Summary
Däggdjursceller uttrycker bakteriella kassetten mareld gen (
Abstract
Mammaliecell-baserade in vitro-tester har använts i stor utsträckning som alternativ till djurförsök för toxikologiska studier, men har begränsats på grund av de höga monetära och tid kostnaderna för parallella provberedning som är nödvändiga på grund av den destruktiva karaktär eldflugeluciferas-baserade screeningmetoder . Denna video beskriver användningen av autonomt bioluminescerande däggdjursceller, som inte kräver den destruktiva tillsats av en luciferin substrat, som ett billigt och enkel metod för att övervaka de cytotoxiska effekterna av en förening av intresse. Däggdjursceller som stabilt uttrycker den fullständiga bakteriell bioluminescens (luxCDABEfrp) genkassett producera autonomt en optisk signal som toppar vid 490 nm utan tillsats av en dyr och som kan påverka luciferinsubstrat, excitering av en extern energikälla, eller förstörelse av provet som är traditionellt utförs under optisk avbildning förfarandes. Detta oberoende av yttre stimulering lägger bördan för att bibehålla den självlysande reaktionen enbart på cellen, vilket innebär att den resulterande signalen endast upptäcks under aktiv metabolism. Denna egenskap gör det lux-uttryckande cellinje en utmärkt kandidat för användning som en biosentinel mot cytotoxiska effekter eftersom förändringar i självlysande produktionen tyder på negativa effekter på cellulär tillväxt och ämnesomsättning. Likaså medger självständiga karaktär och brist på erforderliga prov förstörelse upprepad avbildning av samma prov i realtid under hela giftet exponering och kan utföras på flera prover med befintlig utrustning för bildåtergivning på ett automatiserat sätt.
Introduction
I USA, läkemedel och andra produkter avsedda som livsmedel kräver omfattande bedömning innan de godkänns för konsumentbruk av Food and Drug Administration. Den ekonomiska bördan för att utföra detta test placeras på utvecklarens 1, vilket väsentligt ökar kostnaderna för ny förening utveckling och därför leder till en ökad kostnad för konsumenterna. Medan traditionellt mycket av denna screening har utnyttjat djurförsök att agera som ombud för mänskliga värdar, har detta visat sig vara en stor ekonomisk börda, med uppskattningsvis $ 2800000000 årligen spenderas på ADME / Tox (adsorption, distribution, metabolism, utsöndring, och toxicitet ) screening ensam 2 och fler bevis som tyder på att djurmodeller inte säkert kan förutsäga mänskliga toxikologiska reaktioner 3. Därför har in vitro human cellkultur-baserad testning vunnit popularitet under de senaste två decennierna på grund av dess relativt lägrekostnader, högre genomströmning och bättre representation av mänsklig biotillgänglighet och toxikologi 4. Aktuella cellen kultur-baserade toxicitet screeningmetoder använda olika ändpunkter, såsom mätning av ATP-nivåer, screening av aktiviteten av endogent tillgängliga cytoplasma enzymer, sondera integritet cellmembranet, eller spåra nivån på mitokondriell aktivitet, för att utvärdera cellulär viabilitet 5 , 6. Men oavsett den valda slutpunkten, dessa metoder kräver all destruktion av proverna innan mätningar kan utföras, vilket bara producerar data med en enda tidpunkt. Som ett resultat, ett stort antal prover behöver vara förberedd och behandlas parallellt för grundläggande toxikologiska kinetiska studier, återigen lägga till kostnader och arbete som krävs för ny förening utveckling. Alternativt, analyser som använder utsöndras luciferas såsom Gaussia luciferas 7, Vargula luciferas 8, och Metridia luciferas 9har utvecklats till att eliminera behovet av cell-lys och kräver en bråkdel av media för resultatmåttsmätningen, dock är de fortfarande begränsade till provtagning vid förutbestämda tidpunkter och också kräver tillsats av exogena ljus-aktiverande substrat.
För att undvika skada för erforderlig prov förstörelse samt att eliminera kostnaderna för substrat, har en human cellinje varit utformad som uttrycker hela bakteriella mareld (lux) genkassett (luxCDABEfrp) för att möjliggöra kontinuerlig övervakning av levande celler som liknar till fluorescerande färgämne baserade levande cell imaging, men utan de ytterligare photon-aktiverande och mikroskopisk undersökning förfaranden. Denna cellinje har förmåga att konstitutivt producera en optisk signal för kontinuerlig, direkt detektion utan behov av yttre stimulering och därmed undvika destruktion av proverna. Mekanistiskt den självlysande signalen genereras från dessa celler leders när luxAB bildade luciferas enzymet katalyserar oxidationen av en långkedjig fettsyra aldehyd (syntetiserad och regenereras genom de luxCDE genprodukter med hjälp av endogena substrat) i närvaro av minskad Riboflavinfosfat (FMNH 2, som recirkuleras från FMN av FRP-genen produkt) och molekylärt syre 10. Redovisning av lux kassetten i värdcellen kan därför lätt att produceras och detekteras utan celldöd eller exogena substrat tillägg. Likaså ser samspelet mellan de lux gener och endogent tillgängliga FMN, och O 2 samsubstrat, och kraven på underhåll av en miljö som kan stödja omställningen av FMN till FMNH 2, att den resulterande självlysande signalen endast kan upptäckas från att leva , metaboliskt aktiva celler.
Dessa krav har tidigare utnyttjats för att visa att lux-based självlysande effekt korrelerar starkt med cellulär befolkningens storlek 11 och att toxisk förening exponering försämrar autobioluminescent produktion i en dos-respons mode 12. Här använder vi en tidigare karaktäriserat autobioluminescent humana embryonala njur (HEK293) cellinje 11 för att visa den automatiserade toxikologisk screening av ett antibiotikum av bleomycin familjen med kända DNA-skadande aktivitet som ett representativt exempel för att validera ansökan om autobioluminescent däggdjursceller för toxicitetstester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Cellberedning
- Hämta tillbaka en flaska med bioluminescerande HEK293 celler från flytande kväve fryst lager och odla dem i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 0,01 mM icke-essentiella aminosyror, 1 x antibiotika-antimykotika, och 0,01 mM natriumpyruvat i en T 75 vävnadsodlingskolv vid 37 ° C och 5% CO2.
Obs: Medierna och kompletterande komponenter varierar beroende på cellinjer och därför bör väljas därefter. - Refresh medium var 2-3 dagar tills den når ~ 80% sammanflödet.
Obs: Den mängd som krävs celler kommer att baseras på den experimentella designen. Vid behov kan fler celler erhållas genom subkultur. - Harvest celler för testning.
- Avlägsna mediet och tvätta cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att försiktigt snurra kolven och sedan kasta det använda PBS.
- Lägg trypsin och inkubera vid 37 ° C under 2 min,eller tills cellerna har lossnat från kolven.
- Samla de lösgjorda cellerna i PBS och överföra dem till ett rent centrifugrör.
Obs: Om ickeadherenta cellinjer används, separera celler genom centrifugering och tvätta en gång med PBS.
- Bestäm den totala cellantalet med användning av en hemacytometer eller andra celler räknesystem.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 xg under 5 min. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i färskt, förvärmt medium.
- Seed lika stort antal celler in i individuella brunnar i en opak platta med flera brunnar. I detta exempel plattan 5 x 10 5 celler i en 1 ml volym i varje brunn i en svart 24-brunnar. Plate en lika stor volym av medium i triplikatbrunnar för att fungera som den negativa kontrollen.
Obs: Antalet celler utströks i varje brunn är flexibel och kan optimeras för enskilda experiment. För varje bioluminescent cellinje, experimentellt bestämma förhållandet mellan antalet celler och bioluminescent utgång, såväl som den minimala detekterbara cellantalet före eventuella toxicitetstest. För att göra detta, mått mareld över ett brett spektrum av befolkningen storlekar (t.ex. 1 x Oktober 03-01 x 10 6 celler) under standardiserade avbildningsbetingelser. - Behandla celler med testning förening (er) som beskrivs nedan.
2. Kemisk förbehandling
- Förbered kemikalier som testas som en koncentrerad förrådslösning. I detta exempel använder en 100 mg / ml stamlösning av ett antibiotikum av bleomycin familjen.
Obs! För att minimera potentiella fordonsbaserade toxiska effekter, speciellt om ett organiskt lösningsmedel används som vehikel för kemisk addition, rekommenderas att beståndet koncentrationen vara minst 1000 gånger den önskade efterapplicering koncentration. - Lägg den förberedda kemisk lager direkt till cellerna. I detta exempel dos antibiotikumet av intresse vid slutkoncentrationer av 100, 200, 300 och 400 | ig / ml i triplicate brunnar. Lämna tre brunnar av celler obehandlade som kontroller.
Obs: Den slutliga koncentrationen av målet kemikalien skall väljas baserat på specifika experimentella mål. Ett brett intervall av koncentrationer är normalt testas för att erhålla ett fullt spektrum av de toxiska effekterna.
Tre. Imaging och dataanalys
- Omedelbart efter kemisk tillsats, placera plattan i bildbehandling kammare lämpligt instrument för bildtagning och mareld mätning.
- Mät Mareld var 15 min under en 24 timmarsperiod med en 10 tid min integration för varje läsning.
Obs: Integrationen tid som används i detta exempel är på en per-platta basis och kan justeras för mätning på en per-väl basis med andra luminometrar av valet. Integrationen tid kan också justeras baserat på den valda självlysande cellinje. Eftersom bioluminiscens framställs autonomt utan celldestruktion eller någon extern stimulans, läsningar kan tas vid varje önskad tidpunkt för att uppfylla särskilda experimentella syften. - Kvantifiera bioluminescent intensitet från varje brunn genom att identifiera en region av intresse med användning kompatibel programvara. Display ljusutmatningen antingen som det totala flödet (fotoner / sekund) eller den genomsnittliga radians (fotoner / sekund / cm 2 / steridian) i varje prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie, var dynamiken i autobioluminescent HEK293-celler övervakas kontinuerligt under en 24 h period som svar på antibiotika exponering (Figur 1). De toxiska effekterna av detta antibiotikum, som är en medlem av bleomycin familjen känd för att döda levande celler genom att binda till och klyva DNA 13, demonstrerades genom en minskning i självlysande produktionen jämfört med obehandlade celler, vilket kan vara direkt visualiseras genom PseudoColor bilder (Figur 2). Den autobioluminescent naturen hos dessa celler, som tillät upprepad parallell screening av prover under varierande behandlingsbetingelser, tillåts för jämförelse av olika koncentrationer vid varje given tidpunkt för enkel dos-respons-analys. Exempelvis bioluminescens framställts av celler efter 15 h, 18 h och 20 h av behandling avsattes mot kemiska koncentrationer i figur 3, som visar att ökande antibiotikabehandling ResulTed i minskningen av självlysande produktionen i en dos-respons sätt.
Figur 1. Kontinuerlig uppföljning av självlysande dynamik som svar på kemisk exponering. Konstitutivt självlysande HEK293 celler exponerades för olika koncentrationer av ett antibiotikum av bleomycin familjen. Bioluminescent produktionen övervakades under en 24 timmars period av exponering (representativa uppgifter för tekniska triplicates på en tallrik, medelvärde ± standardavvikelse) (nytryck från 14).
Figur 2. PseudoColor bilder av behandlade celler.
Figur 3. Dos-respons av kemisk exponering. Den självlysande effekt efter 15 timmar, 18 timmar och 20 timmar av exponering visade att ökande antibiotikabehandling resulterade i en minskning av ljus produktion i en dos-respons sätt (representativa uppgifter för tekniska triplicates på en tallrik, medelvärde ± standardfel). R 2 värde beräknas för linjär regression.
Tabell 1. Representant jämförelse avvisat toxicitet skärmen med antingen autobioluminescent (lux-baserad) mänskliga celler eller en traditionell Eldflugeluciferas (luc)-baserad analys i en 96-brunnar format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod visar användningen av autonomt bioluminescerande däggdjursceller som en in vitro cytotoxicitet screeningsanalys som tillåter levande celler övervakas kontinuerligt under sin livstid. Detta protokoll är flexibel och kan modifieras för att tillgodose specifika experimentella betingelser efter behov. Till exempel presenterade experimentet här är lämplig för att spåra akuta toxiska effekter, men kan anpassas för att bedöma tröga eller långsiktiga effekter genom att upprepade gånger avbildning vid ökade tidsintervall (dvs. varje 24 tim) och bibehålla cellerna under normala inkubationstiden förhållanden mellan avläsningar. Dessutom kan integrationen tiden justeras baserat på den självlysande cellinje. Ett preliminärt experiment för bildframställning med olika integreringstider kan utföras för att bestämma den optimala avläsningsfönstret. Den 10 min integration används i detta exempel valdes för att belysa det dynamiska omfånget av självlysande produktion över hela treatment förhållanden, men en kortare läsram kan appliceras beroende på applikation. Samma sätt, medan en 24-brunnars platta används för demonstration i detta exempel, 96 - kan eller 384-brunnars plattor vara substituerad för högre genomströmning applikationer. Även de representativa resultat som visas här visar tekniska triplicates på en enda platta, är det viktigt att notera att oberoende analyser på olika plattor bör utföras för att fastställa statistisk signifikans mellan behandlingsgrupperna nivåer när man testar en förening av intresse. Dessutom, eftersom denna analys kan anpassas för användning i en mängd olika instrument med varierande upptäckt känslighet, är det rekommenderat att acceptabla signal-till-brus och signal-till-bakgrund förhållanden bör fastställas på en per-instrument basis.
Det tidigare fastslagits att det minimala detekterbara cellantalet i en 24-brunnsplatta var cirka 1,5 x 10 4 celler under avbildningsbetingelser beskrivs här 15.Det är dock viktigt att notera att den minimala antalet celler som krävs för tillförlitlig detektering varierar med väl storlek, och att användningen av mindre brunnar minskar antalet celler som krävs för detektering genom att öka antalet av bioluminescerande celler per ytenhet. Därför rekommenderas det starkt att förhållandet mellan bioluminescerande produktion och befolkningens storlek skall fastställas enligt de önskade avbildningsbetingelser före screening. Dessutom kan ett fotomultiplikatorrör-baserade plattläsaren också användas för datainsamling i stället för IVIS Lumina imaging system, men på bekostnad av att erhålla PseudoColor bilder. Oberoende av avbildningsanordningen används instrumentet, bör en ogenomskinlig platta användas för att minimera förlust av signalstyrka och / eller bioluminescent förorening av intilliggande brunnar på grund av fotoner korsar plattan.
Jämfört med andra vanligen använda cellkultur-baserade metoder, har denna metod fördelen att datainsamling kan vara performed på ett helt automatiserat sätt eftersom behovet av provet destruktion eller substrattillsats elimineras. Det möjliggör också för kontinuerlig spårning av dynamiska effekter på samma cell population under en längre tids exponering, vilket ger en förbättrad upplösning på toxikologiska kinetik utan samtidig ökning av monetära eller tid kostnader som är nödvändiga vid användning av cell-lys-krävande metoder ( Tabell 1). Emellertid är en viktig begränsning med denna metod som celltyp-specifik testning kräver stabil transfektion av lux kassetten i varje celltyp av intresse i syfte att generera en autobioluminescent fenotyp för screening. Även om detta behov endast utföras en gång eftersom cellerna kan därefter förvaras i flytande kväve för framtida bruk, är transfektionsförfarandet en potentiellt tidskrävande strävan.
Trots denna förutsättning, redogjorde protokollet här är enkel och billig, krävers minimala praktiskt arbete från laboratoriepersonal, inte kräver några ytterligare reagens, och genererar data som direkt kan användas för toxikologisk tolkning. Av dessa skäl drar vi slutsatsen att autobioluminescent däggdjurscellinjer kan användas som en hög genomströmning analys för snabb preliminär screening av ett stort antal kandidater att välja föreningar som kräver mer detaljerad nedströms utvärdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DM Close, SA Ripp, och GS Sayler är grundare och ägare av 490 BioTech, Inc.
Acknowledgments
Dessa forskningsinsatser stöddes av National Science Foundation Division of Chemical, bioteknik, miljö och transport (CBET) System under utmärkelsen siffror CBET-0.853.780 och CBET-1.159.344 och National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) enligt utmärkelse nummer 1R43ES022567-01, och National Cancer Institute, Cancer Imaging program inom utmärkelse nummer CA127745-01. IVIS Lumina instrument som används i detta arbete erhölls från amerikanska armén Defense University Research Instrumentation Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved? FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T.
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A.
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441 (2010).
- Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Biomedical Sciences and Engineering Conference (BSEC), Mar 15-17, Knoxville, TN, , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).
