eksempler på hvordan du kan presentere enzym resultater.

I vårt eksempel, vurderte vi potensielle enzymkinetikk for potensiell C-, N-og P-EEAS mellom begge behandlings plottet de to jorddybde (figur 5, Fig. 6). Funnene viser at temperaturfølsomheten av EEAS var ikke signifikant forskjellig mellom behandlings plottet enten jorddybder for aktiveringsenergi som vist i Arrhenius plott (figurene 5a-c) og tilhørende aktiverings energier (figur df) og (ikke overraskende) for Q 10 PLOts (i dette eksempel mellom 15 ° C og 25 ° C laboratorie inkubasjoner, figurene 6a-c). Dette tyder på at enzymkinetikk ikke ble påvirket av felt eksperimentell behandling i denne studien.

Tabell 1
Tabell 1. Dyp brønn plate design for fluorescens standard konsentrasjoner med jordprøver. Mal for organisering og lasting fluorescens standarder (MUB eller MUC) med jordprøver inn i den dype brønnen plate før ruger. Merk: Kolonnene representerer de samme jordprøver (800 mL av jordslam tillegg). En gradering av fluorescens standard konsentrasjoner er lastet for hver rad (200 mL tilføyelser). Hver celle representerer fluorescens standard konsentrasjon pluss jord slam tilsetninger. For eksempel, S1 - S12 representerer jordprøver (800 mL av jord slurry); MUB 0-100 mikrometer = 4-Methylumbelliferone konsentrasjoner (200 mL tillegg). I dette eksempel er p H åpen, og er følgelig tilgjengelig for å inneholde en høyere fluorescens standard konsentrasjon hvis nødvendig. Denne beslutning om å øke standardkurven konsentrasjoner kan være nødvendig for høyere potensial enzymaktivitet (og / eller substratblandingene anvendte konsentrasjoner) for bestemte jordprøver. Potensialet enzymaktiviteten for prøvene bør falle innenfor området for standardkurven verdier. Klikk her for å vise større bord .

Tabell 2
Tabell 2. Dyp brønn plate design for jordprøver med underlaget. Mal for organisering og lasting prøver og underlag jord inn i den dype brønnen plate før ruger. Merk: Kolonnene representerer de samme jordprøver (800 mL av såil slam tilføyelser). Forskjellige underlag er lastet over hver rad (200 mL tilføyelser). Hver celle representerer jordprøver pluss underlaget tillegg. For eksempel, S1 - S12 representerer unike jordprøver (800 ul av jordslam). Substrater (200 mL tilføyelser) omfatter: BG = 4-Methylumbelliferyl β-D-glukopyranosid; CB = 4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside; NAG = 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glukosaminid, PHOS = 4-Methylumbelliferyl fosfat: XYL = 4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside, AG = 4-Methylumbelliferyl α-D-glukopyranosid, og LAP = L-Leucin-7-amido-4-methylcoumarin hydroklorid. I dette eksemplet, er rad H åpen, og er dermed tilgjengelig for å inkludere en annen substrat for å vurdere en annen potensiell enzymaktivitet hvis ønskelig. Klikk her for å vise større bord .

Temperatur Tid
4 ° C ~ 23 timer
15 ° C 6 timer
25 ° C 3 hr
35 ° C 1,5 time

Tabell 3. Inkubator temperaturer som kreves for tilsvarende inkubering tidsperioder. Inkubasjon temperaturer og de ​​tilsvarende tidsperioder for enzymanalyseprosedyre.

Tabell 4
Tabell 4. MUB og MUC standardkurve beregninger. Demonstrerer hvordan man kan organisere en) MUB og b) MUC rå fluorescens data (mikromol) til senere å beregne skråningen, y-aksen, og R-squared verdier. For å beregne stigningstallet, y-aksen, og R-squared verdier fra dine vanlige konsentrasjonskurver, velger du (eller tomt) avMUB og / eller MUC rå fluorescens data som den avhengige variabelen (y-aksen) og standard konsentrasjon (mikromol) som uavhengig variabel (x-aksen). Merk:. MUB = 4-methylufilbelli; MUC = 7-amino-4-methylcoumarin Klikk her for å vise større bord .

Tabell 5
Tabell 5. . Enzymaktivitet beregninger Demonstrerer hvordan man a) organisere prøve rå fluorescens data og deretter utføre de nødvendige trinnene (bf) til å beregne EEAS inn: mikromol aktivitet / g tørr jord / hr. Merk: S1 - S12 representerer unike jordprøver. Substrater omfatter: BG = 4-Methylumbelliferyl β-D-glukopyranosid; CB = 4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside; NAG = 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glukosaminid, PHOS = 4-Methylumbelliferyl phosphate: XYL = 4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside; AG = 4-Methylumbelliferyl α-D-glukopyranosid, og LAP = L-leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydroklorid. Klikk her for å vise større bord .

Figur 1
Figur 1. MUB standard kurve plottet. Spredningsplott visualisering av standardkurver med rå fluorescens data som den avhengige variabelen (y-aksen) og standard konsentrasjon (mikromol) som uavhengig variabel (x-aksen).

Fig. 2
Figur 2. C, N og P sykling enzymaktivitet. Potensielle EEAS på Prairie Varme og forhøyet CO 2 Enrichment (Phace) nettsted i kontrollstykkene (ACN: utsettes for omgivelsesklimaforhold) og behandlings plott (Ehn: utsettes for økt temperatur og økt CO 2). Jord enzymer ble analysert ved et) 0-5 cm jord dybder og b) 5-15 cm jord dypet. Vertikale stolper representerer gjennomsnitt ± SE Note: ACN = ambient - klima tomter; EHN = forhøyet CO 2 og oppvarming tomter. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Total C, N og P sykling enzym støkiometriske forhold Summen av potensielle EEAS involvert i oppkjøpet av a) C, b) N, og c) P-for begge behandlingsgruppene i Phace forsøket på 0-5 cm og 5. - 15 cm jord dybder. Vertikal søylene representerer gjennomsnitt ± SE Note: ACN = ambient - klima tomter; EHN = forhøyet CO 2 og oppvarming tomter. Klikk her for å se større figur .

Figur 4
Figur 4. Enzym støkiometri for total C, N, og P sykling enzymaktivitet Enzyme oppkjøpsaktivitet støkiometriske forhold ved Prairie Varme og forhøyet CO 2 Enrichment (Phace) nettsted i kontroll plott. (ACN: utsettes for omgivelsesklimaforhold) og behandlings plott (Ehn: utsettes for for høy temperatur og forhøyet CO 2). Totalt jord a) C: N, b) C: P og c) N: P ble plottet for begge behandlingsgruppene på 0-5 cm og 5-15 cm jord dypet. Vertikale stolper representerer gjennomsnitt ± SE Note: ACN= Ambient - klima tomter; EHN = forhøyet CO 2 og oppvarming tomter. Klikk her for å se større figur .

Figur 5
Figur 5. . Total C, N og P sykkelenzymaktiverings energier temperaturfølsomhet av mulige EEAS vist ved hjelp av Arrhenius plott for total a) C, b) N, og c) P-nedbrytende enzymer, så vel som de tilsvarende aktiveringsenergiverdier for total d) C , e) N, og f) P nedbrytende enzymer blant behandlings tomter og jorddybde på Prairie Varme og forhøyet CO 2 Enrichment (Phace) nettsted. Vertikale stolper for aktivering energi (dvs. df) representerer gjennomsnitt ± SE Note: ACN = enmbient - klima tomter; EHN = forhøyet CO 2 og oppvarming tomter. For publisering, er det viktig å merke seg at forfatteren ville vanligvis velger å presentere enten Arrhenius plott (dvs. ac) eller aktivering energiverdier (dvs. df), men ikke begge plott-typene. Klikk her for å se større figur .

Figur 6
Figur 6. Total C, N og P sykling enzym Q10 (15-25 ° C). Temperatur sensitiviteten for potensielle EEAS målt som Q 10, basert på laboratorie inkubasjoner ved 15 ° C og 25 ° C for total a) C, b) N, og c) P nedbrytende enzymer blant behandlings tomter og jorddybde på Prairie Varme og forhøyet CO 2 </ Sub> Enrichment (Phace) nettsted. Vertikale stolper for Q10 representerer gjennomsnitt ± SE Note: ACN = ambient - klima tomter; EHN = forhøyet CO 2 og oppvarming tomter. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Laboratoriet-basert måling av potensielle jord EEAS kan gi viktig innsikt i mikrobielle reaksjoner på deres abiotiske miljøet, og deres konsekvenser for økosystemenes funksjon. Resultatene av dette eksemplet datasett antyder at minimale forskjeller i jord-enzymaktivitet, eller kinetikk mellom klimabehandlingsflater. Men inverse trender blant tomter oppmuntre til videre etterforskning av kovariater som kan påvirke produksjonen av mikrobielle EEAS som jordfuktighet, jord pH eller plantevekst. Samlet sett vurderer EEAS i form av (1) generelle EØS i jord, (2) EØS støkiometri (3) Arrhenius tomter / aktivisering energi, og (4) Q 10 tilbyr et bredt spekter av tilnærminger som kan være en indikasjon på økosystem-nivå prosesser for å robustly karakterisere jordøkosystemet funksjonelle dynamikk.

Høy gjennomstrømming fluorescens-basert EØS-analyser er et nyttig verktøy som er mye brukt til å undersøke potensielle EEAS i jord ogandre miljøer. Viktigere, potensielle aktiviteter reflekterer størrelsen enzymet bassenget, men ikke av seg selv kvantifisere enzym produksjon eller omsetning priser 46. Selv om teknikken er relativt grei, kan tilsynelatende små forskjeller mellom lab protokoller hemme sammenlignbare resultater 13. Dessverre har vi ikke i dag har egnede standardiserte positive kontroller for EEAS. Bruken av støkiometriske forhold er en tilnærming for å overvinne disse utfordringene. Ellers har ankomsten av høy gjennomstrømming teknikker avanserte studier av enzymer i miljøet fire. Forsiktig tolkning av data generert av disse analysene kan belyse viktige trender i mikrobiell aktivitet.

Robustheten i protokollen stammer fra muligheten til å velge for forhold som er spesifikke for de enkelte prøver, men dette kan også resultere i begrensninger. En rekke modifikasjoner vil være nødvendig for å sikre at prøvene er nøyaktig målt for enkelte felt nettsted:

Buffer

Bufferen du velger vil være avhengig av pH-verdien i jordsmonnet. Bufring stabiliserer også fluorescensintensiteten av det fluorescerende standarder, noe som er sterkt pH-avhengig 27,47. PH-buffer som vi bruker vanligvis å gjøre jorden oppslemmingen er en 50 mM natrium-acetat, eller Tris-buffer som velges for bufferen er spesiell syre dissosiasjonskonstant (pKa) til passer best jord - eksempel pH-nivåer. Natriumacetat har en pKa på 4,76, og Tris har en pKa på 8,06 slik at de mengder av disse to buffere vil variere for å oppnå den ønskede pKa for den enkelte prøve. Fosfatbuffer (pKa = 7,2) har blitt foreslått for nøytrale / svakt basisk jord. Men vi advarer for å teste for analytisk variasjon i forstudier før du bruker denne bufferen, så høye fosfat konsentrasjoner kan påvirke enzymaktivitet.

Håndtering og lagring av fluorescerende substrater

jove_content "> Fluorescens analyser kan lide av forstyrrelser forårsaket av urenheter og / eller ustabilitet i mange fluorescerende forbindelser når de utsettes for lys, så forsiktighet er nødvendig ved håndtering av fluoriserende underlag. Vi anbefaler på det sterkeste å minimalisere eventuelle lyseksponering til fluorescensmerkede underlag og MUB og MUC standarder . Bruke amber glassflasker eller dekker glass og beholdere som brukes til å lage og lagre fluorescerende substrater og standarder er sterkt anbefalt, aluminiumsfolie til å pakke inn glass og beholdere fungerer godt Likeledes effektivt inoculating plater og overføring til mørke inkubatorer er beste praksis Vi anbefaler.. lagring av substrater og standarder (-20 ° C) i ikke lengre enn to måneder (samtidig som den beskyttes mot lys), og tine substrater (5 ° C) ~ 24 til 48 timer før begynnelsen av enzymanalysen (e).

Design og Replication

Til beste kontoen for godt å vel prøve variasjoner, implementere negative analyse kontroller og (hvis mulig) assay replikerer anbefales. Variasjon kan skje på grunn av forskjeller i mengden av jordpartikler i hver brønn og pipettering feil. Derfor vil sterk blanding og god pipetteringsteknikk vesentlig redusere brønn til brønn variasjon. Videre har vi det sterkeste å implementere en negativ analyse kontroll (buffer + substrat løsning) for å overvåke substrat uoverensstemmelser over tid. Dette kan enkelt overvåkes når du leser enzym plater ved å sammenligne negative kontrollbrønner (vi bruker vanligvis den siste kolonnen på 96-brønners plater). Negative kontroller substrat er vanligvis stabile, og derfor signalet øker godt over deteksjonsgrensen, er det et tegn på forurensning eller substrat ustabilitet, noe som krever utskifting av substratet og / eller standardløsninger.

For å øke gjennom, vår-protokollen innbefatter flere potensielle EEAS i ett dyp brønn mikroplate, selv om andre protokoller utføre en typeassay per plate (dvs. ett substrat per plate) siden ulike EEAS oppstå på ulike priser. Uansett, må enzym optimalisering utføres på jord før du utfører denne høy gjennom tilnærming eller enkelt plate tilnærming. Flere substrater kan anvendes på en enkelt plate hvis reaksjonshastigheter er relativt konsistent for hvert enzym i løpet av tidsrommet for inkubasjonen.

Vår protokoll innstiller ~ 2,75 g jord for å gjøre oppslemmingen løsning, mens ~ 1 gram anbefales i andre protokoller 24. Vi foreslår at du bruker mer jord (hvis mulig) er en effektiv metode for å bedre fangst innen-sample jord variasjon i enzymaktivitetsnivå. I denne protokollen, inkuber vi 800 pl av jordslam med 200 pl substrat, mens andre bare inkubere 200 pl av jordslam med 50 pl substrat. Dette er rett og slett en funksjon av å skalere opp som til slutt ikke endrer den målte aktiviteten. Det er også praktiske fordelerfor å bruke større volumer. One, er det lettere å unngå jordpartikler mens pipettering inn tilsvarende svarte flatbunnede 96-brønners plater før innspilling intensiteter på fluor. For det andre er den ekstra volum nyttig i tilfelle av utilsiktede oljeutslipp ved overføring av de sorte flatbunnede 96-brønners plater til fluorometer før opptak enzym-relaterte fluorescensintensiteter. Selv små avvik i volum vil betydelig redusere fluorescens blant brønner. Til slutt, på grunn av den høye gjennomstrømningen natur av denne protokoll har vi vanligvis velge å stole på eksperimentell replikering for å representere variasjoner i enzymaktivitetsnivå i stedet for å utføre analysen replikerer. Det er alltid best praksis å inkludere analytiske gjentak, men i praksis, føler vi vår protokollen gir en balansert avveining mellom analytiske og eksperimentelle gjentak gitt begrensede ressurser. Likeledes anvender vår tilnærming relativt godt homogenisert jord (2,75 g) pr assay 25, som inherently avtar innen-jord variasjoner. Beslutningen om å bruke analytiske gjentak bør vurderes nøye ved å teste for analytisk feil i forstudier 48. Vi anbefaler imidlertid at eksperimentelle design med færre enn fire behandlingsgruppe gjentak bør sterkt vurdere å bruke analysen replikater.

Jord, Buffer Volumes, og Substratkonsentrasjon optimalisering

Jordsmonnet buffer: substratkonsentrasjon-forholdet er en viktig variabel som sterkt påvirker den målte fluorescens ved utføring av enzymanalyser. Mengden av jord i slurryen tilsatt til analysen eller konsentrasjonen av substratet kan ha behov for å bli justert, avhengig av aktiviteten til enzymer i jordprøven. De valgte for dette eksempelet beløp ble basert på tidligere tester av disse massene for å sikre at underlaget tilgjengelighet var ikke begrensende, og at vi skulle måle maksimal potensielle priser under analyseforhold (V max) 44,45. Men for jordprøver som har høye konsentrasjoner av enzymer, mengden av jord eller substrat-konsentrasjon må økes. Vi har funnet at økende konsentrasjoner substrat (og justering av standardkurven tilsvarende) kan påvirke linearitet av kurven. Derfor anbefaler vi å redusere jordmengder og / eller proporsjonale justeringer til buffer volumene som er nødvendig. Uansett er det viktig å optimere substratkonsentrasjon for hver jordtype analysert fordi målte EEAS kan variere fra en størrelsesorden større mellom mettet og sub-mettede substrat-konsentrasjoner 26. Derfor forskjeller mellom eksperimentell behandling (etc.) er utsatt for type II statistisk feil og mindre sannsynlighet for å bli oppdaget på sub-mette forhold, og statistisk feil 27,35. For å optimalisere substrat-konsentrasjoner, bør innledende enzymanalyser utført på representative prøver jord ved hjelp av et bredt utvalg av substrat-konsentrasjoner. Etterregistrering av fluorescens, er det bare plotte dataene (i likhet med den standard kurve eksempel, figur 1) for å identifisere substratet konsentrasjon (x-aksen) som korresponderer med enzym-aktivitet (y-aksen), hvor skråningen nivåer av (~ 0). Likeledes, substratkonsentrasjon svarende til det punkt hvor skråningen nivåer av (~ 0) er en god indikasjon på den optimale substratkonsentrasjon for den spesielle jord.

Dette assay måler slutt fluorescens i et gitt tids produsert av fluorogene gruppe som spaltes fra substratet på grunn av enzym-mediert substrat depolymerisering. Derfor, trinn 5 (substrat addisjon) er kritisk og må utføres så effektivt som mulig for å minimere tiden mellom når substratet tilsettes til jordsmonnet, og når analysene inkuberes. Likeledes, når substratet kommer i kontakt med prøven, vil det enzymatiske reaksjoner begynner å forekomme. Vi anbefaler å bruke en multi-kanalpipette på grunn av dette. Det er sterkt anbefalt å bli effektiv bruk av flerkanals pipette før den dagen du utfører dine enzymanalyser. For å oppnå dette, kan du øve pipettering med vann til du lett kan overføre volumer inn i 96-brønners plater med pipette.

Jord slukke

Quenching refererer til avtagende fluorescensintensitet forårsaket av partikler og / eller organisk materiale i jorden slam-inkubasjoner 26. Quenching kan påvirkes ved å justere jord: buffer forholdstall 25.. På grunn av bakgrunnsfluorescens fra individuelle prøver, er det avgjørende å kjøre standarder med prøver å ta hensyn til bakgrunnen (quenching) fluorescens. Selv om noen protokoller bruke en enkelt konsentrasjon etter testing at signalet er lineær, anbefaler vi på det sterkeste å implementere en standard quench kontroll for hver prøve du best kontroll for effekten av slukke. Unnlatelse av å gjøre dette vil resultere i en standard kurve gjelder ikke for prøven, og en uriktig beregning av enzymatisk aktivitet. Tilsetningen av standarder for å jord oppslemminger er ikke tid-sensitive, da standard tillegg påvirker ikke bakgrunnsfluorescens av prøven.

NaOH tillegg

Tilsetning av NaOH er brukt i noen protokoller for å optimalisere fluorometriske enzymaktivitetsmålinger, fordi den fluorescerende fargestoff frigitt fra de syntetiske substrater oppviser maksimal fluorescens ved pH> 9,0 26,49. Ved vurderingen av dette forslaget vil NaOH-konsentrasjonen som er nødvendig til jord slurry pH (dvs. til pH> 9) varierer avhengig av den spesielle jord og pH-buffer som brukes 26. Men andre hevder at NaOH ikke kan være nødvendig fordi signalintensiteten er generelt svært høy selv ved lavere pH, og fordi den innfører en ekstra kilde til målingsfeil. For eksempel er effekten av NaOH tilsetninger på slurry pH og dermed MUB eller MUC fluorescerende Whitescence endringer over tid 25. MUB koblede underlag har vist seg å vise konsistent økt fluorescens etter 20 min etter NaOH tilsetninger før nivåer smalne, mens MUC har vist jevn redusert fluorescens i opp til 60 min 26. Derfor er det viktig å standardisere tiden mellom NaOH-tilsetningen og fluorescens-måling. Alternativt, hvis fluorescens nivåer er tilstrekkelig detekterbar uten tillegg utfører analysene uten tilsetning av NaOH er blitt foreslått som en like akseptabelt alternativ 26..

Temperatur

Temperatur følsomhet bør tas i betraktning når man bestemmer inkubasjonstemperatur. Hvis den primære interesse er å forstå enzymkinetikk, ved hjelp av tre eller flere temperaturer som illustrert ved hjelp av Arrhenius tomter (i resultatene delen) er en robust tilnærming. Hvis prøven området har karakteristisk lav temperatur som permafrost jord, deretter duration av inkubasjon kan trenge å bli utvidet til å tillate for enzymer til å reagere i de kaldere inkubasjonstemperaturer. Mens tradisjonelle enzymkinetikk antyder at en økning i temperaturen bør resultere i øket enzymaktivitet, har vi funnet at enzymer kan være spesifikk for det gjelder temperaturfølsomhet 50. Derfor å forstå stedsspesifikk enzymaktivitet potensial er det kritisk at inkubasjonstemperatur og varighet bli justert for å reflektere felt reiser verdier.

