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Immunology and Infection

का प्रयोग करें Published: November 22, 2013 doi: 10.3791/50964
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for Molecular Bacteriology and Infection, Imperial College London

Summary

मोम कीट गैलेरिया मेल्लोनेल्ला के लार्वा हाल ही में लीजोनेला pneumophila संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक Vivo में मॉडल के रूप में स्थापित किया गया था. यहाँ, हम टीका, जीवाणु डाह और नकल की माप के साथ ही संक्रमित hemocytes की निकासी और विश्लेषण सहित लार्वा में लीजोनेला के रोगजनन चिह्नित करने के लिए मौलिक तकनीक, प्रदर्शित करता है.

Abstract

लीजोनेला pneumophila, Legionnaires रोग नामक एक गंभीर निमोनिया, की प्रेरणा का एजेंट संक्रमित और वायुकोशीय मैक्रोफेज भीतर replicates कि एक महत्वपूर्ण मानव रोगज़नक़ है. इसके डाह रिक्तिका (एलसीवी) युक्त लीजोनेला के रूप में जाना एक प्रतिकृति अनुमोदक रिक्तिका स्थापित करने के लिए आवश्यक है जो डॉट / आईसीएम प्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली (T4SS) पर निर्भर करता है. एल pneumophila संक्रमण हालांकि सबसे माउस उपभेदों उपन्यास संक्रमण मॉडल के लिए खोज करने के लिए अग्रणी, अनुमोदक नहीं हैं चूहों में मॉडलिंग की जा सकती. हमने हाल ही में मोम कीट गैलेरिया मेल्लोनेल्ला के लार्वा एल की जांच के लिए उपयुक्त हैं कि पता चला है pneumophila संक्रमण. जी मेल्लोनेल्ला तेजी से मानव रोगजनकों के लिए एक संक्रमण मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया और एक अच्छे संबंध कीट में और स्तनधारी मॉडल में कई प्रजातियों के जीवाणु की डाह के बीच मौजूद है. लार्वा की प्रतिरक्षा सुरक्षा साधनों की एक प्रमुख घटक hemocytes, व्यवसाय कर रहे हैंआक्रमणकारियों लेते हैं और नष्ट जो अल फ़ैगोसाइट,. एल pneumophila, संक्रमित एक एलसीवी बनाने के लिए और इन कोशिकाओं के भीतर दोहराने में सक्षम है. यहाँ हम एल का विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन जी में pneumophila डाह संक्रामक एल कैसे विकसित करने सहित मेल्लोनेल्ला मॉडल, pneumophila, inhibitors के साथ लार्वा pretreat लार्वा को संक्रमित और मात्रा का ठहराव और immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए संक्रमित कोशिकाओं को निकालने के लिए कैसे. हम भी प्रतियोगिता assays में बैक्टीरियल प्रतिकृति और फिटनेस यों के लिए क्या करते हैं. इन तरीकों एल में महत्वपूर्ण कारकों का निर्धारण करने के लिए म्यूटेंट की तेजी से जांच के लिए अनुमति इस जटिल रोगज़नक़ की हमारी समझ को सहायता करने के लिए एक नए उपकरण का वर्णन pneumophila डाह,.

Introduction

संक्रमण के पशु मॉडल बैक्टीरियल विषैलापन कारकों के निर्धारण में अमूल्य साबित कर दिया है. हालांकि, दब्बू मॉडल संक्रमण के पारंपरिक स्तनधारी मॉडल के लिए एक व्यवहार्य विकल्प के रूप में बढ़ ध्यान प्राप्त की है. मोम कीट का लार्वा, गैलेरिया मेल्लोनेल्ला तेजी से 1 ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया 2,3 और कई रोगजनक कवक 4,5 सहित महत्वपूर्ण मानव रोगज़नक़ों, की एक संख्या का अध्ययन किया जा रहा है. एक कीट मॉडल का उपयोग करना एक दब्बू, जी के रूप में, पारंपरिक स्तनधारी मॉडल से अधिक लाभ का एक नंबर है मेल्लोनेल्ला स्तनधारी मॉडल की नैतिक सीमाओं के अधीन नहीं है. इसके अलावा, लार्वा को आसानी से रखा जा सकता है संज्ञाहरण के बिना इंजेक्शन से संक्रमित, रासायनिक inhibitors 6 साथ pretreatment गुजरना और 37 डिग्री सेल्सियस 7 में ऊष्मायन बनाए. दिलचस्प है, जी में कई सूक्ष्मजीवों की pathogenicity के बीच एक अच्छे संबंध मेलlonella और संक्रमण के स्तनधारी मॉडल 2,8 स्थापित किया गया है. जी की प्रतिरक्षा प्रणाली की वृद्धि की समझ मेल्लोनेल्ला भी इस मॉडल जीव का लक्षण वर्णन में सहायता प्रदान की है. स्तनधारियों में पाया के रूप में कीड़े एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली नहीं है, वे रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स 9 के उत्पादन सहित परिष्कृत सेलुलर और कंधे का गढ़ है. Hemocytes सेलुलर गढ़ के प्रमुख मध्यस्थ हैं और कर रहे हैं जी के hemolymph (या रक्त) में पाया सबसे अनेक सेल प्रकार मेल्लोनेल्ला 10, इन कोशिकाओं को पेशेवर फ़ैगोसाइट हैं और दोनों को ले जा रहा है और एक फागो-lysosomal डिब्बे 10,11 में बैक्टीरिया अपमानजनक और बैक्टीरिया हमलावर चारों ओर पिंड बनाने, शारीरिक रूप से बैक्टीरियल प्रतिकृति 12 सीमित द्वारा मानव मैक्रोफेज और neutrophils के लिए इसी तरह कार्य करते हैं.

लीजोनेला pneumophila गंभीर pneumoni का कारण बनता है कि एक सांस रोगज़नक़ हैऐसे बुजुर्ग या 13 immunocompromised रूप अतिसंवेदनशील आबादी में एक (Legionnaires रोग). लीजोनेला यह ताजा पानी अमीबा 14,15 की विभिन्न प्रजातियों में से एक रोगज़नक़ है जहां पर्यावरण और मानव निर्मित दोनों जल स्रोतों में सर्वत्र पाया जाता है. लीजोनेला बचता है और मेजबान सेल 16-20 में 275 से अधिक प्रेरक प्रोटीन सरकाना को 4 स्राव प्रणाली (T4SS) लिखें डॉट / आईसीएम (organelle तस्करी में दोषपूर्ण / intracellular गुणा) के रूप में जाना एक बहु प्रोटीन परिसर के उपयोग से इन पेशेवर फ़ैगोसाइट भीतर replicates. ये प्रोटीन रिक्तिका (एलसीवी) युक्त लीजोनेला के निर्माण के लिए अग्रणी, सामान्य मेजबान सेल phagocytic रास्ते नष्ट करने का काम करते हैं. एलसीवी लाइसोसोम के साथ फ्यूजन से बचा जाता है और बजाय जालिका रंगरूटों (ईआर) किसी न किसी ईआर 21,22 जैसा एक विशेष डिब्बे में जिसके परिणामस्वरूप, पुटिका व्युत्पन्न. एल pneumophila एक आकस्मिक मानव पथ में माना जाता हैogen, यह अमीबा भीतर दोहराने के लिए अनुमति देते हैं कि एक ही रणनीति है, यह भी मानव वायुकोशीय मैक्रोफेज 23 में प्रतिकृति अनुमति देते हैं.

स्तनधारी मेजबान चूहों और गिनी सूअरों 24,25 सहित मानव लीजोनेला संक्रमण के लिए मॉडल के रूप में लक्षण वर्णन किया गया है. हालांकि, माउस उपभेदों के बहुमत एक हल्के, खुद को सीमित संक्रमण 24 विकसित करता है जो जन्मजात सूरजमुखी मनुष्य ए / जम्मू माउस, के अपवाद के साथ लीजोनेला संक्रमण 26 के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. गिनी पिग मॉडल और अधिक बारीकी से मानव रोग 25, म्यूटेंट की कमी जैसा दिखता है और बढ़ी हुई लागत उनके उपयोग 27 हतोत्साहित है. इसके अलावा, कई दब्बू मॉडल Caenorhabditis 28 एलिगेंस सहित लीजोनेला pneumophila संक्रमण के लिए विकसित किया गया है, ड्रोसोफिला 29 मेलानोगास्टर और कई प्रजातियों अमीबा 30-32 की. हालांकि, इन मॉडलों सी. में कमजोरी, डाह है एलिगेंस 28 डॉट / आईसीएम पर निर्भर नहीं है. ड्रोसोफिला मॉडल बैक्टीरियल डाह 29 कारकों और हालांकि वादा किया जाना प्रतीत होता है की जांच करने में प्रभावी साबित कर दिया है, इस मॉडल पूरी तरह से विशेषता नहीं किया गया है. एक कोशिकीय अमीबा एल के पर्यावरण मेजबान हैं pneumophila और एक आणविक स्तर 33 में विषैलापन कारकों की कार्रवाई की जांच के लिए आदर्श होते हैं हालांकि ऐसे caspases 34 के रूप में संक्रमण के स्तनधारी मेजबान सेल प्रतिक्रिया की कई महत्वपूर्ण मध्यस्थों की कमी है. स्तनधारी प्रयोग से संबंधित उच्च लागत और नैतिक चिंताओं के साथ मौजूदा मॉडल की कमजोरियों, अन्य उपयुक्त मॉडल जीवों 29,35 के लिए खोज करने के लिए प्रेरित किया है.

हमने हाल ही में दिखा दिया है कि जी मेल्लोनेल्ला एल के लिए एक उपयुक्त मॉडल है pneumophila 36,37 रोगजनन. इस प्रोटोकॉल संक्रमित के लिए इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक तकनीक विवरणजी आईएनजी मेल्लोनेल्ला लार्वा, लार्वा नैतिकता का विश्लेषण गिनती और immunofluorescence के लिए hemocytes निकालने और व्यवहार्य CFU द्वारा प्रतिकृति का निर्धारण संक्रमित लार्वा से गिना जाता है.

Protocol

1. एल की तैयारी संक्रमण के लिए pneumophila

  1. लकड़ी का कोयला खमीर निकालने (CYE) प्लेट (2 जी / एल सक्रिय लकड़ी का कोयला, 10 जी / एल खमीर निकालने, 13 जी / एल अग्रवाल, 10 जी / एल एन (2 acetamido)-2-aminothanesulfonic एसिड (इक्के), तैयार करें 1 जी / एल α-ketoglutarate, 0.4 ग्राम / एल एल सिस्टीन एचसीएल और 0.25 ग्राम / एल फेरिक पाइरोफॉस्फेट, पीएच 6.9).
    नोट: यदि आवश्यक हो, प्लेटें Cye (6 ग्राम / एमएल) केनामाइसिन जोड़ने (25 माइक्रोग्राम / एमएल) और / या chloramphenicol.
    1. सभी एल बाहर ले जाने के लिए जैव सुरक्षा रोकथाम स्तर 2 पर pneumophila काम (बीएसएल 2) स्थानीय नियमों के अनुपालन में एक माइक्रोबियल सुरक्षा कैबिनेट (एमएससी) में.
  2. स्ट्रीक एल CYE प्लेटों पर -80 डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल शेयरों से pneumophila
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए प्लेटें सेते
    नोट: 4 दिनों के लिए प्लेटों के ऊष्मायन काफी एल का ग़ुस्सा बढ़ जाती है जी में pneumophila 3 दिनों के लिए ऊष्मायन से अधिक मेल्लोनेल्ला.
  4. संक्रमण से पहले एक दिन, एक पाश फू resuspendprewarmed के 1 मिलीलीटर में बैक्टीरिया की डालूँगा (कई कालोनियों युक्त) (37 डिग्री सेल्सियस) खमीर निकालने (ऐ) शोरबा इक्के और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर 600 एनएम (600 आयुध डिपो) पर absorbance के उपाय.
  5. एक अंतिम ओवर ड्राफ्ट 0.1 की 600 (यदि आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ) एक ताजा 3 मिलीलीटर ऐ संस्कृति टीका लगाना.
    1. एक मीडिया को केवल मीडिया की बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रण.
  6. 21 घंटे के लिए 200 rpm पर एक मिलाते इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    नोट: जीवाणु संक्रमण 38 के बाद घातीय चरण के लिए विकसित किया जाना चाहिए. 21 घंटे के लिए बढ़ते प्रयोगों का मानकीकरण करने की अनुमति देता.
    नोट: प्रोटीन शामिल होने के लिए आवश्यक है, तो रातोंरात आइसोप्रोपिल 0.5 मिमी β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) जोड़ें.
  7. 600 (बैक्टीरिया के बाद बहुत तेजी से विकास चरण, आयुध डिपो के 600 2.5-3 में होना चाहिए) आयुध डिपो उपाय.
  8. बाँझ Dulbecco फॉस्फेट buffered खारा (डी पीबीएस) में 1 एक्स 10 9 CFU / एमएल देने के लिए जीवाणु संस्कृति पतला.
    नोट: पिछले परिणामों के आधार पर, एक आयुध डिपो 1 की 600 हालांकि यह अलग एल के लिए पुष्टि की जानी चाहिए, 1 x 10 9 CFU / एमएल से मेल खाती है pneumophila उपभेदों.
    नोट: एक प्लाज्मिड से एक प्रोटीन की प्रेरण आवश्यक है, तो inoculum को IPTG के 1 मिमी जोड़ें.
  9. उम्मीद CFU inoculum में मौजूद है यह सुनिश्चित करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में धारा 9 में वर्णित के रूप में inoculum प्लेट.

2. लार्वा की तैयारी

  1. पर्याप्त जी खरीद मेल्लोनेल्ला एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता से लार्वा. लार्वा 5 वीं या 6 वें instar मंच (लंबाई में लगभग बीच में 2-3 सेमी) में भेज दिया और तुरंत उपयोग के लिए उपयुक्त हैं.
    नोट: लार्वा पहले 39 में वर्णित किया गया है कि कैसे करने के पीछे का वर्णन विधि.
    नोट: लार्वा अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है और भोजन की आवश्यकता नहीं है. तुरंत प्यूपीकरण के संकेत दे रहा है किसी भी लार्वा त्यागें.
  2. Plac से लार्वा के लिए कंटेनर की तैयारीएक 10 सेमी पेट्री डिश के तल में 10 सेमी फिल्टर पेपर का एक चक्र आईएनजी.
  3. कुंद इत्तला दे दी चिमटी का प्रयोग, पेट्री डिश में लगभग समान आकार के दस स्वस्थ लार्वा जगह है.
    नोट: अस्वस्थ लग रही रंग भूरा या मुहासेवाला कीड़े त्यागें. स्वस्थ लार्वा समान रूप से मलाईदार अंधेरे मलिनकिरण का कोई क्षेत्रों के साथ रंग और खत्म कर दिया, तो जल्दी से खुद को सही करने में सक्षम हैं.

3. जी का संक्रमण मेल्लोनेल्ला लार्वा

  1. सतह के लिए फिल्टर पेपर के एक चक्र के टेप से इंजेक्शन मंच तैयार करें.
  2. सुरक्षित रूप से एक इंजेक्शन मंच बनाने के लिए फिल्टर पेपर के लिए क्षैतिज एक P1000 टिप टेप. यह बाँझ होने की जरूरत नहीं है.
  3. 70% इथेनॉल aspirating और कम से कम 10 मिनट के लिए incubating द्वारा एक 20 μl microtiter सिरिंज जीवाणुरहित.
    1. इंजेक्शन लगाने जबकि पंचर सबूत दस्ताने पहनें,
  4. कई बार aspirating और बाँझ पानी को खदेड़ने के द्वारा किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल निकालें.
  5. USIएल की सिरिंज, महाप्राण 10 μl एनजी pneumophila 1 एक्स 10 9 CFU / एमएल निलंबन.
  6. एक लार्वा लो और धीरे लेकिन मजबूती से अपनी पीठ पर बारी, P1000 टिप में मशगूल.
  7. लार्वा के सामने, सही proleg अधिक सिरिंज की नोक रखें.
  8. धीरे, यह लार्वा के अंदर है, यकीन है कि proleg में सुई की नोक डालें, और सुचारू रूप से सिरिंज सारी सामग्री को इंजेक्षन.
    नोट: सिरिंज सही ढंग से डाला जाता है तो वह चेंबर में यह करने के लिए जगह ही सिरिंज का उपयोग लार्वा लेने के लिए संभव हो जाना चाहिए.
    1. इंजेक्शन के बाद, कुछ सेकंड के लिए लार्वा का पालन. लार्वा सेकंड के एक जोड़े के बाद क्रॉल शुरू कर देंगे लेकिन तरल पदार्थ उगलना नहीं होना चाहिए.
  9. 10 7 CFU एल के साथ संक्रमण, संक्षेप में कुछ घंटे के बाद संक्रमण लार्वा का निरीक्षण pneumophila 130b पहले 5-8 घंटा पीआई के भीतर किसी भी लक्षण पैदा नहीं करता इसलिए लार्वा काले / ग्रे इस बिंदु से पहले, टी मोड़ रहे हैंवह प्रयोग बंद किया जाना चाहिए.
    नोट: 1 मिमी IPTG साथ लार्वा का टीका प्रयोग के पाठ्यक्रम पर लार्वा व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है.
  10. इसी तरह, लार्वा मृत्यु दर का विश्लेषण करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए डी पीबीएस इंजेक्शन के साथ 10 लार्वा सहित हालत प्रति 10 लार्वा की कुल इंजेक्षन.
  11. टेप पेट्री डिश बंद कर दिया और माध्यमिक रोकथाम में जगह.
  12. प्रयोग की अवधि के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मानक बैक्टीरियल इनक्यूबेटर में सेते हैं.

4. एक रासायनिक अवरोध करनेवाला के साथ लार्वा की pretreatment

  1. खंड 3.1-3.6 में वर्णित के रूप में पूर्व संक्रमण के लिए, इंजेक्शन के लिए लार्वा तैयार करते हैं.
  2. सामने में Cytochalasin विकास की एक 100 माइक्रोन समाधान के 10 μl इंजेक्षन, 10 लार्वा के proleg छोड़ दिया.
    नोट: एफडीए लार्वा को चोट को कम करने के लिए जीवाणु निलंबन से एक अलग proleg में इंजेक्ट किया जाता है.
  3. एक नियंत्रण के रूप में 10 लार्वा में DMSO के 10 μl इंजेक्षन.
  4. पर लार्वा सेते4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस.
  5. सामने में धारा 3 में वर्णित के रूप में सही 1 10 x 7 के साथ या तो proleg, pretreated लार्वा इंजेक्षन गुम्मट एल के CFU pneumophila या एक पीबीएस नियंत्रण.

5. लारवल मृत्यु का विश्लेषण

  1. 18 घंटा बाद संक्रमण (पीआई) में, मृत्यु दर के लिए सभी संक्रमित लार्वा की जांच.
  2. मृत्यु की जांच लार्वा पर बारी और पैर की आवाजाही के लिए देखने के लिए कुंद इत्तला दे दी चिमटी का उपयोग करने के लिए, स्वस्थ लार्वा जल्दी से खुद को सही करना चाहिए. रंजकता संक्रमण के लिए एक मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को इंगित करता है. किसी भी आंदोलन है, तो के रूप में जीवित गिनती.
  3. मृत और जीवित लार्वा की रिकार्ड संख्या.
  4. चुने हुए अन्य सभी बिंदुओं पर समय इस प्रक्रिया को दोहराएं.
    नोट: ऊष्मायन तीन से अधिक दिनों के लिए जारी किया जाता है, pupae देखा जा सकता है. किसी भी pupae निकालें और पर ठंड से euthanize - 20 डिग्री सेल्सियस कायापलट हो सकता है पहले.

6. Hemolymph के निष्कर्षण

  1. बेतरतीब ढंग से चयन तीनलार्वा और इस तरह के 5 और 18 घंटा पीआई के रूप में चयनित समय बिंदुओं पर एक 14 मिलीलीटर ट्यूब में जगह है,
  2. लार्वा के पैर का कोई आंदोलन मनाया जा सकता है, जब तक 5-10 मिनट के लिए बर्फ पर इस ट्यूब रखें.
  3. लार्वा की पूंछ के पास दो क्षेत्रों के बीच एक चीरा बनाने, एक छुरी का उपयोग कर एक पेट्री डिश और, पर anesthetized लार्वा रखें.
  4. Hemolymph इकट्ठा करने के लिए एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में लार्वा निचोड़.
    1. कम से कम तीन व्यक्तियों से पूल hemolymph. एक लार्वा आकार के आधार पर hemolymph के 15-50 μl के बीच देता है.
      नोट: hemolymph निकासी के दौरान यह नमूनों की संभावित प्रदूषण, जिसके परिणामस्वरूप पेट को बाधित करने के लिए बहुत आसान है. बैक्टीरिया बाहर चढ़ाना हालांकि, जब एंटीबायोटिक चयन हमेशा की आवश्यकता होगी (दूर पेट से) पूंछ के पास लार्वा काटने से प्रदूषण को कम.
      नोट: संग्रह के बाद 10 मिनट के भीतर ब्राउन और coagulating, प्रक्रिया hemolymph मोड़ से hemolymph रोकने के लिए.
  5. पर एक नया 14 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब, सील और जगह में लार्वा शरीर त्यागें - 20 डिग्री सेल्सियस रातोंरात लार्वा मर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए.
  6. मृत लार्वा आटोक्लेव और स्थानीय नियमों के अनुसार निपटाने.

7. Hemocyte व्यवहार्यता का निर्धारण

  1. जैसा कि ऊपर वर्णित hemolymph निकालें.
  2. 0.02% की 20 μl एक 96 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएं में पीबीएस में (v / v) Trypan नीले रंग के साथ निकाली hemolymph के 20 μl मिलाएं.
  3. आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. एक hemocytometer पर और व्यवहार्य (नीला नहीं) कोशिकाओं गिनती लोड hemolymph के 10 μl.
  5. त्रुटि को कम करने के लिए तीन प्रतियों में प्रत्येक नमूना गणना.

8. Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए निकाले Hemocytes का प्रसंस्करण

  1. 24 अच्छी तरह से थाली में एक 10-15 मिमी कांच coverslip पर कम से कम तीन लार्वा और पिपेट से निकाला जमा hemolymph मिलाएं.
    नोट: hemocytes कांच का पालन कर सकते में coverslips उपचार की आवश्यकता नहीं है.
  2. डी के 0.5 मिलीलीटर जोड़ेंपीबीएस और नीचे से ऊपर pipetting और से अच्छी तरह मिला लें.
  3. एक एयरोसोल तंग अपकेंद्रित्र थाली धारक का उपयोग कर कमरे के तापमान (आर टी) पर 500 XG पर 10 मिनट के लिए थाली अपकेंद्रित्र.
  4. Hemocytes पालन किया है कि जाँच करने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग अच्छी तरह से प्रत्येक की जांच.
  5. सतह पर तैरनेवाला निकालें और ध्यान से थाली 2-3X कमाल की है और एक विंदुक के साथ डी पीबीएस हटाने, अच्छी तरह से दीवार के लिए 0.5 मिलीलीटर डी पीबीएस जोड़कर कोशिकाओं तीन बार धोएं.
  6. 4% पीबीएस में (v / v) paraformaldehyde (पीएफए) के 0.5 मिलीलीटर के अलावा द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें.
  7. आरटी पर 20-30 मिनट के बीच के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
  8. के रूप में पहले, डी पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं.
  9. जोड़ें 0.5 मिलीलीटर अवशिष्ट पीएफए ​​बुझाने और 15 मिनट के लिए आरटी पर सेते पीबीएस में 15 मिमी एनएच 4 सीएल.
  10. डी पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं.
    नोट: इस स्तर पर, coverslips 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संग्रहित किया जा सकता है
  11. पीबीएस में 0.5 मिलीलीटर 0.1% ट्राइटन X-100 जोड़ें और कोशिकाओं permeabilize के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं. अवरुद्ध समाधान (2% (पीबीएस में w / v) बीएसए) के साथ 1 घंटे के लिए ब्लॉक.
  12. निर्माता द्वारा निर्दिष्ट कमजोर पड़ने पर अवरुद्ध समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  13. पीबीएस के साथ 3x धो लें.
  14. ऊपर के रूप में बैक्टीरिया के दृश्य के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी और DAPI साथ 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  15. पीबीएस के साथ 3x धो लें.
  16. गिलास स्लाइड पर बढ़ते अभिकर्मक की एक बूंद का उपयोग coverslips माउंट.
  17. पूरी तरह से बढ़ते समाधान करने के लिए सूखी आरटी पर अंधेरे में रात भर सेते हैं.
  18. छवि एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन पर स्लाइड.

9. बैक्टीरियल CFU की मात्रा

  1. आंत वनस्पति द्वारा संक्रमण से बचने के लिए प्लेटों Cye को 100 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर spectinomycin जोड़ें. एल pneumophila तनाव 130b 40 spectinomycin के लिए स्वाभाविक रूप से प्रतिरोधी है.
  2. Hemolymph निकासी से पहले, 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों तौलना.
  3. धारा 6 में वर्णित के रूप में hemolymph निकालें और तौला टी में जगहubes, 5 मिलीग्राम / एमएल digitonin के 1 μl जोड़ने अच्छा मिश्रण है और hemocytes lyse करने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. Hemolymph साथ ट्यूब Reweigh और निकाले hemolymph के वजन का निर्धारण.
  5. बाँझ ऐ मीडिया में hemolymph के दस गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन.
  6. एक कलम का प्रयोग, छह बराबर क्षेत्रों और लेबल में एक CYE प्लेट के आधार विभाजित करते हैं.
  7. प्रत्येक कमजोर पड़ने की 25 μl की प्लेट तीन बूँदें थाली के प्रत्येक खंड में (सबसे कमजोर शुरुआत के साथ).
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात अत्यंत lids के साथ प्लेटें सेते
  9. बूंदों के पूरी तरह सूख जाने के बाद, कम से कम एक और दो दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक की थाली की बारी है और सेते हैं.
  10. प्रत्येक कमजोर पड़ने पर कालोनियों की गणना के द्वारा निकाले बैक्टीरिया यों और निकाले hemolymph के वजन के मानक के अनुसार.

10. प्रतियोगी सूचकांक का निर्धारण (सीआई)

  1. दोनों उपभेदों शोरबा संस्कृति में और CYE अगर प्लेट PRIO पर समान रूप से अच्छी तरह से विकसित है कि पुष्टिप्रतियोगी सूचकांक का प्रयास करने के लिए आर.
  2. धारा 1 में वर्णित के रूप में गुम्मट या केनामाइसिन प्रतिरोधी उत्परिवर्ती जीवाणु निलंबन को तैयार है और एक 1:1 के अनुपात में मिश्रण.
    1. CYE spectinomycin पर inoculum (100 माइक्रोग्राम / एमएल) और CYE spectinomycin / kanamycin की प्लेट धारावाहिक dilutions
  3. ऊपर वर्णित के रूप में उपयुक्त समय बिंदुओं पर लार्वा और निकालने hemolymph संक्रमित.
  4. Hemolymph निकालने और CYE spectinomycin और CYE spectinomycin / kanamycin पर धारावाहिक dilutions चढ़ाना द्वारा व्यवहार्य मायने रखता है का निर्धारण करते हैं.
  5. सीआई = (उत्परिवर्ती उत्पादन / गुम्मट उत्पादन) / (उत्परिवर्ती inoculum / गुम्मट inoculum) इस प्रकार है: प्रतिस्पर्धी सूचकांक (सीआई) की गणना.

Representative Results

यहाँ यह दिखा दिया है कि जी मेल्लोनेल्ला एल अध्ययन करने के लिए एक प्रयोग करने में आसान, उपयुक्त मॉडल है pneumophila संक्रमण. पहले यह दिखाया गया है कि एल मैक्रोफेज, अमीबा और स्तनधारी मॉडल में pneumophila डाह डॉट / आईसीएम स्राव प्रणाली 41-43. जी की उपस्थिति पर निर्भर है मेल्लोनेल्ला लार्वा ऊपर वर्णित के रूप में संक्रमित और जंगली प्रकार (WT) और एक डॉट / आईसीएम कमी तनाव की डाह की तुलना में थे. एल की 10 7 CFU साथ संक्रमण pneumophila तनाव 130b 24 घंटा बाद संक्रमण (पीआई) के भीतर 100% मृत्यु दर में हुई. हालांकि, एल एक कार्यात्मक डॉट / आईसीएम T4SS स्राव प्रणाली नहीं है जो pneumophila Δ Dota तनाव, चित्रा (1) इस परख में असंक्रामक था. यह दर्शाता है कि एल जी में pneumophila डाह मेल्लोनेल्ला लक्षण वर्णन के लिए इस मॉडल को उपयुक्त बनाने, डॉट / आईसीएम effectors के स्थानान्तरण पर निर्भर करता हैये प्रोटीन के समारोह.

हाल ही में, यह cytochalasin उपचार द्वारा phagocytosis के निषेध खमीर Candida albicans 6 से संक्रमण के लार्वा की ग्रहणशीलता के साथ वृद्धि हुई है कि दिखाया गया था. एल के रूप में pneumophila बैक्टीरिया के तेज इस मॉडल में अपनी रोगजनन में महत्वपूर्ण है अगर यह निर्धारित करने के लिए निर्णय लिया गया था, एक intracellular रोगज़नक़ है. लार्वा 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए 100 माइक्रोन Cytochalasin डी (Cyd) के 10 μl के साथ pretreated थे, तो गुम्मट एल की 10 7 CFU से संक्रमित अकेले अवरोध करनेवाला के साथ 24 घंटा पीआई उपचार पर नजर रखी pneumophila 130b और मृत्यु दर लार्वा अस्तित्व को प्रभावित नहीं किया. हालांकि, pretreated, संक्रमित लार्वा DMSO के इलाज, संक्रमित कीड़े (चित्रा 2) की तुलना में काफी अधिक अस्तित्व (पी = 0.0066, unpaired टी परीक्षण) का प्रदर्शन किया. Cyd उपचार के प्रभाव 48 घंटा पीआई (नहीं दिखाया परिणाम) द्वारा समाप्त कर दिया गया था, इस कारण जी में दवा का आधा जीवन के लिए हो सकता हैमेल्लोनेल्ला. इस एल की कि तेज दर्शाता जी में pneumophila मेल्लोनेल्ला hemocytes बैक्टीरियल डाह का एक महत्वपूर्ण पहलू है.

अभिव्यक्ति मान्य है और जी में एक effector प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए मेल्लोनेल्ला, hemocytes निकाला और immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के लिए प्रोसेस किया गया. लार्वा WT और Δ Dota एल 4 एन टर्मिनल हा टैग के लिए जुड़े हुए अच्छी तरह से परिभाषित T4SS प्रेरक, एस.आई.डी.सी. 41-918, का एक टुकड़ा व्यक्त pneumophila 130b से संक्रमित थे. यह प्रेरक एक phosphoinositide-4-फॉस्फेट बाध्यकारी डोमेन 44 के माध्यम से एलसीवी बाध्य करने के लिए प्रदर्शन किया गया. विरोधी हा (लाल) और विरोधी लीजोनेला (हरा) एंटीबॉडी, 4HA-एस.आई.डी.सी. 41-918 संक्रमित hemocytes में एलसीवी के लिए स्थानीय (चित्रा 3) का उपयोग करना. यह स्थानीयकरण पहले अमीबा Dictyostelium discoideum में और सी की पुष्टि स्तनधारी मैक्रोफेज 44,45 में दिखाया गया हैइस मॉडल के omparability.

डाह के लिए प्रोटीन के महत्व को आमतौर पर जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती जीवाणुओं के विकास कैनेटीक्स की तुलना द्वारा निर्धारित किया जाता है. संक्रमण के पाठ्यक्रम पर बैक्टीरियल प्रतिकृति कैनेटीक्स का पालन करने के लिए, तीन लार्वा hemolymph एकत्र और जमा, (0, 5, 18, और 24 घंटा पीआई) हर समय बिंदु पर बलिदान किया गया और निकाले hemolymph के CFU/0.1g निर्धारित. 5 घंटा पीआई, गुम्मट बैक्टीरिया की CFU पर एक प्रारंभिक डुबकी हालांकि 24 घंटा पीआई तक बढ़ जाती है के बाद, Δ Dota तनाव कोई प्रतिकृति आए और 18 घंटा पीआई (चित्रा 4) पर मंजूरी दे दी है.

एल की क्षमता एक T4SS पर निर्भर ढंग से मैक्रोफेज की सेल पैदा करने के लिए pneumophila लंबे हालांकि कोई इसी तरह के अध्ययन vivo में प्रदर्शन किया गया है, 46 प्रलेखित किया गया है. परिसंचारी hemocytes की एकाग्रता 5, 18 में निर्धारित किया गया था, और 24 घंटा पीआई लार्वा से संक्रमित थे गुम्मट या Δ (चित्रा 5) देखा जा सकता है. हालांकि, 18 घंटा पीआई पर Δ Dota, संक्रमित लार्वा वहाँ नहीं गुम्मट में hemocyte एकाग्रता में उल्लेखनीय गिरावट थी, लेकिन. यह अंतर immunofluorescence द्वारा देखा के रूप में intracellular बैक्टीरिया की उपस्थिति के साथ संयुक्त hemocyte संख्या में गिरावट, पता चलता है, 24 घंटा पीआई पर कायम है कि एल pneumophila तो बैक्टीरिया प्रतिकृति के कई दौर से गुजरना करने की इजाजत दी, उन्हें lyses hemocytes भीतर replicates.

चित्रा 1
चित्रा 1. एल के साथ संक्रमण pneumophila लाती डॉट / आईसीएम निर्भर लार्वा मृत्यु दर. 10 लार्वा पीबीएस अकेले या 10 से संक्रमित थे Dota एल pneumophila 130b के ऊपर> 7 CFU,. गुम्मट से संक्रमित लार्वा 24 घंटे के बाद संक्रमण (पीआई) के भीतर संक्रमण का शिकार, फिर भी कोई मृत्यु दर अकेले पीबीएस या Δ Dota तनाव के साथ inoculated लार्वा में देखा गया था. परिणाम तीन अलग प्रयोगों, ± मानक विचलन का मतलब कर रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. मृत्यु दर बैक्टीरियल internalization पर निर्भर है. 10 एल pneumophila लार्वा (पी = 0.0066, unpaired टी परीक्षण) काफी कम प्रदर्शन किया तो 10 7 WT और 24 घंटा पीआई pretreated लार्वा पर ​​नजर रखी मृत्यु दर से संक्रमित 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए 100 माइक्रोन Cytochalasin डी (Cyd) के 10 μl के साथ pretreated थे मृत्यु दर. परिणाम विदेश मंत्रालय का प्रतिनिधित्व करते हैंहालत प्रति 10 लार्वा के साथ मानक विचलन ± चार स्वतंत्र प्रयोगों में के एन.

चित्रा 3
चित्रा 3. निकाले hemocytes में प्रेरक प्रोटीन की Immunofluorescence इमेजिंग. Hemocytes एल से संक्रमित लार्वा से निकाला गया 5 घंटा पीआई कोशिकाओं पर 4HA-एस.आई.डी.सी. 41-918 व्यक्त pneumophila 130b गुम्मट या Δ Dota नाभिक कल्पना करने के लिए विरोधी हा (लाल) और विरोधी लीजोनेला (हरा) एंटीबॉडी और DAPI डीएनए दाग (नीला) का उपयोग दाग रहे थे. 4HA-एस.आई.डी.सी. 41-918 आसपास के गुम्मट मनाया, लेकिन नहीं Δ Dota, बैक्टीरिया गया था. स्केल बार 5 माइक्रोन.

चित्रा 4
चित्रा 4. एल pneumophila जी भीतर replicates मेलोNella एक डॉट / आईसीएम पर निर्भर ढंग से. लार्वा गुम्मट या Δ Dota एल pneumophila साथ और 0, 5, 18 में संक्रमित, और 24 घंटा पीआई जमा तीन संक्रमित कीड़ों से hemolymph, CYE प्लेटों पर चढ़ाया और CFU निर्धारित किए गए थे और inoculum करने और निकाले hemolymph के वजन के लिए सामान्यीकृत. गुम्मट एल Δ Dota तनाव 18 घंटा पीआई परिणामों के भीतर मंजूरी दे दी थी, जबकि प्रयोग के पाठ्यक्रम पर दोहराया pneumophila मानक विचलन ± तीन अलग प्रयोगों का मतलब कर रहे हैं.

चित्रा 5
चित्रा 5. गुम्मट एल के साथ संक्रमण महत्वपूर्ण hemocyte विनाश में pneumophila परिणाम. Hemocytes 5, 18 पर निकाले, और लार्वा से 24 घंटा पीआई गुम्मट या Δ Dota एल pneumophila और एक hemocytometer गिनती का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं से संक्रमित थे. में कोई फर्क नहींकोशिकाओं की संख्या हालांकि 18 घंटा पीआई पर hemocytes का केवल लगभग 15% Δ Dota तनाव की तुलना गुम्मट तनाव से संक्रमित लार्वा में रहने के तनाव के बीच 5 घंटा पीआई पर देखा गया था. परिणाम तीन अलग प्रयोगों, ± मानक विचलन का मतलब कर रहे हैं.

Discussion

लीजोनेला pneumophila संक्रमण के लिए गैलेरिया मेल्लोनेल्ला लार्वा मॉडल रोगजनन के vivo अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण है. यहाँ यह बृहतभक्षककोशिका संक्रमण के पहलुओं के एक नंबर जी में recapitulated किया जा सकता है कि दिखाया गया है डाह और बैक्टीरियल प्रतिकृति में डॉट / आईसीएम T4BSS की भूमिका और डॉट / ICM-प्रेरक एस.आई.डी.सी. का स्थानीयकरण सहित मेल्लोनेल्ला मॉडल,. इसके अतिरिक्त, हम actin polymerization के एक रासायनिक अवरोध करनेवाला काफी macophages 47 में प्राप्त परिणामों नकल उतार और बैक्टीरिया के internalization लार्वा मृत्यु दर का कारण करने के लिए आवश्यक है कि सबूत के समर्थन, लार्वा मृत्यु दर को कम कर देता है कि प्रदर्शित करता है. इससे पहले, यह दिखा दिया है कि एल के बीच डाह में बदलाव अन्य संक्रमण मॉडल में देखा pneumophila उपभेदों जी में सत्यापित किया जा सकता मेल्लोनेल्ला और बाद घातीय विकास के चरण में विषैलापन कारकों की है कि प्रेरण बैक्टीरियल डाह के लिए आवश्यक है जी मेल्लोनेल्ला एल के लिए एक उपयुक्त मॉडल है pneumophila संक्रमण.

एल के CFU निर्धारण लार्वा से pneumophila या तो अकेले या मिश्रित संक्रमण में बहुत मॉडल की उपयोगिता बढ़ जाती संक्रमित. इससे पहले, कई कारकों संक्रमण 29,48-51 में से एक या एक से अधिक मॉडल में बैक्टीरियल प्रतिकृति पर सूक्ष्म प्रभाव है कि खोज की गई है. लार्वा एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के अधिकारी नहीं है, सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की उपस्थिति सूक्ष्म phenotypes बढ़ाना सेवा कर सकता है, जो अकेले मैक्रोफेज की तुलना में मजबूत चयन प्रदान करता है. इसलिए, यह इन उपभेदों शायद काफी लार्वा मृत्यु दर को प्रभावित नहीं करेगा, जबकि वे जी में बैक्टीरियल प्रतिकृति या फिटनेस की कमी हुई प्रदर्शित कर सकते हैं, संभव है कि मेल्लोनेल्ला मॉडल. साथ ही साथ एल की प्रतिकृति लार्वा में pneumophila, हम देर से संक्रमण में महत्वपूर्ण hemocyte कमी दिखाई है. एल के रूप मेंpneumophila भी बैक्टीरियल प्रतिकृति के एक अप्रत्यक्ष माप के रूप में सेवा कर सकता है hemocyte कमी को मापने, इसकी प्रतिकृति चक्र के अंत में मेजबान कोशिकाओं lyse की उम्मीद है. हाल के परिणाम इस तस्वीर पहले 37 belived से अधिक जटिल है सुझाव है कि हालांकि Hemocyte कमी पहले, संक्रमण 3,52 में कीट मृत्यु दर के साथ जोड़ा गया है. हाल ही में, यह लार्वा की भुखमरी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 53 के दमन के माध्यम से संक्रमण के लिए वृद्धि की संवेदनशीलता की ओर जाता है कि दिखाया गया है. यहाँ वर्णित assays में लार्वा अध्ययन की अवधि के लिए नहीं खिलाया गया और यह फेड लार्वा एल का जवाब होता है कि कैसे अच्छी तरह से ज्ञात नहीं है pneumophila संक्रमण.

जी के लाभ में से एक एक मॉडल के रूप में जीव मेल्लोनेल्ला संक्रमित लार्वा से hemocytes की निकासी और मात्रा का ठहराव के कम है. पिछले वीडियो हालांकि, मिले कीड़े 54,55 से निकालने hemocytes के लिए विभिन्न तरीकों से पता चला हैविभागाध्यक्ष यहाँ प्रस्तुत तत्काल प्रसंस्करण के लिए सरल और उपयुक्त है. एक बार निकाले, hemocytes आसानी से, मात्रा निर्धारित immunofluorescence, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 36 के लिए इस्तेमाल किया या cytometry 56 या सुसंस्कृत प्रवाह और संक्रमण के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रिया में विस्तार से जांच करने की अनुमति पूर्व vivo 3 संक्रमित हो सकता है. यह काफी मॉडल का लचीलापन बढ़ता है. जी में immunofluorescence के लिए एक चेतावनी मेल्लोनेल्ला जी के खिलाफ मान्य एंटीबॉडी की सीमित आपूर्ति है मेल्लोनेल्ला प्रोटीन. हालांकि, अध्ययन लार्वा प्रोटीन, 57 और मानव प्रतिरक्षा संबंधी प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के खिलाफ एंटीबॉडी का निर्माण का प्रदर्शन किया है जी को पहचान पाए गए 11 जी पर immunofluorescence के लिए क्षमता का प्रदर्शन मेल्लोनेल्ला प्रोटीन मेल्लोनेल्ला hemocytes.

जी की आसानी मेल्लोनेल्ला संक्रमण सकता है कि तेजी से, मध्यम throughput स्क्रीन के लिए अनुमति देता हैविभिन्न लीजोनेला प्रजातियों और उपभेदों की डाह तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और आगे इस तरह आसंजन अणुओं 58 या अन्य मॉडलों में डाह के लिए आवश्यक हैं जो टाइप 2 स्राव प्रणाली 59 के रूप में पहले से पहचान विषैलापन कारकों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इस मॉडल का उपयोग स्रावित और translocated प्रेरक प्रोटीन सहित उपन्यास विषैलापन कारकों की पहचान और आगे लक्षण वर्णन अनुमति देगा. हाल ही में, यह एल की कि phospholipase सी गतिविधि दिखाया गया है pneumophila जी में एक भूमिका है मेल्लोनेल्ला डाह 60 और उस डॉट / आईसीएम प्रेरक प्रोटीन SdhA डाह 37 के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, हम हाल ही में जी में मनाया phenotypes के बीच एक संबंध है कि प्रदर्शन किया है मेल्लोनेल्ला और ए / जम्मू माउस तनाव 37 में.

यह पर्यावरण प्रोटोजोआ और कोशिकीय मेजबान और मुरी पूरक करने के लिए इस उपकरण के मूल्य को रेखांकित करता हैपूर्वोत्तर के संक्रमण मॉडल. जी लार्वा जीनोमिक अनुक्रम उपलब्ध हो जाएगा और अधिक आनुवंशिक उपकरण स्थापित कर रहे हैं एक बार मेल्लोनेल्ला मॉडल, भविष्य में और भी अधिक मूल्यवान बन जाएगा. इस दिशा में कदम प्रतिरक्षा संबंधी transcriptome 61 और लेपिडोप्टेरा एसपीपी 62 में जीन मुंह बंद करने के लिए अग्रिम एक पहल के गठन का ब्यौरा हाल के प्रकाशन में शामिल हैं.

जी का उपयोग करके मेल्लोनेल्ला लार्वा, हम एल के रोगजनन जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि बैक्टीरियल डाह की सरल, तेजी से readouts की एक संख्या है pneumophila. इन assays और एल के व्यापक स्क्रीनिंग की स्थापना pneumophila उपभेदों और serogroups इस नए उपकरण की उपयोगिता में वृद्धि होगी और एल के बारे में हमारी समझ के लिए योगदान देगा pneumophila रोगजनन.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

सीआर हार्डिंग वेलकम ट्रस्ट छात्रवृत्ति WT086724 द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material/ Equipment
ACES yeast extract (AYE) broth 4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution*
*add sterile ingredients after autoclaving
Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar
Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate) Sigma P6526 0.6 mM solution, sterile filtered
Sterile cysteine solution Sigma C7880 3.3 mM solution, sterile filtered
G. mellonella (waxworms) Livefood UK W250
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC) Sigma H9037
Anti-Legionella LPS Cambridge Biosciences PA1-7227
Anti-Rabbit IgG Alexa488 Jackson Immunoreach 711-485-152
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma I6758
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS) Sigma D8662
Paraformaldehyde Agar Scientific R1026
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma A9434
Trypan Blue solution Sigma T8154
Digitonin Sigma D141
Cytochalasin D Biomol International BML-T109-0001
Name Company Catalog Number Comments
Material
Microtiter Syringe Sigma 24544
Cell counter, double, Improved Neubauer VWR 631-0926
Centrifuge For centrifuging plates
Fluorescence microscope Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores
Inverted microscope For viable cell counting
Puncture-proof glove Turtleskin

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संक्रमण अंक 81 जीवाणु संक्रमण संक्रमण रोग मॉडल पशु जीवाणु संक्रमण और Mycoses, कीट मॉडल जीवाणु संक्रमण Legionnaires रोग haemocytes
का प्रयोग करें<em&gt; गैलेरिया मेल्लोनेल्ला</em&gt; एक मॉडल जीव के रूप में अध्ययन करने के लिए<em&gt; लीजोनेला pneumophila</em&gt; संक्रमण
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Harding, C. R., Schroeder, G. N.,… More

Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection. J. Vis. Exp. (81), e50964, doi:10.3791/50964 (2013).

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