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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Uso di Published: November 22, 2013 doi: 10.3791/50964
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for Molecular Bacteriology and Infection, Imperial College London

Summary

La larva di tarma della cera Galleria mellonella è stato recentemente stabilito come un modello in vivo per studiare l'infezione da Legionella pneumophila. Qui, dimostriamo tecniche fondamentali per caratterizzare la patogenesi della Legionella nelle larve, tra cui l'inoculazione, la misurazione della virulenza batterica e la replica così come l'estrazione e l'analisi delle hemocytes infetti.

Abstract

Legionella pneumophila, l'agente eziologico della polmonite grave chiamata malattia del legionario ', è un importante agente patogeno umano che infetta e replica all'interno dei macrofagi alveolari. La sua virulenza dipende dal sistema Dot / Icm di secrezione di tipo IV (T4SS), che è essenziale per stabilire una replica vacuolo permissiva conosciuta come la Legionella contenente vacuolo (LCV). L. infezione pneumophila può essere modellato in topi tuttavia la maggior parte ceppi di topi non sono permissive, che porta alla ricerca di modelli nuovi di infezione. Abbiamo recentemente dimostrato che le larve della tarma della cera Galleria mellonella sono adatti per le indagini di L. infezione pneumophila. G. mellonella viene più utilizzato come modello di infezione per patogeni umani ed esiste una buona correlazione tra virulenza di diverse specie batteriche nel insetti e nei modelli di mammifero. Una componente chiave delle difese immunitarie del larve sono hemocytes, professioneAL fagociti, che occupano e distruggono gli invasori. L. pneumophila è in grado di infettare, formare un LCV e replicarsi all'interno di queste cellule. Qui mostriamo protocolli per l'analisi L. pneumophila virulenza in G. modello mellonella, compreso il modo di crescere infettive L. pneumophila, pretrattare le larve con inibitori, infettare le larve e come estrarre cellule infette per la quantificazione e la microscopia a immunofluorescenza. Abbiamo anche descritto come quantificare replicazione batterica e fitness in saggi di concorrenza. Questi approcci consentono il rapido screening di mutanti per determinare i fattori importanti in L. pneumophila virulenza, descrivendo un nuovo strumento per aiutare la nostra comprensione di questo complesso patogeno.

Introduction

Modelli animali di infezione sono stati indispensabili per la determinazione dei fattori di virulenza batterica. Tuttavia, i modelli di invertebrati hanno acquisito maggiore attenzione come una valida alternativa ai modelli tradizionali di mammiferi di infezione. Le larve del lepidottero della cera, Galleria mellonella viene sempre più utilizzato per studiare una serie di importanti patogeni umani, compresi Gram-positivi 1 e Gram-negativi batteri 2,3 e numerosi funghi patogeni 4,5. Utilizzando un modello insetto ha un numero di vantaggi rispetto ai modelli tradizionali di mammifero, come un invertebrato, G. mellonella non è soggetto alle limitazioni etiche dei modelli mammiferi. Inoltre, le larve possono essere facilmente mantenuta, infettato da iniezione senza anestesia, subisce pretrattamento con inibitori chimici 6 e sostenere incubazione a 37 ° C 7. È interessante notare che una buona correlazione tra la patogenicità di vari microrganismi in G. mellonella e modelli di mammiferi di infezione è stata stabilita 2,8. La maggiore comprensione del sistema immunitario di G. mellonella ha anche assistito nella caratterizzazione di questo organismo modello. Anche se gli insetti non hanno un sistema immunitario adattativo come si trova nei mammiferi, hanno difese cellulari e omerali sofisticate, compresa la produzione di peptidi antimicrobici 9. Emociti sono il principale mediatore di difese cellulari e sono il tipo di cellule più presenti trovato emolinfa (o sangue) di G. mellonella 10, Queste cellule sono fagociti professionali e svolgono funzioni simili a macrofagi e neutrofili sia riprendendo e degradante batteri in un fago-lisosomiale vano 10,11 e formando noduli intorno batteri invasori, limitando fisicamente replicazione batterica 12.

Legionella pneumophila è un patogeno respiratorio che provoca gravi pneumoniuna (malattia del legionario) in popolazioni sensibili come gli anziani o immunocompromessi 13. Legionella si trova ubiquitariamente in sorgenti d'acqua sia ambientali e antropiche, dove è un agente patogeno di varie specie di amebe acqua fresca 14,15. Legionella sopravvive e replica all'interno di questi fagociti professionali utilizzando un complesso multi-proteina nota come il Dot / Icm (difettoso nella tratta organello / moltiplicazione intracellulare) tipo 4 sistema di secrezione (T4SS) di traslocare oltre 275 proteine ​​effettrici nella cellula ospite 16-20. Queste proteine ​​servono a sovvertire le normali vie fagociti cellula ospite, che porta alla creazione della Legionella contenente vacuolo (LCV). La LCV evita la fusione con i lisosomi e invece recluta reticolo endoplasmatico (ER) vescicole-derivato, conseguente in un vano specializzato che assomiglia alla ER ruvido 21,22. L. pneumophila è considerato un percorso umano accidentaleogen, le stesse strategie che permettono di replicare all'interno di amebe, permettono anche di replica nei macrofagi alveolari umani 23.

Ospiti mammiferi sono stati caratterizzati come modelli per l'infezione da Legionella umana, tra cui topi e cavie 24,25. Tuttavia, la maggior parte dei ceppi di topi sono resistenti alla infezione da Legionella 26 ad eccezione del inbred albino A / mouse J, che sviluppa un lieve, autolimitante infezione 24. Sebbene il modello cavia più simile malattia umana 25, la mancanza di mutanti e maggiori costi scoraggia l'uso di 27. Inoltre, diversi modelli di invertebrati sono stati sviluppati per l'infezione da Legionella pneumophila compresi Caenorhabditis elegans 28, Drosophila melanogaster 29 e diverse specie di amebe 30-32. Tuttavia, questi modelli hanno punti deboli, virulenza in C. elegans 28, limitando l'utilità di questo modello. Il modello Drosophila è dimostrato efficace nelle indagini virulenza batterica Fattori 29 e sembra essere promettente però, questo modello non è stato pienamente caratterizzato. Amebe unicellulari sono gli ospiti ambientali di L. pneumophila e sono ideali per studiare l'azione dei fattori di virulenza a livello molecolare 33 mancano tuttavia alcuni importanti mediatori della risposta cellula ospite di mammifero di infezione come caspasi 34. Le carenze dei modelli esistenti, insieme con il costo elevato e le preoccupazioni etiche relative alla sperimentazione dei mammiferi, ha portato alla ricerca di altri appropriati organismi modello 29,35.

Abbiamo recentemente dimostrato che G. mellonella è un modello adatto a L. pneumophila patogenesi 36,37. Dettagli Questo protocollo tecniche sperimentali utilizzate per infettareing G. mellonella larve, analizzando la moralità larvale, estrazione hemocytes per il conteggio e immunofluorescenza e determinare replica valida CFU risiedono da larve infette.

Protocol

1. Preparazione di L. pneumophila per infezione

  1. Preparare carbone estratto di lievito (CYE) piastre (carbone 2 g / L attivato, estratto di 10 g / L di lievito, 13 g / L di agar, 10 g / L N-(2-acetammido)-2-aminothanesulfonic acido (ACE), 1 g / L α-chetoglutarato, 0,4 g / L di L-cisteina HCl e 0,25 g / L pirofosfato ferrico, pH 6,9).
    Nota: Se necessario, aggiungere kanamicina (25 mcg / ml) e / o cloramfenicolo (6 mg / ml) per CYE piastre.
    1. Eseguire tutti L. lavoro pneumophila a livello di biosicurezza di contenimento 2 (BSL-2) in una cappa di sicurezza microbiologica (MSC) nel rispetto delle norme locali.
  2. Streak L. pneumophila da -80 ° C scorte di glicerolo su piastre CYE
  3. Incubare le piastre per 4 giorni a 37 ° C.
    Nota: L'incubazione delle piastre per 4 giorni aumenta significativamente la virulenza di L. pneumophila in G. mellonella sopra incubazione per 3 giorni.
  4. Un giorno prima dell'infezione, risospendere uno fu cicloll di batteri (contenente diverse colonie) in 1 ml di preriscaldata (37 ° C) ACES estratto di lievito (AYE) brodo e misurare l'assorbanza a 600 nm (OD 600) utilizzando uno spettrofotometro.
  5. Seminare una nuova cultura da 3 ml AYE (con antibiotici se necessario) per un diametro finale 600 0.1.
    1. Include un supporto solo controllare per garantire la sterilità dei media.
  6. Incubare a 37 ° C in un incubatore agitazione a 200 rpm per 21 hr.
    Nota: I batteri dovrebbero essere coltivate a fase post-esponenziale per l'infezione 38. In crescita per 21 ore consente esperimenti di essere standardizzati.
    Nota: Se richiesto per l'induzione di proteine, aggiungere 0,5 mm isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) durante la notte.
  7. Misurare il diametro esterno 600 (batteri dovrebbero essere in fase di crescita post-esponenziale, OD 600 2,5-3).
  8. Diluire coltura batterica che invia 1 x 10 9 UFC / ml in tampone fosfato sterile Dulbecco (D-PBS).
    Appunto: In base ai risultati precedenti, un OD 600 di 1 corrisponde a 1 x 10 9 UFC / ml, tuttavia questo dovrà essere confermato per differente L. ceppi pneumophila.
    Nota: se è necessaria l'induzione di una proteina da un plasmide, aggiungere 1 mM di IPTG al inoculo.
  9. Piatto l'inoculo come descritto nella sezione 9 come controllo per garantire l'atteso CFU è presente nel inoculo.

2. Preparazione delle larve

  1. Acquistare sufficiente G. mellonella larve da un fornitore commerciale. Le larve vengono spediti allo stadio 5 ° o 6 ° instar (approssimativamente tra i 2-3 cm di lunghezza) e sono adatti per l'uso immediato.
    Nota: Un metodo che descrive come larve posteriore è stato descritto in precedenza 39.
    Nota: Le larve può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di due settimane e non richiedono cibo. Eliminare immediatamente qualsiasi larve che presentano segni di impupamento.
  2. Preparare il contenitore per larva da placzione un cerchio di carta da filtro 10 cm sul fondo di un piatto 10 centimetri Petri.
  3. Utilizzando una pinzetta a punta smussa, collocare dieci sano larve di dimensioni approssimative di simile nella piastra di Petri.
    Nota: Eliminare insalubri di colore marrone o macchie in cerca di insetti. Larve sane sono uniformemente crema colorata senza zone di macchie scure e sono in grado a destra se stessi rapidamente se capovolta.

3. Infezione di G. mellonella larve

  1. Preparare la piattaforma di iniezione con nastro adesivo un cerchio di carta da filtro alla superficie.
  2. Saldamente nastro una punta P1000 orizzontalmente per la carta da filtro per creare una piattaforma di iniezione. Ciò non deve essere sterile.
  3. Sterilizzare una siringa microtitolazione 20 microlitri aspirando il 70% di etanolo e incubando per almeno 10 min.
    1. Indossare guanti puntura prova durante l'iniezione,
  4. Rimuovere eventuali residui di etanolo aspirando ed espellendo acqua sterile diverse volte.
  5. Using la siringa, aspirare 10 ml di L. pneumophila 1 x 10 9 sospensione CFU / ml.
  6. Prendere una larva e delicatamente ma con fermezza accenderlo sua schiena, chinò la punta P1000.
  7. Posizionare la punta della siringa sulla parte anteriore, destra proleg delle larve.
  8. Delicatamente, inserire la punta dell'ago nel proleg, assicurandosi che sia dentro le larve, e senza intoppi iniettare tutto il contenuto della siringa.
    Nota: se la siringa è inserita correttamente, dovrebbe essere possibile per raccogliere le larve utilizzando solo la siringa per posizionarlo nella camera.
    1. Dopo l'iniezione, osservare le larve per alcuni secondi. Le larve inizierà a gattonare dopo un paio di secondi, ma non dovrebbe espellere fluido.
  9. Osservare brevemente le larve poche ore dopo l'infezione, infezione con 10 7 CFU L. pneumophila 130b non causa alcun sintomo entro il primo 5-8 ore pi Pertanto, se le larve si stanno rivolgendo grigio / nero prima di questo punto, tegli esperimento deve essere interrotto.
    Nota: Inoculo delle larve con 1 mM IPTG non influenza la vitalità larvale nel corso dell'esperimento.
  10. Allo stesso modo, iniettare un totale di 10 larve per condizione di cui 10 larve iniettato con D-PBS per servire come controllo per analizzare la mortalità larvale.
  11. Tape Petri chiusi e posto in contenimento secondario.
  12. Incubare in un incubatore batterica normale a 37 ° C, per tutta la durata dell'esperimento.

4. Il pretrattamento di larve con un inibitore chimico

  1. Prima dell'infezione, preparare larve iniettabile come descritto nella sezione 3.1-3.6.
  2. Iniettare 10 ml di una soluzione di Citocalasina D 100 pM nella parte anteriore, sinistra proleg di 10 larve.
    Nota: Inhibitor viene iniettato in una proleg diverso da sospensione batterica per ridurre le lesioni alle larve.
  3. Iniettare 10 ml di DMSO in 10 larve come controllo.
  4. Incubare larve a37 ° C per 4 ore.
  5. Iniettare larve pretrattato come descritto nella sezione 3, nella parte anteriore, giusto Proleg sia con 1 x 10 7 CFU di WT L. pneumophila o un controllo PBS.

5. Analisi della mortalità larvale

  1. A 18 ore dopo l'infezione (pi), esaminare tutte le larve infette per la mortalità.
  2. Per verificare la mortalità, utilizzare una pinzetta a punta smussa per girare le larve e cercare il movimento delle gambe, larve sane dovrebbe raddrizzare stessi rapidamente. Pigmentazione indica una forte reazione immunitaria alle infezioni. Se non vi è alcun movimento, contano come vivo.
  3. Numero record di larve morti e vivi.
  4. Ripetere questo processo in tutti gli altri punti temporali scelti.
    Nota: Se l'incubazione è continuata per più di tre giorni, pupe può essere visto. Rimuovere eventuali pupe e eutanasia mediante congelamento a - 20 ° C prima metamorfosi può accadere.

6. Estrazione di emolinfa

  1. Casualmente selezionare trelarve e posto in una provetta 14 ml in momenti scelti come 5 e 18 ore pi,
  2. Posizionare questo tubo in ghiaccio per 5-10 minuti, finché si osserva alcun movimento delle gambe delle larve.
  3. Collocare le larve anestetizzato su un piatto Petri e, utilizzando un bisturi praticare un'incisione tra due segmenti vicino alla coda delle larve.
  4. Spremere le larve in una sterile provetta da centrifuga da 1,5 ml per raccogliere l'emolinfa.
    1. Pool emolinfa da almeno tre persone. Un larve dà tra 15-50 ml di emolinfa a seconda delle dimensioni.
      Nota: Durante l'estrazione emolinfa è molto facile da interrompere l'intestino, con conseguente potenziale contaminazione dei campioni. Ridurre la contaminazione tagliando le larve vicino alla coda (distanti dall'intestino) Tuttavia, la selezione antibiotica sarà sempre necessaria quando placcatura i batteri.
      Nota: per evitare emolinfa di imbrunimento e coagulante, processo emolinfa entro 10 minuti dopo la raccolta.
  5. Eliminare il corpo larvale in un nuovo 14 ml tubo Falcon, tenuta e posto a - 20 ° C durante la notte per assicurarsi le larve sono morti.
  6. Autoclave larve morte e smaltire secondo le normative locali.

7. Determinazione del hemocyte Viabilità

  1. Estrarre emolinfa come descritto sopra.
  2. Mescolare 20 ml di emolinfa estratto con 20 ml di 0,02% (v / v) Trypan blu in PBS in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
  3. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  4. Carico 10 ml di emolinfa su un emocitometro e contare (non blu) cellule vitali.
  5. Contare ciascun campione in triplicato per ridurre l'errore.

8. Il trattamento dei Estratte ematociti concentrati per immunofluorescenza microscopia

  1. Mescolare la emolinfa pool estratto da almeno tre larve e pipetta su un vetrino di vetro 10-15 mm in una piastra da 24 pozzetti.
    Nota: Coprivetrini non richiedono trattamento hemocytes può aderire al vetro.
  2. Aggiungere 0,5 ml di D-PBS e mescolare bene pipettando su e giù.
  3. Centrifugare la piastra per 10 min a 500 xg a temperatura ambiente (RT) con un portatarga centrifuga a tenuta di aerosol.
  4. Esaminare ciascun pozzetto utilizzando un microscopio invertito per verificare che le emociti hanno aderito.
  5. Rimuovere il surnatante e lavare accuratamente le cellule tre volte con l'aggiunta di 0,5 ml di D-PBS alla parete del pozzo, dondolo piastra 2-3x e rimuovendo il D-PBS con una pipetta.
  6. Fissare le cellule mediante aggiunta di 0,5 ml di 4% (v / v) paraformaldeide (PFA) in PBS.
  7. Incubare le cellule per 20-30 minuti a temperatura ambiente.
  8. Lavare le cellule tre volte con D-PBS, come prima.
  9. Aggiungere 0,5 ml di 15 mM NH 4 Cl in PBS per estinguere residuo PFA e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
  10. Lavare le cellule tre volte con D-PBS.
    Nota: In questa fase, i coprioggetti possono essere conservati per una notte a 4 ° C.
  11. Aggiungere 0,5 ml di 0,1% Triton X-100 in PBS e incubare per 5 min a temperatura ambiente per permeabilize cellule. Blocco per 1 ora con una soluzione bloccante (2% (w / v) di BSA in PBS).
  12. Incubare per 1 ora a RT al buio con l'anticorpo primario diluito in soluzione bloccante alla diluizione specificata dal costruttore.
  13. Lavare 3x con PBS.
  14. Incubare per 1 ora con l'anticorpo secondario e DAPI per la visualizzazione di batteri come sopra.
  15. Lavare 3x con PBS.
  16. Montare i vetrini utilizzando una goccia di reagente montaggio su vetrini.
  17. Incubare per una notte al buio a temperatura ambiente per asciugare completamente la soluzione di montaggio.
  18. Immagine scorre su un microscopio a fluorescenza.

9. Quantificazione dei batterica CFU

  1. Aggiungere 100 mg / ml spectinomicina per CyE piastre per evitare la contaminazione da flora intestinale. L. ceppo pneumophila 130b è naturalmente resistente a spectinomicina 40.
  2. Prima estrazione emolinfa, pesa 1,5 ml provette da centrifuga.
  3. Estrarre emolinfa come descritto nella sezione 6 e mettere in pesato tUBE, aggiungere 1 ml di 5 mg / ml digitonina, mescolare bene e incubare per 5 minuti a RT per la lisi hemocytes.
  4. Pesare il tubo con emolinfa e determinare il peso di emolinfa estratto.
  5. Eseguire dieci diluizioni seriali piega del emolinfa nei media AYE sterile.
  6. Utilizzando una penna, dividere la base di una piastra CYE in sei settori uguali ed etichetta.
  7. Piastre tre gocce di 25 pl di ciascuna diluizione (a partire dal più diluito) in ciascuna sezione della piastra.
  8. Incubare le piastre con i coperchi Upmost notte a 37 ° C.
  9. Una volta che le gocce si sono asciugati completamente, girare la piastra sopra e incubare a 37 ° C per almeno altri due giorni.
  10. Quantificare i batteri estratti per conteggio delle colonie ad ogni diluizione e normalizzare il peso di emolinfa estratto.

10. Determinazione del Competitive Index (CI)

  1. Verificare che entrambi i ceppi crescono altrettanto bene in brodo di coltura e su piastre di agar CYE prior per tentare l'indice competitivo.
  2. Preparare sospensioni batteriche mutanti resistenti WT o kanamicina come descritto nella sezione 1 e mescolare in un rapporto di 1:1.
    1. Diluizioni seriali Piatto della inoculo sulla CYE spectinomicina (100 pg / ml) e CYE spectinomicina / kanamicina
  3. Infettare le larve ed estratto di emolinfa in momenti opportuni, come sopra descritto.
  4. Determinare la conta estraendo emolinfa e placcatura diluizioni seriali su CYE spectinomicina e CYE spectinomicina / kanamicina.
  5. Calcolare l'indice competitivo (CI) come segue: CI = (uscita mutante / uscita WT) / (inoculo mutante / WT inoculo).

Representative Results

Qui si dimostra che G. mellonella è un modello adeguato, facile da usare per studiare L. infezione pneumophila. In precedenza è stato dimostrato che L. pneumophila virulenza di macrofagi, amebe e modelli di mammifero è dipendente dalla presenza del sistema di secrezione Dot / Icm 41-43. G. mellonella larve sono stati infettati come descritto sopra e la virulenza del tipo selvatico (WT) e un ceppo Dot / Icm-carenti rispetto. Infezione da 10 7 CFU di L. ceppo pneumophila 130b provocato 100% di mortalità entro 24 ore dopo l'infezione (pi). Tuttavia, la L. ceppo pneumophila Δ DotA, che non ha un sistema di secrezione Dot / Icm T4SS funzionale, era avirulent in questo saggio (Figura 1). Ciò dimostra che L. pneumophila virulenza in G. mellonella dipende dalla traslocazione di effettori Dot / Icm, rende questo modello adatto per la caratterizzazione dila funzione di queste proteine.

Recentemente, è stato dimostrato che l'inibizione della fagocitosi mediante trattamento citocalasina aumentato il susceptibly delle larve alle infezioni da lievito Candida albicans 6. Come L. pneumophila è un patogeno intracellulare, è stato deciso di determinare se l'assorbimento dei batteri è fondamentale nella sua patogenesi in questo modello. Le larve sono stati pretrattati con 10 ml di 100 mM Citocalasina D (CyD) per 4 ore a 37 ° C, poi infettato con 10 7 UFC di WT L. pneumophila 130b e la mortalità monitorati a 24 ore pi Il trattamento con il solo inibitore non hanno influenzato la sopravvivenza delle larve. Tuttavia, pretrattati, larve infette visualizzato significativamente maggiore sopravvivenza (P = 0.0066, spaiato T-test) rispetto al DMSO-trattati, insetti infettate (Figura 2). L'effetto del trattamento CyD stata abolita per 48 hr pi (risultati non mostrati), che può essere dovuto al emivita del farmaco in G.mellonella. Ciò dimostra che l'assorbimento di L. pneumophila in G. mellonella emociti è un aspetto cruciale della virulenza batterica.

Per convalidare espressione e determinare la localizzazione subcellulare di una proteina effettore in G. mellonella, hemocytes sono stati estratti ed elaborati per la microscopia di immunofluorescenza. Le larve sono stati infettati con WT e Δ DOTA L. pneumophila 130b esprimere un frammento della effettrici T4SS ben definito, SIDC 41-918, fusa a 4 tag N-terminale HA. Questo attuatore è stato dimostrato di impegnare la LCV tramite un dominio phosphoinositide-4-fosfato vincolante 44. Utilizzando anti-HA (rosso) e anti-Legionella anticorpi (verde), 4HA-SIDC 41-918 localizzato al LCV in hemocytes infetti (Figura 3). Questa localizzazione è stato precedentemente mostrato nella discoideum amebe Dictyostelium e in macrofagi mammiferi 44,45 confermando il comparability di questo modello.

L'importanza delle proteine ​​di virulenza è solitamente determinata confrontando la cinetica di crescita di tipo selvatico e batteri mutanti. Per seguire la cinetica di replicazione batterica nel corso dell'infezione, tre larve sono stati sacrificati in ogni momento (0, 5, 18, e 24 ore pi), l'emolinfa raccolto e combinato e la CFU/0.1g di emolinfa estratto determinata. Dopo un tuffo iniziale a 5 ore pi, il CFU di batteri WT aumenta fino a 24 ore pi tuttavia, il ceppo Δ dota subisce alcuna replica e viene azzerato a 18 ore pi (Figura 4).

La capacità di L. pneumophila di provocare la lisi dei macrofagi in modo T4SS-dipendente è stata a lungo documentato 46, tuttavia esistono studi simili sono stati condotti in vivo. La concentrazione di emociti circolanti è stato fissato al 5, 18, e 24 ore pi larve sono stati infettati con WT o Δ (Figura 5). Tuttavia, a 18 ore pi c'è stato un calo significativo della concentrazione hemocyte in WT, ma non Δ DotA, larve infetti. Questa differenza persisteva a 24 ore pi Il calo numero hemocyte, combinata con la presenza di batteri intracellulari come visto da immunofluorescenza, suggerisce che L. pneumophila si replica all'interno hemocytes poi lisa, permettendo ai batteri di sottoporsi a diversi cicli di replica.

Figura 1
Figura 1. Infezione da L. pneumophila induce Dot / Icm-dipendente della mortalità larvale. del 10 larve sono stati infettati con PBS da solo o 10 Dota L. pneumophila 130b, incubate a 37 ° C per 72 ore e il tempo della morte delle larve registrato. Tutte le larve infettati con il WT ceduto alle infezioni entro 24 ore dopo l'infezione (pi), ma non la mortalità è stata osservata in larve inoculate con solo PBS o il ceppo Δ dota. I risultati sono la media di tre esperimenti separati, ± deviazione standard.

Figura 2
Figura 2. La mortalità dipende internalizzazione batterica. 10 L. pneumophila larve sono stati pretrattati con 10 ml di 100 mM Citocalasina D (CyD) per 4 ore a 37 ° C e poi infettate con 10 7 WT e mortalità monitorata a 24 ore pi larve pretrattato dimostrato significativamente (P = 0.0066, T-test non accoppiato) ridotto mortalità. Risultati rappresentano la MEAn di a quattro esperimenti indipendenti ± deviazioni standard con 10 larve per condizione.

Figura 3
Figura 3. Immunofluorescenza di imaging di proteine ​​effettrici in hemocytes estratti. Ematociti concentrati sono stati estratti da larve infettati con L. pneumophila 130b WT o Δ Dota esprimere 4HA-SIDC 41-918 a 5 celle pi hr sono state colorate con anti-HA (rosso) e anti-Legionella anticorpi (verde) e macchia DNA DAPI (blu) per visualizzare i nuclei. 4HA-SIDC 41-918 è stato osservato WT circostante, ma non Δ DotA, batteri. Barra della scala 5 micron.

Figura 4
Figura 4. L. pneumophila si replica all'interno di G. melloNella in maniera Dot / Icm-dipendente. larve sono stati infettati con pneumophila WT o Δ DotA L. e a 0, 5, 18, ​​e 24 ore pi emolinfa da tre insetti infetti pool, placcato su piastre CYE e CFU determinata e normalizzata per l'inoculo e al peso di emolinfa estratto. WT L. pneumophila replicato nel corso dell'esperimento, mentre il ceppo Δ DOTA viene liberata entro 18 hr pi risultati sono la media di tre esperimenti separati ± deviazione standard.

Figura 5
Figura 5. Infezione da WT L. risultati pneumophila in significativa distruzione hemocyte. ematociti concentrati sono stati estratti a 5, 18, ​​e 24 ore pi da larve infettati con pneumophila WT o Δ DotA L. e cellule vitali contate con un emocitometro. Nessuna differenza nellanumero di cellule è stato osservato a 5 ore pi tra i ceppi però a 18 ore pi solo circa il 15% di emociti rimangono in larve infettate con il ceppo WT rispetto al ceppo Δ dota. I risultati sono la media di tre esperimenti separati, ± deviazione standard.

Discussion

Modello larvale La Galleria mellonella per l'infezione da Legionella pneumophila è uno strumento utile per studi in vivo di patogenesi. Qui è dimostrato che un numero di aspetti di infezione di macrofagi può essere riassunta nella G. modello mellonella, compreso il ruolo del Dot / Icm T4BSS in virulenza e la replicazione batterica e la localizzazione della Dot / Icm-effector SIDC. Inoltre, abbiamo dimostrato che un inibitore chimico di polimerizzazione riduce significativamente la mortalità larvale, imitando i risultati ottenuti in macophages 47 e elementi di prova che l'internalizzazione dei batteri è necessaria per provocare la mortalità larvale. In precedenza, è stato dimostrato che le variazioni di virulenza tra L. ceppi pneumophila visto in altri modelli di infezione possono essere verificate in G. è necessario mellonella e che l'induzione di fattori di virulenza in fase di crescita post-esponenziale per la virulenza batterica G. mellonella è un modello adatto a L. infezione pneumophila.

Determinazione del CFU di L. pneumophila da larve infetti singolarmente o in infezioni miste aumenta notevolmente l'utilità del modello. In precedenza, diversi fattori sono stati scoperti che hanno effetti sottili sulla replicazione batterica in uno o più modelli di infezione 29,48-51. Sebbene le larve non possiedono un sistema immunitario adattativo, la presenza della risposta immunitaria innata fornisce selezione più forte rispetto alla sola macrofagi, che possono servire per amplificare fenotipi sottili. Pertanto, è possibile che, mentre questi ceppi probabilmente non influenzare significativamente la mortalità larvale, possono dimostrare diminuita replicazione batterica o idoneità in G. modello mellonella. Così come replica di L. pneumophila nelle larve, abbiamo dimostrato significativa deplezione hemocyte tardi infezione. Come L.pneumophila è previsto per lisare cellule ospiti al termine del suo ciclo di replica, misurando hemocyte esaurimento può anche servire come una misura indiretta della replicazione batterica. Hemocyte esaurimento precedentemente è stato correlato con la mortalità degli insetti in infezione 3,52, anche se i risultati recenti suggeriscono che questo quadro è più complesso di prima belived 37. Recentemente, è stato dimostrato che la fame di larve porta ad una maggiore suscettibilità alle infezioni attraverso una soppressione delle risposte immunitarie 53. Nei saggi qui descritti, non larve sono state alimentate per tutta la durata dello studio e non si sa quanto bene larve Fed rispondere agli L. infezione pneumophila.

Uno dei vantaggi di G. mellonella come organismo modello è la facilità di estrazione e quantificazione di emociti di larve infetti. Video precedenti hanno indicato vari metodi per l'estrazione hemocytes dagli insetti 54,55 invece, l'ha incontratohod presentato qui è semplice e adatto per l'elaborazione immediata. Una volta estratto, hemocytes può essere facilmente quantificato, utilizzato per immunofluorescenza, microscopia elettronica a trasmissione 36 o citometria a flusso 56 o colta e infettati ex vivo 3 permettendo la risposta delle cellule all'infezione da indagare in dettaglio. Ciò aumenta notevolmente la flessibilità del modello. Un avvertimento a immunofluorescenza in G. mellonella è la limitata offerta di anticorpi convalidati contro G. proteine ​​mellonella. Tuttavia, gli studi hanno dimostrato la creazione di anticorpi contro le proteine ​​larvali 57 e gli anticorpi contro le proteine ​​del sistema immunitario legati umani sono stati trovati a riconoscere G. proteine ​​mellonella 11 dimostrano il potenziale di immunofluorescenza su G. hemocytes mellonella.

La facilità di G. infezione mellonella consente rapide schermi, medie di throughput che potrebberoessere utilizzato per confrontare la virulenza di varie specie e ceppi di Legionella e potrebbe essere utilizzato per analizzare ulteriormente fattori di virulenza precedentemente identificati come molecole di adesione 58 o il sistema di secrezione di tipo 2 59 che sono necessari per la virulenza in altri modelli. Inoltre, l'uso di questo modello permetterà l'identificazione e l'ulteriore caratterizzazione di nuovi fattori di virulenza tra cui proteine ​​effettrici secrete e traslocati. Recentemente, è stato dimostrato che l'attività della fosfolipasi C di L. pneumophila ha un ruolo nel G. mellonella virulenza 60 e che è necessaria la effettrici proteina Dot / Icm SDHA per la virulenza 37. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che esiste una correlazione tra i fenotipi osservati in G. mellonella e nel topo ceppo A / J 37.

Questo sottolinea il valore di questo strumento per integrare protozoo ambientale e di accoglienza unicellulari e murimodelli di infezione ne. Il G. modello mellonella diventerà ancora più prezioso in futuro, una volta che la sequenza genomica larvale sarà disponibile e sono stabiliti gli strumenti più genetiche. Passi in questa direzione includono la recente pubblicazione in dettaglio il sistema immunitario legati trascrittoma 61 e la formazione di una iniziativa per avanzare silenziamento genico in Lepidotteri spp 62.

Utilizzando G. mellonella larve, abbiamo una serie di semplici, rapide letture di virulenza batterica che possono essere utilizzati per studiare la patogenesi di L. pneumophila. Istituzione di questi saggi e più ampia proiezione di L. ceppi pneumophila sierogruppi e aumenterà l'utilità di questo nuovo strumento e contribuiranno alla nostra comprensione di L. pneumophila patogenesi.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

CR Harding è stato sostenuto dalla studentship WT086724 Wellcome Trust.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material/ Equipment
ACES yeast extract (AYE) broth 4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g α-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution*
*add sterile ingredients after autoclaving
Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar
Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate) Sigma P6526 0.6 mM solution, sterile filtered
Sterile cysteine solution Sigma C7880 3.3 mM solution, sterile filtered
G. mellonella (waxworms) Livefood UK W250
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC) Sigma H9037
Anti-Legionella LPS Cambridge Biosciences PA1-7227
Anti-Rabbit IgG Alexa488 Jackson Immunoreach 711-485-152
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma I6758
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS) Sigma D8662
Paraformaldehyde Agar Scientific R1026
Ammonium chloride (NH4Cl) Sigma A9434
Trypan Blue solution Sigma T8154
Digitonin Sigma D141
Cytochalasin D Biomol International BML-T109-0001
Name Company Catalog Number Comments
Material
Microtiter Syringe Sigma 24544
Cell counter, double, Improved Neubauer VWR 631-0926
Centrifuge For centrifuging plates
Fluorescence microscope Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores
Inverted microscope For viable cell counting
Puncture-proof glove Turtleskin

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Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection. J. Vis. Exp. (81), e50964, doi:10.3791/50964 (2013).

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