Konklusjon

EØS er kritiske driverne av biogeokjemiske prosesser i jord, og dermed må vi være i stand til å måle sine aktiviteter. Det er mange utfordringer til å måle EEAS i jord, inkludert interferens og hemming. Til tross for disse utfordringene kan standardiserte protokoller (som den er beskrevet her) være universelt anvendt for å måle EEAS for en lang rekke enzymer. Mens det er ganske lett å generere kvalitetsdata følge disse protokollene, er infortolkning av disse dataene i en økologisk sammenheng krever nøye vurdering av hva disse analysene er virkelig måler, og hvordan EEAS henhold analyseforhold kan avvike fra de som er under in situ forhold.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Denne publikasjonen er finansiert av enzymer i Environment Research Coordination Network Forskning støttet av US National Science Foundation (DEB # 1021559). Denne forskningen ble støttet av US National Science Foundation (DEB # 1021559), og det amerikanske energidepartementets Office of Science (Biological and Environmental Research). Eventuelle meninger, funn og konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette materialet er de av forfatterne, og reflekterer ikke nødvendigvis synspunktene til den amerikanske NSF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents:
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (AG) Sigma Aldrich M9766 Sugar degradation
4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside (BG) Sigma Aldrich M3633 Sugar degradation
4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside (CB) Sigma Aldrich M6018 Cellulose degradation
L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP) Sigma Aldrich L2145 Protein degradation
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide (NAG) Sigma Aldrich M2133 Chitin degradation
4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS) Sigma Aldrich M8883 Phosphorus mineralization
4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside (XYL) Sigma Aldrich M7008 Hemicellulose degradation
4-Methylumbelliferone (MUB) Sigma Aldrich M1381
7-Amino-4-methylcoumarin (MUC) Sigma Aldrich A9891
50 mM Sodium acetate anhydrous buffer Fisher Scientific S210-500 acidic and neutral soils
50 mM Tris base buffer Fisher Scientific BP154-1 basic soils
Equipment
Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs Fisher Scientific 14-512-65 pipetting reservoir
Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel Fisher Scientific 13-684-265 8-channel pipette, range: 50-1,200 μl
TipOne 101-1,250 μl extended length natural tips USA Scientific 1112 - 1720 10 racks of 96 tips (960 tips)
Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in. Fisher Scientific 11-100-100SH Lab disc magnetic stir plate
Waring blender Fisher Scientific 14-509-7P Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container
BRAND Dispensette III bottle-top dispensers Fisher Scientific 13-688-231 Dispenser; range: 5-50 ml
Wheaton Unispense μP peristaltic pumps Fisher Scientific 13-683-7 Optional dispenser
Fisherbrand magnetic stir bar Fisher Scientific 1451363SIX Used to stirr soil slurry afer blending
Pyrex glass bowls World Kitchen 5304218 Pyrex 10 oz rimmed custard cup
Costar 96-well black solid plates Fisher Scientific 07-200-590 Used for plate reader step
Costar 96-well assay blocks Fisher Scientific 07-200-700 V-bottom; 2 ml; sterile
Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats Fisher Scientific 14-387-93 Sterile 96-well cap mat for square wells
Centrifuge equipped with holders for deep-well plates Thermo Scientific 3121 Centra-GP8 (this model is no longer available)
Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader Tecan 30016058 Plate reader (this model is no longer available)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burns, R. G., Dick, R. P. Enzymes in the environment: activity, ecology, and applications. 86, CRC. (2002).
  2. Burns, R. G. Enzyme activity in soil: Location and a possible role in microbial ecology. Soil Biology and Biochemistry. 14 (82), 423-427 (1982).
  3. Bandick, A. K., Dick, R. P. Field management effects on soil enzyme activities. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1471-1479 (1999).
  4. Burns, R. G., et al. Soil enzymes in a changing environment: Current knowledge and future directions. Soil Biology and Biochemistry. 58, 216-234 (2013).
  5. Sinsabaugh, R. L., Hill, B. H., Follstad Shah, J. J. Ecoenzymatic stoichiometry of microbial organic nutrient acquisition in soil and sediment. Nature. 462, 795-798 (2009).
  6. Sinsabaugh, R. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology Letters. 11, 1252-1264 (2008).
  7. Wallenstein, M., Allison, S. D., Ernakovich, J., Steinweg, J. M., Vol Sinsabaugh, R. Soil Biology. Shukla, G., Varma, A. 22, Springer. Berlin Heidelberg. 245-258 (2011).
  8. Wallenstein, M. D., McMahon, S. K., Schimel, J. P. Seasonal variation in enzyme activities and temperature sensitivities in Arctic tundra soils. Global Change Biology. 15, 1631-1639 (2009).
  9. Steinweg, J. M., Dukes, J. S., Wallenstein, M. D. Modeling the effects of temperature and moisture on soil enzyme activity: Linking laboratory assays to continuous field data. Soil Biology and Biochemistry. 55, 85-92 (2012).
  10. Wallenstein, M. D., Weintraub, M. N. Emerging tools for measuring and modeling the in situ activity of soil extracellular enzymes. Soil Biology and Biochemistry. 40, 2098-2106 (2008).
  11. Sinsabaugh, R. L. Phenol oxidase, peroxidase and organic matter dynamics of soil. Soil Biology and Biochemistry. 42, 391-404 (2010).
  12. Allison, S. Soil minerals and humic acids alter enzyme stability: implications for ecosystem processes. Biogeochemistry. 81, 361-373 (2006).
  13. Deng, S., Popova, I. E., Dick, L., Bench Dick, R. scale and microplate format assay of soil enzyme activities using spectroscopic and fluorometric approaches. Applied Soil Ecology. 64, 84-90 (2013).
  14. Sinsabaugh, R., Klug, M. J., Collins, H. P., Yeager, P. E., Peterson, S. O. Standard Soil Methods For Long Term Ecological Research. Robertson, G. P., Coleman, D. C., Bledsoe, C. S., Sollins, P. , Oxford University Press. (1999).
  15. Tabatabai, M. A. Methods of Soil Analysis. Page, A. L., Miller, R. H., Keeney, D. R. 2, American Society of Agronomy, Inc. 903-947 (1994).
  16. Parham, J. A., Detection Deng, S. P. quantification and characterization of B-glucosaminidase activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
  17. Jacks, T. J., Kircher, H. W. Fluorometric assay for the hydrolytic activity of lipase using fatty acyl esters of 4-methylumbelliferone. Analytical Biochemistry. 21 (67), 279-285 (1967).
  18. Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thrombosis Research. 17 (80), 393-402 (1980).
  19. Jasinski, J. P., Woudenberg, R. C. 7-Amino-4-methylcoumarin. Acta Crystallographica Section C. 50, 1954-1956 (1994).
  20. Hoppe, H. G. SIGNIFICANCE OF EXOENZYMATIC ACTIVITIES IN THE ECOLOGY OF BRACKISH WATER - MEASUREMENTS BY MEANS OF METHYLUMBELLIFERYL-SUBSTRATES. Mar. Ecol.-Prog. Ser. 11, 299-308 (1983).
  21. Somville, M. Measurement and Study of Substrate Specificity of Exoglucosidase Activity in Eutrophic Water. Applied and Environmental Microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
  22. Darrah, P. R., Harris, P. J. A fluorimetric method for measuring the activity of soil enzymes. Plant and Soil. 92, 81-88 (1986).
  23. Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and Soil. 175, 147-152 (1995).
  24. Saiya-Cork, K. R., Sinsabaugh, R. L., Zak, D. R. The effects of long term nitrogen deposition on extracellular enzyme activity in an Acer saccharum forest soil. Soil Biology and Biochemistry. 34, 1309-1315 (2002).
  25. DeForest, J. L. The influence of time, storage temperature, and substrate age on potential soil enzyme activity in acidic forest soils using MUB-linked substrates and l-DOPA. Soil Biology and Biochemistry. 41, 1180-1186 (2009).
  26. German, D. P., et al. Optimization of hydrolytic and oxidative enzyme methods for ecosystem studies. Soil Biology and Biochemistry. 43, 1387-1397 (2011).
  27. Marx, M. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil Biology and Biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
  28. Parton, W. J., Morgan, J. A., Wang, G., Del Grosso, S. Projected ecosystem impact of the Prairie Heating and CO2 Enrichment experiment. New Phytologist. 174, 823-834 (2007).
  29. Morgan, J., et al. C4 grasses prosper as carbon dioxide eliminates desiccation in warmed semi-arid grassland. Nature. 476, (2011).
  30. Carrillo, Y., Pendall, E., Dijkstra, F. A., Morgan, J. A., Newcomb, J. M. Response of soil organic matter pools to elevated CO2 and warming in a semi-arid grassland. Plant and Soil. , (2011).
  31. Allison, S. D., Vitousek, P. M. Responses of extracellular enzymes to simple and complex nutrient inputs. Soil Biology and Biochemistry. 37, 937-944 (2005).
  32. Moorhead, D. L., Sinsabaugh, R. L. A theoretical model of litter decay and microbial interaction. Ecological Monographs. 76, 151 (2006).
  33. Allison, S. D., Weintraub, M. N., Gartner, T. B., Waldrop, M. P. Soil Biology. Shukla, G., Varma, A. 22, Springer. Berlin Heidelberg. 229-243 (2011).
  34. Treseder, K. K., Vitousek, P. M. Effects of soil nutrient availability on investment in acquisition of N and P in Hawaiin rain forests. Ecology. 82 (2001), 946-954 (2001).
  35. Fujita, Y., de Ruiter, P., Wassen, M., Heil, G. Time-dependent, species-specific effects of N:P stoichiometry on grassland plant growth. Plant and Soil. 334, 99-112 (2010).
  36. Elser, J. J., Dobberfuhl, D. R., MacKay, N. A., Schampel, J. H. Organism Size, Life History, and N:P Stoichiometry. BioScience. 46, 674-684 (1996).
  37. Allison, V. J., Condron, L. M., Peltzer, D. A., Richardson, S. J., Turner, B. L. Changes in enzyme activities and soil microbial community composition along carbon and nutrient gradients at the Franz Josef chronosequence, New Zealand. Soil Biology and Biochemistry. 39, 1770-1781 (2007).
  38. German, D. P., Marcelo, K. R. B., Stone, M. M., Allison, S. D. The Michaelis - Menten kinetics of soil extracellular enzymes in response to temperature: a cross-latitudinal study. Global Change Biology. 18, 1468-1479 (2012).
  39. German, D. P., Chacon, S. S., Allison, S. D. Substrate concentration and enzyme allocation can affect rates of microbial decomposition. Ecology. 92, 1471-1480 (2011).
  40. Fierer, N., Craine, J. M., McLauchlan, K., Schimel, J. P. Liter quality and the temperature sensitivity of decomposition. Ecology. 86, 320-326 (2005).
  41. Sterner, R. W., Elser, J. J. Ch. 5. Ecological Stoichiometry: The Biology of Elements from Molecules to the Biosphere. Sterner, R. W., Elser, J. J. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 179-230 (2002).
  42. Cleveland, C., Liptzin, D. C:N:P stoichiometry in soil: is there a "Redfield ratio" for the microbial biomass. Biogeochemistry. 85, 235-252 (2007).
  43. Logan, S. R. The origin and status of the Arrhenius equation. Journal of Chemical Education. 59, 279 (1982).
  44. Trasar-Cepeda, C., Gil-Sotres, F., Leirós, M. C. Thermodynamic parameters of enzymes in grassland soils from Galicia, NW Spain. Soil Biology and Biochemistry. 39, 311-319 (2007).
  45. Menten, L., Michaelis, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem Z. 49, 333-369 (1913).
  46. Wallenstein, M. D., Haddix, M. L., Lee, D. D., Conant, R. T., Paul, E. A. A litter-slurry technique elucidates the key role of enzyme production and microbial dynamics in temperature sensitivity of organic matter decomposition. Soil Biology and Biochemistry. 47, 18-26 (2012).
  47. Chrost, J. Fluorescence correction for measurements of enzyme activity in natural waters using methylumbelliferyl-substrates. Archiv für Hydrobiologie. 106, 79 (1986).
  48. Reed, G. F., Lynn, F., Meade, B. D. Use of Coefficient of Variation in Assessing Variability of Quantitative Assays. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9, 1235-1239 (2002).
  49. Mead, J. A. R., Smith, J. N., Williams, R. T. Studies in detoxification. 67. Biosynthesis of the glucuronides of umbelliferone and 4- Methylumbelliferone and their use in fluorimetric determination of b-glucuronidase. Biochemical Journal. 61, 569-574 (1955).
  50. Haddix, M. L., et al. The Role of Soil Characteristics on Temperature Sensitivity of Soil Organic. Matter. Soil Sci. Soc. Am. J. 75, 56-68 (2011).

Tags

Environmental Sciences Ecological and Environmental Phenomena Miljø biokjemi miljø Mikrobiologi Soil mikrobiologi økologi Eukaryota archaea bakterier Jord ekstracellulære enzymaktivitet (EEAS) fluorometriske enzymanalyser substrat degradering 4-methylufilbelli (MUB) 7-amino-4-methylcoumarin (VIE) enzym temperaturkinetikk jord
Høy gjennomstrømming Fluorometrisk Måling av mulig Jord Ekstracellulære enzymaktivitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bell, C. W., Fricks, B. E., Rocca,… More

Bell, C. W., Fricks, B. E., Rocca, J. D., Steinweg, J. M., McMahon, S. K., Wallenstein, M. D. High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities. J. Vis. Exp. (81), e50961, doi:10.3791/50961 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter