Summary
Larven af voks møl Galleria mellonella blev for nylig etableret som en in vivo model for at studere Legionella pneumophila infektion. Her vil vi demonstrere grundlæggende teknikker til at karakterisere patogenesen af legionella i larverne, herunder podning, måling af bakteriel virulens og replikation samt udvinding og analyse af inficerede hæmocytter.
Abstract
Legionella pneumophila, det agens af en alvorlig lungebetændelse kaldet legionærsyge, er en vigtig menneskelig patogen, som inficerer og replikater inden alveolære makrofager. Dens virulens afhænger af Dot / Icm type IV sekretionssystem (T4SS), som er afgørende for at etablere en replikering eftergivende vakuole kaldet Legionella indeholder vakuole (LCV). L. pneumophila infektion kan modelleres i mus dog de fleste musestammer ikke er eftergivende, hvilket fører til søgen efter nye infektion modeller. Vi har for nylig vist, at larver af voks møl Galleria mellonella er egnede til undersøgelse af L. pneumophila infektion. G. mellonella anvendes i stigende grad som en infektion model for humane patogener og en god korrelation mellem virulens af flere bakteriearter i insekt og pattedyr modeller. Et centralt element i larverne immunforsvar er hæmocytter, erhverval fagocytter, der tager op og ødelægge angriberne. L. pneumophila er i stand til at inficere, danner en LCV-og replikere i disse celler. Her demonstrerer vi protokoller til analyse L. pneumophila virulens i G. mellonella model, herunder hvordan at vokse smitsomme L. pneumophila, forbehandle larverne med inhibitorer, inficere larverne, og hvordan man udtrække inficerede celler til kvantificering og immunofluorescensmikroskopi. Vi beskriver også, hvordan at kvantificere bakteriel replikation og fitness i konkurrencesager assays. Disse metoder giver mulighed for hurtig screening af mutanter for at bestemme faktorer, der er vigtige i L. pneumophila virulens, der beskriver et nyt værktøj til at støtte vores forståelse af denne komplekse patogen.
Introduction
Dyremodeller for infektion har vist sig at være uvurderlig ved bestemmelse af bakterielle virulensfaktorer. Imidlertid har hvirvelløse modeller opnået øget opmærksomhed som et levedygtigt alternativ til traditionelle pattedyr modeller for infektion. Larver af voks møl er Galleria mellonella i stigende grad anvendt til at undersøge en række vigtige humane patogener, herunder Gram-positive 1 og Gram-negative bakterier 2,3 og flere patogene svampe 4,5. Ved hjælp af et insekt model har en række fordele frem for traditionelle pattedyr modeller, som en invertebrat, G. mellonella er ikke underlagt de etiske begrænsninger af pattedyr modeller. Desuden kan larverne let fastholdes smittet ved injektion uden bedøvelse undergår forbehandling med kemiske inhibitorer 6 og opretholde inkubation ved 37 ° C 7. Interessant nok en god korrelation mellem patogeniciteten af flere mikroorganismer i G. mellonella og pattedyr modeller af infektion er etableret 2,8. Den øgede forståelse af immunsystemet G. mellonella har også bistået i karakteriseringen af denne model organisme. Selvom insekter ikke har en adaptive immunsystem, som findes i pattedyr, har de avancerede cellulære og humerus forsvar, inklusive fremstilling af antimikrobielle peptider 9. Hæmocytter er vigtig mediator af cellulære forsvar og er den mest talrige celletype findes i hæmolymfe (eller blod) G. mellonella 10. Disse celler er professionelle fagocytter og lignende funktioner til humane makrofager og neutrofiler ved både at optage og nedværdigende bakterier i en phago-lysosomale rum 10,11 og danner knuder rundt invaderende bakterier, fysisk begrænsende bakteriereplikation 12.
Legionella pneumophila er en respiratorisk patogen, der forårsager alvorlig pneumonien (Legionærsyge) hos modtagelige populationer såsom ældre eller immunsupprimerede 13.. Legionella findes allestedsnærværende i både miljø-og menneskeskabte vandkilder, hvor det er et patogen for forskellige arter af ferskvand amøber 14,15. Legionella overlever og replikerer i disse professionelle fagocytter ved anvendelse af en multi-protein-kompleks kendt som Dot / Icm (mangelfuld organel handel / intracellulær formering) type 4 sekretionssystem (T4SS) til at translokere over 275 effektor-proteiner i værtscellen 16-20. Disse proteiner tjener til at undergrave de normale værtscelle fagocytotiske veje, der fører til oprettelsen af Legionella indeholder vakuole (LCV). LCV undgår fusion med lysosomer og i stedet rekrutterer endoplasmatiske reticulum (ER)-afledte vesikler, hvilket resulterer i en specialiseret rum, der ligner den ru ER 21,22. L. pneumophila betragtes som en menneskelige fejl stiogen; de samme strategier, som gør det muligt at replikere i amøber, også tillade replikation i humane alveolære makrofager 23.
Pattedyrværter er blevet karakteriseret som modeller for humane Legionella infektion, herunder mus og marsvin 24,25. Men de fleste af musestammer er resistente over for Legionella-infektion 26 med undtagelse af den indavlede albino A / J-mus, som udvikler en mild, selvbegrænsende infektion 24. Selv marsvinemodellen mere ligner menneskelige sygdomme 25, manglen af mutanter og øgede omkostninger fraråder brugen 27.. Desuden er der udviklet flere hvirvelløse modeller for Legionella pneumophila infektion, herunder Caenorhabditis elegans 28 Drosophila melanogaster 29 og flere arter af amøber 30-32. Men disse modeller har svagheder, virulens i C. elegans 28, hvilket begrænser anvendeligheden af denne model. Drosophila-modellen har vist sig effektiv i at undersøge bakteriel virulensfaktorer 29 og synes dog at være lovende, denne model er ikke blevet fuldt karakteriseret. Encellede amøber er de miljømæssige værter L. pneumophila og er ideelle til at undersøge virkningen af virulensfaktorer på molekylært niveau 33 mangler dog flere vigtige mediatorer af pattedyrværten celle respons på infektion, såsom caspaserne 34. Svaghederne ved de eksisterende modeller, sammen med de høje omkostninger og etiske problemer forbundet med pattedyr eksperimenter, har ført til søgen efter andre passende modelorganismer 29,35.
Vi har for nylig påvist, at G. mellonella er en egnet model for L. pneumophila Patogenese 36,37. Denne protokol beskriver de eksperimentelle teknikker, der anvendes til inficerening G. mellonella larver, analysere larve moral, udvinding hæmocytter for optælling og immunfluorescens og bestemme replikation ved levedygtig CFU tæller fra inficerede larver.
Protocol
1.. Fremstilling af L. pneumophila for infektion
- Forbered trækul gærekstrakt (CYE) plader (2 g / l aktivt kul, 10 g / l gærekstrakt, 13 g / L agar, 10 g / l N-(2-acetamido)-2-aminothanesulfonic acid (ACES), 1 g / L α-ketoglutarat, 0,4 g / L L-cystein HCI og 0,25 g / L ferripyrophosphat, pH 6,9).
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, tilsættes kanamycin (25 ug / ml) og / eller chloramphenicol (6 ug / ml) til CYE plader.- Udføre alle L. pneumophila arbejde på biosikkerhed indeslutningsniveau 2 (BSL-2) i en mikrobiel sikkerhedskabinet (MSC) i overensstemmelse med lokale regler.
- Streak L. pneumophila fra -80 ° C glycerolstamopløsninger onto CYE plader
- Pladerne inkuberes i 4 dage ved 37 ° C.
Bemærk: Inkubering af pladerne i 4 dage øger virulensen af L. pneumophila i G. mellonella løbet inkubation i 3 dage. - En dag før infektion, opblande en løkke full i bakterier (indeholdende flere kolonier) i 1 ml forvarmet (37 ° C) ACES gærekstrakt (AYE) bouillon, og absorbansen måles ved 600 nm (OD600) ved anvendelse af et spektrofotometer.
- Podes en frisk 3 ml AYE kultur (med antibiotika, hvis det kræves) til en endelig OD 600 på 0,1.
- Medtag et medie kun styre for at sikre steriliteten af medierne.
- Inkuberes ved 37 ° C i en rysteinkubator ved 200 rpm i 21 timer.
Bemærk: Bakterierne dyrkes til post-eksponentielle fase for infektion 38.. Voksende for 21 hr tillader eksperimenter skal standardiseres.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt for protein induktion, tilsættes 0,5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) natten over. - Mål OD 600 (bakterier skal være i post-eksponentiel vækstfase, OD600 2,5-3).
- Fortynd bakteriekultur til opnåelse af 1 x 10 9 CFU / ml i sterilt Dulbeccos phosphatbufret saltopløsning (D-PBS).
Bemærk: Baseret på tidligere resultater, en OD600 på 1 svarer til 1 x 10 9 CFU / ml, men dette skal bekræftes for forskellige L. pneumophila stammer.
Bemærk: Hvis induktion af et protein fra et plasmid er nødvendig, tilsættes 1 mM IPTG til inoculum. - Plate inokulum som beskrevet i afsnit 9 som en kontrol for at sikre den forventede CFU er til stede i podestoffet.
2. Fremstilling af Larver
- Køb tilstrækkelig G. mellonella larver fra en kommerciel leverandør. Larverne sendes på 5. eller 6. stadiums fase (ca. mellem 2-3 cm i længde) og er egnet til brug med det samme.
Bemærk: En metode, der beskriver, hvordan man bagud larver er blevet beskrevet tidligere 39.
Bemærk: Larver kan opbevares ved stuetemperatur i op til to uger, og ikke kræver fødevarer. Umiddelbart kassere larver, der udviser tegn på pupation. - Forbered beholder til larve ved placning en cirkel på 10 cm filtrerpapir i bunden af en 10 cm petriskål.
- Ved stump tippet pincet placere ti sunde larver på ca samme størrelse i petriskål.
Bemærk: Smid usunde brun farvet eller plettet leder insekter. Sunde larver er ensartet cremefarvet med nogen områder af mørk misfarvning og er i stand til at skaffe sig ret hurtigt, hvis væltet.
3. Infektion af G. mellonella Larver
- Forbered injektion platform ved at tape en kreds af filterpapir til overfladen.
- Sikker tape en P1000 spids vandret til filtrerpapiret til at skabe en injektion platform. Dette behøver ikke at være sterile.
- Steriliser en 20 ul mikrotiter sprøjten ved sugning 70% ethanol og inkubering i mindst 10 minutter.
- Bær Punkterfri handsker under injektion,
- Fjern eventuelle rester af ethanol ved at aspirere og udstøde sterilt vand flere gange.
- USIng sprøjten aspirer 10 ul af L. pneumophila 1 x 10 9 CFU / ml suspension.
- Tag en larve og forsigtigt, men fast tænde den ryggen, bøjede sig over P1000 spids.
- Placér spidsen af sprøjten over den forreste, højre proleg larverne.
- Forsigtigt, spidsen af nålen ind i proleg, og sørg for, at det er inde i larver og problemfrit injicere hele sprøjtens indhold.
Bemærk: Hvis sprøjten er isat korrekt, bør det være muligt at afhente larverne kun bruger sprøjten for at placere det ind i kammeret.- Efter injektion observere larverne i et par sekunder. Larverne vil begynde at kravle efter et par sekunder, men bør ikke udskille væske.
- Kortvarigt observere larverne et par timer efter infektion, infektion med 10 7 CFU L. pneumophila 130b ikke forårsage nogen symptomer inden for de første 5-8 hr pi Derfor, hvis larver bliver grå / sort før dette tidspunkt than eksperiment bør ophøre.
Bemærk: Podning af larver med 1 mM IPTG påvirker ikke larvernes levedygtighed i løbet af eksperimentet. - På samme måde, injiceres i alt 10 larver pr betingelse med 10 larver injiceret med D-PBS til at tjene som en kontrol til at analysere larvernes dødelighed.
- Tape petriskåle lukket og plads i den sekundære indeslutning.
- Inkuber i en standard bakteriel inkubator ved 37 ° C i varigheden af eksperimentet.
4.. Forbehandling af Larver med en kemisk inhibitor
- Forud for infektion, forberede larver til injektion som beskrevet i afsnit 3,1-3,6.
- Indsprøjtes 10 pi af en 100 uM opløsning af Cytochalasin D i den forreste, venstre proleg 10 larver.
Bemærk: Inhibitor injiceres ind i en anden proleg fra bakteriesuspensionen at reducere skade på larver. - Indsprøjtes 10 pi DMSO i 10 larver som en kontrol.
- Inkuber larver på37 ° C i 4 timer.
- Sprøjt forbehandlet larver, som beskrevet i afsnit 3 i den forreste, højre proleg med enten 1 x 10 7 CFU WT L. pneumophila eller en PBS-kontrol.
5.. Analyse af Larvernes dødelighed
- På 18 timer efter infektion (pi), undersøge alle inficerede larver for dødelighed.
- For at kontrollere dødelighed bruge stumpe tippet pincet til at slå over larver og se bevægelse af benene for, bør sunde larver rette sig hurtigt. Pigmentering angiver en stærk immunreaktion på infektion. Hvis der er nogen bevægelse, tæller som live.
- Rekordstort antal døde og levende larver.
- Gentag denne proces på alle andre tidspunkter valgt.
Bemærk: Hvis inkubation fortsættes i mere end tre dage, kan pupper ses. Fjern eventuelle pupper og aflive ved frysning ved - 20 ° C før metamorfose kan forekomme.
6.. Udvinding af hæmolymfe
- Tre tilfældigt udvalgtelarver og anbringes i et 14 ml rør på udvalgte tidspunkter såsom 5 og 18 timer pi,
- Placer dette rør på is i 5-10 minutter, indtil der kan observeres nogen bevægelse af benene af larver.
- Placer bedøvet larver på en petriskål og ved hjælp af en skalpel, lave et snit mellem to segmenter nær halen af larver.
- Klem larverne i en steril 1,5 ml centrifugerør at indsamle hæmolymfe.
- Pool hæmolymfe fra mindst tre personer. Én larver giver mellem 15-50 pi hæmolymfe afhængig af størrelse.
Bemærk: Under hæmolymfe udvinding er det meget let at forstyrre tarmen, hvilket resulterer i potentielle forurening af prøverne. Reducere forureningen ved at skære larver nær halen (væk fra tarmen) vil imidlertid antibiotisk selektion altid kræves, når udpladning bakterier.
Bemærk: For at undgå hæmolymfe dreje brun og koagulere, proces hæmolymfe inden 10 min efter opsamling.
- Pool hæmolymfe fra mindst tre personer. Én larver giver mellem 15-50 pi hæmolymfe afhængig af størrelse.
- Kassér larve krop ind i en ny 14 ml Falcon rør, sæl og sted ved - 20 ° C natten over for at sikre, larverne er døde.
- Autoklave døde larver og bortskaffes i henhold til lokale regler.
7.. Bestemmelse af Hemocyte Viability
- Uddrag hæmolymfe som beskrevet ovenfor.
- Bland 20 ul ekstraheret hæmolymfe med 20 ul af 0,02% (v / v) Trypan blue i PBS i en brønd i en plade med 96 brønde.
- Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Belastning 10 ul hæmolymfe på et hæmocytometer og tælle levedygtige (ikke blå) celler.
- Tæl hver prøve i tre eksemplarer til at reducere fejl.
8.. Behandling af ekstraheret hæmocytter for immunfluorescensmikroskopi
- Bland puljet hæmolymfe ekstraheret fra mindst tre larver og pipette på en 10-15 mm dækglas i en 24-brønds plade.
Bemærk: Dækglas ikke kræver behandling, da hæmocytter kan klæbe til glas. - Tilsæt 0,5 ml D-PBS og blandes godt ved pipettering op og ned.
- Centrifugér pladen i 10 minutter ved 500 xg ved stuetemperatur (RT) under anvendelse af en aerosol-tæt centrifuge nummerplade holder.
- Undersøg hver brønd med et inverteret mikroskop for at kontrollere, at de hæmocytter har levet.
- Supernatanten fjernes, og omhyggeligt vaske cellerne tre gange ved tilsætning af 0,5 ml D-PBS til væggen i brønden, rokkende pladen 2-3x og fjernelse af D-PBS med en pipette.
- Fikseres cellerne ved tilsætning af 0,5 ml 4% (v / v) paraformaldehyd (PFA) i PBS.
- Inkubér cellerne i 20-30 minutter ved stuetemperatur.
- Vaskes cellerne tre gange med D-PBS, som før.
- Tilsæt 0,5 ml 15 mM NH4CI i PBS for at standse resterende PFA og inkuberes ved stuetemperatur i 15 min.
- Vaskes cellerne tre gange med D-PBS.
Bemærk: På dette tidspunkt kan dækglassene opbevares natten over ved 4 ° C. - Tilsæt 0,5 ml 0,1% Triton X-100 i PBS og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur for at permeabilisere cellerne. Blok til 1 time med blokerende opløsning (2% (w / v) BSA i PBS).
- Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i mørke med det primære antistof, fortyndet med blokerende opløsning ved fortynding af fabrikanten angivne.
- Vask 3 gange med PBS.
- Der inkuberes i 1 time med det sekundære antistof og DAPI til visualisering af bakterier som ovenfor.
- Vask 3 gange med PBS.
- Monter dækglas ved hjælp af en dråbe montering reagens på objektglas.
- Inkuberes natten over i mørke ved RT til fuldt ud at tørre montage løsning.
- Billede glider på et fluorescens-mikroskop.
9.. Kvantificering af bakteriel CFU
- Tilføj 100 ug / ml spectinomycin at CYE plader for at undgå forurening med tarmfloraen. L. pneumophila stamme 130b er naturligt resistente over for spectinomycin 40.
- Før hæmolymfe udvinding, vejer 1,5 ml centrifugerør.
- Uddrag hæmolymfe som beskrevet i afsnit 6 og placere i vejet tUBE'er, tilsættes 1 ml af 5 mg / ml digitonin, bland godt og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur for at lysere hæmocytter.
- Vejes glasset med hæmolymfe og bestemme vægten af hæmolymfe udvindes.
- Udfør ti gange serielle fortyndinger af hæmolymfe i sterilt AYE medier.
- Ved hjælp af en pen, opdele bunden af en CYE plade i seks lige store sektorer og etiket.
- Plate tre dråber 25 ul af hver fortynding (startende med den mest fortyndede) i hver sektion af pladen.
- Pladerne inkuberes med låg yderste natten over ved 37 ° C.
- Når dråberne er tørret fuldstændigt, drejes pladen igen og inkuberes ved 37 ° C i mindst yderligere to dage.
- Kvantificere bakterierne udvundet ved at tælle kolonierne på hver fortynding og normalisere til vægten af hæmolymfe ekstraheret.
10.. Bestemmelse af Competitive Index (CI)
- Bekræft, at begge stammer vokser lige godt i bouillon kultur og på CYE agarplader prior til at forsøge den konkurrencemæssige indeks.
- Forbered WT eller kanamycinresistente mutant bakteriesuspensioner som beskrevet i afsnit 1, og bland i forholdet 1:1.
- Plate seriefortyndinger af inoculum på CYE spectinomycin (100 ug / ml) og CYE spectinomycin / kanamycin
- Inficere larver og ekstrakt hæmolymfe på passende tidspunkter som beskrevet ovenfor.
- Bestem kimtal ved at udtrække hæmolymfe og forkromning seriefortyndinger på CYE spectinomycin og CYE spectinomycin / kanamycin.
- Beregn den konkurrencemæssige indeks (CI) som følger: CI = (mutant udgang / WT-udgang) / (mutant inokulum / WT inokulum).
Representative Results
Her er det påvist, at G. mellonella er en passende, let at bruge model til at studere L. pneumophila infektion. Tidligere er det blevet vist, at L. pneumophila virulens i makrofager, amøber og pattedyr modeller er afhængig af tilstedeværelsen af Dot / Icm sekretionssystem 41-43. G. mellonella larver blev smittet som beskrevet ovenfor og virulens af vildtype (WT) og en Dot / Icm-mangelfuld stamme sammenlignet. Infektion med 10 7 CFU L. pneumophila stamme 130b resulterede i 100% dødelighed inden for 24 timer efter infektion (pi). Men L. pneumophila Δ DOTA-stamme, som ikke har en funktionel Dot / Icm T4SS sekretionssystem, var avirulent i dette assay (figur 1). Dette viser, at L. pneumophila virulens i G. mellonella afhænger translokation af Dot / icm effektorer, hvilket gør denne model velegnet til karakterisering affunktionen af disse proteiner.
For nylig blev det vist, at inhibering af fagocytose af cytochalasin øgede behandling susceptibly larvernes til infektion med gær Candida albicans 6. Som L. pneumophila er et intracellulært patogen, blev det besluttet at bestemme, om optagelse af bakterier er afgørende i patogenesen i denne model. Larverne blev forbehandlet med 10 pi 100 pM Cytochalasin D (CyD) i 4 timer ved 37 ° C og derefter inficeret med 10 7 CFU WT L. pneumophila 130b og dødelighed overvåget ved 24 hr pi Behandling med inhibitoren alene ikke larvernes overlevelse. Men forbehandlet smittet larver viste signifikant større overlevelse (p = 0,0066, parret t-test) sammenlignet med DMSO-behandlede, inficerede insekter (figur 2). Virkningen af CyD behandling blev ophævet ved 48 timer pi (resultater ikke vist), hvilket kan skyldes, at halveringstiden af lægemidlet i G.mellonella. Dette viser, at optagelsen af L. pneumophila i G. mellonella hæmocytter er et afgørende aspekt af bakteriel virulens.
For at validere ekspression og bestemme den subcellulære lokalisering af en effektor-protein i G. mellonella, hæmocytter blev udvundet og forarbejdet til immunfluorescensmikroskopi. Larverne blev inficeret med WT og Δ DOTA L. pneumophila 130b udtrykker et fragment af veldefineret T4SS effektor, SIDC 41-918, fusioneret til fire N-terminale HA-tags. Denne effektor blev demonstreret at binde LCV via en phosphoinositid-4-fosfat-bindende domæne 44. Brug anti-HA (rød) og anti-legionella (grøn) antistoffer, 4HA-SIDC 41-918 lokaliseret til LCV i inficerede hæmocytter (Figur 3). Denne placering er tidligere blevet vist i amøber Dictyostelium discoideum og i mammale makrofager 44,45 bekræfter comparability af denne model.
Betydningen af proteiner til virulens sædvanligvis bestemmes ved sammenligning af vækstkinetik af vildtype og mutante bakterier. For at følge den bakterielle replikations-kinetik i løbet af infektion blev tre larver aflivet på hvert tidspunkt (0, 5, 18 og 24 timer pi), den hæmolymfe opsamlet og samlet og CFU/0.1g af ekstraheret hæmolymfe bestemmes. Efter en indledende dip 5 timer pi, CFU af WT bakterier stiger op til 24 timer pi dog Δ DOTA stammen undergår ingen replikation og udskilles på 18 timer pi (fig. 4).
Evnen L. pneumophila at forårsage lysis af makrofager i en T4SS-afhængig måde har længe været dokumenteret 46, men ingen lignende undersøgelser er blevet udført in vivo. Koncentrationen af cirkulerende hæmocytter blev bestemt ved 5, 18 og 24 timers pi larver blev inficeret med WT eller Δ
Figur 1. Infektion med L. pneumophila inducerer Dot / Icm-afhængige larve dødelighed. 10 larver blev inficeret med PBS alene eller 10
Figur 2. Dødeligheden er afhængig af bakteriel internalisering. 10 L. pneumophila larver blev forbehandlet med 10 pi 100 pM Cytochalasin D (CyD) i 4 timer ved 37 ° C og derefter inficeret med 10 7 WT og dødelighed overvåget ved 24 hr pi forbehandlet larver viste signifikant (p = 0,0066, parret T-test) reducerede dødelighed. Resultaterne repræsenterer MEAn på fire uafhængige eksperimenter ± standardafvigelser med 10 larver pr tilstand.
Figur 3. Immunofluorescens billeddannelse af effektor-proteiner i udvundet hæmocytter. Hæmocytter blev ekstraheret fra larverne inficeret med L. pneumophila 130b WT eller Δ DOTA udtrykker 4HA-SIDC 41-918 på 5 hr pi Celler blev farvet under anvendelse af anti-HA (rød) og anti-Legionella (grøn) antistoffer og DAPI DNA-farve (blå) til at visualisere cellekerner. 4HA-SIDC 41-918 blev observeret omkring WT, men ikke Δ DotA, bakterier. Målestok 5 um.
Figur 4.. L. pneumophila replikerer inden G. Mellonella i en Dot / Icm-afhængig måde. Larverne blev inficeret med WT eller Δ DOTA L. pneumophila og 0, 5, 18 og 24 timer pi af hæmolymfe fra tre inficerede insekter samledes, udpladet på CYE pladerne og CFU bestemmes og normaliseret til inokulum og vægten af hæmolymfe ekstraheret. WT L. pneumophila replikeres i løbet af forsøget, mens det Δ DOTA stammen blev fjernet inden for 18 timer pi Resultaterne er middelværdien af tre separate forsøg ± standardafvigelse.
Figur 5. Infektion med WT L. pneumophila resulterer i signifikant ødelæggelse hemocyte. hæmocytter blev ekstraheret ved 5, 18 og 24 timer pi fra larver inficeret med WT eller Δ DOTA L. pneumophila og levedygtige celler talt under anvendelse af et hæmocytometer. Ingen forskel iantallet af celler blev set ved 5 timer pi mellem stammerne dog på 18 timer pi kun cirka 15% af hæmocytter forbliver i larver inficeret med WT-stammen i forhold til Δ DOTA stamme. Resultaterne er gennemsnit af tre separate forsøg, ± standardafvigelse.
Discussion
Galleria mellonella larvernes model for Legionella pneumophila infektion er et nyttigt værktøj for in vivo undersøgelser af patogenese. Her er det vist, at en række aspekter af makrofag infektion kan sammenfattet i G. mellonella model, herunder den rolle, Dot / Icm T4BSS i virulens og bakteriel replikation og lokaliseringen af Dot / Icm-effektor SIDC. Derudover viser vi, at en kemisk inhibitor af actinpolymerisation reducerer larve dødelighed, efterligne resultater opnået i macophages 47 og dokumentation, at internalisering af bakterierne er forpligtet til at forårsage larvernes dødelighed. Tidligere er det blevet påvist, at variationerne i virulens mellem L. pneumophila stammer set i andre infektionsmodeller kan verificeres i G. mellonella og at induktion af virulensfaktorer i post-eksponentielle vækstfase er nødvendig for bakteriel virulens
Bestemmelse af CFU L. pneumophila fra larver smittet enten enkeltvis eller i blandede infektioner øger anvendeligheden af modellen. Tidligere har flere faktorer blevet opdaget, at have subtile effekter på bakteriel replikation i en eller flere modeller af infektion 29,48-51. Selv larverne ikke besidder en adaptive immunsystem, giver tilstedeværelsen af medfødte immunreaktion stærkere markering sammenlignet med makrofager alene, der kan tjene til at forstærke subtile fænotyper. Derfor er det muligt, at mens disse stammer sandsynligvis vil ikke påvirke larvernes dødelighed, kan de demonstrere nedsat bakteriereplikation eller egnethed i G. mellonella model. Samt replikation af L. pneumophila i larverne har vi vist signifikant hemocyte udtynding sent i infektion. Som L.forventes pneumophila at lysere værtscellerne ved afslutningen af sin replikationscyklus måling hemocyte udtømning kan også tjene som en indirekte måling af bakteriel replikation. Hemocyte udtømning er tidligere blevet korreleret med insekt dødelighed infektion 3,52, selv om de seneste resultater tyder på, at dette billede er mere kompleks end første belived 37. For nylig er det blevet vist, at udsultning af larver fører til forøget modtagelighed for infektion gennem en undertrykkelse af immunreaktioner 53. I analyserne er beskrevet her, blev larverne ikke fodres for varigheden af undersøgelsen og det vides ikke, hvor godt fodret larver ville reagere på L. pneumophila infektion.
En af fordelene ved G. mellonella som en model organisme er den lethed af ekstraktion og kvantificering af hæmocytter fra inficerede larver. Tidligere videoer har vist forskellige metoder til udvinding hæmocytter fra insekter 54,55 dog opfyldthod præsenteres her er enkel og egnede til umiddelbar forarbejdning. Når udvundet, kan hæmocytter let kvantificeres, der anvendes til immunfluorescens, transmission elektronmikroskopi 36 eller flowcytometri 56 eller kulturperler og inficerede ex vivo 3 tillader cellernes reaktion på infektion, der skal undersøges nærmere. Dette øger fleksibiliteten af modellen betydeligt. En advarsel til immunfluorescens i G. mellonella er det begrænsede udbud af antistoffer valideret mod G. mellonella proteiner. Imidlertid har undersøgelser vist, at oprettelsen af antistoffer mod larvernes proteiner 57 og antistoffer mod humane immun-relaterede proteiner blev fundet at genkende G. mellonella proteiner 11 demonstrerer potentialet for immunfluorescens på G. mellonella hæmocytter.
Den lette G. mellonella infektion giver mulighed for hurtige, medium throughput skærme, der kunnebruges til at sammenligne virulensen af forskellige Legionella arter og stammer og kan anvendes til yderligere at analysere tidligere identificerede virulensfaktorer såsom adhæsionsmolekyler 58 eller type 2 sekretion systemet 59, som er nødvendige for virulens i andre modeller. Desuden vil anvendelsen af denne model er muligt at identificere og yderligere karakterisering af nye virulensfaktorer, herunder udskilte og translokeres effektor proteiner. For nylig er det blevet vist, at phospholipase C-aktivitet af L. pneumophila har en rolle i G. mellonella virulens 60 og at Dot / Icm effektor protein SdhA er nødvendig for virulens 37.. Desuden har vi for nylig vist, at der er en sammenhæng mellem de fænotyper observeret i G. mellonella og A / J mus stamme 37.
Det understreger værdien af dette værktøj til at supplere miljømæssig protozo og encellede vært og Murine infektion modeller. G. mellonella model vil blive endnu mere værdifuld i fremtiden, når den larve genomiske sekvens vil være til rådighed og flere genetiske værktøjer er etableret. Skridt i denne retning bl.a. den nylige offentliggørelse beskriver immun-relaterede transkriptom 61 og dannelsen af et initiativ for at fremme gen-nedregulering i Lepidoptera-arter 62.
Ved hjælp af G. mellonella larver, har vi en række enkle, hurtige aflæsninger af bakteriel virulens, der kan anvendes til at undersøge patogenesen af L. pneumophila. Etablering af disse analyser og bredere screening af L. pneumophila stammer og serogrupperne vil øge anvendeligheden af dette nye værktøj og vil bidrage til vores forståelse af L. pneumophila patogenese.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
CR Harding blev støttet af Wellcome Trust studentship WT086724.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/ Equipment | |||
| ACES yeast extract (AYE) broth | 4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* *add sterile ingredients after autoclaving |
||
| Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates | As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar | ||
| Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate) | Sigma | P6526 | 0.6 mM solution, sterile filtered |
| Sterile cysteine solution | Sigma | C7880 | 3.3 mM solution, sterile filtered |
| G. mellonella (waxworms) | Livefood UK | W250 | |
| Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC) | Sigma | H9037 | |
| Anti-Legionella LPS | Cambridge Biosciences | PA1-7227 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa488 | Jackson Immunoreach | 711-485-152 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS) | Sigma | D8662 | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | |
| Cytochalasin D | Biomol International | BML-T109-0001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Microtiter Syringe | Sigma | 24544 | |
| Cell counter, double, Improved Neubauer | VWR | 631-0926 | |
| Centrifuge | For centrifuging plates | ||
| Fluorescence microscope | Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores | ||
| Inverted microscope | For viable cell counting | ||
| Puncture-proof glove | Turtleskin | ||
References
- Olsen, R. J., Watkins, M. E., Cantu, C. C., Beres, S. B., Musser, J. M. Virulence of serotype M3 Group A Streptococcus strains in wax worms (Galleria mellonella larvae. Virulence. 2, 111-119 (2011).
- Jander, G., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Positive correlation between virulence of Pseudomonas aeruginosa mutants in mice and insects. J. Bacteriol. 182, 3843-3845 (2000).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Appl. Environ. Microbiol. 76, 310-317 (2010).
- Mowlds, P., Barron, A., Kavanagh, K. Physical stress primes the immune response of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans. Microbes Infect. 10, 628-634 (2008).
- Renwick, J., Daly, P., Reeves, E. P., Kavanagh, K. Susceptibility of larvae of Galleria mellonella to infection by Aspergillus fumigatus is dependent upon stage of conidial germination. Mycopathologia. 161, 377-384 (2006).
- Banville, N., Fallon, J., McLoughlin, K., Kavanagh, K. Disruption of haemocyte function by exposure to cytochalasin b or nocodazole increases the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Microbes Infect. 13, 1191-1198 (2012).
- Mowlds, P., Kavanagh, K. Effect of pre-incubation temperature on susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection by Candida albicans. Mycopathologia. 165, 5-12 (2008).
- Joyce, S. A., Gahan, C. G. Molecular pathogenesis of Listeria monocytogenes in the alternative model host Galleria mellonella. Microbiology. 156, 3456-3468 (2010).
- Mak, P., Zdybicka-Barabas, A., Cytrynska, M. A different repertoire of Galleria mellonella antimicrobial peptides in larvae challenged with bacteria and fungi. Dev. Comp. Immunol. 34, 1129-1136 (2010).
- Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1295-1309 (2002).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect. Immun. 73, 4161-4170 (2005).
- Ratcliffe, N. A., Gagen, S. J. Studies on the in vivo cellular reactions of insects: an ultrastructural analysis of nodule formation in Galleria mellonella. Tissue Cell. 9, 73-85 (1977).
- Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. N. Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
- Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
- Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 (2011).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Horwitz, M. A. The Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) inhibits phagosome-lysosome fusion in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 2108-2126 (1983).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect. Immun. 63, 3609-3620 (1995).
- Segal, G., Shuman, H. A. Legionella pneumophila utilizes the same genes to multiply within Acanthamoeba castellanii and human macrophages. Infect. Immun. 67, 2117-2124 (1999).
- Brieland, J., et al. Replicative Legionella pneumophila lung infection in intratracheally inoculated A/J mice. A murine model of human Legionnaires' disease. Am. J. Pathol. 145, 1537-1546 (1994).
- Baskerville, A., Fitzgeorge, R. B., Broster, M., Hambleton, P., Dennis, P. J. Experimental transmission of legionnaires' disease by exposure to aerosols of Legionella pneumophila. Lancet. 2, 1389-1390 (1981).
- Wright, E. K., et al. Naip5 affects host susceptibility to the intracellular pathogen Legionella pneumophila. Curr. Biol. 13, 27-36 (2003).
- Padilla-Carlin, D. J., McMurray, D. N., Hickey, A. J. The guinea pig as a model of infectious diseases. Comp. Med. 58, 324-340 (2008).
- Komura, T., Yasui, C., Miyamoto, H., Nishikawa, Y. Caenorhabditis elegans as an alternative model host for Legionella pneumophila, and protective effects of Bifidobacterium infantis. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4105-4108 (2011).
- Kubori, T., Shinzawa, N., Kanuka, H., Nagai, H. Legionella metaeffector exploits host proteasome to temporally regulate cognate effector. PLoS Pathog. 6, e1001216 (2010).
- Abu Kwaik, Y. The phagosome containing Legionella pneumophila within the protozoan Hartmannella vermiformis is surrounded by the rough endoplasmic reticulum. Appl. Environ. Microbiol. 62, 2022-2028 (1996).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Solomon, J. M., Rupper, A., Cardelli, J. A., Isberg, R. R. Intracellular growth of Legionella pneumophila in Dictyostelium discoideum, a system for genetic analysis of host-pathogen interactions. Infect. Immun. 68, 2939-2947 (2000).
- Hilbi, H., Weber, S. S., Ragaz, C., Nyfeler, Y., Urwyler, S. Environmental predators as models for bacterial pathogenesis. Environ. Microbiol. 9, 563-575 (2007).
- Khoa, D. B., Trang, L. T., Takeda, M. Expression analyses of caspase-1 and related activities in the midgut of Galleria mellonella during metamorphosis. Insect Mol Biol. 21, 247-256 (2012).
- Brassinga, A. K., et al. Caenorhabditis is a metazoan host for Legionella. Cell Microbiol. 12, 343-361 (2011).
- Harding, C. R., et al. Legionella pneumophila pathogenesis in the Galleria mellonella infection model. Infect. Immun. 80, 2780-2790 (2012).
- Harding, C. R., et al. The Dot/Icm effector SdhA is necessary for virulence of Legionella pneumophila in Galleria mellonella and A/J mice. Infect. Immun. 81, 10-1128 (2013).
- Byrne, B., Swanson, M. S. Expression of Legionella pneumophila virulence traits in response to growth conditions. Infect. Immun. 66, 3029-3034 (1998).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis. J. Vis. Exp. , e4392 (2012).
- Suter, T. M., Viswanathan, V. K., Cianciotto, N. P. Isolation of a gene encoding a novel spectinomycin phosphotransferase from Legionella pneumophila. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 1385-1388 (1997).
- Hilbi, H., Segal, G., Shuman, H. A. Icm/dot-dependent upregulation of phagocytosis by Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 42, 603-617 (2001).
- Watarai, M., et al. Legionella pneumophila is internalized by a macropinocytotic uptake pathway controlled by the Dot/Icm system and the mouse Lgn1 locus. J. Exp. Med. 194, 1081-1096 (2001).
- Santic, M., Asare, R., Doric, M., Abu Kwaik, Y. Host-dependent trigger of caspases and apoptosis by Legionella pneumophila. Infect. Immun. 75, 2903-2913 (2007).
- Weber, S. S., Ragaz, C., Reus, K., Nyfeler, Y., Hilbi, H. Legionella pneumophila exploits PI(4)P to anchor secreted effector proteins to the replicative vacuole. PLoS Pathog. 2 (4), e46 (2006).
- Luo, Z. Q., Isberg, R. R. Multiple substrates of the Legionella pneumophila Dot/Icm system identified by interbacterial protein transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 841-846 (2004).
- Alli, O. A., et al. Temporal pore formation-mediated egress from macrophages and alveolar epithelial cells by Legionella pneumophila. Infect. Immun. 68, 6431-6440 (2000).
- Elliott, J. A., Winn, W. C. Treatment of alveolar macrophages with cytochalasin D inhibits uptake and subsequent growth of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 51, 31-36 (1986).
- Cirillo, S. L., Yan, L., Littman, M., Samrakandi, M. M., Cirillo, J. D. Role of the Legionella pneumophila rtxA gene in amoebae. Microbiology. 148, 1667-1677 (2002).
- Ridenour, D. A., Cirillo, S. L., Feng, S., Samrakandi, M. M., Cirillo, J. D. Identification of a gene that affects the efficiency of host cell infection by Legionella pneumophila in a temperature-dependent fashion. Infect. Immun. 71, 6256-6263 (2003).
- Samrakandi, M. M., Cirillo, S. L., Ridenour, D. A., Bermudez, L. E., Cirillo, J. D. Genetic and phenotypic differences between Legionella pneumophila strains. J. Clin. Microbiol. 40, 1352-1362 (2002).
- Lomma, M., et al. The Legionella pneumophila F-box protein Lpp2082 (AnkB) modulates ubiquitination of the host protein parvin B and promotes intracellular replication. Cell. Microbiol. , (2010).
- Champion, O. L., et al. Galleria mellonella as an alternative infection model for Yersinia pseudotuberculosis. Microbiology. 155, 1516-1522 (2009).
- Banville, N., Browne, N., Kavanagh, K. Effect of nutrient deprivation on the susceptibility of Galleria mellonella larvae to infection. Virulence. 3, 497-503 (2012).
- Qayum, A. A., Telang, A. A protocol for collecting and staining hemocytes from the yellow fever mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. , e2772 (2011).
- Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J. Vis. Exp. , e4173 (2012).
- Garcia-Garcia, E., Garcia-Garcia, P. L., Rosales, C. An fMLP receptor is involved in activation of phagocytosis by hemocytes from specific insect species. Dev. Comp. Immunol. 33, 728-739 (2009).
- Bogus, M., Scheller, K. Allatotropin released by the brain controls larval molting in Galleria mellonella by affecting juvenile hormone synthesis. Int. J. Dev. Biol. 40, 205-210 (1996).
- Chang, B., Kura, F., Amemura-Maekawa, J., Koizumi, N., Watanabe, H. Identification of a novel adhesion molecule involved in the virulence of Legionella pneumophila. Infect. 73, 4272-4280 (2005).
- Cianciotto, N. P. Many substrates and functions of type II secretion: lessons learned from Legionella pneumophila. Future Microbiol. 4, 797-805 (2009).
- Aurass, P., et al. The Legionella pneumophila Dot/Icm-secreted effector PlcC/CegC1 together with PlcA and PlcB promotes virulence and belongs to a novel zinc metallophospholipase C family present in bacteria and fungi. J. Biol. Chem. , (2013).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glockner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
- Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J. Insect. Physiol. 57, 231-245 (2011).
