Summary
Cellule di mammifero che esprimono la cassetta genica bioluminescenza batterica (
Abstract
Cellule di mammifero, con sede in vitro sono stati ampiamente utilizzati come alternative alla sperimentazione animale per gli studi tossicologici, ma sono stati limitati a causa degli elevati costi monetari e di tempo di preparazione del campione parallelo che rese necessarie a causa della natura distruttiva di lucciola luciferasi metodi di screening basati su . Questo video descrive l'utilizzazione di cellule di mammifero autonomamente bioluminescenti, che non richiedono l'aggiunta distruttiva di un substrato luciferina, come un metodo economico e facile per monitorare gli effetti citotossici di un composto di interesse. Cellule di mammifero che esprimono stabilmente la bioluminescenza batterica totale (luxCDABEfrp) cassetta genica autonomamente producono un segnale ottico che picchi a 490 nm senza l'aggiunta di un substrato luciferina costoso e suscettibili d'interferire, eccitazione da una fonte di energia esterna, o la distruzione del campione che è tradizionalmente eseguito durante la procedura di imaging otticos. Questa indipendenza dalla stimolazione esterna pone l'onere per mantenere la reazione di bioluminescenza sulla sola cella, il che significa che il segnale risultante viene rilevato solo durante metabolismo attivo. Questa caratteristica rende la linea cellulare lux esprimono un ottimo candidato per l'uso come un biosentinel contro gli effetti citotossici in quanto i cambiamenti nella produzione bioluminescenti sono indicativi di effetti negativi sulla crescita cellulare e il metabolismo. Analogamente, la natura autonoma e la mancanza di distruzione campionamento richiesto permette ripetuta esposizione dello stesso campione in tempo reale durante il periodo di esposizione tossica e possono essere eseguite su più campioni utilizzando apparecchiatura di immagine esistente in modo automatico.
Introduction
Negli Stati Uniti, i prodotti farmaceutici e di altri prodotti destinati al consumo umano richiedono una valutazione prima di essere approvati per l'uso del consumatore da parte della Food and Drug Administration. L'onere finanziario per l'esecuzione di questo test è posto sulla sviluppatore 1, che aumenta sostanzialmente il costo di sviluppo nuovo composto e quindi si traduce in un aumento dei costi per i consumatori. Mentre tradizionalmente molto di questo screening è utilizzato soggetti animali di agire come proxy per ospiti umani, questo ha dimostrato di essere un grande onere finanziario, con una cifra stimata di 2,8 miliardi dollari spesi ogni anno in ADME / Tox (assorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione e tossicità ) lo screening solo 2 e la crescente evidenza che suggerisce che i modelli animali non possono prevedere in modo affidabile le risposte tossicologici umani 3. Pertanto, in fase di test delle cellule umane in vitro cultura basata ha guadagnato popolarità nel corso degli ultimi due decenni a causa della sua relativamente bassadei costi, maggiore produttività e una migliore rappresentazione della biodisponibilità umana e tossicologia 4. Attuali metodi di screening coltura cellulare basati tossicità impiegano vari endpoint, come la misurazione dei livelli di ATP, screening l'attività di enzimi citoplasmatici disponibili endogenamente, sondando l'integrità della membrana cellulare, o di monitoraggio del livello di attività mitocondriale, per valutare la vitalità cellulare 5 , 6. Tuttavia, indipendentemente l'endpoint prescelta, tutti questi metodi richiedono la distruzione del campione prima misurazioni possono essere prese, quindi solo produrre dati in un singolo punto di tempo. Di conseguenza, un gran numero di campioni devono essere preparati e trattati in parallelo per studi di base cinetica tossicologici, di nuovo aggiungendo al costo e la manodopera necessaria per nuovo sviluppo composto. In alternativa, saggi di luciferasi utilizzando secreti come Gaussia luciferasi 7, Vargula luciferasi 8, 9 e Metridia luciferasiè stato sviluppato che eliminano la necessità di lisi cellulare e richiedono una frazione dei mezzi per la misura finale, tuttavia, questi vengono ancora limitata a campionamento in punti di tempo predeterminati e inoltre richiede l'aggiunta di substrati luce-attivanti esogeni.
Per evitare danno di distruzione campione requisito nonché per eliminare il costo di substrati, una linea cellulare umana è stato ingegnerizzato che esprime la piena bioluminescenza batterica (lux) cassetta genica (luxCDABEfrp) per permettere il monitoraggio continuo di cellule vive che è simile a fluorescenza-dye imaging cellulare dal vivo a base, ma senza le ulteriori procedure di indagine fotone-attivanti e microscopiche. Questa linea cellulare è in grado di produrre costitutivamente un segnale ottico per la continua, rilevamento diretto senza bisogno di stimolazione esterna, evitando così la distruzione del campione. Meccanicamente, il segnale bioluminescente generato da queste cellule risultas quando l'enzima luciferasi luxAB-formata catalizza l'ossidazione di un grasso a catena lunga aldeide (sintetizzato e rigenerata dai prodotti genici luxCDE utilizzano substrati endogeni) in presenza di una ridotta riboflavina fosfato (FMNH 2, che viene riciclata dalla FMN dal gene frp prodotto) e ossigeno molecolare 10. Espressione del lux cassetta nella cellula ospite consente quindi leggera da produrre e accertata, senza distruzione cellulare o esogena aggiunta del substrato. Allo stesso modo, l'interazione tra i geni lux e la FMN disponibile endogena, e O 2 cofermenti, e l'obbligo per il mantenimento di un ambiente in grado di supportare la conversione di FMN a FMNH 2, assicura che il segnale bioluminescente risultante può essere rilevata solo da vivere , cellule metabolicamente attive.
Questi requisiti sono stati precedentemente sfruttato per dimostrare che lux-based uscita bioluminescente è strettamente correlato con le dimensioni della popolazione cellulare 11 e che l'esposizione composto tossico compromette produzione autobioluminescent in modo dose-risposta 12. Qui usiamo un autobioluminescent rene embrionale umano precedentemente caratterizzato (HEK293) linea cellulare 11 per dimostrare lo screening tossicologico automatizzata di un antibiotico della famiglia bleomicina con nota DNA attività dannosa come un esempio rappresentativo per convalidare l'applicazione di cellule di mammiferi autobioluminescent per test di tossicità.
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Protocol
1. Preparazione delle cellule
- Recuperare una fiala di bioluminescenti HEK293 cellule dal liquido azoto magazzino congelati e li crescere in mezzo di coltura di Dulbecco modificato (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino, 0,01 mM aminoacidi non essenziali, 1x antibiotico-antimicotico, e 0,01 mM sodio piruvato in una T pallone di coltura tissutale a 37 75 ° C e 5% di CO 2.
Nota: I mezzi di comunicazione e dei componenti supplementari variano in base a linee cellulari e quindi dovrebbero essere scelti di conseguenza. - Refresh media ogni 2-3 giorni fino a raggiungere ~ 80% di confluenza.
Nota: La quantità di cellule necessario sarà basato sul disegno sperimentale. Se necessario, più celle possono essere ottenuti con subcoltura. - Celle di raccolta per il test.
- Rimuovere il supporto e lavare le cellule con tampone fosfato (PBS), ruotando delicatamente il pallone e poi scartando l'speso PBS.
- Aggiungere tripsina e incubare a 37 ° C per 2 min,o fino a quando le cellule si sono staccati dal pallone.
- Raccogliere le cellule distaccate in PBS e trasferirli in una provetta pulita.
Nota: se le linee di cellule non aderenti sono usate, celle separate per centrifugazione e lavare una volta con PBS.
- Determinare il numero totale delle cellule utilizzando un emocitometro o altro sistema di conteggio delle cellule.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 min. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in terreno fresco, preriscaldata.
- Seed ugual numero di celle in singoli pozzetti di una piastra multi-bene opaca. In questo esempio, la piastra 5 x 10 5 cellule in un volume di 1 ml in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti nero. Piastra di un uguale volume di medie pozzetti in triplicato di agire come controllo negativo.
Nota: Il numero di cellule piastrate in ciascun pozzetto è flessibile e può essere ottimizzata per esperimenti singoli. Per ciascuna linea cellulare bioluminescente, sperimentalmente determinare il rapporto tra numero di cellule e bioluminescent uscita, così come la cellula minima rilevabile contano prima di eventuali prove di tossicità. Per fare questo, misura bioluminescenza in una vasta gamma di dimensioni della popolazione (per esempio, 1 x 3-01 Ottobre x 10 6 cellule) in condizioni standardizzate di imaging. - Trattamento di cellule con il composto di test (s) come descritto di seguito.
2. Preparazione chimica
- Preparare la sostanza chimica in fase di test da una soluzione madre concentrata. In questo esempio, utilizzare un 100 mg / ml soluzione madre di un antibiotico della famiglia bleomicina.
Nota: Per minimizzare potenziali effetti tossici veicolo basati, specialmente se un solvente organico viene usato come veicolo per addizione chimica, si raccomanda che la concentrazione magazzino sia almeno 1000 volte la concentrazione post-applicazione desiderata. - Aggiungere il brodo chimico preparato direttamente alle cellule. In questo esempio, la dose di antibiotico di interesse a concentrazioni finali di 100, 200, 300 e 400 mcg / ml in triplicate pozzi. Lasciare tre pozzi di cellule non trattate come controlli.
Nota: La concentrazione finale della sostanza chimica di destinazione deve essere scelto sulla base di obiettivi sperimentali specifici. Una vasta gamma di concentrazioni è normalmente testato per ottenere uno spettro di effetti tossici.
3. Imaging e analisi dei dati
- Subito dopo aggiunta chimica, pone la placca nella camera di imaging di strumento appropriato per l'acquisizione delle immagini e la misurazione bioluminescenza.
- Bioluminescenza misura ogni 15 min per un periodo hr 24 utilizzando un tempo di integrazione 10 min per ogni lettura.
Nota: Il tempo di integrazione utilizzato in questo esempio è su una base per-piastra e può essere regolato per la misura su una base per-pozzetto usando altri luminometri di scelta. Il tempo di integrazione può essere regolata in base alla linea cellulare bioluminescente scelto. Perché bioluminescenza è prodotto autonomamente senza distruzione cellulare o qualsiasi stimolo esterno, leggereIngs possono essere prese in qualsiasi punto temporale desiderato per soddisfare gli obiettivi sperimentali specifici. - Quantificare l'intensità bioluminescente da ogni pozzetto identificando una regione di interesse utilizzando software compatibile. Visualizzare l'emissione di luce sia come flusso totale (fotoni / secondo) o la radianza media (fotoni / secondo / cm 2 / steridian) di ciascun campione.
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Representative Results
In questo studio, la dinamica di autobioluminescent HEK293 sono state monitorate continuamente per un periodo di 24 ore in risposta all'esposizione antibiotico (Figura 1). Gli effetti tossici di questo antibiotico, che è un membro della famiglia bleomicina conosciuti per uccidere cellule viventi legandosi al DNA e aderire 13, sono stati dimostrati attraverso una diminuzione della produzione bioluminescente rispetto alle cellule non trattate, che può essere direttamente visualizzati attraverso le immagini pseudocolor (Figura 2). La natura autobioluminescent di queste cellule che hanno permesso la proiezione parallela ripetuta di campioni al variare delle condizioni di trattamento, consentito per confronto delle concentrazioni diverse in un dato punto di tempo per una facile analisi dose-risposta. Per esempio, bioluminescenza prodotta dalle cellule dopo 15 ore, 18 ore e 20 ore di trattamento è stato tracciato rispetto concentrazioni chimiche in Figura 3, che mostra che aumentando Resul trattamento antibioticoTED nella riduzione della produzione bioluminescente in modo dose-risposta.
Figura 1. Monitoraggio continuo delle dinamiche bioluminescenti in risposta all'esposizione chimica. Costitutivamente bioluminescenti HEK293 cellule sono state esposte a varie concentrazioni di un antibiotico della famiglia bleomicina. Produzione bioluminescente è stato monitorato per un periodo di 24 ore di esposizione (dati rappresentativi per triplicato tecnici su un piatto, media ± errore standard) (ristampa da 14).
Figura 2. Immagini PseudoColor di cellule trattate.
Figura 3. Dose-risposta di esposizione chimica. L'uscita bioluminescente dopo 15 ore, 18 ore e 20 ore di esposizione, mostrò che aumentando trattamento antibiotico provocato la riduzione della produzione di luce in modo dose-risposta (dati rappresentativi per triplicati tecnici su una piastra, media ± errore standard). Valore R 2 è calcolato per la regressione lineare.
Tabella 1. Confronto Rappresentante delschermo tossicità dimostrata utilizzando sia autobioluminescent (lux-based) cellule umane o di un tradizionale lucciola luciferasi (luc) a base di test in un formato a 96 pozzetti.
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Discussion
Questo metodo viene illustrato l'utilizzo di cellule di mammifero in autonomia bioluminescenti come dosaggio di screening citotossicità in vitro che permette alle cellule Live per essere monitorati continuamente durante la loro vita. Questo protocollo è flessibile e può essere modificato per accomodare condizioni sperimentali specifiche come richiesto. Per esempio, l'esperimento qui presentato è adatto per l'inseguimento effetti tossici acuti, ma può essere adattato per valutare gli effetti ad azione lenta ea lungo termine da ripetutamente l'imaging ad elevati intervalli di tempo (cioè ogni 24 ore) e mantenendo le cellule in condizioni di incubazione standard tra letture. Inoltre, il tempo di integrazione può essere regolata in base alla linea cellulare bioluminescente. Un esperimento preliminare dell'imaging con vari tempi di integrazione può essere eseguita per determinare la finestra di lettura ottimale. L'integrazione 10 min utilizzata in questo esempio è stato scelto per evidenziare la gamma dinamica della produzione bioluminescenti in tutti treatmencondizioni t, tuttavia una cornice di lettura più breve possono essere applicati a seconda dell'applicazione. Analogamente, mentre una piastra a 24 pozzetti è utilizzato per la dimostrazione in questo esempio, 96 - piastre o 384 pozzetti può essere sostituito per applicazioni di throughput più elevato. Sebbene i risultati rappresentativi mostrati qui dimostrano triplicato tecnici su una singola piastra, è importante notare che le analisi indipendenti su piastre differenti devono essere eseguite per stabilire significatività statistica tra i livelli di trattamento nel test di un composto di interesse. Inoltre, poiché questo dosaggio può essere adattato per l'uso in una varietà di strumenti con varie sensibilità di rilevamento, si raccomanda di rapporto segnale-rumore e segnale-fondo accettabili dovrebbero essere determinati su una base per-strumento.
Precedentemente è stato determinato che il numero di cellule minima rilevabile in una piastra a 24 pozzetti è stato di circa 1,5 x 10 4 cellule nelle condizioni descritte qui di imaging 15.Tuttavia, è importante notare che il numero minimo di cellule necessario per rilevazione certa varia con dimensioni bene, e che l'uso di piccoli pozzi riduce il numero di cellule necessario per il rilevamento aumentando il numero di cellule bioluminescenti per unità di superficie. Pertanto, si raccomanda vivamente che il rapporto tra la produzione bioluminescente e dimensione della popolazione è determinata secondo le condizioni di imaging desiderati prima dello screening. Inoltre, un lettore di piastra valvolare fotomoltiplicatore può essere utilizzato anche per l'acquisizione dati in luogo del sistema di imaging IVIS Lumina, ma a scapito di ottenere immagini pseudocolor. Indipendentemente dallo strumento di imaging impiegata, una piastra opaco deve essere usato per minimizzare la perdita di segnale e / o contaminazione bioluminescente di pozzetti adiacenti a causa fotoni attraversano la piastra.
Rispetto ad altri approcci comunemente impiegato cellula coltura basati, questo metodo offre il vantaggio di acquisizione dati può essere performed in modo completamente automatico poiché la necessità di distruzione campione o l'aggiunta del substrato è eliminato. Esso consente inoltre il monitoraggio continuo di effetti dinamici sulla stessa popolazione cellulare per un periodo prolungato di esposizione, che fornisce una risoluzione maggiore della cinetica tossicologici senza il contemporaneo aumento dei costi monetari e di tempo che si rende necessaria quando si utilizza cellule lisi-che richiede metodi ( Tabella 1). Tuttavia, una importante limitazione di questo metodo è che il test specifico del tipo cellulare richiederà la trasfezione stabile della cassetta nel lux ciascun tipo cellulare di interesse al fine di generare un fenotipo autobioluminescent per lo screening. Sebbene questa soluzione solo una volta da quando le cellule possono successivamente essere conservati in azoto liquido per uso futuro, la procedura di trasfezione è uno sforzo potenzialmente lunga.
Nonostante questa premessa, il protocollo qui descritto è semplice e poco costoso, richiedes minimal hands-on di lavoro da personale di laboratorio, non richiede reagenti aggiuntivi, e genera i dati che possono essere utilizzati direttamente per l'interpretazione tossicologico. Per queste ragioni, concludiamo che le linee cellulari di mammifero autobioluminescent possono essere usati come un saggio ad alta prestazione per lo screening rapido preliminare di un gran numero di candidati per selezionare composti che richiedono valutazione più dettagliata valle.
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Disclosures
DM Close, SA Ripp e GS Sayler sono fondatori e proprietari di 490 Biotech, Inc.
Acknowledgments
Questi sforzi di ricerca sono stati sostenuti dalla National Science Foundation Divisione di Chimica, Bioingegneria, ambientale e di trasporto (CBET) Sistemi di cui ai numeri premio CBET-0.853.780 e CBET-1.159.344 e il National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) con il numero award 1R43ES022567-01, e il National Cancer Institute, Cancer Imaging Program con il numero award CA127745-01. Lo strumento Lumina IVIS utilizzato in questo lavoro è stato ottenuto dalla US Army Defense University Strumentazione Research Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
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