ショウジョウバエの幼虫は、その半透明のキューティクルと強力な遺伝学へのライブイメージングのための魅力的なモデル系である。このプロトコルは、単層のPDMSデバイスを活用する方法について説明し、 第3齢ショウジョウバエの幼虫の神経細胞内で細胞過程のライブイメージングのための「幼虫チップ」と呼ばれる。
ライブイメージングは、しかし、これは生きている動物に挑戦することができ、細胞生物学的プロセスを研究するための重要な技術である。 ショウジョウバエの幼虫の半透明のキューティクルは、ライブイメージング研究のための魅力的なモデル生物になります。しかし、ライブイメージング技術のための重要な課題は、非侵襲的に固定化し、顕微鏡で動物を配置することである。このプロトコルは、我々は'幼虫チップ」と呼ぶポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイス上でショウジョウバエの幼虫を固定化し、画像化するためのメソッドを使用するシンプルで簡単に説明します。幼虫チップは注射器を介して真空を印加すると、動物を固定化し、このような神経索、分節神経、ボディなどの腹側の構造をもたらし、薄いカバーガラスに取り付けられぴったりフィットのPDMSマイクロチャンバーで構成されているカバーガラスのすぐ近く内の壁の筋肉、。これは、高分解能イメージングを可能にし、重要なことには、オクタンの使用を回避する生理学的プロセスの広い範囲の研究を促進するstheticsや化学物質、。幼虫が固定化から容易に回復するので、それらは容易に複数の撮像セッションを行うことができる。これは時間から日の範囲の時間経過にわたる長期的な研究が可能になります。このプロトコルは、ステップバイステップのチップとどのように第3齢幼虫における神経イベントのライブイメージングのためのチップを利用するに準備する方法について説明します。これらのイベントは、軸索、傷害に対するカルシウム応答、および長い距離と時間スケールでの光転換タンパク質の人身売買の経時的研究における細胞小器官の迅速な輸送が含まれています。チップの別のアプリケーションは、再生および軸索損傷の変性反応を研究することであるので、このプロトコルの第2の部分は、分節神経挫滅による末梢神経内で軸索が負傷のための新しい、簡単な手順を説明します。
ショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエは 、100年以上のモデル生物として利用されており、基本的なシグナリングおよび無脊椎動物からヒトに保存されている発生経路を定義することに尽力証明されている。特定の細胞型で、蛍光タグ付けされたタンパク質を発現させるために利用できる多くの遺伝的なツールがあり、特に以来、ライブイメージングは、細胞のメカニズムを研究する重要なアプローチであり、シンプルなボディープランとショウジョウバエの幼虫の半透明のキューティクルは、ライブイメージングのための魅力的なシステムになります。
ライブイメージング技術のための重要な課題は、非侵襲的に固定化し、顕微鏡検査のために動物を配置することである。従来の固定化アプローチは、動物を殺すどちらの切開1,2またはクロロホルムの使用を含む。麻酔エーテル4およびイソフルラン5-8も使用されている。麻酔薬は、多くの利点を提供するが、彼らはまた、それゆえに研究プロセスに影響を与えると動物へのストレスを作成することができ、神経活動と(ハートビートを含む)の重要な生理学9月11日を阻害する。エーテルおよびイソフルランを操作するための人間の安全上の懸念もあります。
私たちは「幼虫チップ」12を呼び出して、単層のPDMSマイクロ流体デバイス、 ショウジョウバエの幼虫を固定化する薬物のない方法を開発した。このプロトコルは、取得したり、幼虫チップを作る方法を説明し、早期段階第3齢幼虫にライブイメージングのためにそれを利用する方法。チップがシリンジを介して真空を印加すると、その、ジャストフィットマイクロチャンバーから構成され、穏やかな機械的な力を介して動物に固定する。固定化方法は、ガラスカバースリップに近接内の神経索分節の神経及び体壁の筋肉のような腹側構造をもたらす。これは、高い開口アパーチャを有するような構造体の高分解能イメージングを可能にするTURE(高倍率)目的。
(I)幼虫チップの使用は、無麻酔動物のin vivoイメージングを可能にする、化学物質の使用を置き換えます。他の従来技術に比べて幼虫チップの利点は、次のものがあります。 (II)幼虫は、すぐに(イソフルラン8,13のための2時間の回復期とは対照的に)チップから放出された後に回復。これはミリ秒から数分に、時間や日に至るまで、幅広い時間スケールにわたって画像化を可能にします。 (ⅲ)ガス透過性材料であるPDMSの使用は、幼虫の体内への環境からの酸素/空気を連続的に拡散を可能にします。 (iv)のチップを使用するのは簡単かつ安全である、及び(v)それは再利用可能であり、最小限のコストで製造することができる。
幼虫チップを使用するための指示に加えて、このプロトコルは、 第3齢幼虫におけるニューロンのイベントを研究するためのその使用のいくつかの例を提供する。これらはaxonaのライブイメージングを含むL輸送、傷害に対するカルシウム応答、および長い距離と時間スケールでの光転換タンパク質の人身売買の経時的研究。
チップの別のアプリケーションは、軸索損傷に対するニューロンの応答を研究することである。このために、追加の手順は分節神経挫滅による末梢神経内で軸索が負傷のために(第3部)に記載されている。この単純なアッセイは、同時に処理されるべき多くの動物を可能にする標準的な解剖実体顕微鏡下の両方の迅速かつ再現可能に行うことができる。傷害に対する細胞応答は、幼虫チップでのライブイメージングによって研究することができる。
作ったり、幼虫チップを得た。
幼虫チップは、カバーガラスに付着したPDMSブロック( 'PDMSチップ」と呼ばれる)で構成されています。ステップ1のプロトコルは、SU-8鋳型が使用可能であると仮定すると、幼虫チップの製造および使用のための手順を説明します。 SU-8鋳型は、フォトリソグラフィ(詳細はGhannad-Rezaie ら 12を参照)、シリコンウエハ上に140μmの厚さのSU-8フォトレジスト層をパターニングすることによって微細加工される。 SU-8鋳型の微細加工が特殊な装置へのアクセスを必要とするように、我々は微細加工施設から、それを注文するお勧めします( 例 。ミシガン州14大学のLNF施設)、またはそれらに提供されているチップ設計を送信することにより、鋳物工場から補足ファイルとして。一つはPDMSチップ(異なるサイズの幼虫で使用するための、例えば )の設計を変更したい場合は、DXFファイル( 例えば AutoCADの)を扱うCADソフトウェアを使用することができる。 SU-8金型もMondalの説明に従って、社内で行うことができら。27多くの読者はそれが便利なだけで、自分のチップを製造する前に、テクニックを試すために、サンプルのPDMSチップを得かもしれません。これは、要求に応じて、自由に利用可能になります。
ライブイメージングのためのマイクロ流体 '幼虫チップ」を使用する:
幼虫チップ内の固定化方法は、動物の動きを制限するために、真空の適用を介して、麻酔薬の使用を避け、その代わりに圧力を伴う。動物は、複数の時間12用チップに固定化を生き残ることができますが、短い固定期間(5月15日分)をお勧めします。これは、細胞内カルシウムの変化、または高速軸索輸送など、関心のある多くの細胞事象を、画像化するための十分な時間である。これはまた、このようなレーザベースマイクロサージェリー、光退色、およびphotoconverなどの生きた動物で目的の操作のための十分な時間であるシオン。
単一の動物においてより長い期間にわたって長手方向にイベントを研究するために、動物は、チップ内に配置し、複数回撮像され、休止期間によって分離することができる。彼らは簡単な食料源と湿度を提供するようにグレープジュース寒天プレートは、イメージングセッション間で休憩に最適です。各セッションは(下記、トラブルでパート2を参照)が、動物にダメージを与えるためのいくつかのリスクがあるため、複数のイメージングセッションは、程度に幼虫の生存率に影響します。動物は、日常的に50%を超える生存率で二日間にわたって> 5回撮像することができる。動物を麻酔していないので、彼らはすぐに、チップ内の真空度のリリース後に健康で、運動性である。そこ撮像セッション間の回復時間のための必要性が存在しないため、セッションの間の時間間隔はフレキシブルであり、実験の目的に合わせることができる。
トラブルシューティング:
最も一般的な技術である幼虫チップおよび推奨する解決方法は以下の通りと訴える。
(1) 動物があまり移動している。あまりにも多くの移動度は、撮像シーンを妨害する可能性がある。幼虫チップで、このための最も一般的な理由はa)の動物は、チップには小さすぎる、またはb)固定化工程の間に適用される真空圧が危険にさらされている。このプロトコルで説明幼虫チップは早期第3齢幼虫を上演するために設計されています。動物のための最適なサイズは、(前後軸に沿って)、長さ3.5〜4ミリメートルである。抵抗がハンドルに感じられるまで真空圧が十分であることを確実にするために、注射器2〜2.5ミリリットルを引っ張ったり、。真空が作動していることOne指示が周囲チャネル内の小さな気泡が真空源に向かってゆっくりと移動して見ることができることである。別の指標は、チップが(上から持ち上げたときカバーガラスは常にチップと一緒に旅行べきことであり、これは、チャンバを輸送するための方法をお勧めします幼虫は配置され、真空)にしたら。チューブに亀裂がある場合には真空が損なわれる可能性がある、または油は、チューブ内に存在する場合。これにより、容易に針の先端と(ステップ1.6から1.14まで)、ポリエチレン-50チューブを分配G 23置換することによって対処することができる。
(2)動物は、チップ内の画像形成後に死亡した。 手順は、動物の際に最小限のストレスを引き起こすためのものであり、野生型の遺伝子型の動物であっても、チップ12上の固定化の時間の後、> 90%の生存率を有している。いくつかの遺伝子型は、チップのストレスが少なく弾力される可能性があるので、最初に野生型動物(たとえば、 カントンS)の固定化技術を生き残ることを確認してください。 A)致死のための最も一般的な原因は、幼虫の不正確な位置決め( 図2G-H参照 )である。クチクラ、頭部または気管の部分が完全にチャンバ内にない場合、それらは固定化の際に損傷を受けることがあり、そしてaチップ(> 4mm)を大きすぎる幼虫が生存する可能性は低い。 B)致死はあまり一般的な原因は、過剰な圧力や真空チップのロードを使用することである。適切チップに配置されると、真空によって発生した圧力は十分に許容される。しかし真空から、または動物を配置する初期のいずれかの過剰な圧力は、問題となることがあります。それは、正しいサイズの野生型幼虫を試験によって経験的に必要とされる圧力の程度を学習することをお勧めします。あまりにも多くのハロカーボンオイルは、動物の気管をカバーしていた場合はC)動物は、潜在的に長期生存の問題を持つことができる。油は、チップのいくつかの重要な役割を果たしている:それは、結像光学系の間に真空を作成するために重要であり、チップ内の乾燥を妨げる。しかし、過剰な油は避けるべきである。 (これはまた、真空を損なう、チューブ、シリンジ内の油につながることができます)。そして提案されたプロトコルのコートオイルと幼虫のちょうど腹側、Rイメージングのための最終的なカバーガラスに転送する前に、きれいなカバースリップ上の幼虫の配置によって余分な油をemoves。 D)光毒性は、撮像セッションから体験することができます。任意のライブイメージング·アプリケーションと同様に、最高の高感度カメラまたは検出器を用いて達成される低強度のレーザ光で短い露光時間を使用することが理想的である。水銀光源によって作成された広域スペクトル光を含む、UV光での照射を最小化しようとする。
他の問題と今後の方向性:
この方法は麻酔薬を使用しないので、動物の心が打ち続けています。これは、より多くの他よりもいくつかの場所で画像化に影響を与えるいくつかの避けられない機動性を作成します。ここでの例は、腹側神経索分節の神経及び体壁を容易に心拍からの干渉なしに撮像することができることを実証している。ハートビートは、撮像に影響を与える場合において、定期的な運動は、時々で補正することができる解析ソフトウェア(たとえば、ImageJのための手ブレ補正プラグイン)。個々のオブジェクトは、高速時間スケールで(高速軸索輸送については、例えば約1ミクロン/秒)または非常に遅い時間スケールで(数分から数時間)を移動している場合に適しています。しかし、ときにオブジェクト(S)の速度と方向の範囲に関心が移動するのではなく、ハートビート誘起動きを補正するために困難になることができます。
もう一つの問題は、動物から動物へ、あるいはチップ内の同じ動物の複数の撮像セッション間の光学系のわずかな変動である。深い関心のある物体が動物内で、より大きなこの変化はなります。分節性神経および腹側神経索は、次いで、通常は定期的な顕微鏡内に結像される動物深すぎる。しかし幼虫チップで経験穏やかな圧力は非常に近く、キューティクルやカバーガラスにこれらの構造をプッシュします。カバーガラスからのこれらの構造の正確な距離は、TRから小さな変化を持つことになります裁判にIAL。オブジェクトのための変化が、このような感覚ニューロンの細胞体として、キューティクルを閉じて、小さい。これは、光学系の変動を考慮するため、動物および独立した試験の大多数を利用すること、特に強度の測定を行うため、重要である。
ここに示す例は、神経細胞内のプロセスに焦点を当てているが、アプローチは、顕微鏡対物レンズの焦点深度内にもたらすことができる動物で任意の構造を画像化するために従順でなければならない。これは、キューティクル、体壁の筋肉、およびそれらのNMJを含む。動物の腹側に気管、潜在的に消化管のどの部分にも画像化されることがあります。動物はまた、背側表面近傍の構造の短期イメージングのためのカバーガラスに向かってその背側に配置することができる。動物内の深い画像構造化する能力を用いる顕微鏡対物レンズの作動距離によって制限される。このようなIMなどの構造aginalディスクは、高倍率( 例えば 40倍)の目標にはアクセスできません。
このプロトコルで説明幼虫チップは(3.5〜4ミリメートルの大きさの範囲の)早期の第3齢段階で幼虫のために設計されています。しかし、多くの興味深い質問が異なる幼虫の段階で画像化を必要とする。後期第3齢に対応するために2 回目の幼虫、以上のチップを収容するための小さなチップを容易に同じ原理を用いて設計することができる。 (補足図1は、変更された室のサイズのシリコン金型を作るための容易に変更可能なDXFファイルが含まれています)。可逆的シールの単純な原理であっても、Cなどの他の生物に適用することができる主な変種はチャンバサイズであることと虫やゼブラフィッシュ、。有用な将来の方向は、スクリーニング目的に使用する、一度に多くの動物を固定化することができ、チップを設計することである。しかし、このために、設計が大幅に異なる必要があるであろうチップ内に動物を配置する問題は独立して各動物のために対処する必要がある現在のデバイスから。
幼虫末梢神経傷害応答を研究するための神経挫滅アッセイ:
幼虫分節神経のため、ここで説明した神経挫滅アッセイは、 ショウジョウバエの末梢軸索の損傷を導入するための簡単な方法です。この方法の利点は、a)それは、ショウジョウバエの研究室(実体顕微鏡用のCO 2源と鉗子)に見られる標準のツールで行うことが簡単であること、b)には、多くの動物のために迅速に行うことができ、損傷後の神経コードの生化学的解析を行っ14実現可能なこと、c)この傷害に対する分子や細胞応答は、14,15,28高い再現性であり、脊椎動物の神経細胞29,30にも重要なプロセスを発見するために使用することができます。
神経細胞を損傷するための代替方法がfocuことですSA高出力レーザー、例えばレーザー顕微17,31-33を経由して軸索を切断するため、パルスUVまたはフェムト秒レーザー、。幼虫のチップは、マイクロサージェリーのために動物を配置するための理想的な方法です。しかし、前述の試験で、間の光学における小さな差異に、レーザーベースの方法は、特に幼虫分節神経において、幼虫に再現することがより困難になることができます。また、レーザベースの軸索損傷は、(多数の動物を有する)を大規模に行うことはより困難であるため、各動物を位置決めするために多くの時間を必要とする。
トラブルシューティング:
神経挫滅から最も一般的に発生する技術的な問題は、内臓の損傷による死亡である。クラッシュを実施するときには、腹側神経索、唾液腺、または腸を挟まないようにすることが重要である。これは、キューティクルを穿刺しないことも重要です。これらの問題は、最高のキューティクルsurfacに45°の角度でピンセットを持って来ることによって回避される電子( 図3参照)。
鉗子の品質は、その後クラッシュと生存の有効性に大きな影響を与えます。我々はDumostar数5鉗子をお勧めします。その切れ味を保持するには、鉗子は、注意して取り扱う他の目的に使用されていない、と彼らは鈍いか、曲がっになったら交換する必要があります。
動物の大きさはまた、クラッシュの有効性に影響を与えることができる。 (長さ3ミリメートル未満)の小さな動物ははるかに少ない傷害を生き残る可能性が高い。大型動物では、( 第3齢を徘徊)、それは神経を見つけ、大きな唾液腺および腸への損傷を回避することがより困難であり、蛹化前に損傷応答を研究するための短い時間がある。神経挫滅を最 も効果的に(前後軸に沿った長さが〜3〜4.5ミリメートルである)初期の第3齢幼虫で行われる。
動物が上に上昇する食料源が影響する可能性クラッシュ後のキューティクルと生存の強さ。これは、標準的な酵母 – グルコースのレシピから作られた食品中の動物を調達することをお勧めします。
効果的にクラッシュを行う方法を学習するための最良の方法は、最初にプライマリ生存を達成するという目標(とは蛹化)クラッシュ後の24時間で、多くの動物をで練習することです。初心者は、通常、低い生存率( 例えば 、10%)を有するが、技術が学習されると、生存率は約90%に達することができる。
他の問題と今後の方向性:
クラッシュアッセイは、損傷部位と軸索と損傷部位より遠位シナプスの変性に軸索の近位の発芽を研究するための強力な方法を提供する。変性の速度が異なるニューロンタイプ間で異なりますが、それらは傷害アッセイの再現性を証明するものを提供し、特定の神経細胞タイプの中で、高度に再現可能である。
対照的に、「回生」は出芽近位の軸索で観察された応答は、研究により困難である。分節神経のすべての軸索は(例えば、 図6と図3を参照)損傷部位に近い発芽広範な開始。しかし発芽の程度はニューロンからニューロンへの変化し、定量化することは困難であることができます。出芽における類似度変動性はUVパルス化色素レーザーを用いて導入分節神経の単一運動ニューロンのより局所性病変後に観察することができる。私たちは、発芽のnondiscriminate方向性が分節神経の指導の手がかりがないことによるものであることを解釈する。これとは対照的に、近くに自分の細胞体へのレーザにより負傷した感覚ニューロンの軸索は、失われた軸索34と同じ方向に新たな軸索 成長を受ける。動物のこの領域における軸索は、おそらく再生軸索の指導のためのより具体的な位置情報にさらされている。分節神経内の環境はずっとresemblanを持っていることはほとんどありませんもともと胚におけるそれらの誘導中にナビゲートする軸索は、従って再生軸索を案内する情報を有することが期待されていないことを環境にCE。
分節神経挫滅アッセイを使用して再生を研究するための他の制限は、動物が受ける前に負傷した感覚と運動神経軸索はまだ彼らの目標を達成するために(0.25〜1ミリメートル)を覆うようにかなりの距離があり、限られた時間枠(<3日間)ということです蛹化。最近の研究では、 第3齢幼虫35の長さをトリプルprothoraciotropicホルモン受容体の遺伝子操作を同定した。この操作は9ではなく3日間に、大幅に損傷後の神経細胞の回復と変性を研究するための時間枠を拡張します。これは損傷がシナプスエンディングに近い誘導される場合は特に、そのシナプス後の目標とそのような傷ついた軸索の再接続などの新しいイベントを、観察するのに十分な長さがあります。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、(CACへによってR00MH080599、ノースカロライナ州にR 21 NS062313、およびNS069844)国立科学財団、(認可番号CACへのIOS-0842701)、および国立衛生研究所によってサポートされていました。私たちは、技術サポート、フライラインのブルーミントンストックセンターのジェームズ·シャッツ、エミリーハン、とレニチュオンを承認したいと思います。すべてのチップは、ミシガン大学でルーリーナノファブリケーション施設で製造された。
0.5 mm Polyethylene tubing | Fisher scientific | 14-170-11B | Polyethylene tubing, I.D. = 0.023’’, O.D. = 0.038’’ |
1 mm Polyurethane tubing | Fisher scientific | BB521-63 | Polyurethane tubing, I.D. = 0.063’’, O.D. = 0.125’’ |
barb to barb connector | Bio Rad | 732-8300 | 0.8 mm barb to barb connector |
3-way stopcock valve | Bio Rad | 732-8104 | Screw on valve for the syringe |
Syringe (20 ml) | Fisher scientific | 14-817-33 | Screw on 20 ml syringe for generating vacuum |
Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A684 | Needle for outlet connection |
Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D., .8mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A679 | Needle for outlet connection |
Halocarbon oil | Sigma | H8898 | Halocarbon oil 700 |
Dumostar Number 5 Forceps | Roboz | RS-498 | For nerve crush |
PDMS Kit (Base and curing agent) | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear |
Glass Coverslips | Fisher scientific | 12-544-C | 24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective) |
Disposable Plastic Cup (9 oz.) | |||
Plastic coffee stirrer stick | |||
Razor Blade | |||
Grape juice agar plates | See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe |