Summary
बैक्टीरियल bioluminescence जीन कैसेट व्यक्त स्तनधारी कोशिकाओं (
Abstract
स्तनधारी सेल आधारित इन विट्रो assays में व्यापक रूप से विषाक्तता अध्ययन के लिए पशु परीक्षण के लिए विकल्प के रूप में नियोजित किया गया है, लेकिन कारण जुगनू luciferase आधारित स्क्रीनिंग तरीकों के विनाशकारी प्रकृति के लिए जरूरी हो जाता है कि समानांतर नमूना तैयार करने की उच्च मौद्रिक और समय की लागत के कारण सीमित कर दिया गया है . इस वीडियो ब्याज की चक्रवृद्धि की साइटोटोक्सिक प्रभाव की निगरानी के लिए एक सस्ता और सरल विधि के रूप में, एक luciferin सब्सट्रेट के विनाशकारी अलावा आवश्यकता नहीं है, जो स्वायत्त bioluminescent स्तनधारी कोशिकाओं के उपयोग का वर्णन करता है. स्थिरतापूर्वक पूर्ण बैक्टीरियल bioluminescence (luxCDABEfrp) जीन कैसेट व्यक्त स्तनधारी कोशिकाओं स्वायत्त एक ऑप्टिकल संकेत है कि उत्पादन एक बाह्य ऊर्जा स्रोत, या पारंपरिक रूप से है कि नमूने के विनाश से एक महंगी और संभवतः हस्तक्षेप luciferin सब्सट्रेट, उत्तेजना के अलावा बिना 490 एनएम पर चोटियों ऑप्टिकल इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान प्रदर्शनएस. बाहरी उत्तेजना से इस स्वतंत्रता परिणामी संकेत केवल सक्रिय चयापचय के दौरान पता लगाया है, जिसका अर्थ है कि केवल सेल पर bioluminescent प्रतिक्रिया को बनाए रखने के लिए बोझ स्थानों. Bioluminescent उत्पादन में परिवर्तन सेलुलर वृद्धि और चयापचय पर प्रतिकूल प्रभाव का संकेत कर रहे हैं क्योंकि यह विशेषता लक्स व्यक्त सेल लाइन साइटोटोक्सिक प्रभाव के खिलाफ एक biosentinel के रूप में उपयोग के लिए एक उत्कृष्ट उम्मीदवार बनाता है. इसी प्रकार, आवश्यक नमूना विनाश के स्वायत्त प्रकृति और कमी विषैला जोखिम की अवधि के दौरान वास्तविक समय में एक ही नमूना के दोहराया इमेजिंग परमिट और एक स्वचालित फैशन में मौजूदा इमेजिंग उपकरणों का उपयोग कर कई नमूने भर में प्रदर्शन किया जा सकता है.
Introduction
वे खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा उपभोक्ता उपयोग के लिए मंजूरी दे दी है इससे पहले अमेरिका में, मानव उपभोग के लिए इरादा दवाइयों और अन्य उत्पादों के व्यापक मूल्यांकन की आवश्यकता है. इस परीक्षण के प्रदर्शन के लिए वित्तीय बोझ काफी हद तक उपभोक्ताओं के लिए एक वृद्धि की लागत में नए परिसर के विकास और इसलिए अनुवाद की लागत बढ़ जाती है जो डेवलपर 1, पर रखा गया है. इस स्क्रीनिंग के पारंपरिक रूप से बहुत मानव मेजबान के लिए परदे के पीछे के रूप में कार्य करने के लिए पशु विषयों का उपयोग किया गया है, यह (Tox / ADME सोखना, वितरण, चयापचय, उत्सर्जन, और विषाक्तता पर सालाना खर्च एक अनुमान के अनुसार $ 2800000000, के साथ एक बड़े वित्तीय बोझ साबित हो गया है ) अकेले स्क्रीनिंग 2 और पशु मॉडल मज़बूती से मानव विषाक्तता प्रतिक्रियाओं 3 भविष्यवाणी नहीं कर सकते हैं सुझाव है कि बढ़ते सबूत. इसलिए, इन विट्रो मानव सेल संस्कृति आधारित परीक्षण में है क्योंकि इसके अपेक्षाकृत कम की पिछले दो दशकों में लोकप्रियता हासिल की हैलागत, उच्च throughput, और मानव जैव उपलब्धता और विष विज्ञान 4 का बेहतर प्रतिनिधित्व. वर्तमान सेल संस्कृति आधारित विषाक्तता स्क्रीनिंग तरीकों सेलुलर व्यवहार्यता 5 का मूल्यांकन करने के लिए, सेलुलर झिल्ली की अखंडता की जांच, या mitochondrial गतिविधि के स्तर पर नज़र रखने, endogenously उपलब्ध साइटोप्लाज्मिक एंजाइमों की गतिविधि स्क्रीनिंग, ऐसे एटीपी के स्तर की माप के रूप में विभिन्न endpoints, रोजगार , 6. माप इस प्रकार केवल एक ही समय बिंदु पर डेटा उत्पादन लिया जा सकता है हालांकि, इससे पहले की परवाह किए बिना चुना समापन बिंदु, इन तरीकों के सभी नमूने के विनाश की आवश्यकता होती है. नतीजतन, नमूने की बड़ी संख्या तैयार करने और बुनियादी विषाक्तता कैनेटीक्स पढ़ाई के लिए समानांतर में इलाज किया, फिर नए परिसर के विकास के लिए आवश्यक लागत और श्रम को जोड़ने की जरूरत है. वैकल्पिक रूप से, का उपयोग कर assays के ऐसे Gaussia luciferase 7, Vargula luciferase 8, और Metridia luciferase 9 के रूप में luciferase स्रावितसेल के लिए समाप्त करने की जरूरत है और समापन बिंदु माप के लिए मीडिया के एक अंश की आवश्यकता होती है, हालांकि, यह अभी भी पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर नमूना लेने तक ही सीमित हैं और भी एक्सोजेनस प्रकाश को सक्रिय substrates के अलावा आवश्यकता है कि विकसित किया गया है.
अपेक्षित नमूना विनाश की हानि के साथ ही substrates की लागत को खत्म करने से बचने के लिए एक मानव कोशिका लाइन इसी तरह की है कि जीवित कोशिकाओं की सतत निगरानी के लिए अनुमति देने के लिए पूरा बैक्टीरियल bioluminescence (लक्स) जीन कैसेट (luxCDABEfrp) व्यक्त अंजाम दिया गया है फ्लोरोसेंट डाई आधारित जीना सेल इमेजिंग के लिए, लेकिन अतिरिक्त फोटोन को सक्रिय और सूक्ष्म जांच प्रक्रिया के बिना. यह सेल लाइन इस प्रकार नमूना के विनाश से बचने, अनिवार्यता से बाहरी उत्तेजना के लिए आवश्यकता के बिना सतत, प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए एक ऑप्टिकल संकेत उत्पादन करने में सक्षम है. Mechanistically, इन कोशिकाओं से उत्पन्न bioluminescent संकेत परिणामएस luxAB का गठन luciferase एंजाइम कम राइबोफ्लेविन फॉस्फेट की उपस्थिति (एफआरपी जीन द्वारा FMN से साफ किया है जो FMNH 2, में एक लंबी श्रृंखला फैटी एल्डिहाइड (अंतर्जात substrates का उपयोग luxCDE जीन उत्पादों से संश्लेषित और पुनर्जीवित) के ऑक्सीकरण catalyzes जब उत्पाद) और आणविक ऑक्सीजन 10. मेजबान सेल में लक्स कैसेट की अभिव्यक्ति इसलिए उत्पादन और सेलुलर विनाश या एक्सोजेनस सब्सट्रेट अलावा बिना पता लगाया जा प्रकाश में सक्षम बनाता है. इसी तरह, लक्स जीन और endogenously उपलब्ध FMN, और ओ 2 cosubstrates, और FMNH 2 से FMN के रूपांतरण का समर्थन कर सकते हैं कि एक पर्यावरण के रखरखाव के लिए आवश्यकता के बीच बातचीत के परिणामस्वरूप bioluminescent संकेत ही रहने से पता लगाया जा सकता है कि यह सुनिश्चित करता है , metabolically सक्रिय कोशिकाओं.
इन जरूरतों पहले कि लक्स बस को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैएड bioluminescent उत्पादन सेलुलर जनसंख्या आकार 11 और उस विषाक्त यौगिक जोखिम एक खुराक प्रतिक्रिया फैशन 12 में autobioluminescent उत्पादन impairs के साथ दृढ़ता से संबद्ध है. यहाँ हम विषाक्तता परीक्षण के लिए autobioluminescent स्तनधारी कोशिकाओं के आवेदन को मान्य करने के लिए एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में जाना जाता डीएनए हानिकारक गतिविधि के साथ bleomycin परिवार के एक एंटीबायोटिक के स्वचालित विषाक्तता स्क्रीनिंग प्रदर्शित करने के लिए एक पहले से विशेषता autobioluminescent मानव भ्रूण गुर्दे (HEK293) सेल लाइन 11 का उपयोग करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. सेल तैयार
- तरल नाइट्रोजन में जमे हुए स्टॉक से bioluminescent HEK293 कोशिकाओं की एक शीशी की वसूली और Dulbecco संशोधित ईगल 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक मध्यम (DMEM), 0.01 मिमी nonessential अमीनो एसिड, 1x एंटीबायोटिक कवकनाशी, और एक टी में 0.01 मिमी सोडियम पाइरूवेट में उन्हें विकसित 37 में 75 टिशू कल्चर कुप्पी डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
नोट: मीडिया और पूरक घटक सेल लाइनों के आधार पर अलग अलग होंगे और इसलिए तदनुसार चुना जाना चाहिए. - ताज़ा मध्यम हर पहुँचने तक 2-3 दिन ~ 80% संगम.
नोट: आवश्यक कोशिकाओं की राशि प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर किया जाएगा. यदि आवश्यक हो, अधिक कोशिकाओं subculturing द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. - परीक्षण के लिए हार्वेस्ट कोशिकाओं.
- मध्यम निकालें और फॉस्फेट के साथ कोशिकाओं को धो धीरे कुप्पी घूमता और फिर छोड़ते पीबीएस खर्च से खारा (पीबीएस) buffered.
- 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर trypsin और सेते जोड़ें,या कोशिकाओं तक कुप्पी से अलग है.
- पीबीएस में अलग कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एक साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब में उन्हें स्थानांतरण.
नोट: nonadherent सेल लाइनों centrifugation द्वारा, अलग कोशिकाओं का इस्तेमाल किया और पीबीएस के साथ एक बार धो रहे हैं.
- एक hemacytometer या अन्य सेल गिनती प्रणाली का उपयोग कर कुल कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं.
- 5 मिनट के लिए 300 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ताजा, prewarmed मध्यम में कोशिकाओं resuspend.
- एक अपारदर्शी बहु अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं में कोशिकाओं के बीज बराबर संख्या. इस उदाहरण में, प्लेट 5 एक्स 10 एक काले रंग की 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में एक 1 मिलीलीटर मात्रा में 5 कोशिकाओं. प्लेट तीन प्रतियों कुओं में मध्यम के एक बराबर मात्रा नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करने के लिए.
नोट: प्रत्येक कुएं में चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या लचीला है और व्यक्तिगत प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. प्रत्येक bioluminescent सेल लाइन के लिए, प्रयोगात्मक सेल नंबर और biolumi के बीच रिश्ता तयnescent उत्पादन, साथ ही कम से कम पता लगाने योग्य सेल से पहले किसी भी विषाक्तता परीक्षण के लिए गिनती. मानकीकृत इमेजिंग परिस्थितियों में आबादी के आकार की एक विस्तृत रेंज (उदाहरण के लिए, 1 x 10 3 1 x 10 6 कोशिकाओं) भर में यह उपाय bioluminescence ऐसा करने के लिए. - नीचे बताए अनुसार परीक्षण परिसर (एस) के साथ कोशिकाओं को समझो.
2. रासायनिक तैयारी
- एक केंद्रित शेयर समाधान के रूप में परीक्षण किया जा रहा रासायनिक तैयार. इस उदाहरण में, एक 100 मिलीग्राम / bleomycin परिवार के एक एंटीबायोटिक की मिलीलीटर शेयर समाधान का उपयोग करें.
नोट: एक कार्बनिक विलायक रासायनिक इसके लिए एक वाहन के रूप में प्रयोग किया जाता है, खासकर अगर संभावित वाहन आधारित जहरीले प्रभाव को कम करने के लिए, यह शेयर एकाग्रता कम से कम 1,000 बार वांछित बाद आवेदन एकाग्रता होने की सिफारिश की है. - सीधे कोशिकाओं को तैयार रासायनिक शेयर जोड़ें. इस उदाहरण में, खुराक अंतिम 100 की सांद्रता, 200, 300, और त्रि में 400 माइक्रोग्राम / एमएल पर ब्याज की एंटीबायोटिककुओं मुड़ा हुआ. नियंत्रण के रूप में अनुपचारित कोशिकाओं के तीन कुओं छोड़ दें.
नोट: लक्ष्य रसायन के अंतिम एकाग्रता विशिष्ट प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर चुना जाना चाहिए. सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला के सामान्य रूप से विषाक्त प्रभाव की एक पूरी स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए परीक्षण किया है.
3. इमेजिंग और डेटा विश्लेषण
- तुरंत रासायनिक इसके बाद, छवि अधिग्रहण और bioluminescence माप के लिए उपयुक्त साधन की इमेजिंग कक्ष में थाली जगह.
- प्रत्येक पढ़ने के लिए एक 10 मिनट के एकीकरण के समय का उपयोग करते हुए एक 24 घंटे की अवधि में उपाय bioluminescence हर 15 मिनट.
नोट: इस उदाहरण में प्रयुक्त एकीकरण समय एक प्रति प्लेट के आधार पर है और चुनाव के दूसरे luminometers का उपयोग कर एक प्रति अच्छी तरह आधार पर माप के लिए समायोजित किया जा सकता है. एकीकरण के समय को चुना bioluminescent सेल लाइन के आधार पर भी समायोजित किया जा सकता है. Bioluminescence सेल विनाश या किसी भी बाहरी उत्तेजना के बिना स्वायत्त उत्पादन किया गया है, इसलिए पढ़ाबैठकों विशिष्ट प्रायोगिक उद्देश्यों को पूरा करने के लिए किसी भी इच्छित समय बिंदु पर ले जाया जा सकता है. - संगत सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए ब्याज की एक क्षेत्र की पहचान के एक अच्छी तरह से bioluminescent तीव्रता यों. तो कुल प्रवाह (फोटॉनों / सेकेंड) या प्रत्येक नमूने की औसत चमक (फोटॉनों / सेमी / दूसरी 2 / steridian) के रूप में प्रकाश उत्पादन प्रदर्शित करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इस अध्ययन में, autobioluminescent HEK293 कोशिकाओं की गतिशीलता एंटीबायोटिक जोखिम (चित्रा 1) के जवाब में एक 24 घंटे की अवधि में लगातार निगरानी की गई. के लिए बाध्य करने और डीएनए 13 cleaving से जीवित कोशिकाओं को मारने के लिए जाना जाता bleomycin परिवार का एक सदस्य है जो इस एंटीबायोटिक, के जहरीले प्रभाव, pseudocolor चित्रों के माध्यम से सीधे देखे जा सकते हैं जो अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में bioluminescent उत्पादन में कमी, के माध्यम से प्रदर्शन किया गया (चित्रा 2). अलग उपचार परिस्थितियों में नमूनों की दोहराया समानांतर स्क्रीनिंग की अनुमति दी है जो इन कोशिकाओं, के autobioluminescent प्रकृति आसान खुराक प्रतिक्रिया विश्लेषण के लिए किसी भी समय बिंदु पर विभिन्न सांद्रता की तुलना के लिए अनुमति दी. उदाहरण के लिए, bioluminescence कि बढ़ती एंटीबायोटिक उपचार resul दिखा, चित्रा 3 में रासायनिक सांद्रता के खिलाफ साजिश रची गई थी, 15 के बाद कोशिकाओं से 18 घंटा, और उपचार के 20 घंटा घंटा उत्पादनएक खुराक प्रतिक्रिया ढंग से bioluminescent उत्पादन की कमी में टेड.
चित्रा 1. रासायनिक जोखिम. अनिवार्यता से bioluminescent HEK293 कोशिकाओं के जवाब में bioluminescent गतिशीलता की सतत ट्रैकिंग bleomycin परिवार के एक एंटीबायोटिक के विभिन्न सांद्रता के संपर्क में थे. Bioluminescent उत्पादन जोखिम के एक 24 घंटे की अवधि (एक थाली, मतलब ± मानक त्रुटि पर तकनीकी triplicates के लिए प्रतिनिधि डेटा) (14 से पुनर्मुद्रण) पर नजर रखी थी.
चित्रा 2. इलाज कोशिकाओं की pseudocolor छवियों.
चित्रा 3. रासायनिक जोखिम की खुराक प्रतिक्रिया. Bioluminescent 15 घंटे बाद उत्पादन, 18 घंटे, और जोखिम के 20 घंटा एंटीबायोटिक उपचार में वृद्धि एक खुराक प्रतिक्रिया ढंग से प्रकाश उत्पादन की कमी (एक थाली पर तकनीकी triplicates के लिए प्रतिनिधि डेटा, में कहा कि परिणाम से पता चला मतलब ± मानक त्रुटि). आर 2 मूल्य रेखीय प्रतिगमन के लिए गणना की है.
की तालिका 1. प्रतिनिधि तुलनाautobioluminescent (लक्स आधारित) मानव कोशिकाओं या एक पारंपरिक जुगनू luciferase (ल्यूक) के आधार पर एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में परख का उपयोग कर प्रदर्शन किया विषाक्तता स्क्रीन.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस विधि जीवित कोशिकाओं लगातार उनके जीवनकाल में नजर रखी जा करने की अनुमति देता है कि इन विट्रो cytotoxicity स्क्रीनिंग परख में एक के रूप में स्वतंत्र रूप bioluminescent स्तनधारी कोशिकाओं के उपयोग को दर्शाता है. इस प्रोटोकॉल लचीला है और आवश्यकता के रूप में विशिष्ट प्रयोगात्मक शर्तों को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, प्रयोग तीव्र विषाक्त प्रभाव पर नज़र रखने के लिए उपयुक्त है यहाँ प्रस्तुत है, लेकिन बार बार वृद्धि की समय अंतराल (यानी हर 24 घंटे) में इमेजिंग और बीच मानक ऊष्मायन शर्तों के तहत कोशिकाओं को बनाए रखने के द्वारा धीमी गति से अभिनय या दीर्घकालिक प्रभाव का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है रीडिंग. इसके अलावा, एकीकरण समय bioluminescent सेल लाइन के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. विभिन्न एकीकरण के साथ बार इमेजिंग के एक प्रारंभिक प्रयोग इष्टतम पढ़ने विंडो निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है. इस उदाहरण में प्रयुक्त 10 मिनट एकीकरण सभी treatmen भर bioluminescent उत्पादन के गतिशील रेंज को उजागर करने के लिए चुना गया थाटी शर्तों, लेकिन एक छोटी पढ़ने फ्रेम आवेदन के आधार पर लागू किया जा सकता है. 24 अच्छी तरह से थाली इस उदाहरण में प्रदर्शन के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि इसी प्रकार से, 96 - या 384 अच्छी तरह प्लेटें उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है. प्रतिनिधि परिणाम एक ही थाली पर तकनीकी triplicates का प्रदर्शन यहाँ दिखाया गया है, यह ब्याज की चक्रवृद्धि जब परीक्षण उपचार के स्तर के बीच सांख्यिकीय महत्व स्थापित करने के लिए किया जाना चाहिए अलग प्लेटों पर कि स्वतंत्र assays के नोट करना महत्वपूर्ण है. इस परख अलग पता लगाने संवेदनशीलता के साथ उपकरणों की एक किस्म में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है क्योंकि इसके अलावा, यह स्वीकार्य संकेत करने वाली शोर और संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात प्रति एक साधन के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए की सिफारिश की है.
यह पहले से एक 24 अच्छी तरह से थाली में कम से कम पता लगाने योग्य सेल संख्या यहां 15 वर्णित इमेजिंग परिस्थितियों में लगभग 1.5 x 10 4 कोशिकाओं था कि निर्धारित किया गया था.हालांकि, यह विश्वसनीय पता लगाने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या अच्छी तरह से आकार के साथ बदलता रहता है, और छोटे कुओं का उपयोग प्रति इकाई क्षेत्र bioluminescent कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि से पता लगाने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या कम कर देता है कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है. इसलिए, यह दृढ़ता से bioluminescent उत्पादन और जनसंख्या के आकार के बीच संबंध पहले की स्क्रीनिंग के लिए वांछित इमेजिंग शर्तों के तहत निर्धारित करने की सिफारिश की है. इसके अलावा, एक photomultiplier ट्यूब आधारित प्लेट रीडर भी IVIS Lumina इमेजिंग प्रणाली के स्थान पर डाटा अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन pseudocolor छवियों को प्राप्त करने की हानि पर. भले ही कार्यरत इमेजिंग साधन के, एक अपारदर्शी थाली संकेत हानि और / या थाली गुजर फोटॉनों के कारण आसन्न कुओं की bioluminescent प्रदूषण को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
अन्य आमतौर पर कार्यरत सेल संस्कृति आधारित दृष्टिकोण की तुलना में, इस विधि डाटा अधिग्रहण performe हो सकता है कि लाभ प्रदान करता हैनमूना विनाश या सब्सट्रेट इसके लिए जरूरत के बाद से एक पूरी तरह से स्वचालित फैशन में घ समाप्त हो रहा है. तरीकों सेल की आवश्यकता होती है सेल का उपयोग करते समय यह भी जरूरी है कि मौद्रिक या समय की लागत में समवर्ती वृद्धि के बिना जहर कैनेटीक्स के एक बढ़ाया संकल्प प्रदान करता है जो जोखिम की एक लम्बी अवधि में ही सेल की आबादी पर गतिशील प्रभाव का लगातार नज़र रखने के लिए अनुमति देता है ( तालिका 1). हालांकि, इस पद्धति का एक महत्वपूर्ण सीमा है कि सेल प्रकार विशिष्ट परीक्षण जांच के लिए एक autobioluminescent फेनोटाइप उत्पन्न करने के लिए ब्याज की प्रत्येक कोशिका प्रकार में लक्स कैसेट की स्थिर अभिकर्मक की आवश्यकता होगी है. कोशिकाओं बाद भविष्य में उपयोग के लिए तरल नाइट्रोजन में संग्रहित किया जा सकता है के बाद से इस जरूरत को केवल एक बार प्रदर्शन किया है, अभिकर्मक प्रक्रिया एक संभावित समय लेने का प्रयास है.
इस शर्त के बावजूद, प्रोटोकॉल यहाँ सरल और सस्ती है, आवश्यकता है उल्लिखितएस न्यूनतम हाथ पर प्रयोगशाला कर्मियों से काम करते हैं, किसी भी अतिरिक्त अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, और सीधे विषाक्तता व्याख्या के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि डेटा उत्पन्न नहीं करता है. इन कारणों के लिए, हम autobioluminescent स्तनधारी सेल लाइनों अधिक विस्तृत बहाव के मूल्यांकन की आवश्यकता है कि यौगिकों का चयन करने के लिए उम्मीदवारों की एक बड़ी संख्या का तेजी से प्रारंभिक जांच के लिए एक उच्च throughput परख के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है समाप्त.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
डीएम बंद, एसए ripp, और जी एस Sayler 490 बायोटेक, इंक के संस्थापक और मालिक हैं
Acknowledgments
ये शोध प्रयासों रासायनिक, जैव अभियांत्रिकी, पर्यावरण, और पुरस्कार संख्या CBET-0853780 और CBET-1159344 और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, पर्यावरणीय स्वास्थ्य विज्ञान के राष्ट्रीय संस्थान (NIEHS) के तहत परिवहन (CBET) सिस्टम के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन प्रभाग द्वारा समर्थित थे पुरस्कार संख्या 1R43ES022567-01, और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, पुरस्कार संख्या CA127745-01 के तहत कैंसर इमेजिंग प्रोग्राम के तहत. इस काम में इस्तेमाल IVIS Lumina साधन अमेरिकी सेना रक्षा विश्वविद्यालय अनुसंधान इंस्ट्रूमेंटेशन कार्यक्रम से प्राप्त हुई थी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved? FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441 (2010).
- Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Biomedical Sciences and Engineering Conference (BSEC), Mar 15-17, Knoxville, TN, , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).
