Drosophila larver er en attraktiv model for billeddannelse på grund af deres gennemskinnelige neglebånd og kraftfulde genetik. Denne protokol beskriver, hvordan at udnytte en enkelt-lags PDMS-enhed, kaldet 'larve chip' for levende billeddannelse af cellulære processer indenfor neuroner i 3. stadie Drosophila larver.
Live-billeddannelse er en vigtig teknik for at studere celle biologiske processer, men det kan være udfordrende i levende dyr. Den gennemskinnelige neglebånd af Drosophila larve gør det til en attraktiv model organisme til levende billeddiagnostiske undersøgelser. En vigtig udfordring for levende billeddiagnostiske teknikker er imidlertid at noninvasively immobilisere og placere et dyr på mikroskopet. Denne protokol udgør en enkel og nem at bruge metoden til at immobilisere og billeddannelse Drosophila larver på en polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluid enhed, som vi kalder den "larve chip". Larven chip består af en tætsiddende PDMS mikrokammer der er knyttet til en tynd dækglas, der ved anvendelse af et vakuum via en sprøjte, immoboliserer dyret og bringer ventrale strukturer såsom nerve ledning, segmenter nerver og krop væg muskler, inden for tæt på dækglasset. Dette giver mulighed for høj opløsning billeddannelse, og vigtigere, undgår anvendelsen af anesthetics og kemikalier, hvilket letter undersøgelse af en bred vifte af fysiologiske processer. Da larver let komme immobiliseringen, kan de let underkastes flere billedoptagelse. Dette giver mulighed for longitudinelle studier over tid kurser lige fra timer til dage. Denne protokol beskriver trin-for-trin, hvordan du forbereder chip og hvordan man udnytter chippen for levende billeddannelse af neuronale begivenheder i 3. instar larver. Disse hændelser omfatter den hurtige transport af organeller i axoner, calcium svar til skade, og time-lapse undersøgelser af handel med foto-konvertibelt proteiner over lange afstande og tidshorisonter. En anden anvendelse af chip er at studere regenerative og degenerative reaktioner på axonal skade, så den anden del af denne protokol beskriver en ny og enkel procedure for at skade axoner inden perifere nerver ved en segmental nerve crush.
Bananfluen, Drosophila melanogaster, er blevet udnyttet som en model organisme i over 100 år, og har vist sig medvirkende til at definere grundlæggende signalering og udviklingsmæssige veje, der er bevaret fra hvirvelløse dyr til menneske. Live-billeddannelse er en vigtig tilgang til at studere cellulære mekanismer, og den simple krop plan og gennemskinnelige neglebånd af Drosophila larve gør det til et attraktivt system til billeddannelse, især da der er mange genetiske værktøjer til rådighed for at udtrykke fluorescens mærkede proteiner i bestemte celletyper.
En vigtig udfordring for levende billeddiagnostiske teknikker er at noninvasively immobilisere og placere et dyr til mikroskopi. Konventionelle immobilisering tilgange omfatter dissektion 1,2 eller anvendelse af chloroform som begge dræbe dyret. Anæstetika ether 4 og isofluoran 5-8 er også blevet anvendt. Mens bedøvelsesmidler giver mange fordeleDe inhiberer også neurale aktivitet og vigtig fysiologi (herunder hjerteslag) 9-11, kan derfor påvirke processen undersøgt og skaber stress på dyret. Der er også menneskelige sikkerhedsmæssige bekymringer for at arbejde med ether og isofluoran.
Vi har udviklet en stoffri metode til at immobilisere Drosophila larver i et enkelt lag PDMS mikrofluid enhed, som vi kalder den "larve chip '12. Denne protokol vil beskrive, hvordan opnå eller gøre larven chip, og hvordan du udnytter det for levende billeddannelse i tidlig iscenesat 3. instar larver. Chippen består af en tætsiddende mikrokammer, der ved anvendelse af et vakuum via en sprøjte, immoboliserer dyret via blid mekanisk kraft. Immobiliseringsprocessen metode bringer ventrale strukturer såsom nerve ledning, segmenter nerver, og krop væg muskler, inden for tæt på et dækglas. Dette giver mulighed for høj opløsning billeddannelse af sådanne strukturer med høj numerisk apertidige (høj forstørrelse) mål.
Fordele ved larve chip i forhold til andre konventionelle teknikker omfatter følgende: (i) Anvendelse af larve chip erstatter brugen af kemikalier, der giver mulighed for in vivo billeddannelse af unanesthetized dyr. (Ii) Larver inddrive straks efter frigivelse fra chippen (i modsætning til en 2 timers restitutionsperiode for isofluoran 8,13). Dette giver mulighed for billedbehandling i brede tidsskalaer, der spænder fra millisekunder til minutter, timer og dage. (Iii) anvendelse af PDMS, som er et gaspermeabelt materiale, gør det muligt for kontinuerlig diffusion af oxygen / luft fra omgivelserne ind i larve kroppen. (Iv) Chippen er nem og sikker at bruge, og (v) det er genbruges, og kan fremstilles til en minimal pris.
Ud over instruktioner til brug af larve-chip, vil denne protokol giver flere eksempler på dens anvendelse til at studere neuronale begivenheder i 3. instar larver. Disse omfatter levende billeddannelse af Axonal transport, calcium svar til skade, og time-lapse undersøgelser af handel med foto-konvertibelt proteiner over lange afstande og tidshorisonter.
En anden anvendelse af chippen er at studere neuronale reaktioner på axonal skade. Til dette en yderligere procedure er beskrevet (i del 3) for skade axoner inden perifere nerver ved en segmental nerve crush. Denne enkle Assayet kan udføres både hurtigt og reproducerbart under en standard dissektion stereomikroskop, som giver mulighed for mange dyr, der skal behandles på samme tid. Cellulære reaktioner på skaden kan studeres ved billeddannelse i larve chip.
Gøre eller opnåelse larve chip:
Larven chip består af en PDMS blok (det såkaldte 'PDMS chip ") knyttet til en dækglas. Protokollen i trin 1 beskrives proceduren for fremstilling og anvendelse af larve chips, under forudsætning af en SU-8 mug er til rådighed. SU-8 formen er microfabricated ved fotolitografisk mønstring en 140 um tyk SU-8 fotoresistlag på en silicium wafer (for detaljer se Ghannad-Rezaie et al. 12). Som microfabrication af SU-8 skimmel kræver adgang til specialudstyr, anbefaler vi at bestille det fra en microfabrication facilitet (f.eks. Den LNF facilitet på University of Michigan 14), eller fra et støberi ved at sende dem chip-design, der leveres som en supplerende fil. Hvis man ønsker at ændre udformningen af PDMS chip (fx til anvendelse med larver af forskellige størrelser), en CAD-software, der håndterer DXF-filer (f.eks Autocad) kan anvendes. En SU-8 mug kan også ske in-house at følge instruktionerne i Mondal et al. Kan 27 Mange læsere finder det bekvemt at blot at opnå en prøve PDMS chip til at afprøve teknikken før opdigte deres egne chips. Dette vil blive gjort frit tilgængelige efter anmodning.
Anvendelse af mikrofluid 'larve chip' for levende billeddannelse:
Immobiliseringen metode larve chip undgår anvendelsen af anæstetika, og i stedet involverer tryk, via anvendelse af et vakuum til at begrænse dyrets bevægelse. Mens dyr kan overleve immobilisering i chippen for flere timer 12, en kortere immobilisering periode (5-15 min) anbefales. Det er tid nok til billeddannelse mange cellulære begivenheder af interesse, herunder ændringer i intracellulært calcium, eller hurtigt axonal transport. Det er også tid nok til de ønskede manipulationer i levende dyr, såsom laser-baserede mikrokirurgi fotoblegning og photoconverSion.
At studere begivenheder på langs over en længere periode i et enkelt dyr, kan dyrene anbringes i chippen og filmede flere gange, adskilt af perioder med hvile. Druesaft agarplader er ideelle til at hvile mellem billeddannelse sessioner, da de giver en nem fødekilde og fugtighed. Flere billeddiagnostiske sessioner gøre påvirke larvernes overlevelse til en vis grad, da hver session bærer en vis risiko for at beskadige dyret (se del 2 i fejlfinding, nedenfor). Dyr kan rutinemæssigt afbildes> 5 gange i løbet af to dage med en overlevelsesrate på mere end 50%. Da dyrene ikke bedøves, de er sunde og bevægelige straks efter frigivelse af vakuumet i chippen. Der er derfor ikke behov for nyttiggørelse tid mellem billeddiagnostiske sessioner, så den tid, afstand mellem sessioner er fleksibel og kan tilpasses til målsætningerne i eksperimentet.
Fejlfinding:
Den mest almindelige tekniske eranlægger sag med larve chip og anbefalede løsninger er følgende:
(1) Dyret bevæger sig for meget. For meget mobilitet kan forstyrre de billeddannende mål. De mest almindelige årsager til dette i larve chippen er a) dyret er for lille til chippen, eller b) vakuumtrykket påføres under immobiliseringstrinet er kompromitteret. Larven chip beskrevet i denne protokol er designet til tidlig iscenesat 3. instar larver. Den optimale størrelse for dyret er 3,5-4 mm i længden (langs anteroposterior aksen). For at sikre at vakuumtrykket er tilstrækkelig, Træk sprøjten 2-2,5 ml, eller indtil der mærkes modstand i håndtaget. En indikation af, at vakuum fungerer er, at små bobler i omkredsen kanalen kan ses bevæge sig langsomt mod vakuumkilden. En anden indikation er, at dækglasset altid skulle rejse med chippen, når chippen løftes fra toppen (og dette er den anbefalede metode til transport af kammeretnår larverne er positioneret, og vakuummet er tændt). Vakuum kan blive kompromitteret, hvis der er revner i slangen, eller hvis der er olie i slangen. Dette kan nemt løses ved at erstatte 23 G dispensering nålespidsen og polyethylen-50-rør (fra trin 1,6-1,14).
(2) Dyret dør efter billeddannelse i chippen. Metoden er bestemt til at forårsage minimal stress på dyret, og dyr af vildtype genotype har en overlevelsesrate> 90%, selv efter en times immobilisering på chippen 12.. Da nogle genotyper kan være mindre modstandsdygtige over for stress i chippen, så tjek først at vildtype dyr (for eksempel Canton S) overleve immobilisering teknik. a) Den mest almindelige årsag til dødelighed er forkert positionering af larve (se figur 2G-H). Såfremt dele af neglebånd, hoved eller luftrør er ikke helt i kammeret, så de kan blive beskadiget under immobilisering og enlarve, der er for stor til den chip (> 4 mm) er mindre tilbøjelige til at overleve. b) En mindre almindelig årsag til dødelighed er brugen af for meget pres eller vakuum, når du lægger chippen. Når placeret korrekt i den chip, tryk fra vakuum er veltolereret. Men overdrevent tryk, enten fra vakuum eller i den indledende fase af at positionere dyret kan være et problem. Det er bedst at lære graden nødvendige tryk empirisk ved forsøg med vildtype larver af den korrekte størrelse. c) Hvis der for meget Halocarbon olie dækker dyrets luftrør dyret potentielt kan have problemer med langsigtede overlevelse. Olien spiller flere vigtige roller i chippen: Det er vigtigt for oprettelsen af det vakuum, optikken under billedbehandling, og det modvirker udtørring i chippen. Men overdreven olie bør undgås. (Dette kan også føre til olie i slangen og sprøjten, kompromittere vakuum). De foreslåede protokol frakker bare den ventrale side af larve med olie, så reFlytter overskydende olie ved placering af larve på et rent dækglas før overførsel til den endelige dækglas til billeddannelse. d) fototoxicitet kan opleves fra imaging session. Som med alle levende billedbehandling ansøgning, er det ideelt at bruge korte eksponeringstider med lav intensitet laserlys, hvilket bedst opnås ved hjælp af et meget følsomt kamera eller detektor. Forsøge at minimere belysning med UV-lys, herunder bredspektret lys lavet af Hg lyskilder.
Andre spørgsmål og fremtidige retninger:
Da denne metode ikke udnytter bedøvelsesmidler, fortsætter dyrets hjerte til at slå. Dette skaber en vis uundgåelig mobilitet, som påvirker billeddannelse nogle steder mere end andre. Eksemplerne her viser, at den ventrale nerve ledning, segmenter nerver og krop væg kan let filmede uden indblanding fra hjerteslag. I tilfælde, hvor hjerteslag påvirker billeddannelse, kan de regelmæssige bevægelser undertiden korrigeres for medi analyse software (for eksempel Image Stabilizer plugin til ImageJ). Det fungerer godt, når de enkelte objekter bevæger sig på en hurtig tidsskala (fx ~ 1 mM / sek til hurtig aksonal transport) eller på en meget langsom tidsskala (minutter til timer). Men når det objekt (er) af interesse farten med en række hastigheder og retninger, kan det være sværere at korrigere for hjerteslag inducerede bevægelser.
Et andet problem er mindre variabilitet i optik fra dyr til dyr, eller mellem flere billedoptagelse af samme dyr i chippen. Jo dybere objekt af interesse er i dyret, jo større denne variation vil være. Segmental nerver og den ventrale nerve ledningen er normalt for dybt inden så dyret, der skal afbildes på en regelmæssig mikroskop. Den milde overtryk i larve chip skubber Men disse strukturer meget tæt på neglebånd og dækglasset. Den nøjagtige afstand af disse strukturer fra dækglasset vil have små variationer fra trundervægter le til retssagen. Variationen for objekter lukke kutikula, såsom cellelegemer af sensoriske neuroner, er mindre. Det er derfor vigtigt, især for at foretage målinger af intensitet, at udnytte et stort antal dyr og uafhængige forsøg at tage højde for variabiliteten i optik.
Mens her viste eksempler har fokuseret på processer inden for neuroner, bør tilgangen være modtagelig for billeddannelse nogen struktur i dyret, der kan bringes i fokus dybde af mikroskop mål. Dette omfatter neglebånd, krop væg muskler, og deres NMJs. Trachea på den ventrale side af dyret og potentielt dele af fordøjelseskanalen kan også afbildes. Dyret kan også være placeret med sin dorsale side mod dækglasset til kortvarig billeddannelse af strukturer nær den dorsale overflade. Evnen til billede strukturer dybt inde i dyret er begrænset af distancen af mikroskop mål anvendes. Strukturer såsom imaginal diske er utilgængelige for høj forstørrelse (f.eks 40X) mål.
Larven chips, der er beskrevet i denne protokol er designet til larver i begyndelsen af 3. instar etape (spænder i størrelse fra 3,5 til 4 mm). Men mange interessante spørgsmål kræver billedbehandling på forskellige larvestadier. Mindre chips til at rumme 2 nd instar larver, eller større chips til at rumme sent 3. instars kan nemt udformet efter samme princip. (Supplerende Figur 1 indeholder en let modificerbare DXF-fil for at gøre silicium forme med ændrede kammer størrelser). Det enkle princip om den reversible sæl kan endog anvendes til andre organismer såsom C. elegans eller zebrafisk, med de vigtigste variant er kammerets størrelse. En nyttig fremtidige retning er at designe en chip, som kan immobilisere mange dyr på én gang, skal bruges til screening formål. Men for dette, ville konstruktionen skal være væsentligt anderledesfra den aktuelle enhed, hvor spørgsmål om at placere dyret på chippen skal behandles for hvert dyr uafhængigt.
Den nerveknusning assay til at studere skade reaktioner i larvernes perifere nerver:
Den nerve crush beskrevne analyse her larve segmental nerver er en simpel metode til at indføre en skade på perifere axoner i Drosophila. Fordelene ved denne metode kan nævnes: a) er det nemt at foretage med standardværktøjer findes i en Drosophila lab (et stereomikroskop CO 2 kilde og tang) b) det kan gennemføres hurtigt for mange dyr, hvilket gør biokemisk analyse af nerve snore efter skade gennemførlig 14 c) de molekylære og cellulære reaktioner på denne skade er meget reproducerbar 14,15,28 og kan bruges til at opdage processer, der også er vigtige for vertebrate neuroner 29,30.
Alternative metoder til skade neuroner er at focusa kraftig laser, for eksempel en pulserende UV eller femtosekund laser, at afskære en Axon via laser mikrokirurgi 17,31-33. Larven chip er en ideel metode til at positionere dyret for sådan mikrokirurgi. Men på grund af mindre forskelle i optik mellem forsøg, diskuteret ovenfor, kan laser-baserede metode være vanskeligere at gengive i larver, især i larve segmentariske nerver. Også laserbaseret axonal skade kræver mere tid til at placere hvert dyr, og derfor er vanskeligere at gennemføre i stor skala (med et stort antal dyr).
Fejlfinding:
Den hyppigst forekommende teknisk spørgsmål fra nerveknusning er død fra skader på indre organer. Ved udførelse af knuse, er det vigtigt ikke at klemme den ventrale nerve ledning, spytkirtler, eller tarmene. Det er også vigtigt ikke at punktere kutikula. Disse spørgsmål er bedst undgås ved at bringe tang ved en vinkel på 45 ° neglebånd overflade (se figur 3).
Kvaliteten af tangen har en stor indflydelse på effektiviteten af knuse og overlevelse bagefter. Vi anbefaler Dumostar nummer 5 pincet. For at bevare deres skarphed, skal tangen håndteres med omhu, ikke anvendes til andre formål, og erstattet når de bliver sløve eller bøjet.
Størrelsen af dyret kan også påvirke effektiviteten af crush. Små dyr (mindre end 3 mm i længden) er langt mindre tilbøjelige til at overleve skaden. Med store dyr (vandrer 3 rd instars), er det mere vanskeligt at finde nerver og undgå skader på de større spytkirtler og tarme, og der er mindre tid til at studere skade reaktioner før pupation. Den nerve crush er mest effektivt gennemført i begyndelsen af 3. stadiums larver (som er ~ 3-4,5 mm i længden langs anteroposterior aksen).
Fødekilde at dyret er hævet på kan påvirkestyrken af neglebånd og overlevelse efter crush. Det anbefales at opdrætte dyr i fødevarer fremstillet af en standard gær-glucose opskrift.
Den bedste metode til at lære at gøre det knuse effektivt, er at øve sig på mange dyr, først med det primære mål at opnå overlevelse (og ikke pupation) 24 timer efter crush. Begyndere normalt har en lav overlevelsesrate (fx 10%), men når teknikken er lært, kan overlevelsesrater nå ~ 90%.
Andre spørgsmål og fremtidige retninger:
Knuse analysen giver en kraftfuld metode til at studere spiring af Axon proksimalt skaden site og degeneration af axoner og synapser distale til skaden site. Mens satserne for degeneration varierer mellem forskellige neuron typer, de er meget reproducerbar inden for en given neuron typen, der giver hyldest til reproducerbarheden af skaden analysen.
I modsætning hertil "regenerativ 'spiringrespons observeret i proksimale axoner er mere udfordrende at studere. Alle axoner i segmental nerve indlede omfattende spiring tæt på skadestedet (se for eksempel figur 6 og figur 3). Men omfanget af spiring kan variere fra neuron til neuron, og er vanskelige at kvantificere. Der kan konstateres en lignende grad, og variation i spiring efter flere fokale læsioner af enlige motoneurons i segmental nerver indført ved hjælp af en UV pulserende farvestof laser. Vi tolker, at den nondiscriminate retningen af den spirende skyldes fraværet af vejlednings stikord i de segmenter nerver. I modsætning hertil sensoriske neuron axoner såret ved hjælp af laser tæt på deres cellelegemer undergår ny axonal vækst i samme retning som den tabte Axon 34. Axoner i denne region af dyret sandsynligvis udsat for mere specifik positionelle information til vejledning af regenererende axoner. Miljøet inden segmental nerver er usandsynligt at have meget resemblance til det miljø, som axoner oprindeligt navigerede under deres vejledning i fosterstadiet, og derfor forventes ikke at have oplysninger til at guide regenererende axoner.
En anden begrænsning for at studere regeneration ved hjælp af segmental nerveknusning analysen er, at sårede sensoriske og motoneuron axoner har fortsat en betydelig afstand til at dække (0.25-1 mm) for at nå deres mål, og en begrænset tidsramme (<3 dage), inden dyret gennemgår pupation. En nylig undersøgelse har identificeret en genetisk manipulation af prothoraciotropic hormonreceptor som tredobler varigheden af 3. instar larvestadiet 35. Denne manipulation vil forlænge tidsrammen for at studere genopretning og degeneration af neuroner efter skaden betydeligt til 9 i stedet for 3 dage. Dette kan være lang nok til at observere nye begivenheder, såsom genåbning af en skadet axon med sin postsynaptiske mål, især hvis skaden er foranlediget tæt på den synaptiske slutning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (tilskud nummer IOS-0.842.701 til CAC), og National Institute of Health (R00MH080599 til BY, R21 NS062313 til NC, og NS069844 til CAC). Vi vil gerne anerkende James Schutt, Emily Han, og Leni Truong for teknisk support, og Bloomington Stock center for flueliner. Alle chips blev fabrikeret på Lurie nanofabrikation Facility på University of Michigan.
0.5 mm Polyethylene tubing | Fisher scientific | 14-170-11B | Polyethylene tubing, I.D. = 0.023’’, O.D. = 0.038’’ |
1 mm Polyurethane tubing | Fisher scientific | BB521-63 | Polyurethane tubing, I.D. = 0.063’’, O.D. = 0.125’’ |
barb to barb connector | Bio Rad | 732-8300 | 0.8 mm barb to barb connector |
3-way stopcock valve | Bio Rad | 732-8104 | Screw on valve for the syringe |
Syringe (20 ml) | Fisher scientific | 14-817-33 | Screw on 20 ml syringe for generating vacuum |
Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A684 | Needle for outlet connection |
Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D., .8mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A679 | Needle for outlet connection |
Halocarbon oil | Sigma | H8898 | Halocarbon oil 700 |
Dumostar Number 5 Forceps | Roboz | RS-498 | For nerve crush |
PDMS Kit (Base and curing agent) | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear |
Glass Coverslips | Fisher scientific | 12-544-C | 24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective) |
Disposable Plastic Cup (9 oz.) | |||
Plastic coffee stirrer stick | |||
Razor Blade | |||
Grape juice agar plates | See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe |