Summary
세균의 생물 발광 유전자 카세트를 표현하는 포유 동물 세포 (
Abstract
포유류 세포 기반 생체 분석에 널리 독성 연구를위한 동물 실험의 대안으로 채택되었지만 인해 반딧불 루시 페라 기반 검사 방법의 파괴 특성에 필요하게되는 병렬 샘플 준비의 높은 금융 및 시간 비용으로 인해 제한되어있다 . 이 비디오는 그 화합물의 세포 독성 효과를 모니터링하기위한 저렴하고 손쉬운 방법으로, 루시페린 기판의 파괴적인 추가를 필요로하지 않는 자율적으로 발광 포유 동물 세포의 활용을 설명합니다. 안정적 전체 세균의 생물 발광 (luxCDABEfrp) 유전자 카세트를 표현 포유 동물 세포는 자율적으로 광 신호를 생성하는 외부 에너지 원, 또는 전통적 시료의 파괴에 의한 비용과 가능한 간섭 루시페린 기판, 여기의 첨가없이 490 nm에서 피크 광학 이미징 절차 동안 수행의. 외부 자극으로부터이 독립 결과 신호 만 활성화 신진 대사 감지 될 것을 의미, 전적으로 셀 발광 반응을 유지하기위한 부담을 배치합니다. 발광 생산의 변화가 세포의 성장과 신진 대사에 악영향을 나타내는 때문에이 특성은 럭스 발현 세포주 세포 독성 효과에 대한 biosentinel로 사용하기위한 최상의 후보합니다. 마찬가지로, 필요한 샘플 파괴의 자율적 인 성격과 부족은 독성 물질 노출의 기간 동안 실시간으로 동일한 샘플의 반복 이미징을 허용하고 자동화 된 방식으로 기존 영상 장비를 사용하여 여러 샘플을 통해 수행 할 수 있습니다.
Introduction
그들은 식품 의약청 (Food and Drug Administration) 소비자의 사용이 승인되기 전에 미국에서, 인간의 소비를위한 의약품 및 기타 제품은 광범위한 평가를 필요로합니다. 이 테스트를 수행하기위한 재정 부담이 크게 소비자를위한 비용 증가로 새로운 화합물을 개발하기 때문에 번역의 비용을 증가 개발자 1에 배치됩니다. 이 검사 전통적으로 많은 인간의 호스트에 대한 프록시 역할을하는 동물의 과목을 활용했지만,이 (독극물 / ADME 흡착, 분배, 대사, 배설 및 독성에 연간 소요 추정 2,800,000,000달러로, 큰 재정 부담이 될 입증되었습니다 ) 단독 심사 2과 동물 모델을 안정적으로 인간 학적 반응에게 3 예측할 수없는 것을 제안 증거 확보. 따라서 체외 인간의 세포 배양 기반의 테스트 때문에 상대적으로 지난 20 년 동안 인기를 얻고있다비용, 높은 처리량, 그리고 인간의 생체 이용률 및 독성 4의 좋은 표현입니다. 현재 셀 문화 기반의 독성 스크리닝 방법은 세포 생존에게 5을 평가하기 위해, 세포막의 무결성을 프로빙, 또는 미토콘드리아 활동의 수준을 추적, 내생 가능한 세포질 효소의 활동을 심사, 이러한 ATP 수준의 측정 등 다양한 엔드 포인트를, 고용 6. 측정함으로써 단일 시점의 데이터를 생성, 촬영하기 전에 그러나,에 관계없이 선택된 엔드 포인트의이 방법은 모든 시료의 파괴를 필요로합니다. 결과적으로 많은 양의 샘플은 준비 및 기본 독성 동력학 연구를위한 병렬 처리, 다시 새로운 화합물 개발에 필요한 비용과 노동력에 추가해야합니다. 또한, 사용 분석은 Gaussia 루시 페라 제 7 Vargula 루시 페라 제 8 및 Metridia 루시 페라 제 9과 루시 페라 분비세포 용해에 대한 필요성을 제거하고 엔드 포인트 측정을위한 미디어의 일부만을 필요로하지만, 이들은 여전히 일정 시간 지점에서 샘플링을 제한하고 또한 외생 빛을 활성화 기판의 추가를 필요로하는 개발되었습니다.
필요한 샘플 파괴의 손해뿐만 아니라 기판의 비용을 제거하기 위해를 방지하기 위해, 인간의 세포 라인은 비슷합니다 살아있는 세포를 지속적으로 모니터링 할 수 있도록 전체 세균의 생물 발광 (LUX) 유전자 카세트 (luxCDABEfrp) 표현하는 설계되었습니다 형광 염료 기반의 라이브 셀 이미징하지만, 추가 광자 활성화 및 현미경 조사 절차없이. 이 세포주 따라서 시료의 파괴를 방지, 구조적으로 외부 자극에 대한 필요없이 지속적 직접 검출을위한 광 신호를 생성 할 수 있습니다. 기작이 세포에서 생성되는 발광 신호가 발생의 luxAB 구성된 루시 페라 제 효소는 감소 리보플라빈 인산염의 존재 (FRP 유전자에 의해 FMN에서 재활용 FMNH 2의 긴 사슬 지방산 알데히드 (내생 기판을 사용하여 luxCDE 유전자 산물에 의해 합성 및 재생)의 산화를 촉진시 제품)와 산소 분자 10. 숙주 세포에있는 럭스 카세트의 발현 따라서 생산 세포의 파괴 또는 외인성 기판 추가하지 않고 감지 할 빛을 수 있습니다. 마찬가지로, 럭스 유전자와 내생 사용할 수 FMN, 및 O 2 cosubstrates 및 FMNH 2 FMN의 변환을 지원 할 수있는 환경의 정비에 대한 요구 사이의 상호 작용 결과 생물 발광 신호가 단지 생활에서 감지 할 수 있도록 , 대사 활성 셀.
이러한 요구 사항은 이전에 해당 럭스-BAS를 보여 악용되었습니다ED 발광 출력은 세포 인구 크기 11 그 독성 화합물에 노출 용량 - 반응 패션 12 autobioluminescent 생산을 저해와 강하게 연관시킵니다. 여기에서 우리는 독성 테스트를위한 autobioluminescent 포유 동물 세포의 응용 프로그램을 확인하는 대표적인 예로 알려진 DNA 손상 활동 블레오 마이신 계열의 항생제의 자동 독성 스크리닝을 보여 이전에 특징 autobioluminescent 인간의 배아 신장 (HEK293) 세포 라인 (11)을 사용합니다.
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Protocol
1. 세포의 준비
- 액체 질소 냉동 재고 발광 HEK293 세포의 병을 복구하고 Dulbecco의 수정 이글의 10 % 태아 소 혈청과 보충 배지 (DMEM), 0.01 mM의 불필요한 아미노산, 1X 항생제 항진균 및 T 0.01 밀리미터 나트륨 피루브산에서 그들을 성장 37 75 조직 배양 플라스크 ° C와 5 % CO 2.
참고 : 미디어 및 보조 구성 요소는 세포 라인에 따라 달라질 수 있으므로 그에 따라 선택해야합니다. - 새로 고침 중간마다 도달 할 때까지 2~3일 ~ 80 % 합류.
참고 : 필요한 세포의 양이 실험 설계를 기반으로합니다. 필요한 경우, 더 많은 세포를 계대 배양하여 얻을 수 있습니다. - 테스트를 위해 수확 세포.
- 매체를 제거하고 인산염 세포를 씻어 부드럽게 플라스크를 소용돌이 후 폐기 PBS를 소비하여 식염수 (PBS)를 버퍼.
- 2 분 동안 37 ° C에서 트립신과 부화를 추가또는 셀 때까지 플라스크에서 분리했다.
- PBS에서 분리 된 세포를 수집하고 깨끗한 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다.
참고 : nonadherent 세포 라인을 원심 분리하여 별도의 셀을 사용하고 PBS로 한번 세척하는 경우.
- hemacytometer 또는 다른 세포 계수 시스템을 사용하여 전체 세포 수를 결정합니다.
- 5 분 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 신선한 prewarmed 매체에 세포를 resuspend을.
- 불투명 멀티 웰 플레이트의 각 우물에 세포의 씨앗 같은 수. 이 예에서는, 플레이트 5 × 10 블랙 24 - 웰 플레이트의 각 웰에 1 ML 볼륨에서 5 세포. 판 세중 우물에서 매체의 동일한 볼륨은 대조군 역할을합니다.
참고 : 각 우물에서 도금 세포의 수는 유연하고 개별 실험 최적화 할 수 있습니다. 각 발광 세포 라인에 대한 실험적 세포 수와 biolumi 사이의 관계를 결정nescent 출력뿐만 아니라, 최소 검출 셀은 이전의 모든 독성 시험을 계산합니다. 표준 이미징 조건에서 인구 크기의 넓은 범위 (예를 들어, 1 개의 10월 3일부터 1일까지 X 10 6 세포)에 걸쳐이, 측정 생물 발광을 할 수 있습니다. - 아래에 설명 된대로 시험 화합물 (들)과 세포를 치료.
2. 화학 준비
- 농축 원액으로 테스트되고있는 화학 물질을 준비합니다. 이 예에서는 100 ㎎ / 블레오 마이신 계열의 항생제의 ML 주식 솔루션을 사용합니다.
참고 : 유기 용매가 화학 물질 추가하기위한 수단으로 사용하는 경우 특히, 잠재적 인 차량 기반의 독성을 최소화하기 위해, 그것은 주식 농도가 적어도 1,000 배에서 원하는 포스트 응용 프로그램의 농도 것이 좋습니다. - 직접 세포에 준비된 화학 주식을 추가합니다. 이 예에서는, 복용량 최종 100 농도, 200, 300, 그리고 트라이에서 400 ㎍ / ㎖에서 관심 항생제우물 plicate. 컨트롤로 치료 세포의 세 개의 우물을 남겨주세요.
참고 : 대상 화학 물질의 최종 농도는 특정 실험 목표에 따라 선택해야합니다. 농도의 넓은 범위는 일반적으로 독성 효과의 전체 스펙트럼을 얻기 위하여 시험된다.
3. 이미징 및 데이터 분석
- 즉시 화학 물질뿐만 아니라 다음, 이미지 수집 및 생물 발광 측정에 적합한 기기의 이미징 챔버에 접시를 놓습니다.
- 각 읽기 10 분 통합 시간을 사용하여 24 시간 동안 측정 생물 발광은 매 15 분.
참고 :이 예제에 사용되는 적분 시간 당 플레이트 기준이며, 선택의 다른 luminometers를 사용하여 각도 단위로 측정 조정할 수 있습니다. 통합 시간은 선택한 발광 세포 라인에 따라도 조정할 수 있습니다. 생물 발광은 세포 파괴 나 외부 자극없이 자율적으로 제작되고 있기 때문에 읽기INGS는 특정 실험 목적을 달성하기 위해 원하는 시점에서 찍은 수 있습니다. - 호환 소프트웨어를 사용하여 관심 영역을 식별하여 각 우물에서 발광 강도를 정량화. 하나 광속 (광자 / 초) 또는 각 샘플의 평균 래디언스 (광자 / CM / 초 2 / steridian)와 같은 광 출력을 표시합니다.
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Representative Results
본 연구에서는 autobioluminescent HEK293 세포의 역학은 항생제 노출 (그림 1)에 대한 응답으로 24 시간 동안 지속적으로 감시 하였다. 에 바인딩하고 DNA 13 쪼개서 살아있는 세포를 죽이는 것으로 알려져 블레오 마이신 가족의 구성원이 항생제의 독성 효과는 사색 이미지를 직접 시각화 할 수있는 치료 세포에 비해 발광 생산 감소를 통해 입증되었다 (그림 2). 다양한 처리 조건 하에서 시료의 반복 병렬 검사를 허용 이러한 세포의 autobioluminescent 성격은 쉽게 용량 - 반응 분석을위한 어떤 주어진 시점에서 서로 다른 농도의 비교를 허용했다. 예를 들어, 생물 발광은 증가하고 항생제 치료 resul로 보여주는 그림 3에서 화학 물질의 농도에 대하여 플롯되고, 15 일 이후 세포에서 18 시간, 치료의 20 시간을 시간을 생산용량 - 반응 방식으로 발광 생산의 감소 테드.
그림 1. 화학 물질에의 노출. 구조적으로 발광 HEK293 세포 님의 질문에 답변 발광 역학의 지속적인 추적은 블레오 마이신 계열의 항생제의 다양한 농도에 노출되었다. 발광 생산은 노출의 24 시간 기간 (1 판, 평균 ± 표준 오차에 대한 기술 triplicates에 대한 대표적인 데이터) (14에서 재판)을 통해 측정 하였다.
그림 2. 치료 세포의 사색 이미지.
그림 3. 화학 물질에의 노출의 용량 - 반응은. 발광 15 시간 후, 출력, 18 시간, 노출의 20 시간은 항생제 치료의 증가는 용량 - 반응 방식으로 빛을 생산의 감소 (한 접시에 기술 triplicates에 대한 대표적인 데이터에서 결과를 보여 주었다 평균 ± 표준 오차). R 2 값은 선형 회귀 계산됩니다.
표 1. 대표 비교autobioluminescent (LUX 기반) 인간의 세포 또는 기존의 반딧불 루시 페라 제 (루크) 기반의 96 - 웰 플레이트 형식 분석을 사용하여 보여 독성 화면을 표시합니다.
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Discussion
이 방법은 살아있는 세포가 지속적으로 자신의 일생을 통해 모니터링 할 수 있습니다 체외 독성 스크리닝 검사에서와 같은 자율적으로 발광 포유 동물 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 유연하고 필요에 따라 특정 실험 조건에 맞게 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 실험은 급성 독성을 추적에 적합 여기서 제시하지만, 반복적으로 증가 시간 간격 (예 : 매 24 시간)에서의 영상 간의 표준 배양 조건에서 세포를 유지하여 천천히 연기 또는 장기 효과를 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다 독서. 또한, 통합 시간은 발광 세포 라인에 따라 조정할 수 있습니다. 다양한 통합 시간과 영상의 예비 실험은 최적의 읽기 창을 결정하기 위해 수행 할 수 있습니다. 이 예제에 사용 된 10 분 통합은 모든 트리트 걸쳐 발광 생산의 동적 범위를 강조하기 위해 선택되었다T 조건은, 그러나 짧은 독서 프레임은 애플리케이션에 따라 적용 할 수 있습니다. 24 - 웰 플레이트이 예제에서는 데모에 사용되는 동안 마찬가지로, 96 - 또는 384 - 잘 플레이트는 높은 처리량 응용 프로그램을 대체 할 수 있습니다. 대표 결과는 하나의 접시에 기술 triplicates을 보여 여기에 나와 있지만, 그것은 관심의 화합물을 테스트 할 때 처리 수준 사이의 통계적 유의성을 설정하기 위해 수행해야 다른 접시에 그 독립적 인 분석에 유의하는 것이 중요합니다. 이 분석은 다양한 검출 감도와 다양한 악기에 사용하기 위해 적용 할 수 있기 때문에 또한, 그것은 허용 신호 대 잡음 및 신호 배경 비율은 당기구 기준으로 결정되어야하는 것이 좋습니다.
그것은 이전에 24 - 웰 플레이트에서 최소한의 감지 세포 수는 여기에 15을 설명하는 영상 조건에서 약 1.5 × 10 4 세포 것을 결정되었다.그러나, 그것은 믿을 수있는 탐지에 필요한 세포의 최소 숫자가 잘 크기에 따라 달라집니다, 그리고 작은 우물의 사용은 단위 면적 당 발광 세포의 수를 증가시켜 검출에 필요한 세포의 수를 줄일 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, 강력하게 발광 출력과 인구의 크기 사이의 관계가 이전의 검사에 원하는 영상 상태에서 결정하는 것이 좋습니다. 또한, 광전 튜브 기반 플레이트 리더는 IVIS 루미나 이미징 시스템 대신 데이터 수집에 사용할 수 있지만, 사색 이미지를 얻기의 손해에. 에 관계없이 고용 이미징 장비, 불투명 플레이트는 신호 손실 및 / 또는 플레이트를 통과하는 광자에 의한 인접 우물 발광 오염을 최소화하기 위해 사용되어야한다.
다른 일반적으로 고용 세포 배양 기반의 접근 방식을 비교,이 방법은 데이터 수집이 performe 수 있다는 이점을 제공샘플 파괴 기판 추가 할 필요가 이후 완전히 자동화 된 방식으로 D가 제거됩니다. 방법을 용해 - 필요한 셀을 사용하는 경우 그것은 또한 필요하게되는 금전적 또는 시간 비용의 동시 증가없이 독성 동력학의 향상된 해상도를 제공하는 노출의 오랜 기간 동안 동일한 셀 인구에 동적 효과를 지속적으로 추적 할 수 있습니다 ( 표 1). 그러나,이 방법의 중요한 한계는 해당 셀 타입 별 테스트 선별 autobioluminescent 표현형을 생성하기 위해 그 각각의 세포 유형으로 럭스 카세트의 안정적인 형질을 필요로합니다. 세포가 연속적으로 향후 사용을 위해 액체 질소에 저장 될 수 있기 때문에이 필요가 한 번만 수행 할 수 있지만, 형질 절차는 잠재적으로 시간이 많이 소요되는 노력이다.
이 전제 조건에도 불구하고, 프로토콜은 여기에 간단하고 저렴 필요합니다 설명의 최소한의 손에 실험실 직원의 작업, 추가 시약을 필요로하고, 직접 독성 학적 해석 사용할 수있는 데이터를 생성하지 않습니다. 이러한 이유로, 우리는 autobioluminescent 포유 동물 세포주보다 자세한 하류 평가가 필요 화합물을 선택하는 많은 수의 후보들의 신속한 심사를위한 높은 처리량 분석으로 사용할 수 있다는 결론을 내린다.
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Disclosures
DM 닫기, SA RIPP 및 GS Sayler 490 생명 공학, 주식 회사의 설립자 및 소유자이다
Acknowledgments
이러한 연구 노력은 화학, 생물, 환경, 보너스 번호 CBET-0853780 및 CBET-1159344 및 건강의 국립 연구소, 환경 건강 과학 국립 연구소 (NIEHS)에 따라 전송 (CBET) 시스템의 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부문에 의해 지원되었다 보너스 번호 1R43ES022567-01, 그리고 국립 암 연구소, 보너스 번호 CA127745-01에 따라 암 이미징 프로그램에 따라. 이 연구에서 사용 된 IVIS 루미나 계기는 미국 육군 국방 대학 연구 계측 프로그램에서 얻은 것입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
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