Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

إعداد هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية ليتيح فصل آثار Mechanotransduction الإشارات

Published: August 28, 2014 doi: 10.3791/51010
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratoire Interfaces et Fluides Complexes, Université de Mons

Summary

نقدم بولكرلميد هيدروجيل جديد يسمى هيدروكسي PAAm، التي تسمح ملزم مباشرة من البروتينات ECM مع الحد الأدنى من التكلفة أو الخبرة. مزيج من هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية مع microcontact الطباعة تسهل مراقبة مستقلة للعديد من العظة من المكروية الخلية الطبيعية لدراسة mechanostransduction الخلوية.

Abstract

والآن راسخة بأن العديد من الوظائف الخلوية وينظم تفاعلات الخلايا مع العظة الفيزيائية والميكانيكية للمن المصفوفة خارج الخلية (ECM) البيئة. الخلايا حقيقية النواة الشعور باستمرار المكروية المحلية من خلال mechanosensors السطح لتنبيغ التغيرات الجسدية من ECM إلى إشارات البيوكيميائية، ودمج هذه الإشارات إلى تحقيق تغييرات معينة في التعبير الجيني. ومن المثير للاهتمام، والبارامترات الفيزيائية والميكانيكية للزوجين يمكن ECM مع بعضها البعض لتنظيم مصير الخلية. ولذلك، فإن المفتاح لفهم mechanotransduction هو فصل المساهمة النسبية إشارات ECM على الوظائف الخلوية.

هنا نقدم بروتوكول تجريبي مفصل بسرعة وبسهولة لتوليد الهلاميات المائية ذات الصلة بيولوجيا لضبط مستقل من العظة mechanotransduction في المختبر. نحن معدلة كيميائيا الهلاميات المائية بولي أكريلاميد (PAAm) إلى التغلب على جوهرها غير ADHES-إيف الخصائص من خلال دمج مونومرات الأكريلاميد، بين functionalized الهيدروكسيل خلال البلمرة. حصلنا على رواية PAAm هيدروجيل، ودعا هيدروكسي PAAm، الذي يسمح تجميد المرجوة من أي نوع من البروتينات ECM. مزيج من هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية مع microcontact الطباعة تتيح للسيطرة بشكل مستقل مورفولوجيا الخلايا واحدة، وصلابة مصفوفة، وطبيعة وكثافة البروتينات ECM. نحن نقدم طريقة بسيطة والسريع الذي يمكن أن يقام في كل مختبر علم الأحياء للدراسة في العمليات mechanotransduction خلية المختبر. نحن تحقق من صحة هذه الرواية منصة ثنائية الأبعاد عن طريق إجراء التجارب على الخلايا البطانية أن يبرهن على وجود اقتران الميكانيكية بين صلابة ECM والنواة.

Introduction

العديد من المكروية الخلوية المحلية الجوانب (على سبيل المثال، وصلابة، حجم المسام، وطبيعة البروتينات، أو الكثافة خلية يجند) توفر الإحداثيات مجموعة من الإشارات التنظيمية التي تتحكم في العمليات الخلوية مثل الحركة، تكاثر الخلايا، التمايز، والتعبير الجيني. التعديلات من الخصائص الفيزيائية للبيئة خارج الخلية يمكن أن ينظر إليها من قبل الخلايا وتتسبب في عواقب فيزيولوجية مختلفة، بما في ذلك تشويه الاستقطاب الخلوي، والهجرة، والتمايز. يبقى من غير الواضح، مع ذلك، كيف خلايا تترجم إلى إشارات ECM التعديلات البيوكيميائية الخلوية. بالتالي من أهمية كبرى للمهندس رقابة في microenvironments المختبر التي يمكن أن تتكاثر التفاعلات بين الخلايا والمكروية من أجل دراسة مسارات mechanotransduction هو عليه. لمعالجة هذه المشكلة، أدخلنا مؤخرا طريقة رواية 1، ودعا الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي، لتوليد بسهولة يومين الدايممصفوفات nsional الناعمة التي تسمح للسيطرة بشكل مستقل العظة mechanotransduction مهمة: مصفوفة الصلابة، هندسة الخلايا والحبس، طبيعة البروتين وكثافة خلية يجند.

ECM يوجه العمليات الخلوية عبر التدرجات في morphogens (الكيميائي)، والبروتينات لاصقة (haptotaxis)، وتصلب (durotaxis). على مدى العقود القليلة الماضية، تقدما في منصات المختبر وضعت لعزل هذه الاشارات خارج الخلية من أجل استخلاص خلايا كيف هي قادرة على ترجمة ميزات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية في العمليات الفسيولوجية 2-5. وقد وضعت الإلكترون شعاع 6، 7 ضوئيه، تجميد الضوئي 8، أو بمساعدة تقنيات البلازما 9 لتوجيه نمو الخلايا الحية على ركائز micropatterned. على الرغم من أن هذه التقنيات قد أسفرت عن نتائج مهمة، ومعظمهم لا تسمح بالتمييز بين النفوذ الفردي للمنبهات مختلفة على سلوك الخليةوأنها تتطلب مرافق تقنية المختبرات القليلة التي لا تستطيع تحمله. ومن بين هذه التقنيات، microcontact الطباعة (μCP)، برزت كوسيلة قوية والوصول إلى إنشاء خلية لاصقة الصغيرة الجزر 10. وفي الآونة الأخيرة، بذلت جهود واسعة 11-14 لتطوير μCP على الهلاميات المائية مع الجمود الانضباطي من أجل إنتاج مجموعة واسعة من الجمود الملحوظ في الأنسجة الحية. ومن بين هذه الأعمال، أصبح بولي أكريلاميد (PAAm) شعبية 15 و هو بالفعل واحدة من المصفوفات البوليمر المستندة الأكثر استخداما لالميكانيكا الحيوية الخلية المقايسات.

وبين functionalized السطوح PAAm عادة مع heterobifunctional عبر رابط ترتبط N-sulfosuccinimidyl-6- [4'-azido-2'-nitrophenylamido] (سلفو-SANPAH) والبروتينات ECM إلى السطح عن طريق تفعيل الأشعة فوق البنفسجية من nitrophenyl سلفو-SANPAH مجموعات أزيد 16. يتكون أسلوب آخر في اقتران الهيدرازين للبروتينات التي تتأكسد بشدةمع بريودات 17. قدم Hynd وزملاء العمل للتقنية الزخرفة الأسطح هيدروجيل بيوميمتيك مع البروتينات والببتيدات التي تتطلب في بلمرة ضوئية المنشأ جود مونومر-acroyl streptavidin 18. وفي الآونة الأخيرة، تسنغ آخرون. وأفادت طريقة جديدة micropatterning 19 على أساس التعرض للأشعة فوق البنفسجية العميقة من PAAm من خلال قناع الكوارتز البصرية التي تتطلب لاحتضان المواد الهلامية PA تفعيلها مع 1 إيثيل-3- [3 dimethylaminopropyl] carbodiimide هيدروكلوريد (EDC) وN-hydroxysuccinimide (NHS) قبل حلول المياه لإضافة البروتين. على الرغم من قدرة هذه التقنيات لخلق متجانسة وقابلة للتكرار البروتينات micropatterns، معظمهم يعانون القيود الرئيسية: عمليات التوليف طويلة (مثل غسيل الكلى، تجفيد، الخ)، ومركبات كيميائية باهظة الثمن (مثل حمض الهيالورونيك، سلفو-SANPAH) أو الأشعة فوق البنفسجية العميقة التشعيع. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنيات لا تسمح التشكيل مستقلة عن صلابة الركيزة، micropatternهندسة، ECM طبيعة البروتين، وكثافة الخلايا يجند.

أخذ هذه القيود في الاعتبار، قمنا بتطوير نهج قائم على مادة الأكريلاميد الرواية وبسيط يسمح تجميد مجموعة متنوعة من البروتينات والجزيئات الحيوية على الهلاميات المائية لينة ويسمح ضبط مستقلة عن العظة mechanotransduction من أجل فك دورها على الوظائف الخلوية. بدلا من التعامل مع الهلاميات المائية PAAm المركبات الكيميائية القاسية، ونحن نقدم مونومر الأكريلاميد التجاري مع مجموعات الهيدروكسيل PAAm خلال البلمرة. هذه العملية بسيطة تتغلب على الملكية المضادة لللاصقة الجوهرية للالهلاميات المائية PAAm دون أي شروط فنية أخرى.

وجود مجموعات الهيدروكسيل يؤدي إلى تقارب عالية من الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي عن البروتينات والجزيئات الحيوية التي تشكل التفاعلات الهيدروجين الترابط. في تركيبة مع μCP، الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي تمكن جيل السريع للثقافة منصة ثنائية الأبعاد مع مراقبة مستقلةعلى صلابة مصفوفة، نوع من البروتينات ECM، الكثافة خلية يجند والإلتصاق المحصورة، والتي تصور أن يكون منصة قوية لدراسة mechanotransduction.

والغرض من هذا البروتوكول هو توفير المعلومات اللازمة لاتخاذ بسهولة الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي دون أي خبرة في العلوم المادية. الهدف النهائي هو توفير وسيلة للباحثين لطرح الأسئلة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في مستويات الخلايا والأنسجة التي قد تؤدي إلى فهم أفضل لمسارات mechanotransduction تشارك في آليات المرضية في جسم المريض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تفعيل سطح coverslips الزجاج

  1. coverslips مكان الزجاج الدائرية (25 مم) في طبق بتري والتشويه 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم حل عليه لمدة 5 دقائق (الدخان الكيميائية غطاء مستحسن).
  2. إزالة محلول هيدروكسيد الصوديوم وتزج تماما coverslips مع DDH العقيمة 2 O لمدة 20 دقيقة في حين هزاز بلطف على طبق هزاز في غطاء الثقافة العقيمة.
  3. استنزاف العقيمة DDH 2 O وكرر الخطوة 1.2.
  4. إزالة لل coverslips مع ملاقط معقمة ووضعها في طبق بيتري جديدة مع تنشيط الوجه لأعلى.
  5. coverslips الجافة في ظل تدفق مستمر من عالية النقاء غاز النيتروجين.
  6. في غطاء الثقافة العقيمة، تشويه طبقة رقيقة من 3- (trimethoxysilyl) بروبيل أكريليت (92٪) على الجانب تنشيط ساترة لمدة 1 ساعة.
  7. غسل coverslips الزجاج على نطاق واسع مع 3 يغسل من DDH العقيمة 2 O وتزج بهم في DDH العقيمة 2 O في طبق بتري جديد.
  8. الاستفادة من طبق بتريمع parafilm ووضعه على لوحة الروك تحت الإثارة لطيف لمدة 10 دقيقة.
  9. إزالة لل coverslips من DDH 2 O مع ملاقط معقمة مع نصائح الجميلة ووضعها في طبق بيتري جديدة مع تنشيط الوجه لأعلى.
  10. تخزين في RT في مكان جاف مع رقائق الألومنيوم لتجنب الغبار من الالتصاق لل coverslips.

2. إعداد هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية

  1. إعداد والوزن من 65 ملغ من مادة الأكريلاميد N-هيدروكسي إيثيل (HEA) في 1.5 مل إيبندورف أنبوب. من المهم إعداد حل HEA الطازجة.
  2. إضافة 1 مل من 50 ملي HEPES عازلة لHEA وتخلط باستخدام vortexer حتى HEA حل كامل.
  3. إضافة 400 ميكرولتر من 40٪ ث / ث في HEPES حل الأكريلاميد وحجم المطلوب من 2٪ ث / ث في HEPES مكرر الأكريلاميد حل (انظر الجدول 1) للوصول إلى تصلب هيدروجيل المطلوب. ضبط مع 50 ملي HEPES إلى الحجم النهائي من 5 مل.
  4. مزيج الحل باستخدام vortexer وديغا ذلكفي فراغ الغرفة لمدة 20 دقيقة من أجل الحد من تركيز الأكسجين في الحل، والذي يمنع هيدروكسي PAAm البلمرة.
  5. تحت غطاء العقيمة، تصفية حل degased مع 0.2 ميكرومتر حجم المسام مرشح من أجل تعقيمها.
  6. تفعيل coverslips الزجاج الدائرية (22 مم) في نظافة الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون خلال 7 دقائق.
  7. إعداد 100 ميكرولتر من 10٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS) حل، وهذا هو APS 10 ملغ في 100 ميكرولتر DDH 2 O. من المهم إعداد حل APS الطازجة.
  8. إضافة 2.5 ميكرولتر من رباعي ميثيلين ثنائي الأمين (TEMED) و 25 ميكرولتر من الحل APS إلى تعقيم هيدروكسي PAAm الحل (الخطوة 2.5) لبدء البلمرة. مزيج الحل بواسطة 3 pipettings التوالي دون إدخال فقاعات، تحت ظروف معقمة.
  9. تحت غطاء العقيمة، ضع قطرة 25 ميكرولتر من الحل هيدروكسي PAAm على 25 مم ساترة (متوفر من الخطوة 1.9) وعلى الفور وضع 22 ملم GLالحمار ساترة (أعدت في الخطوة 2.5) على رأس الحبرية للضغط الحل هيدروكسي PAAm. توسيط زجاج 22 مم ساترة مع ملاقط معقمة وتذليل أي فقاعات.
  10. تسمح الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي إلى تتبلمر في RT لمدة 15 دقيقة. عكس يدويا المتبقية حل هيدروكسي PAAm في أنبوب إيبندورف لمتابعة استكمال عملية البلمرة.
  11. تزج تماما coverslips مع العقيمة DDH 2 O وفصل بعناية coverslips 22 ملم الزجاج عن طريق إدخال حافة شفرة حلاقة بين coverslips 22 ملم الزجاج وطبقة هيدروجيل هيدروكسي PAAm.
  12. غسل الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي مع برنامج تلفزيوني العقيمة (3 تبادل PBS) والسماح المواد الهلامية مغمورة تماما في برنامج تلفزيوني العقيمة للحفاظ على الماء.
  13. تخزين الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي في برنامج تلفزيوني العقيمة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.

3. Polydimethylsiloxane (PDMS) Microstamp تلفيق

ملاحظة: تلفيق الماجستير السيليكون مطلوب قبل ستاRT في تلفيق PDMS microstamp. ويمكن أن يتم هذا التصنيع الدقيق للسيد السيليكون بواسطة تقنيات الطباعة الحجرية، الأمر الذي يتطلب معدات متخصصة والتدريب. ويتم تشجيع التعاون مع مرفق nanofabrication الى افتعال سيد السيليكون. بدلا من ذلك، اتصل على الشركة التي بتصنيع السيليكون microstructured سادة مصنوعة خصيصا حسب الطلب. من المهم أن نلاحظ أن تلفيق سيد السيليكون يحتاج فقط إلى أن يتم مرة واحدة. في الواقع، وسادة السيليكون microstructured يمكن استخدامها لأجل غير مسمى لإنتاج الطوابع المرنة.

  1. مزيج PDMS وكيل المعالجة في 10: 1 نسبة في كوب من البلاستيك وتخلط جيدا باستخدام ماصة لمدة 10 دقيقة.
  2. ديغا الخليط PDMS تحت فراغ لإزالة فقاعات الهواء التي تشكلت خلال الخطوة 3.1.
  3. وضع سيد السيليكون microstructured في طبق بتري ويلقي طبقة سميكة 10 ملم من نزع الغاز PDMS الخليط على ذلك دون تشكيل فقاعات.
  4. اسمحوا علاج PDMS لمدة 2 ساعة على 60 درجة مئوية فيالفرن.
  5. في بيئة خالية من الغبار، وطبقة PDMS-تقشر والمكوس 1 سم 2 microstamps مع مشرط.
  6. باستخدام ملقط، ومكان PDMS microstamps نمط المتابعة في طبق بيتري.

4. Micropatterning هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية

  1. مكان PDMS microstamps في الإيثانول / الماء (50/50) الحل ويصوتن لمدة 15 دقيقة.
  2. تجفيف الطوابع مع تدفق تيار من النيتروجين ووضعها نمط المتابعة في نظافة الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون (λ <200 نانومتر) لمدة 7 دقائق.
  3. تحت غطاء العقيمة، ضع قطرة 150 ميكرولتر من الحل المنشود البروتين (على سبيل المثال، 100 ميكروغرام / مل laminin في برنامج تلفزيوني أو 25 ميكروغرام / مل فبرونيكتين في PBS) على سطح microstructured من 1 سم 2 PDMS الطوابع.
  4. اختياري: تعديل تركيز المحلول البروتين لتعديل كثافة خلية يجند.
  5. نشر حل البروتين على سطح ختم بنقلها مع طرف العقيمة ماصة تجاه كل ركن منالطابع.
  6. ترك الحل البروتين على كثف على الطوابع PDMS لمدة 60 دقيقة تحت غطاء العقيمة. إيقاف تشغيل المصابيح لتجنب الضرر البروتين.
  7. تحت غطاء العقيمة، ونقل هيدروكسي PAAm coverslips المغلفة (متاح من الخطوة 2.13) في طبق بتري.
  8. إزالة PBS الزائدة من سطح ركائز هيدروكسي PAAm مع تيار النيتروجين المنخفض تحت ظروف معقمة. وقف الإجراءات في أقرب وقت لوحظ أي دليل على المياه الراكدة على سطح هلام. لا ينبغي أن تجفف هلام تماما في هذه المرحلة.
  9. الجافة بعناية سطح منظم من PDMS ختم مع تدفق مستمر من عالية النقاء غاز النيتروجين.
  10. فهم الطابع المغلفة البروتين مع خلع الملابس ملقط الأنسجة ووضع سطح منظم في اتصال مع سطح هيدروجيل المجففة. تطبيق نقاط الضغط وجيزة مع غيض من ملاقط على رأس الطابع PDMS لضمان اتصال جيد بين microfeatures الطوابع وسطح هيدروجيل.
  11. ترك الطابع PDMS على الالبريد سطح مائي لمدة 1 ساعة على RT.
  12. بلطف إزالة PDMS الطوابع من الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm خلع الملابس مع ملقط الأنسجة واتبع الخطوة 4.1 لتنظيف الطوابع.
  13. غسل نطاق واسع في الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي مختومة من 3 تبادل PBS (درجة الحموضة = 7.4) في ظروف معقمة لمدة 10 دقيقة في الصرف.
  14. اختياري: micropatterns إضافية من البروتينات ECM أخرى يمكن أن تضاف إلى هيدروكسي PAAm سطح باتباع الخطوات 4،5-4،11.
  15. إيقاف فاعلية مناطق غير مطبوعة مع محلول معقم من BSA بمعدل 5 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني خلال ليلة واحدة في 4 درجات مئوية تحت الإثارة لطيف على طبق هزاز.
  16. غسل نطاق واسع بنسبة 3 تبادل PBS (درجة الحموضة = 7.4) في ظروف معقمة لمدة 10 دقيقة في الصرف. في هذه المرحلة، وختمها الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية تصل إلى أسبوع واحد.

5. ترسب الخلايا على Micropatterned هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية

  1. احتضان coverslips الخلية في وسائل الإعلام لمدة 30-45 دقيقة قبل الطلاء جملتعلمي.
  2. غسل الخلايا الملتصقة مثقف في 75 سم 2 قارورة الثقافة مع برنامج تلفزيوني العقيمة عند 37 درجة مئوية وسلخه مع 3 مل من التربسين-EDTA أو accutase لمدة 10 دقيقة.
  3. تحويل المبلغ المطلوب من قبل تحسنت كاملة النمو المتوسطة مناسبا لخط الخلوي في قارورة تحتوي على خلايا منفصلة وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 3 دقائق في ز × 650.
  4. إزالة طاف مع micropipette وresuspend الخلايا في كامل مستنبت في 15-20،000 خلية / مل.
  5. إضافة 4 مل من محلول الخلية إلى ساترة micropatterned (تم الحصول عليها من الخطوة 5.1) ووضع ساترة المغطاة خلية في حاضنة الثقافة عند 37 درجة مئوية والرطوبة 5٪ لمدة 1-2 ساعة.
  6. نضح بلطف الخلايا غير مرتبط واستبدال الثقافة المتوسطة. العودة الخلايا تعلق على الحاضنة والسماح لهم انتشرت بالكامل (3-6 ساعة، اعتمادا على نوع من الخلايا).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويعرض الشكل 1A المشارك البلمرة الأكريلاميد (علاء) وbisacrylamide (مكرر AAM) مع N-hydroxyethylacrylamide (HEA) أحادية تحتوي على الهيدروكسيل الأساسي التي شكلتها بلمرة جذرية العشوائية شبكة ماء من بولي أكريلاميد مع مجموعات الهيدروكسيل جزءا لا يتجزأ من (هيدروكسي PAAm) . في هذا البروتوكول، يجب أن تضعف وزنها 65 ملغ من هيئة التعليم العالي في حجم 1 مل من HEPES. مع العلم أن كثافة HEA تساوي تقريبا واحد، ونحن نفترض أن نحصل على حجم العمل من 1،065 ميكرولتر (HEA + HEPES). على النحو الوارد في الجدول رقم 1، إضافة الإجمالية ل1،065 ميكرولتر إلى 400 ميكرولتر من الرأي العام و50 ميكرولتر من bisAAm يؤدي إلى وحدة تخزين من 1،515 ميكرولتر. وبالتالي هناك حاجة إلى حجم 3،485 ميكرولتر من HEPES لضبط الحل إلى الحجم النهائي من 5 مل. كما هو مبين في الخطوة 2.6، يجب تنشيط سطح الزجاج 22 ملم ساترة خلال 7 دقائق في الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون من أجل إزالته دون التسببأية أضرار على سطح هيدروجيل. في الواقع، سطح الزجاج يصبح أكثر ماء بعد الأشعة فوق البنفسجية / العلاج الأوزون وبالتالي يمكن إزالتها بسهولة عن طريق غمر النظام كله في الماء. وبالإضافة إلى ذلك، فإن العلاج بالأشعة فوق البنفسجية / الأوزون يمنع التلوث الكيميائي لل22 ملم ساترة، والتي هي على اتصال مباشر مع سطح مائي. يسمح هذا الأسلوب للحصول على سطح مستو دائري بولي أكريلاميد (22 مليمتر في القطر) منضم إلى ساترة الزجاج (25 مليمتر في القطر).

على النحو المبين في الشكل 1B، micropatterns من البروتينات يمكن أن تنشأ على سطح الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm بواسطة microcontact الطباعة. في هذا الإجراء التجريبي، تسمح التعرض للأشعة فوق البنفسجية / الأوزون للحد مؤقتا للا مائية لا يتجزأ من الطوابع PDMS من خلال تشكيل مجموعات silanol على السطح. في الواقع، خط 185 نانومتر ينتج الأوزون من الأكسجين الجزيئي في حين أن خط 254 نانومتر تحويل الأوزون إلى الأكسجين الذري. يهاجم هذا النوع من رد الفعل با siloxaneckbone من PDMS لتشكيل الأكسجين الغنية SiOx طبقة مثل السيليكا والجماعات سطح سي OH. ومن المعروف أن سطح PDMS تتأكسد لاسترداد للا مائية في ساعات بعد التعرض للهواء بسبب هجرة منخفضة الوزن الجزيئي السلاسل البوليمرية uncrosslinked من مرحلة السائبة إلى السطح. هذه الاستراتيجية تساعد على نشر الحل البروتين على سطح الطابع PDMS.

واحدة من المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هو أن تعدل بشكل مستقل صلابة مصفوفة (الشكل 2A)، والهندسة micropattern (الشكل 2B)، خلية يجند الكثافة (الشكل 2C)، وطبيعة البروتين (أرقام 3A و 3B). كما هو مبين في الشكل 2A، تظهر الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي الاعتماد الخطي للمعاملات الرجوعية المرنة على التركيز عبر رابط من قلة كيلو باسكال إلى عشرات كيلو باسكال، مما يسمح الاستنساخ الدقيق للجمود المكروية الخلوية. الشكل 2B الشكل 2C يبين أن الخلية -ligand الكثافة يمكن التضمين من خلال تغيير تركيز المحلول بروتين يستخدم لاحتضان الطوابع PDMS الشكل 3 يعرض صورة مضان من خطوط الكولاجين ختمها عبر خطوط laminin وفبرونيكتين باستخدام المطبوعات microcontact متتابعة.

ومن المثير للاهتمام للقراء أن نلاحظ أن مختلف الأحجام والأشكال من micropatterns تم ختمها بكفاءة، بغض النظر عن صلابة هيدروجيل. لقد استنسخ بنجاح microfeatures من البروتينات ذات الحواف الحادة (مثل المثلثات والنجوم) وعلى التوالي (على سبيل المثال، خطوط)، أو المنحنية (مثل الدوائر) الأشكال، مما يدل على أنه لا يوجد ماخوالحد r لتعقيد النمط. لتجربة خلية واحدة، كانت مساحة micropattern بين 400 و 2،500 ميكرون 2، وانخفاض قيمة المقابلة إلى الحد من قابلية خلية واحدة. عن العديد من الأساليب القائمة على microprinting أخرى، فإن القيد الرئيسي من الطريقة المعروضة يتعلق قرار المكاني. على الهلاميات المائية شديدة (E> 10 كيلو باسكال)، والقرار المكانية هو حول ميكرومتر ويتحدد أساسا بقرار من الطابع، في حين على الهلاميات المائية "الناعمة"، والحد من القرار يصبح يتحدد جزئيا من تشوه السطحية التي قد تحدث أثناء نقل البروتين.

تم التحقيق سمية الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm عن طريق قياس الجدوى من الخلايا البطانية الأولية مطلي ل1، 2، و 3 أيام في الثقافة على مغلفة متجانس وmicroprinted الناعمة الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm (الشكل 4A). حوالي 80٪ من HUVECs مطلي على micropatterned الناعمة الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm المحافظةقدرتها على الاستمرار لمدة ثلاثة أيام، مما يدل على توافق مع الحياة من هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية للثقافة الخلية. ومن المثير للاهتمام، تم الحصول على صلاحية مماثلة في مختبرنا مع الخلايا العصبية القشرية الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا البطانية الأولية تتكاثر أكثر على "قاسية" (500 كيلو باسكال) مقارنة ب "الناعمة" (25 كيلو باسكال) ركائز (الشكل 4B)، مشيرا إلى أن هذا الأسلوب يوفر المكروية المناسبة لدراسة انتشار الخلوي عبر مجموعة واسعة من الجمود .

لفصل تأثير الركيزة صلابة ومنطقة تنتشر على mechanotransduction، كانت مطلية الخلايا البطانية الابتدائية (HUVECs) على micropatterns المغلفة FN مستطيلة (منطقة ثابتة من 1،200 ميكرون 2) تترسب على الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي ثلاثة التصلب مختلفة (2.5، 8.5، و 25 كيلو باسكال). ثم، كانت ملطخة HUVECs لخيوط الأكتين، وvinculin DNA باتباع إجراء مناعية القياسية، كما تستخدم لماماخلايا ليان مطلي على ركائز الزجاج. أنعم على ركائز، HUVECs تظهر انخفاض كثافة ألياف الأكتين ونواة مستديرة، في حين أشد على ركائز وألياف الأكتين هي استقامة وأكثر سمكا ونواة المسخ (الشكل 5). التغيرات في صلابة الركيزة في منطقة تنتشر ثابتة تعدل التوتر وتوزيع ألياف الأكتين الإجهاد، مما يؤدي في تغيير بنية النواة. وتشير هذه الملاحظة اقتران الميكانيكية بين صلابة مصفوفة، الهيكل الخلوي والنواة.

نسبة AAM / bisAAm النهائية علاء 40٪ (ميكرولتر) وزن HEA لتذوب في 1 مل HEPES (ملغ) علاء مكرر (2٪)
(ميكرولتر) 		HEPES (ميكرولتر) معامل يونغ
(10 3 باسكال)
0.2 / 50
0.5 / 50
1/50
2/50
3/50 		400
400
400
400
400		 65
65
65
65
65 		50
125
250
500
750 		3،485
3،410
3،285
3،035
2،785 		~ 1.4
~ 3.6
~ 8.7
~ 17.2
~ 25

الجدول 1. إعداد هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية مع مختلف الجمود. حلول العمل لإعداد الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي مع صلابة النهائية تتراوح 1،4 حتي 25 كيلو باسكال.

الشكل 1
الرقم 1. (A) الأكريلاميد (AAM، باللون الأسود)، N، N'-methylenebisacrylamide (مكرر علاء، باللون الأزرق) وN-hydroxyethylacrylamide (HEA، باللون الأحمر) كانت مختلطة معا لتشكيل هيدروكسي الهلاميات المائية PAAm. (B) تمثيل تخطيطي من الخطوات المختلفة لإجراء micropatterning على الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm. وحضنت الحل من البروتين لأول مرة خلال 1 ساعة على الوجه بنية microstamp (الخطوة رقم 1). تجفف سطح هيدروجيل بلطف مع تدفق النيتروجين (خطوة رقم 2). ثم يتم وضع microstamp على اتصال رسمي مع سطح هيدروكسي PAAm خلال 1 ساعة (الخطوة 3 #). بعد يغسل المتعاقبة، وتخمل سطح microprinted بمحلول معقم BSA المودعة O / N عند 4 ° C (الخطوة رقم 5) لمنع المناطق غير مطبوعة. وأخيرا، يتم غسل هيدروكسي PAAm سطح microprinted عدة مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة وجاهز للبذار خلية (الخطوة رقم 6). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

1010 / 51010fig2highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 2. (A) تطور تصلب الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي يرتبط خطيا مع كمية مكرر AAM عبر رابط (الخط الأحمر هو الانحدار الخطي مع R 2 = 0995). الصور (B) من الإسفار laminin مستطيلة الميزات الدقيقة ختمها على الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm من التصلب مختلفة (E = 2.5، 15، و 40 كيلو باسكال). أشرطة النطاق تتوافق مع (A) 65 ميكرون، (B) 80 ميكرون، و (C) 50 ميكرون (C) خطوط متوازية من 15 ميكرون شكل العرض التدرج LM على هيدروجيل 25 كيلو باسكال هيدروكسي PAAm، كما يدل على ذلك تطور من ملف كثافة مضان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ن "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 51010 / 51010fig3highres.jpg "العرض =" 500 "/>
صورة شخصية 3. (A) المناعي فبرونيكتين (باللون الأحمر) وLaminin (باللون الأخضر) المشارب عبرت عند 90 درجة (B) Multilabeling فبرونيكتين (باللون الأحمر)، Laminin (باللون الأخضر) والكولاجين (باللون الأزرق) المشارب microprinted في وقت لاحق على ركيزة 25 كيلو باسكال هيدروجيل PAAm. أشرطة النطاق تتوافق مع 30 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. (A) والكمي لبقاء الخلية أظهرت بقاء الخلية الممتاز في 24، 48 و 72 ساعة بعد أن مطلي على متجانس المغلفة وmicropatterned الأسطح هيدروكسي PAAm. أشار عدد فيأسفل كل شريط يتوافق مع العدد الكلي للخلايا يحسب بالنسبة للفحص جدوى. (B) الكمي لHUVECs انتشار في 25 و 500 كيلو باسكال ركائز المغلفة متجانس بعد 1 (أشرطة بيضاء) و 7 (الحانات تجزئته) يوما من الثقافة. الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. الصور الفلورسنت من الخلايا البطانية الأولية immunostained مثقف على micropatterns المغلفة FN مستطيلة، والتي ترسبت على الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm 2.5 كيلو باسكال، 8.5 كيلو باسكال، و 25 كيلو باسكال (من اليسار إلى اليمين). ألياف الأكتين الإجهاد (باللون الأخضر ) كانت ملطخة مع اليكسا فلور 488 phalloidin، الالتصاقات البؤرية (باللون الأحمر) كانت ملطخة مع polyclo الماوسكانت ملطخة الأجسام المضادة الأولية ونال المسمى مع الأجسام المضادة الثانوية مفتش أحمر فلوري وDNA باللون الأزرق مع دابي. قضبان نطاق وتتوافق مع 17 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد أجريت العديد من الملاحظات المختبر في بيولوجيا الخلايا الحديثة على coverslips الزجاج جامدة، وغالبا المغلفة بطبقة رقيقة من البروتينات ECM أو الببتيدات الاصطناعية التي تحتوي على تسلسل RGD. ومع ذلك، هذه ركائز الثقافة الأساسية لا ألخص تعقيد الفيزيائية كله من ECM وبالتالي لا تقدم نموذجا دقيقا لدراسة العمليات mechanotransduction الخلوية. لمعالجة هذه المشكلة، نقترح بديلا بسيطا لfunctionalize الهلاميات المائية ثنائية الأبعاد مع أي المبلغ المطلوب وطبيعة البروتينات ECM. هذا الأسلوب يسمح مراقبة مستقلة من العظة mechanotransduction الهامة، مثل تصلب المصفوفة، مورفولوجيا الخلايا والحبس أو كثافة الخلية يجند. بالإضافة إلى ذلك، الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm التغلب على واحدة من أعظم القصور في أساليب functionalization الحالية، وهو عدم القدرة على شل والتحكم في التوزيع المكاني للبروتين ECM أكثر من واحد. نظرا لتقارب عالية من الطاقة المائيةXY-PAAm الهلاميات المائية لالجزيئات الحيوية، يمكن للمرء التحكم في التوزيع المكاني لمختلف البروتينات ECM على نفس السطح، بغض النظر عن صلابة المصفوفة، باستخدام microprintings متتابعة، والتي لا تتطلب أي معدات إضافية.

نقترح إجراء رواية تقوم على إدماج مجموعات الهيدروكسيل في الهلاميات المائية الأكريلاميد لتجاوز ممتلكاتهم في جوهرها غير لاصقة مع متطلبات الحد الأدنى في التكلفة أو الخبرة. بالمقارنة مع التقنيات الحالية لالزخرفة البروتينات على الهلاميات المائية، للPAAm هيدروكسي طريقة تجنب استخدام المواد الكيميائية السامة القاسية (مثل هيدرات الهيدرازين)، crosslinkers photoreactive مكلفة (على سبيل المثال، سلفو-Sanpah) والاعتماد على الطاقة مصباح الأشعة فوق البنفسجية وتحديد المواقع ل functionalize الهلاميات المائية لينة. تبقى الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm مستقرة ونشطة لعدة أسابيع، ويمكن إنتاجها بكميات كبيرة، microprinted بسهولة وتقارب عالية من أجل الجزيئات الحيوية يسمح للتحقيق في الآثار المستمرة للالبروتينات ECM مترافق على الوظائف الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm يمكن استخدامها لتحقيق كميا كمية من القوات مقلص المبذولة من قبل الخلايا على المكروية المحيطة بها. في الواقع، لقد أظهرنا سابقا أن 1،20 الخرز الفلورسنت يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ بسهولة في الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm، من أجل استخدام قوة الجر خلية المجهري (TFM) لقياس مجال النزوح وتقدير الحقل الجر الناتجة من الخلايا حقيقية النواة المبذولة مطلي على micropatterns ثنائي الأبعاد.

عن العديد من الأساليب القائمة على microprinting أخرى، فإن القيد الرئيسي من الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي يتعلق القرار المكاني للmicrofeatures البروتين. على الهلاميات المائية شديدة (E> 10 كيلو باسكال)، والقرار المكانية حوالي ميكرومتر ويتحدد أساسا بقرار من الطوابع، اعتمادا على تقنية الطباعة الحجرية المستخدمة لصنع قالب السيليكون. على الهلاميات المائية ليونة، ويصبح القرار المكاني يتحدد جزئيا عشرالبريد تشوه السطح أثناء نقل البروتين، الذي يصبح القيد الرئيسي للوصول إلى ميكرومتر القرار المكانية. النهج المقدمة هنا يقتصر حاليا على ركائز ثنائية الأبعاد. ولكن هذا الأسلوب هو تدرجية عالية والمزيد من الدراسات التي تجرى حاليا في المختبر لدينا لتوسيع هذا الأسلوب لهياكل ثلاثية الأبعاد.

نأمل أن الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm قد تساعد على فك الآليات الرئيسية من العمليات الخلوية والأنسجة المعقدة التي ترتبط ارتباطا وثيقا الخصائص الفيزيائية للالمكروية خلية 21،22، بما في ذلك التطور الجنيني، والاستجابات الالتهابية، التئام الجروح، وثمرة neurite والأنسجة الكبار التوازن، والتسبب في أمراض مثل التليف والسرطان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV/Ozone Photoreactor Ultra-Violet Products Model PR-100
Rocking plate IKAcWerke Model KS 130 Basic
Vortexer Scientific Industries Model Vortex Genie2
Vacuum degassing chamber Applied Vacuum Engineering DP- 8-KIT
Parafilm Sigma-Aldrich P7793-1EA
Stainless steel forceps with fine tip Sigma-Aldrich Z225304-1EA
Dressing tissue forceps Sigma-Aldrich F4392-1EA
Petri dishes in polystyrene Sigma-Aldrich P5731-500EA
Aluminium foil, thickness 0.5 mm Sigma-Aldrich 266574-3.4G
Isopore membrane filter (0.2 µm pore size) Millipore GTTP Filter code
Round glass coverslip (22 mm diameter) Neuvitro GG-22
Round glass coverslip (25 mm diameter) Neuvitro GG-25
Variable volume micropipette Sigma-Aldrich Z114820
Protein microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich Z666505-100EA
Scalpel handles Sigma-Aldrich S2896-1EA
Scalpel blades Sigma-Aldrich S2771-100EA
Cell culture flasks (75 cm2) Sigma-Aldrich CLS430641
Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) Sigma-Aldrich Z613983-1EA
Polydimethylsiloxane  Dow Corning Sylgard 184 silicone elastomer kit
Acrylamide (powder) Sigma-Aldrich A3553
N,N’-Methylenebis(acrylamide) Sigma-Aldrich 146072
N-Hydroxyethylacrylamide Sigma-Aldrich 697931
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281
Amonium PerSulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate Sigma-Aldrich 1805
Human Plasma Fibronectin Millipore FC010
Laminin from EHS Sigma-Aldrich L2020
Sodium hydroxyde Sigma-Aldrich 221465-25G
Double-distilled water (ddH2O)
Endothelial cell growth medium Cells Applications 211K-500
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Invitrogen C-003-5C
Accutase PAA laboratories L11-007
HEPES buffer solution 1 M in H2O Sigma-Aldrich 83264-500ML-F
Antibiotics-antimycotics PAA laboratories P11-002
Phosphate Buffer Saline solution PAA laboratories H15-002
Alexa Fluor 488 Phaloidin Molecular Probes A12379
Anti-vinculin antibody produced in mouse Sigma-Aldrich V9131
Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine Molecular Probes T-2762
Anti-Fibronectin (rabbit) Sigma-Aldrich F3648
Streptavidin  Sigma-Aldrich 41469
Anti-Laminin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich L9393
Anti-rabbit IgG-FITC Sigma-Aldrich F7512
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924-100ML
Absolute ethanol Sigma-Aldrich 459844-2.5L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
  2. Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking. Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).
  3. Atmanli, A., Domian, I. J. Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing. J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).
  4. Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays. Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).
  5. Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes. Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).
  6. Rundqvist, J., et al. High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation. J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).
  7. Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications. Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).
  8. Holden, M. A., Cremer, P. S. Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces. J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).
  9. Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture. Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).
  10. Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching. Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).
  11. Tseng, Q., et al. New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).
  12. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS ONE. 7, e51499 (2012).
  13. Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).
  14. Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli. Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).
  15. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
  16. Hemphill, M. A., et al. A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury. PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).
  17. Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
  18. Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).
  19. Tseng, Q., et al. new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells. Nat. Commun. 3, 671 (2012).
  21. Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus. Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).
  22. Trappman, B., Chen, C. S. How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective. Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 90، الهلاميات المائية، mechanotransduction، بولي أكريلاميد، microcontact الطباعة، شكل الخلية، وصلابة، durotaxis، الكثافة خلية يجند
إعداد هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية ليتيح فصل آثار Mechanotransduction الإشارات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grevesse, T., Versaevel, M.,… More

Grevesse, T., Versaevel, M., Gabriele, S. Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues. J. Vis. Exp. (90), e51010, doi:10.3791/51010 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter