Summary
För att mäta potentiella andelen markcellulära enzymaktiviteter, är syntetiska substrat som är bundna till en fluorescerande färg blandas med jordprover. Enzymaktiviteten mätes som det fluorescerande färgämnet frigöres från substratet genom en enzym-katalyserad reaktion, där högre fluorescens indikerar mer substratnedbrytning.
Abstract
Mikroberna i marken och andra miljöer producerar extracellulära enzymer för att depolymerisera och hydrolyserar organiska makromolekyler så att de kan likställas för energi och näringsämnen. Att mäta jord mikrobiell enzymaktivitet är avgörande för att förstå markekosystemet funktionella dynamik. Det allmänna konceptet för fluorescensen enzymanalys är att syntetisk C-, N-, eller P rika substrat bundna med ett fluorescerande färgämne blandas med jordprover. När intakt, gör de märkta substrat inte fluorescerar. Enzymaktiviteten mäts som ökning av fluorescens som de fluorescerande färgämnen klyvs från sina substrat, som tillåter dem att fluorescerar. Enzym mätningar kan uttryckas i enheter av molaritet eller aktivitet. För att utföra denna analys, är jordslam framställs genom att kombinera jord med ett pH-buffert. PH-buffert (typiskt en 50 mM natriumacetat-eller 50 mM Tris-buffert), väljs för buffertens synnerhet syrakonstanten (pKa) för att bäst matcha jord SAmple pH. Jord uppslamningar inokuleras med en icke-begränsande mängd av fluorescensmärkt (t.ex. C-, N-, eller P-rik) substrat. Med hjälp av mark slam i analysen tjänar till att minimera begränsningar av enzym och substrat diffusion. Därför denna analyskontroller för skillnader i substratbegränsning, diffusionshastigheter och mark pH-förhållanden, vilket upptäcka potentiella enzym förvärvsfrekvensen som en funktion av skillnaden i enzymkoncentrationer (per prov).
Fluorescens enzymanalyser är oftast känsligare än spektrofotometriska (dvs. kolorimetriska) analyser, men kan drabbas av störningar som orsakas av orenheter och instabilitet i många fluorescerande föreningar när de utsätts för ljus, så försiktighet krävs vid hantering av fluorescerande substrat. Likaså denna metod bedömer endast potentiella enzymaktiviteter i laboratorium när substrat inte är begränsande. Försiktighet bör iakttas vid tolkning av data som representerar korset-site jämförelser med olika temperaturer eller jordarter, som in situ jordart och temperatur kan påverka enzymkinetik.
Introduction
Extracellulära enzymer (EES) som produceras av jordbakterier, svampar och arkéer är inblandade i otaliga biogeokemiska processer, och är central för behandling, stabilisering och destabilisering av markens organiska material och näringsämnen cykling i terrestra ekosystem 1. Genom att producera betare, jordmikrober bryts ned och omvandla polymera organiska ämnen i mindre lösliga molekyler, därmed befriande tidigare bundna mikro-och makronäringsämnen, vilket gör att växter och mikrober för att tillgodogöra sig tillgängliga näringsämnen från marken. Ees har studerats under decennier, främst genom att mäta deras aktiviteter vid laboratorieanalyser 2-4, eftersom det är mycket svårt att direkt påvisa och kvantifiera enzymer.
Extracellulär enzymaktivitet (EES) är starkast styrs av koncentrationen av enzymer och motsvarande substrat. Överflödet av olika C-, N-och P-nedbrytande enzymer i marken styrs av många faktorer including mikrobiell biomassa, gemenskap sammansättning, substrat tillgänglighet, mikroklimat, och stökiometriska krav 5,6. Men i situ utrikestjänsten inom markmiljön påverkas också av temperaturen 7,8, bindningen av enzymer för att mark leror och humus egenskaper 2, och diffusion begränsningar 9, vilket i slutändan reglerar det aktiva enzymet poolen, i fråga om storlek, substrat tillgänglighet och personalomsättning 10-12. Därför erkänner in situ markförhållanden är avgörande vid användning av laboratorieenzymanalyser för att tolka jord mikrobiell funktion på olika platser miljön.
Många olika klasser av betydelse kan kvantifieras i laboratorieanalyser med hjälp av olika syntetiska substrat (se "Lista med reagenser Table" för mer information). Vissa protokoll utnyttjar substrat i analyser som är kopplade till en kolorimetrisk reaktion som kan detekteras med en spektrofotometer, vedan andra, inklusive det protokoll som vi beskriver här, utnyttja substrat som är bundna till en fluorescerande grupp. Fluorescens EE analyser är oftast känsligare (genom en storleksordning) än kolorimetriska analyser (som använder en kromogen del kopplad med ett syntetiskt substrat) 12-14. Känsligheten i EES-detektion inkluderar två aspekter: en är relaterade till mängden av föreningen av intresse upptäcks och de andra till den lägsta detekterbara potentiella enzymaktivitet. Metoder för kolorimetrisk P-nitrofenol (PNP)-baserade analyser kan återfinnas i tidigare arbeten 15,16. I korthet jord (vanligtvis siktades till <2 mm och lufttorkades) inkuberas vid optimal eller fält-relevant temperatur och pH. Den hastighet med vilken reaktionsprodukten frigörs bestäms kolorimetriskt med en spektrofotometer 14. Ju högre känslighet fluorescens enzymanalyser beror delvis på den mer känslig detektion av det fluorogena delen separation i samband med substråt nedbrytning snarare än inspelning absorbans efter separationen av ett specifikt kromogent molekyldel vid en specifik våglängd. De två mest använda syntetiska fluorescerande indikatorer är 4-metylumbelliferon (MUB) 17 och 7-amino-4-metylkumarin (MUC) 18,19. MUC-bundna substrat är vanligen associerat med N-rika syntetiska substrat, såsom proteiner och / eller aminosyror. Fluorescerande tekniker utvecklades först för vattenlevande prover 20,21, och deras tillämpning på jordar kräver kontroller för signal härdning och störningar 22,23. Analyser kan antingen genomföras med hjälp av traditionella "bänk" kemi med stora volymer, eller kan användas i mikrobaserade protokoll, med ökad genomströmning men möjligen högre mätfel. Medan det finns flera allmänt hänvisas till protokoll för fluorescerande detektering av avdelningen i marken 24, många laboratorier utnyttjar subtila variationer på dessa protokoll, ofta oavsiktligt eller på grund av skillnadenar i laboratorieutrustning och reagenser. Till synes små skillnader i detaljerna i protokollen kan starkt påverka mätas EEAS 25,26 och bristen på standardiserade enzymer som gör det svårt att kalibrera analyser mellan olika laboratorier. Det finns således ett stort behov av att sprida detaljerade protokoll för att uppmuntra standardisering av EES-analyser.
I våra protokoll, är jordprover framställs genom att kombinera jordprover med en pH-buffert och homogenisering med en bländare. Uppslamningarna därefter ympades med en icke-begränsande mängd av fluorescensmärkt C-, N-, eller P-rikt substrat, valt beroende på den specifika frågeställningen av intresse. Med hjälp av mark slam i enzymanalyser fungerar som en kontroll för att minimera substrat diffusionsbegränsningar. De fluorescerande delar kyls tills de klyvs från sina respektive substrat, och således enzymaktivitet kan detekteras som det fluorescerande färgämnet frisätts från substratet by en enzym-katalyserade reaktionen. Den ökade fluorescensintensiteten genom tiden återspeglar hastigheten för den enzymkatalyserade reaktionen.
Det allmänna begreppet fluorescens enzymanalys är att syntetiska substrat bundna med ett fluorogent del (fluorescerande färg), blandas med jordprover 27. Vid enzymkatalyserade substratnedbrytning, bryts bindningen mellan det fluorescerande färgämnet och substratet. Det fluorescerande färgämnet frigöres från substratet följaktligen användas som en indirekt bedömning av enzymaktivitet, och kan kvantifieras med användning av en mikroplattavläsare för att detektera fluorescensintensiteten hos färgämnet. I korthet är fluorescens kvantifiering fulländad som den frigjorda färgen avger ljus av en våglängd efter att absorbera ljus av en annan våglängd. Fluorescensintensiteten registreras av en plattläsare med förmåga att både excitering och detektering. Enzymaktivitet kan därefter kvantifieras utifrån den kända fluorescerande-dye concentrations av substratet (dvs. kända kvantiteter av syntetiskt substrat blandas med jordprover) tillsammans med hänvisning till en standardspädningskurvan för fluorescensintensiteterna för den specifika fluorogena delen hos det substrat som används vid analysen (dvs 4-metylumbelliferon (MUB) eller 7-amino -4-metylkumarin (MUC)). (Se protokoll sektionen för specifika detaljer om enzymaktivitet kvantifiering).
Laboratoriemarkenzymanalyser är användbara för att bedöma mikrobiella funktion, men det finns flera tekniska begränsningar som användare bör känna igen 10. Fluorescens-analyser kan drabbas av störningar som orsakas av föroreningar och / eller instabiliteten hos många fluorescerande föreningar när de exponeras för ljus, så försiktighet krävs vid hantering fluorescerande substrat 25. Jordpartiklar och / eller organiskt material i marken slam kan också störa fluorescensintensiteter, känd som härdningseffekten 26.Dessutom laboratorieenzymanalyser endast bedömer potentiella utrikestjänsten under laboratorieförhållanden. In vitro-analyser mäter utrikestjänsten under förhållanden där substrat diffusion och överflöd är icke begränsande. Därför kan uppgifterna från dessa analyser inte vara en bra proxy för EEAS i in situ markförhållanden 10. Totalt sett är enzymaktiviteten mycket användbart för relativa jämförelser i vilka jordtyper liknar. Men när man använder denna metod för att jämföra verksamheter mellan jordar som skiljer sig i fysikaliska eller kemiska egenskaper, bör försiktighet iakttas. Detta beror på det faktum att skillnaderna i jordart och temperaturen drastiskt kan förändra tillståndet i in situ-enzymkinetik. En annan begränsning är att relativt få substrat är kommersiellt tillgängliga (jämfört med den naturliga miljön). Dessutom är de syntetiska substrat som används för enzymanalyser är relativt enkla (lättlöslig) inte korrekt representera jordsubstrat närvarande eller available på plats. En annan faktor att beakta är att använda mark slam kommer att införliva verksamheten i vissa stabiliserade enzymer (dvs. immobiliserade av organiskt material eller leror) som kanske inte är aktiva i in situ-förhållanden 2. Laboratorieenzymanalyser dessutom inte ge information om persistens av enzymer i marken (enzymomsättningen) eller information om de specifika mikroorganismer som producerar mark enzymer.
Protocol
1. Analys Set-up
- Etikett 3 djupa brunnar: "Sample", "MUB standard", och "MUC-standarden".
- Häll varje standard (MUB av 0, 2,5, 5, 10, 25, 50, och 100 ^ M) och substratet (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) i separata rena, prelabeled reservoarer (orienterade i rader) .
- Pipettera lämplig MUB standard i motsvarande brunnar av MUB standardplatta (Tabell 1).
- Pipettera 200 | il av 0 pM MUB i rad A i MUB standardplattan.
- Pipettera 200 l av 2,5 mikroM MUB i rad B i MUB standardplåt.
- Pipettera 200 | il av 5 | iM MUB i rad C i MUB standardplattan.
- Pipettera 200 l av 10 mikroM MUB i rad D i MUB standard plåt.
- Pipettera 200 l av 25 mikroM MUB i raden E av MUB standard plåt.
- Pipettera 200 l av 50 mikroM MUB i rad F i MUB standard plåt.
- Pipettera 200 ul av 100 μM MUB i rad G i MUB standardplattan.
- Upprepa steg 1.3.1 - 1.3.8 för MUC standarder i motsvarande brunnar i MUC standardplattan.
- Prep jordslam för varje jordprov.
- Väg 2,75 g fält fuktig jord i mixer.
- Lägg till 91 ml 50 mM buffert. Blanda på hög i 1 min.
- Häll mixer innehållet i en ren glasskål minst lika bred som 8-kanals pipett med en omrörare.
- Placera på uppståndelse tallrik, blanda jord slurry på låg.
- Pipettera 800 ul av jord uppslamningen i första kolumnen i provplattan (Tabell 2).
- Upprepa i 1: a kolumnen i MUB standard och MUC standardplattor (tabell 1).
- Skölj mixer, rör om plattan och omrörare med DI H2O eller buffert mellan jordprover.
- Upprepa steg 1.4.1 - 1.4.7) för varje prov, flytta till nästa kolumn med varje efterföljande jordprov (tabell 1 och2).
- Pipettera lämplig substrat (i detta exempel, 200 pM koncentrationer) i motsvarande brunnar i provplattan (tabell 2).
- Pipettera 200 ul av BG substratet i rad A i provplattan.
- Pipettera 200 l av CB substrat i rad B i provplatta.
- Pipettera 200 ul av NAG substratet i rad C i provplattan.
- Pipettera 200 l av PHOS substrat i rad D i provplatta.
- Pipettera 200 l av XYL substrat till raden E av provplatta.
- Pipettera 200 l av AG substrat i rad F i provplatta.
- Pipettera 200 ul av LAP substratet i rad G i provplattan.
- Upprepa steg 1.5.1 - 1.5.7 för varje inkubationstemperatur provplatta.
2. Inkubation av analysplattor
- Täta djupa brunnar ("Sample", "MUB standard", och "MUC standard4 ;) med plattmattor.
- Vänd varje (förseglad) platta för hand tills lösningen blandas grundligt (~ 10x).
- Placera plattorna i lämplig inkubator för krävs inkubationstid perioden (Tabell 3).
- Spela första gången som Time 0. Också spela in lämpliga inkubationstider så att du vet när du ska ta bort plattan från kuvösen (tabell 3).
- Vid slutet av varje inkubationsperiod centrifugera de förseglade plattorna under 3 min vid ~ 2900 X g.
- Efter certifiering, överför 250 pl från varje brunn av de inkuberade djupa brunnar i motsvarande brunnar i svart flatbottnade plattor med 96 brunnar (en svart platta kommer att användas för varje inkuberade djupa brunnar). Det är viktigt att överföra prover från de inkuberade djupa brunnar i samma brunnar (dvs. A1 ... A12, etc.) i den svarta flatbottnade 96-brunnsplattor (tabell 1, 2).
3. Fluorescerande Mätningar påen Microplate Fluorometer
- Efter tillverkarens instruktioner för fluorometriska plattläsaren används, som excitationsvåglängden till 365 nm och emissionsvåglängd på 450 nm (eller använda lämpliga filter).
- Läs de tre plattor på fluorometer. Viktigt: prover och standardplattor (dvs. MUB eller MUC) måste läsas med samma förstärkning.
- Ställ in spektrofotometern för automatisk förstärknings och läsa MUC och MUB standardplattor.
- Ställ vinst till manuell, och minska värdet från optimala till närmast lägre nummer, avrundat till närmaste fem, för varje Standardplatta. Upprepa 2x för varje platta.
- Ställ in förstärkningen till automatiskt och köra provplattan. Köra provplattan manuellt för att matcha den högsta vinsten för var och en av standardplattor (dvs. MUB och MUC).
4. Dataanalys
- Ange standardkurva fluorescens data till kalkylblad för MUB (Tabell 4a) Och MUC-standarden (tabell 4b)
- Konvertera (^ M) koncentrationer till (| imol) (tabellerna 4a och 4b).
- För varje prov standardkurva fluorescensdata, beräkna lutningen, y-avskärning, och R 2 värden för MUB och MUC (imol) standardkoncentrationer. Godtagbara R 2 värden bör överstiga 0,98 för varje prov (tabellerna 4a och 4b). Det kan vara användbart för att visualisera standardkurvor i ett spridningsdiagram, med fluorescens läser plottas som beroende variabel (y-axeln) och standardkoncentration (pmol) ritas som den oberoende variabeln (x-axel) (Figur 1).
- Du kommer att använda MUB och MUC standardkurva lutning och y-skärningspunkten för att beräkna provet + substrat rå fluorescens uppgifter till potentiella utrikestjänsten. Du måste först ange + substrat rå fluorescens exempeldata till ett nytt kalkylblad (tabell 5a (tabell 5b). Observera de tidsvärden som anges i detta exempel är 3 timmar, eftersom proven inkuberades vid 25 ° C (tabell 3).
- Subtrahera standardkurvan i skärningspunkten mellan de motsvarande exempelfluorescensvärden och sedan dividera med lutningen hos den motsvarande standardkurvan (tabell 5c). För att åstadkomma detta, ordna standardrad ekvation att lösa för provenzymkoncentration (x), x = (yb) / m där: [y = provets fluorescens rå läsning, b = intercept från MUB eller MUC Standardkurva, m = lutning från MUB eller MUC Standardkurva].
- Multiplicera prov mikromol, från steg 4.3.1 ovan, med 91 ml (buffertvolym som används i jord slurry) (Tabell 5d).
- Divide värde som erhålls i steg 4.3.2 av provspecifika inkubationstid och torr jordmassa (tabell 5e): [enzym amt. (& #956, mol) x 91 ml x inkubation (h) x torr jord (g) x 0,8 ml x 1,000]
Anm: 0,8 ml är volymen slam som används i varje brunn, och 1000 korrigerar för den faktiska markbeloppet i varje brunn. - Multiplicera det värde som erhålls i steg 4.3.3 med 1,000 för att få de önskade enheter (nmol aktivitet / g torr jord / h) (Tabell 5f).
Representative Results
Enzymanalyser kan användas för att kvantifiera potentiella avdelningen och att jämföra aktiviteter bland liknande prover. Här presenterar vi representativa resultat från en experimentell klimatstudie som jämför jordar som upplevt omgivande klimatförhållanden (ACN) till jordar som exponerats för förhöjda CO2 och värmebehandlingar (EHN) (figur 2-6). Växttäcke alla tomter är desamma som för en nordlig blandad gräs prärien domineras av C4 gräset Bouteloua gracilis (HBK) Lag. och två C3 gräs, Hesperostipa comata Trin och Rupr. och Pascopyrum smithii (Rydb.) och ca 20% av den vegetation består av halvgräs och örter. Mer information om platsbeskrivningen och fält experimentell design finns i referenserna 28-30. Jordar samlades in från två olika djup (0-5 cm och från 5 till 15 cm) inom vart och ett av behandlingsytor med användning av en kärna 1,5 cm diameter för att bedöma mark avdelningen som svar på förändrade klimat cILLKOR. I våra exempel (dvs. figur 2-6), är provstorleken (N = 3). Oavsett detta minimal provstorleken, är variationen relativt liten i de flesta fall (vilket framgår av de felstaplar) och kraftigt speglar variationen i möjliga utrikestjänsten bland behandlings tomter. Variansanalys (ANOVA) och Tukey post hoc multipla jämförelser användes för att identifiera viktiga förändringar i enzymaktivitet bland behandlings tomter och markdjup.
Följande representativa resultat har lämnats för att visa hur denna hög genomströmning, kan fluorometrisk analys användas för att testa (1) övergripande betydelse i jord, (2) hur EES stökiometri kan tyda på ekosystemnivå processer och (3) förhållandet mellan inkubationstemperatur och EES. Mark EES s vanligen studeras för att relatera förändringar i mikrobiella funktion för marknäringscykler, användbara indikatorer för att bedöma mikrobiella näringskrav som svar på klimatförändringar, växtsamhälle shifts, och mer allmänt ekosystemens funktion 31-33. EES stökiometri har nyligen antagits som ett index för att bedöma mark biokemiska närings cykling genom korsande ekologisk stökiometrisk teori och metabolisk teori om ekologi för att bedöma potentiella mikrobiella näringsobalanser som motsvarar omgivningsförhållanden 5. Ett flertal studier har visat att breda stökiometriska förhållanden tyder på näringstillväxtbegränsningar 34-36, och som näringsämnen i jorden blir begränsade, mikrober reagerar genom att avsätta metaboliska resurser för att producera specifika enzymer för att förvärva bristfälliga näringsämnen 37. Ecoenzymatic C: N: P stökiometri förhållanden är således användbara för att identifiera relativa förändringar i eventuella mikrobiella näringskrav som svar på olika miljö störningar 5. Slutligen kan temperaturkänsligheter av utrikestjänsten vara lämpligt att fastställa hur markmikrobiella funktionell mångfald sannolikt påverkas av temperaturskiften <sup> 7,38. Enzymtemperaturkänslighet kan variera kraftigt mellan jordar för en enzymklass, och mikrobiella samhällen som producerar enzymer har visat förändringar i enzymaktivitet motsvarande förändringar i klimatet från historiska förhållanden 7. Således enzymaktivitets frågor relaterade till den termiska ekologi tare kan vara ett användbart sätt att utvärdera mikrobiella funktionella dynamik och belowground ekosystemprocesser som svar på klimatförändringar 39,40.
I detta exempel potentiella C-, N-och P-enzymförvärvsaktiviteter analyseras på 0-5 cm markdjup inte avvika med experimentell behandling (Figur 2a). Emellertid på 5-15 cm jorddjup, har flera potentiella avdelningens skiljer sig signifikant (figur 2b). Exempelvis ,4-glukosidas och β-D-cellobiohydrolas var C-nedbrytande enzymer β-1 lägre i Ehn tomter (p ≤ 0,038, Figur 2b) jämfört med ACN tomter. N och P gruvarbetarealizing enzymer (β-1 ,4-N-acetylglukosaminidas och fosfatas, respektive) var också lägre i den Ehn tomter (p ≤ 0,012, Figur 2b) jämfört med ACN på 5-15 cm markdjup.
Beräkning och plottning av summan av alla C-, N-, eller P-cykling potentiella avdelningen kan vara en användbar metod för att observera bredare mönster med avseende på potentiell jord C-, N-och / eller P-cykler (Figur 3). I detta exempel var summan av β-1 ,4-glukosidas, β-D-cellobiohydrolas, β-xylosidas, och α-1 ,4-glukosidas potentiella avdelningens beräknats utgöra potentiella C cykelaktiviteter. Summan av β-1 ,4-N-acetylglukosaminidas och L-leucin-aminopeptidas beräknades representerar potentiella N cykelaktiviteter. Fosfatas användes för att representera potentiella P cykelaktiviteter. I detta exempel potentiella avdelningen för total C-, N-och P-cykling trended lägre i EHN plottar jämfört med ACN tomter vid 5-15 cm jorddjup (Figure 3). Dock var denna trend bara betydelse för den totala N-och P cykelaktiviteter (p ≤ 0,046, Figur 3). Jord EEAS inte signifikant skiljer sig åt mellan behandlings tomter på 0-5 cm markdjup (Figur 3). Resultaten för detta exempel antyder kontrasterande trender i enzymaktivitet funktionell grupp (dvs. C-, N-eller P-nedbrytande enzymer) hos behandlings tomter (ACN vs EHN) som svar på jorddjup. Till exempel, C-, N-och P-nedbrytande jord avdelningen vid de omgivnings tomter (ACN) trended högre vid lägre djup jämfört med jordar som exponeras för förhöjd CO 2 och uppvärmning (EHN), vilket visade ett omvänt mönster (Figur 3a-c ).
Enzym stökiometri är en annan användbar metod för att bedöma potentiella enzymaktiviteter i miljön (Figur 4). Den mikrobiella efterfrågan på näringsämnen bestäms av elementärt stökiometrin av mikrobiell biomassa i förhållande till miljö-näringstillgång 32. Likaså mikrober producerar specifika enzymer (dvs C-, N-eller P-nedbrytande enzymer) för att tillgodose näringsbehov inom sina markmiljöer, även kallad ekologisk stökiometri 41. Förhållandet av potentiella avdelningen är ett sätt att bedöma mikrobiella näringskrav. Till exempel, en 1:1-förhållande mellan två enzym funktionella grupper (t.ex. i C: N näringsämnen förvärv) tyder på att efterfrågan på N är hög i förhållande till efterfrågan på C när man överväger mikrobiell biomassa C: N-förhållanden på samhällsnivå är typiskt 8:01 42. I det här exemplet, jord enzym stökiometri C: N, C: P eller N: P verksamhet skiljer sig markant mellan de behandlings tomter på 0-5 cm markdjup (figur 4a-c). Men potentiella enzym C: P och N: P kvoter var högre i EHN tomter jämfört med ACN tomter vid 5-15 cm markdjup (p = 0,05; figurerna 4b och 4c). Denna observation tyder på att detär relativt sett högre P mineraliseringsutrikestjänsten jämfört med C och N EES ACN tomter (jämfört med EHN) vid 5-15 cm markdjup. Enzym C: N förvärvsaktivitet nyckeltal visade en liknande trend som framgår av de totala C-avdelningen med högre C: N på grund av högre potentiella C-avdelningen i ACN tomter på lägre djup jämfört med EHN (figur 4a).
Temperaturen kan starkt påverka markutrikestjänsten. Men i typiska laboratorieanalyser, är jord enzymer mäts vid en enda temperatur, som inte kan motsvara in-situ-temperaturer. Vår fluorescens enzymanalys metod tillåter oss att tänka i situ temperatureffekter genom att integrera flera laboratorie inkuberingstemperaturer för jämförelse. Med hjälp av laboratorie inkubationer vid flera temperaturer tillåter oss att analysera temperaturberoende enzymkinetiska data med hjälp av Arrhenius tomt och Q 10 beräkningar. Arrhenius-kurva används för att visualisera aktiveringsenergi, och plottas ossing logaritmen av enzymaktivitet (y-axel beroende variabel) som funktion av den inversa temperaturen konverteras till grader Kelvin (1 / K) på x-axeln (dvs. oberoende variabel, figurerna 5a-c). Aktiveringsenergi definieras vanligen som den minsta energi som krävs för att katalysera en kemisk reaktion (dvs. försämra ett givet substrat i mindre produkter). För våra syften, fungerar aktiveringsenergi som en proxy för känslighet enzymkatalyserade reaktioner temperatur. Högre aktiveringsenergi indikerar känslighet enzymtemperatur. Likaså aktiveringsenergier (dvs. figurerna 5d-f) direkt motsvarar Q-10 värden (dvs. figurerna 6a-c). En ytterligare förklaring av formler som används för att beräkna aktiveringsenergi och praktisk tillämpning kan hittas i många tidigare verk 40,43-45. Arrhenius tomter, aktiveringsenergi och Q 10 tomter ger redundant information och bör intealla användas i samma manuskript för att presentera data för publicering (figurerna 5 och 6). Därför, när du använder dessa tekniker, är det nödvändigt att välja den lämpligaste tomten typ för din enzymTemperatur - kinetik uppgifter 10. Alla diagramtyper (Arrhenius och 10 Q) presenterades här i demonstrationssyfte, för att ge visuella exempel på hur man presenterar enzymresultat.
I våra exempel bedömde vi potentiella enzymkinetik för potentiella C-, N-och P-avdelningen hos båda behandlings tomter vid de två jorddjup (Figur 5, Figur 6). Fyndet visade att känsligheten för avdelningens temperaturen var inte signifikant olika mellan behandlings tomter på antingen jorddjup för aktiveringsenergi som demonstreras i Arrhenius tomter (figur 5a-c) och motsvarande aktiveringsenergier (Figur df) och (inte helt oväntat) för Q 10 plots (i detta exempel mellan 15 ° C och 25 ° C laboratorie inkubationer, figurerna 6a-c). Detta tyder på att enzymkinetik inte påverkades av fält experimentella behandlingar i denna studie.
Tabell 1. Djupa brunnar design för fluorescens standardkoncentrationer med jordprover. Mall för att organisera och lastning fluorescens standarder (MUB eller MUC) med jordprover i den djupa brunnar före inkubering. OBS: Kolumnerna representerar samma jordprover (800 | il tillägg jord slurry). En gradient av fluorescens standardkoncentrationer laddas för varje rad (200 il tillägg). Varje cell representerar fluorescens standardkoncentration plus tillägg jord slurry. Till exempel S1 - S12 representerar jordprover (800 pl av jord slurry), MUB 0-100 ^ M = 4-Methylumbelliferone koncentrationer (200 | il kompletteringar). I det här exemplet är rad H öppet och är därför tillgängligt för att inkludera en högre fluorescensstandardkoncentration om det behövs. Beslutet att höja standardkurvan koncentrationer kan vara nödvändigt för högre potential enzymaktivitet (och / eller de substratkoncentrationer som används) för dina specifika jordprover. Den potentiella enzymaktivitet för dina prover ska ligga inom intervallet för standardkurvan värden. Klicka här för att visa en större tabell .
Tabell 2. Djupa brunnar designen för jordprover med substrat. Mall för att organisera och ladda jordprover och substrat i den djupa brunnar före inkubering. OBS: Kolumnerna representerar samma jordprover (800 | il såil slam tillägg). Olika substrat lastas över varje rad (200 il tillägg). Varje cell representerar jordprover plus substrat tillägg. Till exempel S1 - S12 representerar unika jordprover (800 il jord slurry). Substrat (200 | il kompletteringar) inkluderar: BG = 4-metylumbelliferyl β-D-glukopyranosid, CB = 4-metylumbelliferyl β-D-cellobiosid; NAG = 4-metylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glukosaminid, PHOS = 4-metylumbelliferyl fosfat: XYL = 4-metylumbelliferyl-β-D-xylopyranosid; AG = 4-metylumbelliferyl α-D-glukopyranosid, och LAP = L-leucin-7-amido-4-metylkumarin-hydroklorid. I detta exempel är raden H öppet, och är därmed tillgänglig för att inkludera ett annat underlag för att bedöma en annan potentiell enzymaktivitet om så önskas. Klicka här för att visa en större tabell .
| Temperatur | Tid |
| 4 ° C | ~ 23 tim |
| 15 ° C | 6 tim |
| 25 ° C | 3 tim |
| 35 ° C | 1,5 tim |
Tabell 3. Inkubator temperaturer som krävs för motsvarande inkubation tidsperioder Inkubationstemperaturer och motsvarande tidsperioder för enzymanalysförfarandet..
Tabell 4. MUB och MUC standardkurva beräkningar. Demonstrerar hur man organiserar en) MUB och b) MUC rå fluorescens uppgifter (mikromol) för att därefter beräkna lutning, y-axeln, och R-kvadrat värde. För att beräkna lutningen, y-axeln, och R-kvadrat-värden från din vanliga koncentrationskurvor väljer (eller tomt) iMUB och / eller MUC råa fluorescensdata som beroende variabel (y-axeln) och standardkoncentration (pmol) som den oberoende variabeln (x-axeln). Anmärkning:. MUB = 4-metylumbelliferon, MUC = 7-amino-4-metylkumarin Klicka här för att visa en större tabell .
Tabell 5. . Enzymaktivitet beräkningar visar hur man a) organisera exempel rå fluorescens uppgifter och därefter utföra de steg som behövs (bf) för att beräkna EEAS in: mikromol aktivitet / g torr jord / tim. OBS: S1 - S12 representerar unika jordprover. Substrat inkluderar: BG = 4-metylumbelliferyl β-D-glukopyranosid, CB = 4-metylumbelliferyl β-D-cellobiosid; NAG = 4-metylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glukosaminid, PHOS = 4-metylumbelliferyl phosphate: XYL = 4-metylumbelliferyl-β-D-xylopyranosid, AG = 4-metylumbelliferyl α-D-glukopyranosid, och LAP = L-leucin-7-amido-4-metylkumarin klorid. Klicka här för att visa en större tabell .
Figur 1. MUB standardkurva plot. Scatterplot visualisering av standardkurvor med råa fluorescensdata som beroende variabel (y-axeln) och standardkoncentration (pmol) som den oberoende variabeln (x-axeln).
Figur 2. C, N-och P cykling enzymaktiviteter. Potentiella utrikestjänsten på prärien Värme och Förhöjda CO2 Svanriknings (PHACE) plats i kontrollytorna (ACN: utsatt för omgivningsklimatförhållanden) och behandlings tomter (Ehn: utsatt för ökad temperatur och förhöjd CO2). Jord enzymer analyserades vid ett) 0-5 cm markdjup och b) 5-15 cm markdjup. Vertikala staplar representerar medelvärde ± SE Obs: ACN = omgivnings - klimat tomter, EHN = förhöjd CO2 och värme tomter. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Totalt C, N och P cykling enzym stökiometriska förhållanden Summan av potentiella utrikestjänsten deltar i förvärvet av a) C, b) N, och c) P-för båda behandlingsgrupperna i PHACE experimentet vid 0-5 cm och 5. - 15 cm markdjup. Vertical staplar representerar medelvärde ± SE Obs: ACN = omgivnings - klimat tomter, EHN = förhöjd CO2 och värme tomter. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Enzym stökiometri för total C, N och P cykling enzymaktiviteter Enzyme förvärvsaktivitet stökiometriska förhållanden på prärien Värme och Förhöjda CO2 Enrichment (PHACE) webbplats i kontrollytorna. (ACN: utsatt för omgivande klimatförhållanden) och behandlings tomter (EHN: utsätts för förhöjd temperatur och förhöjt CO 2). Total mark a) C: N, b) C: P och c) N: P plottades för båda behandlingsgrupperna på 0-5 cm och 5-15 cm markdjup. Vertikala staplar representerar medelvärde ± SE Obs: ACN= Ambient - klimat tomter, EHN = förhöjd CO2 och värme tomter. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. . Totalt C, N och P cykling enzymaktiveringsenergier Temperaturkänslighet av potentiella avdelningen visas med Arrhenius tomter för total a) C, b) N, och c) P nedbrytande enzymer, såväl som de motsvarande aktiveringsenergivärdena för total d) C , e) N, och f) P nedbrytande enzymer bland behandlings tomter och jorddjup på prärien Värme och Förhöjda CO2 Enrichment (PHACE) webbplats. Vertikala barer för aktiveringsenergi (dvs. df) representerar medelvärde ± SE Obs: ACN = ambient - klimat tomter, EHN = förhöjd CO2 och värme tomter. För publicering, är det viktigt att notera att författaren normalt skulle välja att presentera antingen Arrhenius tomter (dvs. ac) eller aktiveringsenergivärden (dvs. df), men inte båda plot-typerna. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 6. Totalt C, N och P cykling enzym Q10 (15-25 ° C). Temperatur känslighet för potentiella EEAS mätt som 10 Q, som bygger på laboratorie inkubation vid 15 ° C och 25 ° C för total a) C, b) N, och c) P nedbrytande enzymer bland behandlings tomter och jorddjup på prärien Värme och Förhöjda CO2 </ Sub> Enrichment (PHACE) webbplats. Vertikala streck för Q10 representerar medelvärde ± SE Obs: ACN = omgivnings - klimat tomter, EHN = förhöjd CO2 och värme tomter. Klicka här för att visa en större bild .
Discussion
Den laboratoriebaserad mätning av potentiella jord EEAS kan ge viktiga insikter i mikrobiella reaktioner på sin abiotiska miljön, och dess konsekvenser för ekosystemens funktion. Resultaten av detta exempel datamängd tyder på att minimala skillnader i jord enzymaktivitet eller kinetik hos klimatbehandlings plottningar. Men omvända trender bland tomter uppmuntra till ytterligare utredning av kovariater som kan påverka produktionen av mikrobiella utrikestjänsten, såsom markfuktighet, markens pH eller växters tillväxt. Sammantaget bedömer utrikestjänsten i fråga om (1) övergripande betydelse i jord, (2) EES stökiometri (3) Arrhenius tomter / aktiveringsenergi, och (4) 10 Q erbjuder ett brett spektrum av metoder som kan tyda på ekosystemnivå processer för att kraftigt karakterisera markekosystemet funktionella dynamik.
Hög genomströmning fluorescensbaserade EES-analyser är ett användbart verktyg som ofta används för att undersöka potentiella utrikestjänsten i mark ochandra miljöer. Viktigt potentiella aktiviteter speglar enzymet poolstorlek, men inte själva kvantifiera enzym produktions-eller omsättningshastigheter 46. Även om tekniken är relativt enkelt, kan till synes små skillnader mellan labbprotokoll försvårar jämförbarheten av resultat 13. Tyvärr har vi för närvarande inte har lämpliga standardiserade positiva kontroller för utrikestjänsten. Användningen av stökiometriska förhållanden är en strategi för att övervinna dessa utmaningar. I övrigt, har tillkomsten av hög kapacitet tekniker avancerade studier av enzymer i miljön 4. Noggrann tolkning av data som genereras av dessa analyser kan belysa viktiga trender i mikrobiell aktivitet.
Robustheten i protokollet härrör från möjligheten att välja om förhållanden som är specifika för enskilda prover, men det kan också leda till begränsningar. En rad modifieringar kommer att krävas för att säkerställa prover mäts noggrant för individuella fält platser:
Buffert
Bufferten du väljer beror på pH-värdet i marken. Buffrande också stabiliserar fluorescensintensiteten hos de fluorescerande standarder, som är starkt pH-beroende 27,47. Den pH-buffert som vi använder typiskt för att göra jorden uppslamningen är en 50 mM natriumacetat-eller Tris-buffert som väljs för buffertens synnerhet syrakonstanten (pKa) för att bästa matchningen jord - prov pH-nivåer. Natriumacetat har ett pKa-värde av 4,76, och Tris har ett pKa av 8,06 så att mängderna av dessa två buffertarna kommer att variera i syfte att nå den önskade pKa för det enskilda provet. Fosfatbuffert (pKa = 7,2) har föreslagits för neutrala / svagt basiska jordar. Men, varnar vi för att testa för analytisk variabilitet i förstudier innan du använder denna buffert, som höga fosfathalter kan störa enzymaktivitet.
Hantering och lagring av fluorescerande substrat
jove_content "> fluorescensanalyser kan drabbas av störningar som orsakas av föroreningar och / eller instabilitet i många fluorescerande föreningar när de utsätts för ljus, så försiktighet krävs vid hantering av fluorescerande substrat. Vi rekommenderar starkt att minimera något ljus exponering för fluorescerande substrat och MUB och MUC standarder . Använda bruna glasflaskor eller täcker glas och behållare som används för framställning och magasinering fluorescerande substrat och standarder rekommenderas starkt, aluminiumfolie att svepa glas och behållare fungerar bra Likaså effektivt ympa plattor och överföra till mörka inkubatorer är bästa praxis Vi rekommenderar.. lagra substrat och standarder (-20 ° C) i högst två månader (och samtidigt skydda dem från ljus) och upptining substrat (5 ° C) ~ 24-48 timmar innan du påbörjar enzymanalys (s).Design och replikering
För att bäst står för väl till såväl prov variationer, genomföra negative analyskontroller och (om möjligt) analys replikerar rekommenderas. Variation uppstår vanligtvis på grund av skillnader i mängden av jordpartiklar i varje brunn och pipetteringsfel. Därför kommer en stark blandning och bra pipetteringsteknik avsevärt minimerar väl till bra variation. Dessutom rekommenderar vi starkt att genomföra en negativ analyskontroll (buffert + substratlösning) för att övervaka substrat inkonsekvenser över tiden. Detta kan lätt kontrolleras när man läser enzymplattorna genom att jämföra negativa kontrollbrunnar (vi använder vanligtvis den sista kolumnen på 96-hålsplattor). Negativa substrat kontroller är typiskt stabila, därför signalen ökar väl över detektionsgränsen, är det ett tecken på kontaminering eller substratet instabilitet, vilket kräver utbyte av substratet och / eller standardlösningarna.
För att maximera genomströmningen, innehåller våra protokoll flera potentiella utrikestjänsten i en enda djup brunn mikroplatta, även om andra protokoll utför en typ avassay per platta (dvs. ett substrat per platta) eftersom olika avdelningens inträffa med olika hastigheter. Oavsett måste enzym optimering utföras på marken innan du utför denna hög under hela tillvägagångssätt eller den enda skylt strategi. Flera substrat kan användas på en enda skylt om reaktionshastigheterna är relativt likartade för varje enzym inom tidsperioden för inkubation.
Vår protokoll rekommenderar ~ 2,75 g jord för att göra lösningen slurry, medan ~ 1 gram rekommenderas i andra protokoll 24. Vi föreslår att du använder mer mark (om möjligt) är en effektiv metod för att bättre fånga inom-jordprov variation i enzymaktivitetsnivå. I detta protokoll, vi inkubera 800 l av jord slurry med 200 ^ substrat, medan andra bara inkubera 200 l av jord slurry med 50 pl substrat. Detta är helt enkelt en funktion av att skala upp som i slutändan inte ändrar den uppmätta aktiviteten. Det finns också praktiska fördelarför att använda större volymer. Ett, är det lättare att undvika jordpartiklar medan pipettering in motsvarande svarta flatbottnade 96-brunnsplattor före inspelning intensiteter på fluorometer. För det andra, är den ytterligare volymen användbar i fallet med oavsiktliga utsläpp samtidigt överföra de svarta flatbottnade 96-brunnsplattor till fluorometern före inspelning enzymrelaterade fluorescensintensiteter. Även små avvikelser i volym kommer att avsevärt minska fluorescens mellan brunnar. Slutligen, på grund av den höga genomströmning karaktären av detta protokoll, vi brukar välja att förlita sig på experimentell replikering att representera variation i enzymaktivitetsnivåer istället för att genomföra analysen replikerar. Det är alltid de bästa metoderna för att inkludera analytiska replikat, men i praktiken, vi känner att våra protokoll ger en balanserad avvägning mellan analytiska och experimentella replikat ges begränsade resurser. Likaså använder vår inställning relativt sett väl homogeniserad jord (2,75 g) per analys 25, som inherently minskar inom-markvariationer. Beslutet att använda analytiska replikat bör övervägas noga genom att testa för analytisk fel i förstudier 48. Vi rekommenderar dock att experimentell design med färre än fyra behandlingsgruppen replikat starkt bör överväga att använda analys replikat.
Jord, Buffert volymer, och substratkoncentration optimering
Den jord som buffert: substratkoncentration förhållandet är en viktig variabel som påverkar starkt den uppmätta fluorescensen vid utförande av enzymanalyser. Den mängd jord i uppslamningen sattes till analysen eller koncentrationen av substratet kan behöva justeras beroende på aktiviteten av enzymer i jordprovet. De belopp som valts för detta exempel var baserade på tidigare tester av dessa jordar för att se till att underlaget tillgänglighet var begränsande, och att vi mäter maximala möjliga priser under analysförhållanden (V max) 44,45. För jordprover som har höga koncentrationer av enzymer, mängden av jord eller substratkoncentration måste ökas. Vi har funnit att ökande substratkoncentrationer (och justering av standardkurvan i enlighet med detta) kan påverka lineariteten hos kurvan. Därför rekommenderar vi att minska markbelopp och / eller proportionella justeringar att buffra volymer som behövs. Oavsett, är det viktigt att optimera substratkoncentrationen för varje jordtyp analyseras eftersom uppmätta utrikestjänsten kan avvika med en storleksordning större mellan mättade och under mättade substratkoncentrationer 26. Därför skillnader mellan experimentella behandlingar (etc.) är känsliga för typ II statistiska fel och mindre benägna att upptäckas vid sub-mätt förhållanden, och statistiska fel 27,35. För att optimera substratkoncentrationer, bör preliminära enzymanalyser utförs på representativa jordprover med hjälp av en rad olika substratkoncentrationer. Efterregistrering av fluorescens, helt enkelt plotta data (på liknande sätt som standardkurva exemplet, fig. 1) för att identifiera den substratkoncentration (x-axel) som motsvarar enzymaktivitet (y-axel) där lutningen planar ut (~ 0). Likaså substratkoncentration som motsvarar den punkt där lutningen planar ut (~ 0) är en god indikation på den optimala substratkoncentrationen för just den marken.
Denna analys mäter ultimately fluorescens över en given tid som produceras av det fluorogena molekyldel som klyvs från substratet som ett resultat av enzymmedierad substrat depolymerisation. Därför är steg 5 (substratet tillsats) kritisk och måste utföras så effektivt som möjligt för att minimera tiden mellan när substratet sattes till jordarna och när analyserna inkuberas. På samma sätt, när substratet kommer i kontakt med provet, kommer enzymatiska reaktioner börjar uppträda. Vi rekommenderar att du använder en flerkanaligpipettera av detta skäl. Det är starkt rekommenderat att bli effektivare med hjälp av flerkanals pipett före den dag du gör din enzymanalyser. För att åstadkomma detta, kan du öva pipettering med vatten tills du enkelt kan överföra volymer i 96-hålsplattor med din pipett.
Soil Släckning
Kyla hänvisar till minskande fluorescensintensiteten som orsakas av partiklar och / eller organiskt material i marken uppslamningar-inkubationer 26. Släckning kan påverkas genom justering av jord: buffertförhållanden 25. På grund av bakgrundsfluorescens från individuella prover, är det viktigt att köra standarder med prover som utgör bakgrunden (snabbkylning) fluorescens. Även om vissa protokoll använder en enda koncentration efter att ha testat att signalen är linjär, rekommenderar vi starkt att genomföra en standarddämpningskontroll för varje prov till bästa kontrollen för effekterna av härdning. Underlåtenhet att göra detta kommer att resultera i en monterard kurvan inte är tillämplig på provet, och en felaktig uppskattning av enzymatisk aktivitet. Tillägget av standarder för mark slam inte är tidskänsliga, som standard tillägg inte påverkar bakgrundsfluorescens av provet.
NaOH-tillsats
Tillsatsen av NaOH används i vissa protokoll för att optimera fluorometriska mätningar enzymaktivitets eftersom det fluorescerande färgämnet frigörs från de syntetiska substraten uppvisar maximal fluorescens vid pH> 9,0 26,49. När man överväger detta förslag kommer NaOH koncentration som krävs för att pH-jord slam (dvs pH> 9) variera beroende på den särskilda mark-och pH-buffert som används 26. Men andra menar att NaOH kanske inte nödvändigt eftersom signalstyrkan är i allmänhet mycket hög även vid lägre pH-värde, och därför att det införs ytterligare en källa till mätfel. Till exempel, effekten av NaOH-additioner slammet pH och sålunda MUB eller MUC fluoreScence förändringar över tiden 25. MUB länkade substrat har visat att demonstrera konsekvent ökad fluorescens för 20 min efter NaOH-tillsatser innan nivåer avsmalnar; medan MUC har visat stadig minskad fluorescens under upp till 60 min 26. Därför är det viktigt att standardisera tiden mellan NaOH-tillsats och fluorescensmätning. Alternativt, om fluorenivåerna är tillräckligt upptäckas utan dessutom genomför analyserna utan att lägga NaOH har föreslagits som ett lika godtagbart alternativ 26.
Temperatur
Temperaturkänslighet bör beaktas vid beslut inkubationstemperatur. Om den primära intresse är att förstå enzymkinetik, använder tre eller flera temperaturer som illustreras med hjälp av Arrhenius tomter (i avsnittet resultat) är en robust metod. Om prov webbplatsen har karakteristiskt låg temperatur såsom permafrost jord, sedan duration av inkubation kan behöva förlängas för att möjliggöra de enzymer som reagerar på de kallare inkuberingstemperaturer. Medan traditionella enzymkinetik tyder på att en ökning i temperatur bör resultera i en ökad enzymaktivitet, har vi funnit att enzymer kan vara platsspecifik i termer av temperaturkänslighet 50. Därför att förstå platsspecifik enzymaktivitet potential är det viktigt att inkubationstemperatur och varaktighet justeras för att återspegla fältplatsvärden.
Slutsats
Betare är av avgörande betydelse för biogeokemiska processer i marken, och därför måste vi kunna mäta sin verksamhet. Det finns många utmaningar för att mäta utrikestjänsten i jord, inklusive interferens och hämning. Trots dessa utmaningar kan standardiserade protokoll (såsom den som beskrivs här) tillämpas allmänt för att mäta avdelningen för ett brett spektrum av enzymer. Även om det är ganska lätt att skapa kvalitetsdata efter dessa protokoll, den iterpretation dessa uppgifter i ett ekologiskt sammanhang kräver en noggrann utredning av vad dessa analyser är egentligen mäter, och hur utrikestjänsten enligt analysförhållanden kan skilja sig från de under in situ förhållanden.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna publikation har finansierats av enzymer i Environment Research Coordination Network Research stöds av US National Science Foundation (DEB # 1.021.559). Denna forskning stöds av US National Science Foundation (DEB # 1.021.559), och US Department of Energy Office of Science (bio-och miljöforskning). Alla åsikter, iakttagelser och slutsatser eller rekommendationer som framförs i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis åsikterna hos den amerikanska NSF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (AG) | Sigma Aldrich | M9766 | Sugar degradation |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside (BG) | Sigma Aldrich | M3633 | Sugar degradation |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-cellobioside (CB) | Sigma Aldrich | M6018 | Cellulose degradation |
| L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP) | Sigma Aldrich | L2145 | Protein degradation |
| 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide (NAG) | Sigma Aldrich | M2133 | Chitin degradation |
| 4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS) | Sigma Aldrich | M8883 | Phosphorus mineralization |
| 4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside (XYL) | Sigma Aldrich | M7008 | Hemicellulose degradation |
| 4-Methylumbelliferone (MUB) | Sigma Aldrich | M1381 | |
| 7-Amino-4-methylcoumarin (MUC) | Sigma Aldrich | A9891 | |
| 50 mM Sodium acetate anhydrous buffer | Fisher Scientific | S210-500 | acidic and neutral soils |
| 50 mM Tris base buffer | Fisher Scientific | BP154-1 | basic soils |
| Equipment | |||
| Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs | Fisher Scientific | 14-512-65 | pipetting reservoir |
| Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel | Fisher Scientific | 13-684-265 | 8-channel pipette, range: 50-1,200 μl |
| TipOne 101-1,250 μl extended length natural tips | USA Scientific | 1112 - 1720 | 10 racks of 96 tips (960 tips) |
| Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in. | Fisher Scientific | 11-100-100SH | Lab disc magnetic stir plate |
| Waring blender | Fisher Scientific | 14-509-7P | Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container |
| BRAND Dispensette III bottle-top dispensers | Fisher Scientific | 13-688-231 | Dispenser; range: 5-50 ml |
| Wheaton Unispense μP peristaltic pumps | Fisher Scientific | 13-683-7 | Optional dispenser |
| Fisherbrand magnetic stir bar | Fisher Scientific | 1451363SIX | Used to stirr soil slurry afer blending |
| Pyrex glass bowls | World Kitchen | 5304218 | Pyrex 10 oz rimmed custard cup |
| Costar 96-well black solid plates | Fisher Scientific | 07-200-590 | Used for plate reader step |
| Costar 96-well assay blocks | Fisher Scientific | 07-200-700 | V-bottom; 2 ml; sterile |
| Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats | Fisher Scientific | 14-387-93 | Sterile 96-well cap mat for square wells |
| Centrifuge equipped with holders for deep-well plates | Thermo Scientific | 3121 | Centra-GP8 (this model is no longer available) |
| Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader | Tecan | 30016058 | Plate reader (this model is no longer available) |
References
- Burns, R. G., Dick, R. P. Enzymes in the environment: activity, ecology, and applications. 86, CRC. (2002).
- Burns, R. G. Enzyme activity in soil: Location and a possible role in microbial ecology. Soil Biology and Biochemistry. 14 (82), 423-427 (1982).
- Bandick, A. K., Dick, R. P. Field management effects on soil enzyme activities. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1471-1479 (1999).
- Burns, R. G., et al. Soil enzymes in a changing environment: Current knowledge and future directions. Soil Biology and Biochemistry. 58, 216-234 (2013).
- Sinsabaugh, R. L., Hill, B. H., Follstad Shah, J. J. Ecoenzymatic stoichiometry of microbial organic nutrient acquisition in soil and sediment. Nature. 462, 795-798 (2009).
- Sinsabaugh, R. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology Letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Wallenstein, M., Allison, S. D., Ernakovich, J., Steinweg, J. M., Vol Sinsabaugh, R. Soil Biology. Shukla, G., Varma, A. 22, Springer. Berlin Heidelberg. 245-258 (2011).
- Wallenstein, M. D., McMahon, S. K., Schimel, J. P. Seasonal variation in enzyme activities and temperature sensitivities in Arctic tundra soils. Global Change Biology. 15, 1631-1639 (2009).
- Steinweg, J. M., Dukes, J. S., Wallenstein, M. D. Modeling the effects of temperature and moisture on soil enzyme activity: Linking laboratory assays to continuous field data. Soil Biology and Biochemistry. 55, 85-92 (2012).
- Wallenstein, M. D., Weintraub, M. N. Emerging tools for measuring and modeling the in situ activity of soil extracellular enzymes. Soil Biology and Biochemistry. 40, 2098-2106 (2008).
- Sinsabaugh, R. L. Phenol oxidase, peroxidase and organic matter dynamics of soil. Soil Biology and Biochemistry. 42, 391-404 (2010).
- Allison, S. Soil minerals and humic acids alter enzyme stability: implications for ecosystem processes. Biogeochemistry. 81, 361-373 (2006).
- Deng, S., Popova, I. E., Dick, L., Bench Dick, R. scale and microplate format assay of soil enzyme activities using spectroscopic and fluorometric approaches. Applied Soil Ecology. 64, 84-90 (2013).
- Sinsabaugh, R., Klug, M. J., Collins, H. P., Yeager, P. E., Peterson, S. O. Standard Soil Methods For Long Term Ecological Research. Robertson, G. P., Coleman, D. C., Bledsoe, C. S., Sollins, P. , Oxford University Press. (1999).
- Tabatabai, M. A. Methods of Soil Analysis. Page, A. L., Miller, R. H., Keeney, D. R. 2, American Society of Agronomy, Inc. 903-947 (1994).
- Parham, J. A., Detection Deng, S. P. quantification and characterization of B-glucosaminidase activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Jacks, T. J., Kircher, H. W. Fluorometric assay for the hydrolytic activity of lipase using fatty acyl esters of 4-methylumbelliferone. Analytical Biochemistry. 21 (67), 279-285 (1967).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thrombosis Research. 17 (80), 393-402 (1980).
- Jasinski, J. P., Woudenberg, R. C. 7-Amino-4-methylcoumarin. Acta Crystallographica Section C. 50, 1954-1956 (1994).
- Hoppe, H. G. SIGNIFICANCE OF EXOENZYMATIC ACTIVITIES IN THE ECOLOGY OF BRACKISH WATER - MEASUREMENTS BY MEANS OF METHYLUMBELLIFERYL-SUBSTRATES. Mar. Ecol.-Prog. Ser. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and Study of Substrate Specificity of Exoglucosidase Activity in Eutrophic Water. Applied and Environmental Microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Darrah, P. R., Harris, P. J. A fluorimetric method for measuring the activity of soil enzymes. Plant and Soil. 92, 81-88 (1986).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and Soil. 175, 147-152 (1995).
- Saiya-Cork, K. R., Sinsabaugh, R. L., Zak, D. R. The effects of long term nitrogen deposition on extracellular enzyme activity in an Acer saccharum forest soil. Soil Biology and Biochemistry. 34, 1309-1315 (2002).
- DeForest, J. L. The influence of time, storage temperature, and substrate age on potential soil enzyme activity in acidic forest soils using MUB-linked substrates and l-DOPA. Soil Biology and Biochemistry. 41, 1180-1186 (2009).
- German, D. P., et al. Optimization of hydrolytic and oxidative enzyme methods for ecosystem studies. Soil Biology and Biochemistry. 43, 1387-1397 (2011).
- Marx, M. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil Biology and Biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Parton, W. J., Morgan, J. A., Wang, G., Del Grosso, S. Projected ecosystem impact of the Prairie Heating and CO2 Enrichment experiment. New Phytologist. 174, 823-834 (2007).
- Morgan, J., et al. C4 grasses prosper as carbon dioxide eliminates desiccation in warmed semi-arid grassland. Nature. 476, (2011).
- Carrillo, Y., Pendall, E., Dijkstra, F. A., Morgan, J. A., Newcomb, J. M. Response of soil organic matter pools to elevated CO2 and warming in a semi-arid grassland. Plant and Soil. , (2011).
- Allison, S. D., Vitousek, P. M. Responses of extracellular enzymes to simple and complex nutrient inputs. Soil Biology and Biochemistry. 37, 937-944 (2005).
- Moorhead, D. L., Sinsabaugh, R. L. A theoretical model of litter decay and microbial interaction. Ecological Monographs. 76, 151 (2006).
- Allison, S. D., Weintraub, M. N., Gartner, T. B., Waldrop, M. P. Soil Biology. Shukla, G., Varma, A. 22, Springer. Berlin Heidelberg. 229-243 (2011).
- Treseder, K. K., Vitousek, P. M. Effects of soil nutrient availability on investment in acquisition of N and P in Hawaiin rain forests. Ecology. 82 (2001), 946-954 (2001).
- Fujita, Y., de Ruiter, P., Wassen, M., Heil, G. Time-dependent, species-specific effects of N:P stoichiometry on grassland plant growth. Plant and Soil. 334, 99-112 (2010).
- Elser, J. J., Dobberfuhl, D. R., MacKay, N. A., Schampel, J. H. Organism Size, Life History, and N:P Stoichiometry. BioScience. 46, 674-684 (1996).
- Allison, V. J., Condron, L. M., Peltzer, D. A., Richardson, S. J., Turner, B. L. Changes in enzyme activities and soil microbial community composition along carbon and nutrient gradients at the Franz Josef chronosequence, New Zealand. Soil Biology and Biochemistry. 39, 1770-1781 (2007).
- German, D. P., Marcelo, K. R. B., Stone, M. M., Allison, S. D. The Michaelis - Menten kinetics of soil extracellular enzymes in response to temperature: a cross-latitudinal study. Global Change Biology. 18, 1468-1479 (2012).
- German, D. P., Chacon, S. S., Allison, S. D. Substrate concentration and enzyme allocation can affect rates of microbial decomposition. Ecology. 92, 1471-1480 (2011).
- Fierer, N., Craine, J. M., McLauchlan, K., Schimel, J. P. Liter quality and the temperature sensitivity of decomposition. Ecology. 86, 320-326 (2005).
- Sterner, R. W., Elser, J. J. Ch. 5. Ecological Stoichiometry: The Biology of Elements from Molecules to the Biosphere. Sterner, R. W., Elser, J. J. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 179-230 (2002).
- Cleveland, C., Liptzin, D. C:N:P stoichiometry in soil: is there a "Redfield ratio" for the microbial biomass. Biogeochemistry. 85, 235-252 (2007).
- Logan, S. R. The origin and status of the Arrhenius equation. Journal of Chemical Education. 59, 279 (1982).
- Trasar-Cepeda, C., Gil-Sotres, F., Leirós, M. C. Thermodynamic parameters of enzymes in grassland soils from Galicia, NW Spain. Soil Biology and Biochemistry. 39, 311-319 (2007).
- Menten, L., Michaelis, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem Z. 49, 333-369 (1913).
- Wallenstein, M. D., Haddix, M. L., Lee, D. D., Conant, R. T., Paul, E. A. A litter-slurry technique elucidates the key role of enzyme production and microbial dynamics in temperature sensitivity of organic matter decomposition. Soil Biology and Biochemistry. 47, 18-26 (2012).
- Chrost, J. Fluorescence correction for measurements of enzyme activity in natural waters using methylumbelliferyl-substrates. Archiv für Hydrobiologie. 106, 79 (1986).
- Reed, G. F., Lynn, F., Meade, B. D. Use of Coefficient of Variation in Assessing Variability of Quantitative Assays. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9, 1235-1239 (2002).
- Mead, J. A. R., Smith, J. N., Williams, R. T. Studies in detoxification. 67. Biosynthesis of the glucuronides of umbelliferone and 4- Methylumbelliferone and their use in fluorimetric determination of b-glucuronidase. Biochemical Journal. 61, 569-574 (1955).
- Haddix, M. L., et al. The Role of Soil Characteristics on Temperature Sensitivity of Soil Organic. Matter. Soil Sci. Soc. Am. J. 75, 56-68 (2011).
