Larves de drosophile sont un système de modèle intéressant pour l'imagerie en direct en raison de leur cuticule translucide et la génétique puissants. Ce protocole décrit la façon d'utiliser un dispositif de PDMS à une seule couche, appelée la «puce de larve» pour l'imagerie en temps réel de processus cellulaires dans les neurones du 3ème stade larvaire chez la drosophile.
Imagerie en temps réel est une technique importante pour l'étude des processus biologiques cellulaires, mais cela peut être difficile d'animaux vivants. La cuticule translucide de la larve de drosophile en fait un organisme modèle attrayant pour les études d'imagerie en direct. Cependant, un défi important pour les techniques d'imagerie en direct est d'immobiliser de façon non invasive et positionner un animal sur le microscope. Ce protocole présente une méthode simple et facile à utiliser pour immobiliser et imagerie larves de drosophile sur un polydiméthylsiloxane (PDMS) de dispositif microfluidique, que nous appelons la «puce de larve. La puce de larve est constitué d'un PDMS microchambre de bien ajusté qui est fixée à une lamelle de verre mince, qui, lors de l'application d'un vide par l'intermédiaire d'une seringue, immobilise l'animal et apporte structures ventrales tels que le cordon nerveux, les nerfs segmentaires, et le corps muscles de la paroi, à proximité de la lamelle. Cela permet d'imagerie à haute résolution, et, surtout, évite l'utilisation d'anesthetics et des produits chimiques, ce qui facilite l'étude d'un grand nombre de processus physiologiques. Etant donné que les larves de récupérer facilement l'immobilisation, ils peuvent être facilement soumises à de multiples sessions d'imagerie. Cela permet des études longitudinales plus de cours à temps allant de quelques heures à quelques jours. Ce protocole décrit étape par étape comment préparer la puce et la façon d'utiliser la puce pour l'imagerie en direct d'événements neuronaux dans 3 ème stade larvaire. Ces événements comprennent le transport rapide des organites dans les axones, les réponses de calcium à des blessures et des études time-lapse de la traite des protéines photo-convertible sur de longues distances et des échelles de temps. Une autre application de la puce est d'étudier et de régénération des réponses dégénératives à des lésions axonales, de sorte que la seconde partie de ce protocole décrit une procédure nouvelle et simple pour blesser axones dans les nerfs périphériques par un écrasement du nerf segmentaire.
La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a été utilisé comme un organisme modèle pour plus de 100 ans, et a prouvé contribué à définir la signalisation fondamentale et voies de développement qui sont conservées des invertébrés à l'homme. Imagerie en temps réel est une approche importante pour l'étude des mécanismes cellulaires, et le plan de corps simple et cuticule translucide de la larve de drosophile en fait un système attrayant pour l'imagerie en temps réel, d'autant plus qu'il existe de nombreux outils génétiques disponibles pour l'expression de protéines par fluorescence marqués dans des types cellulaires spécifiques.
Un défi important pour les techniques d'imagerie en direct est d'immobiliser de façon non invasive et positionner un animal pour la microscopie. Méthodes d'immobilisation classiques comprennent 1,2 dissection ou l'utilisation de chloroforme, qui tous deux tuer l'animal. Les anesthésiques de l'éther 4 isofluorane et 5-8 ont également été utilisés. Alors que les anesthésiques offrent de nombreux avantages, Ils inhibent également l'activité neuronale et la physiologie importante (y compris les battements du cœur) 9-11, peuvent donc affecter le processus étudié et créer un stress sur l'animal. Il ya aussi des problèmes de sécurité des personnes pour travailler avec de l'éther et isofluorane.
Nous avons développé une méthode sans drogue pour immobiliser larves de drosophile dans un dispositif microfluidique couche de PDMS unique, que nous appelons la «puce de larve» 12. Ce protocole décrit comment obtenir ou de faire la puce de larve, et comment l'utiliser pour l'imagerie en direct en début de scène stade larvaire 3 ème. La puce est composée d'une microchambre de formes complémentaires, qui, lors de l'application d'un vide par l'intermédiaire d'une seringue, immobilise l'animal par l'intermédiaire d'une force mécanique douce. La méthode d'immobilisation apporte structures ventrales tels que le cordon nerveux, les nerfs segmentaires, et muscles de la paroi du corps, à proximité de la lamelle de verre. Cela permet d'imagerie à haute résolution de ces structures avec aper numérique hauteture (fort grossissement) objectifs.
Les avantages de la puce de larve par rapport aux autres techniques classiques comprennent les suivantes: (i) l'utilisation de la puce de larve remplace l'utilisation de produits chimiques, ce qui permet pour l'imagerie in vivo d'animaux non anesthésiés. (Ii) Les larves de récupérer immédiatement après la sortie de la puce (par opposition à une période de récupération de 2 heures pour isofluorane 8,13). Cela permet pour l'imagerie sur des échelles de temps larges, allant de millisecondes à quelques minutes, des heures et des jours. (Iii) L'utilisation de PDMS, qui est un matériau perméable aux gaz, permet de diffusion en continu d'oxygène / air provenant de l'environnement dans le corps de chenille. (Iv) La puce est sûr et facile à utiliser, et (v) il est réutilisable et peut être fabriqué à un coût minime.
En plus des instructions pour l'utilisation de la puce de larve, ce protocole fournira plusieurs exemples de son utilisation pour étudier les événements neuronaux dans 3 ème stade larvaire. Il s'agit notamment de l'imagerie en direct de Axonal le transport, les réponses de calcium à des blessures et des études time-lapse de la traite des protéines photo-convertible sur de longues distances et des échelles de temps.
Une autre application de la puce est d'étudier les réponses neuronales à des lésions axonales. Pour cette une procédure supplémentaire est décrit (en partie 3) pour blesser axones dans les nerfs périphériques par un écrasement du nerf segmentaire. Ce test simple peut être réalisée à la fois rapidement et de façon reproductible sous un stéréomicroscope à dissection standard, ce qui permet un grand nombre d'animaux devant être traités en même temps. Réponses cellulaires à la blessure peuvent être étudiés par imagerie en temps réel dans la puce de la larve.
Faire ou l'obtention de la puce de larve:
La puce de la larve se compose d'un bloc de PDMS (appelée la «puce PDMS ') fixée à une lamelle de verre. Le protocole décrit à l'étape 1 de la procédure de fabrication et d'utilisation des copeaux de larve, en supposant un moule SU-8 est disponible. Le moule SU-8 est microfabriqué en motif par photolithographie par une épaisse couche de résine photosensible SU-8 de 140 um sur une plaquette de silicium (pour les détails voir Ghannad-Rezaie et al. 12). Comme la microfabrication de la moule SU-8 nécessite un accès à de l'équipement spécialisé, nous vous conseillons de commander à partir d'une installation de microfabrication (p. ex. L'installation LNF à l'Université du Michigan 14), ou d'une fonderie en leur envoyant la conception de la puce qui est fourni comme un dossier complémentaire. Si l'on veut changer la conception de la puce PDMS (par exemple pour une utilisation avec des larves de différentes tailles), un logiciel de CAO qui gère les fichiers DXF (Autocad par exemple) peuvent être utilisés. Un SU-8 moule peut également être faite en interne suivant les instructions de Mondal et al. 27 Beaucoup de lecteurs peuvent trouver pratique d'obtenir simplement une puce de PDMS de l'échantillon à tester la technique avant de fabriquer leurs propres puces. Ce sera mis à disposition gratuitement sur demande.
L'utilisation de la «puce larve" microfluidique pour l'imagerie en direct:
Procédé d'immobilisation dans la puce de larve évite l'utilisation d'anesthésiques, et comporte à la place la pression, via l'application d'un vide, pour restreindre le mouvement de l'animal. Alors que les animaux peuvent survivre immobilisation dans la puce pour plusieurs heures 12, une période d'immobilisation plus courte (5-15 min) est recommandé. C'est assez de temps pour l'imagerie de nombreux événements cellulaires d'intérêt, y compris les modifications du calcium intracellulaire, ou le transport axonal rapide. C'est aussi un temps suffisant pour les manipulations souhaitées dans les animaux vivants, comme le laser à base de microchirurgie, photoblanchiment, et photoconversion.
Pour étudier les événements longitudinalement sur une période de temps plus longue chez un seul animal, les animaux peuvent être placés dans la puce et imagés plusieurs fois, séparées par des périodes de repos. plaques d'agar jus de raisin sont idéales pour se reposer entre les séances d'imagerie, car ils fournissent une source de nourriture facile et de l'humidité. Plusieurs sessions d'imagerie affectent la survie des larves à un degré, puisque chaque session comporte un certain risque pour endommager l'animal (voir partie 2 en dépannage, ci-dessous). Les animaux peuvent être imagés en routine> 5 fois au cours de deux jours, avec un taux de survie supérieur à 50%. Comme les animaux ne sont pas anesthésiés, ils sont en bonne santé et mobiles, immédiatement après la libération de la dépression dans la puce. Il n'y a donc pas besoin de temps de récupération entre les séances d'imagerie, de sorte que l'intervalle de temps entre des sessions est flexible et peut être adapté aux objectifs de l'expérience.
Dépannage:
C'est la technique la plus courantepoursuit avec le morceau de larve et solutions recommandées sont les suivantes:
(1) L'animal se déplace trop. Trop de mobilité peut interférer avec les objectifs d'imagerie. Les raisons les plus communes pour ce dans la puce de la larve sont a) l'animal est trop petit pour la puce, ou b) la dépression appliquée lors de l'étape d'immobilisation est compromise. La puce de larve décrite dans ce protocole est conçu pour le début de mise en scène 3 e stade larvaire. La taille optimale de l'animal est de 3,5 à 4 mm de longueur (selon l'axe antéro-postérieur). Afin de s'assurer que la pression de vide est suffisante, retirer la seringue de 2 à 2,5 ml, ou jusqu'à sentir une résistance dans la poignée. Une indication que le vide fonctionne est que les petites bulles dans le canal périmétrique peuvent être vus se déplaçant lentement vers la source de vide. Une autre indication est que la lamelle doit toujours voyager avec la puce lorsque la puce est levé par le haut (et c'est la méthode recommandée pour le transport de la chambreune fois que les larves est positionné et le vide est présent). Le vide peut être compromise si il existe des fissures dans le tube, ou si il est de l'huile dans le tube. Ceci peut être facilement traitée par le remplacement de la 23 G distribution pointe de l'aiguille et de polyéthylène-50 tubes (de 01.06 à 01.14 étapes).
(2) L'animal meurt après l'imagerie dans la puce. La procédure est destinée à provoquer un minimum de stress sur l'animal, et les animaux de génotype sauvage ont un taux de survie> 90%, même après une heure d'immobilisation sur la puce 12. Depuis certains génotypes peuvent être moins résistants au stress de la puce, vérifiez d'abord que les animaux de type sauvage (par exemple, Canton S) survivent à la technique d'immobilisation. a) La cause la plus fréquente de létalité est un mauvais positionnement de la larve (voir les figures 2G-H). Si des parties de la cuticule, la tête ou de la trachée ne sont pas entièrement à l'intérieur de la chambre, alors ils peuvent être endommagés lors de l'immobilisation, et unelarve qui est trop grand pour la puce (> 4 mm) est moins de chances de survivre. b) A cause moins fréquente de la létalité est l'utilisation d'une trop forte pression ou sous vide lors du chargement de la puce. Lorsqu'il est correctement positionné dans la puce, la pression générée par le vide est bien toléré. Cependant pression excessive, soit à partir du vide ou dans la phase initiale de mise en place de l'animal peut être un problème. Il est préférable d'apprendre le degré de pression nécessaire empiriquement par des essais de type sauvage larves de la bonne taille. c) Si trop d'huile sur les halocarbures couvre la trachée de l'animal l'animal peut potentiellement avoir des problèmes avec la survie à long terme. L'huile joue plusieurs rôles importants dans la puce: il est important pour la création du vide, au cours de l'optique d'imagerie, et elle s'oppose à la dessiccation dans la puce. Cependant huile excessive doit être évitée. (Ceci peut également conduire à l'huile dans le tube et d'une seringue, ce qui compromet le vide). Les couches de protocole proposées juste le côté ventral de la larve à l'huile, puis reDéplace le curseur excès d'huile par le placement de la larve sur une lamelle propre avant de le transférer à la lamelle finale pour l'imagerie. d) la phototoxicité peut être vécue de la session d'imagerie. Comme avec n'importe quelle application de l'imagerie en direct, il est idéal à utiliser de courtes durées d'exposition avec une faible lumière laser d'intensité, ce qui est le mieux réalisé en utilisant une caméra très sensible ou détecteur. Essayez de réduire l'éclairage à la lumière UV, y compris la lumière à large spectre créée par les sources de lumière de mercure.
D'autres questions et orientations futures:
Comme cette méthode n'utilise pas les anesthésiques, le cœur de l'animal continue à battre. Cela crée une certaine mobilité inévitable, ce qui affecte l'imagerie dans certains endroits plus que d'autres. Les exemples ici montrent que le cordon ventral de nerf, nerfs segmentaires, et la paroi du corps peuvent être facilement visualisés sans ingérence de la pulsation. Dans les cas où le rythme cardiaque affecte l'imagerie, les mouvements réguliers peuvent parfois être corrigées pour tenir avecdans le logiciel d'analyse (par exemple, le stabilisateur d'image plugin ImageJ). Cela fonctionne bien lorsque des objets individuels se déplacent sur une échelle de temps rapide (par exemple ~ 1 um / s pour le transport axonal rapide) ou sur une échelle de temps très lent (minutes à quelques heures). Toutefois, lorsque l'objet (s) d'intérêt se déplacent avec une gamme de vitesses et les directions, il peut être plus difficile à corriger le rythme cardiaque induite par les mouvements.
Un autre problème est légère variabilité dans l'optique de l'animal à animal, ou entre plusieurs sessions d'imagerie du même animal dans la puce. Le plus profond de l'objet d'intérêt est dans l'animal, plus cette variation sera. Nerfs segmentaires et la corde nerveuse ventrale sont normalement trop profondément dans l'animal, puis à être imprimé sur un microscope ordinaire. Cependant la pression légère connu dans la puce de larve pousse ces structures très proche de la cuticule et lamelle. La distance exacte de ces structures de la lamelle aura de petites variations de trIAL à un procès. La variation pour des objets près de la cuticule, tels que les corps cellulaires des neurones sensoriels, est inférieure. Il est donc important, en particulier pour effectuer des mesures d'intensité, d'utiliser un grand nombre d'animaux et des essais indépendants pour tenir compte de la variabilité dans l'optique.
Bien que les exemples présentés ici ont porté sur les processus dans les neurones, l'approche doit être possible d'imager toute structure dans l'animal qui peut être mis dans la profondeur de focalisation de l'objectif du microscope. Cela comprend la cuticule, les muscles de la paroi du corps, et leurs NMJs. Trachée sur la face ventrale de l'animal et éventuellement des parties du tube digestif peuvent également être imagés. L'animal peut également être positionné avec sa face dorsale vers la lamelle couvre-objet pour une imagerie à court terme de structures proches de la surface dorsale. La capacité de structures d'image de profondeur à l'intérieur de l'animal est limitée par la distance de travail de l'objectif de microscope utilisé. Des structures telles que imdisques aginal sont inaccessibles à fort grossissement (par exemple 40X) objectifs.
Les puces de larve décrites dans ce protocole sont conçus pour les larves au début 3 ème étape larvaire (allant de la taille de 3,5 à 4 mm). Cependant de nombreuses questions intéressantes nécessitent imagerie à différents stades larvaires. Des puces plus petites pour accueillir 2 larves de deuxième stade, ou plus grandes, pour accueillir fin 3 e stades peuvent être facilement conçus selon le même principe. (Figure supplémentaire 1 contient un fichier DXF facilement modifiables pour la fabrication de moules en silicone avec des tailles de chambre altérées). Le principe simple de la joint réversible pourrait même être appliquée à d'autres organismes tels que C. elegans ou le poisson-zèbre, avec la variante principale étant la taille de la chambre. Une orientation future utile est de concevoir une puce qui peut immobiliser de nombreux animaux à la fois, d'utiliser à des fins de dépistage. Toutefois, pour cela, la conception devrait être significativement différentde l'appareil actuel, où les questions de positionnement de l'animal dans la puce doit être traitée pour chaque animal de façon indépendante.
L'essai d'écrasement du nerf pour étudier les réponses des blessures dans les nerfs périphériques larvaires:
Le test par écrasement du nerf décrit ici pour les nerfs segmentaires larvaires est une méthode simple pour introduire une blessure à axones périphériques chez la drosophile. Avantages de cette méthode: a) il est simple à réaliser avec des outils standards trouvés dans un laboratoire de Drosophila (CO 2 de source et pince stéréoscopique), b) il peut être effectué rapidement pour de nombreux animaux, ce qui rend l'analyse biochimique des cordons nerveux après une blessure réalisable 14, c) les réponses cellulaires et moléculaires à cette blessure sont hautement reproductibles 14,15,28 et peuvent être utilisés pour découvrir des procédés qui sont également importantes dans les neurones de vertébrés 29,30.
D'autres méthodes de blesser neurones est de focusa laser de forte puissance, par exemple un pulsé UV ou laser femtoseconde, de rompre un axone par microchirurgie au laser 17,31-33. La puce de larve est une méthode idéale pour positionner l'animal à cette microchirurgie. Toutefois, en raison des différences mineures dans l'optique entre les essais, décrits ci-dessus, la méthode basée sur le laser peut être plus difficile à reproduire dans les larves, en particulier dans les nerfs segmentaires larvaires. En outre, le laser à base de lésion axonale nécessite plus de temps pour positionner chaque animal, est par conséquent plus difficile à mener sur une grande échelle (avec un grand nombre d'animaux).
Dépannage:
Le problème technique le plus couramment rencontré de la écrasement du nerf est mort de dommages aux organes internes. Lorsque la conduite de l'écrasement, il est important de ne pas pincer le cordon ventral nerveux, les glandes salivaires, ou les intestins. Il est également important de ne pas percer la cuticule. Ces questions sont à éviter en mettant la pince à un angle de 45 ° par rapport à la surfac cuticulee (voir la figure 3).
La qualité de la pince a un grand impact sur l'efficacité de l'écrasement et la survie après. Nous vous recommandons nombre Dumostar 5 forceps. Pour conserver leur netteté, les pinces doivent être manipulés avec soin, pas utilisées à d'autres fins, et remplacés une fois qu'ils deviennent émoussée ou tordue.
La taille de l'animal peut également influer sur l'efficacité de l'écrasement. Les petits animaux (moins de 3 mm de longueur) sont beaucoup moins susceptibles de survivre à la blessure. Avec de grands animaux, (errant 3 e stades), il est plus difficile de repérer les nerfs et éviter d'endommager les grandes glandes salivaires et les intestins, et il ya moins de temps pour étudier les réponses des blessures avant la nymphose. L'écrasement du nerf est le plus efficacement réalisée au début du stade larvaire 3 rd (qui sont ~ 3 à 4,5 mm de longueur le long de l'axe antéro-postérieur).
La source de nourriture que l'animal est relevée sur pourrait influer sur l'force de la cuticule et la survie après la cohue. Il est recommandé d'élever des animaux dans les aliments fabriqués à partir d'une recette standard levure-glucose.
La meilleure méthode pour apprendre à faire la cohue est effectivement de pratiquer de nombreux animaux, d'abord avec l'objectif principal de la réalisation de survie (et pas la nymphose) 24 heures après l'écrasement. Les débutants ont normalement un faible taux de survie (par exemple 10%), mais une fois la technique apprise, les taux de survie peut atteindre ~ 90%.
D'autres questions et orientations futures:
L'essai d'écrasement fournit une méthode puissante pour étudier la germination de l'axone proximal au site de la lésion et la dégénérescence des axones et des synapses distales au site de la lésion. Bien que les taux de dégénérescence varie entre les différents types de neurones différents, ils sont hautement reproductibles pour un type de neurone donné, en fournissant témoigne de la reproductibilité de l'analyse de dommage.
En revanche, la "régénération" bourgeonnementréponse observée dans les axones proximaux est plus difficile à étudier. Tous les axones dans le nerf segmentaire lancer une vaste germination à proximité du site de lésion (par exemple, voir la figure 6 et figure 3). Toutefois, la mesure de la germination peut varier entre les neurones, et est difficile à quantifier. Un degré similaire et de la variabilité dans la germination peuvent être observées après des lésions focales plus de motoneurones simples dans les nerfs segmentaires introduites en utilisant un UV laser à colorant pulsé. Nous interprétons que la directionnalité nondiscriminate de la germination est due à l'absence de signaux de guidage dans les nerfs segmentaires. En revanche, les axones des neurones sensoriels blessés par laser à proximité de leurs corps cellulaires sont soumis à une nouvelle croissance axonale dans la même direction que l'axone perdu 34. Axones dans cette région de l'animal sont probablement exposés à des informations de position plus précise l'orientation des axones. L'environnement dans les nerfs segmentaires est peu probable d'avoir beaucoup resemblanCE pour l'environnement que les axones origine navigué au cours de leur orientation dans l'embryon, donc on ne s'attend pas à avoir des informations pour guider axones.
Une autre limite de l'étude de la régénération en utilisant l'analyse par écrasement du nerf segmentaire est que les axones sensoriels et motoneurones blessés ont encore une grande distance à couvrir (0,25-1 mm) pour atteindre leur cible, et un laps de temps limité (<3 jours) avant les subit animales nymphose. Une étude récente a identifié une manipulation génétique du récepteur de l'hormone prothoraciotropic qui triple la durée de la 3 e stade larvaire 35. Cette manipulation permettra de prolonger la période de temps pour étudier la récupération et la dégénérescence des neurones après un traumatisme important, à 9 au lieu de 3 jours. Cela peut être assez longue pour observer de nouveaux événements, tels que la reconnexion d'un axone blessé avec sa cible post-synaptique, en particulier si la lésion est induite près de la fin synaptique.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation, (numéro de subvention IOS-0842701 CAC), et l'Institut national de la santé (R00MH080599 à BY, R21 NS062313 à NC, et NS069844 CAC). Nous tenons à remercier James Schutt, Emily Han, et Leni Truong pour le support technique et le centre de Stock Bloomington pour lignes de vol. Tous les jetons ont été fabriqués à l'installation Lurie nanofabrication de l'Université du Michigan.
0.5 mm Polyethylene tubing | Fisher scientific | 14-170-11B | Polyethylene tubing, I.D. = 0.023’’, O.D. = 0.038’’ |
1 mm Polyurethane tubing | Fisher scientific | BB521-63 | Polyurethane tubing, I.D. = 0.063’’, O.D. = 0.125’’ |
barb to barb connector | Bio Rad | 732-8300 | 0.8 mm barb to barb connector |
3-way stopcock valve | Bio Rad | 732-8104 | Screw on valve for the syringe |
Syringe (20 ml) | Fisher scientific | 14-817-33 | Screw on 20 ml syringe for generating vacuum |
Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A684 | Needle for outlet connection |
Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D., .8mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A679 | Needle for outlet connection |
Halocarbon oil | Sigma | H8898 | Halocarbon oil 700 |
Dumostar Number 5 Forceps | Roboz | RS-498 | For nerve crush |
PDMS Kit (Base and curing agent) | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear |
Glass Coverslips | Fisher scientific | 12-544-C | 24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective) |
Disposable Plastic Cup (9 oz.) | |||
Plastic coffee stirrer stick | |||
Razor Blade | |||
Grape juice agar plates | See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe |