Summary
תאי יונקים המבטאים את קלטת גן פליטת אור (החיידקים
Abstract
תא המבוסס במבחני חוץ גופית יונקים כבר מועסק באופן נרחב כחלופות לניסויים בבעלי החיים למחקרי toxicological אבל היו מוגבל בשל העלויות הכספיות הגבוהות של זמן והכנת מדגם מקביל המתחייבות עקב הטבע ההרסני של שיטות הקרנה מבוססות לוציפראז גחלילית . סרטון זה מתאר את הניצול של תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent, אשר אינם דורש תוספת ההרסנית של מצע luciferin, כשיטת זולה וקלילה לניטור ההשפעות הרעילים של תרכובת של עניין. תאי יונקים ביציבות להביע פליטת אור חיידקים מלאה (luxCDABEfrp) קלטת גן אוטונומי לייצר אותות אופטיים שפסגות ב 490 ננומטר ללא תוספת של מצע יקר ואולי מפריע luciferin, עירור על ידי מקור אנרגיה חיצוני, או הרס של המדגם שהוא באופן מסורתי מבוצע במהלך הליך הדמיה אופטיים. עצמאות זו מגירוי חיצוני מציבה את נטל לשמירה על תגובת bioluminescent אך ורק בתא, כלומר את האות שנוצרה הוא זוהה רק במהלך חילוף חומרים פעילים. מאפיין זה הופך את קו התא מבטא-Lux מועמד מצוין לשימוש כbiosentinel כנגד השפעות רעילות בגלל שינויים בייצור bioluminescent מצביעים על השפעות שליליות על צמיחה וחילוף חומרים תאיים. כמו כן, האופי האוטונומי וחוסר הרס מדגם הנדרש מאפשר הדמיה חוזרת ונשנית של אותו המדגם בזמן אמת לאורך כל תקופת חשיפת toxicant ויכולים להתבצע על פני מספר רב של דגימות ציוד הדמיה קיים בשימוש באופן אוטומטי.
Introduction
בארה"ב, תרופות ומוצרים אחרים המיועדים למאכל אדם דורשים הערכה מקיפה לפני שהם מאושרים לשימוש על ידי הצרכנים מזון והתרופות אמריקניות. נטל הכספי לביצוע בדיקה זו מושם על 1 מפתח, אשר מגביר באופן משמעותי את עלות פיתוח מתחם חדש ולכן מיתרגם התייקרות לצרכנים. אמנם באופן מסורתי הרבה יותר של הקרנה זו מנוצל נושאי בעלי חיים לפעול כשליחים למארחי אדם, זה הוכיח להיות נטל כספי גדול, עם הערכת 2.8 מליארד דולרים בילו מדי שנה על ADME / Tox (ספיחה, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה, ורעילות ) הקרנה לבד 2 וראיות מצטברות המצביעות על כך מודלים של בעלי חיים לא יכולים לחזות מהימן תגובות toxicological אדם 3. לכן, בבדיקת תא מבוססת התרבות אנושית מבחנה צברה פופולריות בשני העשורים האחרונים בשלה נמוך יחסיתעלות, תפוקה גבוהה יותר, וייצוג טוב יותר של זמינות ביולוגית וטוקסיקולוגיה 4 אנושיים. שיטות הקרנה רעילות המבוססות על תרבות התא נוכחית להעסיק נקודות קצה שונות, כגון מדידת רמות ה-ATP, הקרנת הפעילות של אנזימים זמינים cytoplasmic endogenously, חיטוט היושרה של קרום התא, או מעקב אחר רמת הפעילות של המיטוכונדריה, כדי להעריך את הכדאיות סלולרית 5 , 6. עם זאת, ללא קשר לנקודה הסיום שנבחר, שיטות אלו דורשות כל ההרס של המדגם לפני ניתן לקחת מדידות, ובכך לייצר נתונים רק בנקודת זמן אחת. כתוצאה מכך, מספר גדול של דגימות צריכים להיות מוכן ולטפל במקביל ללימודי קינטיקה toxicological בסיסיים, שוב מוסיפים לעלויות והעבודה הנדרשת לפיתוח מתחם החדש. לחלופין, באמצעות מבחני מופרשים לוציפראז כגון Gaussia 7 לוציפראז, Vargula לוציפראז 8, וMetridia לוציפראז 9פותחו שמבטל את הצורך בתמוגה תא ודורש חלק מכלי התקשורת למדידת נקודת סיום, לעומת זאת, אלה עדיין מוגבלים לדגימה בנקודות זמן שנקבעו מראש, וגם דורש תוספת של מצעי אור הפעלה חיצוניים.
כדי להימנע מהפגיעה של הרס מדגם הנדרש, כמו גם לחסל את העלות של מצעים, קו תא אנושי תוכנן המבטא את פליטת אור מלא חיידקים (לוקס) קלטת גן (luxCDABEfrp) כדי לאפשר לניטור רציף של תאי חיים, כי הוא דומה להדמית תא החי המבוססת על ניאון צבע, אך ללא הליכי חקירת פוטון-הפעלה ומיקרוסקופים נוספים. קו תא זה מסוגל לייצר constitutively אות אופטי לגילוי מתמשך, ישיר ללא צורך בגירוי חיצוני, ובכך נמנע הרס של המדגם. מכאני, אות bioluminescent שנוצרה מהתאים אלה לגרוםS כאשר אנזים לוציפראז luxAB-בנוי מזרז החמצון של אלדהיד שומן ארוך שרשרת (מסונתז ונוצר מחדש על ידי שימוש במוצרי גן luxCDE מצעי אנדוגני) בנוכחות המופחת ריבופלאבין פוספט (2 FMNH, שממוחזר מFMN על ידי גן FRP מוצר) וחמצן מולקולרי 10. ביטוי של לוקס הקסטה בתא המארח ולכן מאפשר לאור להיות מיוצר ומזוהה ללא הרס הסלולר או תוספת מצע אקסוגני. בדומה לכך, האינטראקציה בין גנים ולוקס FMN זמין endogenously וcosubstrates O 2, והדרישה לשמירה על סביבה שיכול לתמוך בהמרה של FMN לFMNH 2, מבטיחה שאות bioluminescent כתוצאה מכך יכולה להיות מזוהות רק מהחיים , תאים פעילים מטבולית.
דרישות אלה בעבר נוצלו על מנת להוכיח כי לוקס-basפלט bioluminescent אד קורלציה חזק עם גודל אוכלוסיית הסלולר 11 וכי חשיפת תרכובת רעילה פוגעת בייצור autobioluminescent אופנה מנה תגובה 12. כאן אנו משתמשים בכליות מתאפיינות בעבר autobioluminescent עוברית אנושית (HEK293) שורת תא 11 כדי להדגים את הקרנת טוקסיקולוגי האוטומטית של אנטיביוטיקה מהמשפחה ידועה bleomycin עם פעילות ה-DNA נזק כדוגמה מייצגת כדי לאמת את היישום של תאי יונקים autobioluminescent לבדיקות רעילות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תא
- לשחזר בקבוקון של HEK293 תאי bioluminescent ממניות קפוא חנקן נוזלי ולגדל אותם במדיום השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי, 0.01 חומצות אמינו חיוניות מ"מ, 1x האנטיביוטיקה antimycotic, ופירובט נתרן מ"מ 0.01 בT בקבוק תרבית רקמה 75 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
הערה: בתקשורת והרכיבים משלימים תשתנינה בהתאם לקווים סלולריים, ולכן יש לבחור בהתאם. - רענן כל מדיום 2-3 ימים עד שמגיע ~ מפגש% 80.
הערה: כמות התאים הנדרשים תהיה מבוססת על עיצוב ניסיוני. במידת צורך, ניתן להשיג יותר תאים על ידי subculturing. - קציר תאים לבדיקה.
- הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS) על ידי בעדינות מתערבל את הבקבוק ולאחר מכן השלכת בילתה PBS.
- הוסף טריפסין ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות,או עד שהתאים יש מנותק מהבקבוק.
- לאסוף את התאים המנותקים בPBS ולהעביר אותם לתוך צינור צנטריפוגות נקי.
הערה: אם שורות תאי nonadherent משמשות תאים נפרדים, על ידי צנטריפוגה ולשטוף פעם עם PBS.
- לקבוע את ספירת התאים הכולל שימוש במערכת ספירת תאים אחרות או hemacytometer.
- צנטריפוגה ההשעיה תא XG 300 במשך 5 דקות. בטל supernatant ו resuspend התאים במדיום טרי, prewarmed.
- מספר שווה של תאי זרע לתוך בארות בודדות של צלחת רב גם אטומה. בדוגמה זו, צלחת 5 x 10 5 תאים בנפח 1 מ"ל לבאר כל צלחת 24 גם שחורה. צלחת נפח שווה של מדיום בבארות בשלושה עותקים לפעול כביקורת שלילית.
הערה: מספר התאים מצופה בכל טוב הוא גמיש ויכול להיות מותאם לניסויים בודדים. עבור כל שורת תאי bioluminescent, בניסוי לקבוע את הקשר בין מספר תאים וbiolumiפלט nescent, כמו גם את התא לגילוי מינימאלי לספור לפני כל בדיקות רעילות. כדי לעשות זאת, פליטת אור אמצעי על פני מגוון רחב של גודל אוכלוסייה (לדוגמה, 1 x 3-01 אוקטובר x 10 6 תאים) בתנאי הדמיה סטנדרטיים. - טיפול בתאים עם מתחם בדיקה (ים) כמפורט להלן.
2. תכשיר
- הכן הכימי שנבדקו כפתרון מניות מרוכז. בדוגמה זו, יש להשתמש בפתרון מניות מ"ל של אנטיביוטיקה ממשפחת bleomycin 100 מ"ג /.
הערה: כדי למזער את ההשפעות רעילות המבוססות על הרכב פוטנציאליות, במיוחד אם ממס אורגני משמש ככלי לתוספת כימית, מומלץ כי ריכוז מניית להיות לפחות 1,000 פעמים ריכוז שלאחר היישום הרצוי. - מוסיף את הציר הכימי המוכן ישירות אל התאים. בדוגמה זו, מינון האנטיביוטיקה של ריבית בריכוזים סופיים של 100, 200, 300, ו -400 מיקרוגרם / מ"ל בתלתplicate בארות. השאר שלוש בארות של תאים שלא טופלו כקבוצת ביקורת.
הערה: הריכוז הסופי של כימי היעד צריך להיות נבחר על בסיס מטרות ניסוי ספציפית. מגוון רחב של ריכוזים בדרך כלל נבחן להשיג ספקטרום מלא של ההשפעות הרעילות.
3. הדמיה וניתוח נתונים
- מייד לאחר בנוסף כימי, למקם את הצלחת בחדר ההדמיה של המכשיר המתאים לרכישת תמונה ומדידת פליטת אור.
- פליטת אור מדוד כל 15 דקות על פני תקופה הפועל 24 שעות באמצעות 10 דקות זמן אינטגרציה לכל קריאה.
הערה: זמן האינטגרציה בשימוש בדוגמה זו הוא על בסיס לכל צלחת ויכול להיות מותאם למדידה על בסיס לכל היטב באמצעות luminometers אחר של בחירה. יכול גם להיות מותאם זמן האינטגרציה המבוסס על שורת תאי bioluminescent בחר. בגלל פליטת אור מופק עצמאי ללא הרס תא או כל גירוי חיצוני, לקרואניתן לקחת ממצאים בכל נקודת זמן רצויה למלא את מטרות ניסוי ספציפיות. - לכמת את עוצמת bioluminescent מכל באר על ידי זיהוי אזור של עניין באמצעות תוכנה תואמת. להציג את פלט האור או כמו השטף הכולל (פוטונים / שני) או קרינה הממוצעת (פוטונים / steridian שני / 2 ס"מ /) של כל דגימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה, את הדינמיקה של תאי autobioluminescent HEK293 נוטרו באופן רציף על פני תקופה הפועל 24 שעות בתגובה לחשיפה לאנטיביוטיקה (איור 1). את ההשפעות הרעילות של האנטיביוטיקה הזה, שהוא חבר של המשפחה הידועה bleomycin להרוג תאי חיים באמצעות קשירה ולביקוע DNA 13, הודגמו באמצעות ירידה בייצור bioluminescent השוואה לתאים שלא טופלו, אשר יכול להיות ישירות דמיינו דרך תמונות pseudocolor (איור 2). טבע autobioluminescent של תאים אלה, שהתירו את ההקרנה החוזרת של דגימות במקביל בתנאי טיפול שונים, אפשר להשוואת ריכוזים שונים בכל נקודת זמן נתונה לניתוח מנה תגובה קלה. לדוגמה, פליטת אור המופקת מהתאים לאחר 15 שעות, 18 שעות, 20 שעות וטיפול היה זמם נגד ריכוזים כימיים באיור 3, מראה כי resul טיפול אנטיביוטי הגדלתטד בהפחתת ייצור bioluminescent באופן המנה תגובה.
איור 1. מעקב רציף של דינמיקת bioluminescent בתגובה לחשיפה כימית. HEK293 תאי bioluminescent constitutively נחשף לריכוזים שונים של אנטיביוטיקה ממשפחת bleomycin. ייצור bioluminescent היה פיקוח על פני תקופה של 24 שעות חשיפה (נתונים מייצגים עבור triplicates הטכני על צלחת אחת, טעות ממוצעת סטנדרטית ±) (תדפיס מ14).
איור 2. תמונות pseudocolor של תאים שטופלו.
איור 3. המנה תגובה של חשיפה כימית. פלט bioluminescent לאחר 15 שעות, 18 שעות, 20 שעות וחשיפה הראו שהגדלת טיפול אנטיביוטי הביאה להפחתה של ייצור האור באופן המנה תגובה (נתונים מייצגים עבור triplicates הטכני על צלחת אחת, ממוצע ± סטיית התקן). ערך R 2 מחושב לרגרסיה לינארית.
השוואת נציג טבלה 1. שלמסך רעילות הפגין או באמצעות autobioluminescent (מבוסס LUX) תאים אנושיים או גחלילית לוציפראז מסורתי (לוק) מבוסס assay בפורמט 96 גם צלחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו מדגימה את שימוש בתאי יונקים אוטונומי bioluminescent כבassay הקרנת cytotoxicity המבחנה המאפשר לתאים חיים כדי להיות במעקב רציף לאורך החיים שלהם. פרוטוקול זה הוא גמיש וניתן לשינוי כדי להתאים לתנאי ניסוי ספציפיים כנדרש. לדוגמה, בניסוי שהוצג כאן מתאים למעקב אחר השפעות רעילות אקוטיות, אך יכול להיות מותאם כדי להעריך את השפעות הפועלות באטיות או ארוכות טווח על ידי הדמיה שוב ושוב במרווחי זמן גדלים (כלומר כל 24 שעות) ושמירת התאים בתנאי דגירה סטנדרטית בין קריאות. בנוסף, ניתן להתאים את זמן האינטגרציה המבוסס על שורת תאי bioluminescent. ניסוי ראשוני של הדמיה עם פעמים אינטגרציה שונות יכול להתבצע על מנת לקבוע את חלון הקריאה האופטימלי. האינטגרציה דקות 10 השתמשה בדוגמה זו נבחרה כדי להדגיש את הטווח הדינמי של ייצור bioluminescent פני כל treatmenתנאי t, לעומת זאת ניתן ליישם מסגרת קריאה קצרה יותר, בהתאם ליישום. באופן דומה, ואילו צלחת 24 גם משמשת להפגנה בדוגמה זו, 96 - ניתן להחליף צלחות או 384 גם עבור יישומי תפוקה גבוהים יותר. למרות שהתוצאות שמוצגת כאן הנציג להפגין triplicates טכני על צלחת אחת, זה חשוב לציין כי מבחני עצמאיים על צלחות שונות צריכה להתבצע להקים מובהקות סטטיסטיות בין רמות טיפול בעת בדיקת מתחם של עניין. יתר על כן, כי assay זה יכול להיות מותאם לשימוש במגוון רחב של מכשירים עם רגישויות שונות זיהוי, מומלץ שיחס אות לרעש ואות לרקע מקובל צריך להיקבע על בסיס לכל מכשיר.
זה נקבע בעבר כי מספר תא הגילוי מינימאלי בצלחת 24 גם היה כ 1.5 x 10 4 תאים בתנאי ההדמיה המתוארים כאן 15.עם זאת, חשוב לציין כי המספר מינימאלי של תאים הנדרשים לזיהוי אמין משתנה עם גודל היטב, וכי השימוש בבארות קטנות יותר מפחית את מספר התאים הדרושים לזיהוי על ידי הגדלת מספר תאי bioluminescent ליחידת שטח. לכן, מומלץ מאוד שמערכת היחסים בין תפוקת bioluminescent וגודל אוכלוסייה תיקבע בתנאי ההדמיה הרצויים לפני ההקרנה. בנוסף, קורא צלחת מבוסס צינור מכפיל יכול לשמש גם לרכישת נתונים במקום של מערכת IVIS ומינה ההדמיה, אבל ברעת קבלת תמונות pseudocolor. ללא קשר למכשיר ההדמיה המועסק, יש להשתמש בצלחת אטומה כדי למזער את האובדן ו / או זיהום של bioluminescent בארות סמוכות בשל פוטונים העוברים דרך צלחת אות.
בהשוואה לתא מועסק בכינוי אחר המבוססות על תרבות גישות, שיטה זו מציעה את היתרון שיכולה להיות רכישת נתונים performeד באופן אוטומטי לחלוטין מאז את הצורך בהרס מדגם או תוספת מצע מתבטל. זה גם מאפשר מעקב הרציף של אפקטים דינמיים על אותה האוכלוסייה של התאים על פני תקופה ממושכת של חשיפה, המספקת רזולוציה משופרת של קינטיקה toxicological ללא עלייה המקבילה בעלויות כספיות או זמן המתחייבת בעת שימוש בתא תמוגה המחייב-שיטות ( טבלת מס '1). עם זאת, מגבלה חשובה של שיטה זו היא שהבדיקות ספציפיות לסוג התא תדרוש transfection היציב של לוקס קלטת לכל סוג תא של עניין על מנת ליצור פנוטיפ autobioluminescent להקרנה. למרות שהצורך הזה רק פעם אחת מאז שבצע לאחר מכן ניתן לאחסן את התאים בחנקן נוזלי לשימוש עתידי, הליך transfection הוא מאמץ זמן רב שעלול להיות.
למרות תנאי זה, הפרוטוקול שתואר כאן הוא פשוט וזול, דורשים מינימאלי הידיים על עבודה מאנשי מעבדה, אינו דורש שום חומרים כימיים נוספים, ומייצר נתונים שניתן להשתמש בו ישירות לפרשנות טוקסיקולוגית. מסיבות אלה, אנו מגיעים למסקנה כי שורות תאי יונקים autobioluminescent יכולות לשמש כassay תפוקה גבוהה לסינון ראשוני מהיר של מספר גדול של מועמדים כדי לבחור תרכובות הדורשות הערכה מפורטת יותר במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DM סגור, SA ריפ, ו-GS Sayler הם מייסדים ובעלים של 490 ביוטכנולוגיה, Inc
Acknowledgments
מאמצי המחקר האלה נתמכו על ידי הקרן הלאומית למדע החטיבה כימית, Bioengineering, סביבתי, ותחבורה (CBET) מערכות תחת מספרי הפרס CBET-0,853,780 וCBET-1,159,344 והמכונים הלאומי לבריאות, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) תחת מספר הפרס 1R43ES022567-01, והמכון הלאומי לסרטן, תכנית הדמיה הסרטן תחת מספר הפרס CA127745-01. מכשיר ומינה IVIS משמש בעבודה זו התקבל מהתכנית של צבא ארצות הברית ביטחון אוניברסיטת מחקר מכשור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved? FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441 (2010).
- Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Biomedical Sciences and Engineering Conference (BSEC), Mar 15-17, Knoxville, TN, , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).
