Summary
We presenteren een nieuw polyacrylamide hydrogel, genaamd hydroxy-PAAM, die een directe binding van ECM eiwitten mogelijk maakt met minimale kosten of deskundigheid. De combinatie van hydroxy-PAAM hydrogels met microcontactprinten vergemakkelijkt onafhankelijke controle van de vele signalen van de natuurlijke cel micro-omgeving voor het bestuderen van cellulaire mechanostransduction.
Abstract
Het is nu algemeen bekend dat vele cellulaire functies worden gereguleerd door interacties van cellen met fysisch-chemische en mechanische signalen van hun extracellulaire matrix (ECM)-omgeving. Eukaryotische cellen voortdurend voelen de lokale micro-omgeving door bovengrondse mechanosensors fysieke veranderingen van ECM in biochemische signalen transduceren, en integreren deze signalen om specifieke veranderingen in genexpressie. Interessant fysicochemische en mechanische parameters van de ECM kan paar met elkaar lot van de cel reguleren. Daarom is een sleutel tot het begrijpen mechanotransduction is om de relatieve bijdrage van ECM signalen op cellulaire functies los te koppelen.
Hier presenteren we een gedetailleerd experimenteel protocol om snel en eenvoudig te genereren biologisch relevante hydrogels voor de onafhankelijke afstelling van mechanotransduction signalen in vitro. We chemisch gemodificeerde polyacrylamide hydrogels (PAAM) om hun intrinsiek niet-pat te overwinnenive eigenschappen door het opnemen van hydroxyl-gefunctionaliseerde monomeren acrylamide tijdens de polymerisatie. We verkregen een nieuwe PAAM hydrogel, genaamd hydroxy-PAAM die immobilisatie van elke gewenste aard van ECM eiwitten toestaat. De combinatie van hydroxy-PAAM hydrogelen met microcontactprinten stelt onafhankelijk regelen van de morfologie van afzonderlijke cellen, de matrix stijfheid, de aard en de dichtheid van ECM eiwitten. Wij bieden een eenvoudige en snelle methode die kan worden ingesteld in elk biologie lab om te studeren in vitro cel mechanotransduction processen. Wij valideren deze roman tweedimensionale platform door het uitvoeren van experimenten op endotheelcellen die een mechanische koppeling tussen ECM stijfheid en de kern aan te tonen.
Introduction
Veel aspecten van de lokale cellulaire micro-omgeving (bijvoorbeeld stijfheid, poriegrootte, aard van eiwitten of cel-ligand density) een coördinaat set van regulerende signalen die cellulaire processen zoals motiliteit, celproliferatie, differentiatie en genexpressie. Modificaties van de fysicochemische eigenschappen van het extracellulaire milieu kan worden waargenomen door cellen en veroorzaken verschillende fysiologische gevolgen, zoals vervorming van cellulaire polarisatie, migratie en differentiatie. Het blijft echter onduidelijk hoe cellen vertalen ECM veranderingen in cellulaire biochemische signalen. Het is derhalve van groot belang te ontwerpen gecontroleerde in vitro micro-omgevingen die de interacties tussen cellen en hun micromilieu kan reproduceren voor het bestuderen mechanotransduction trajecten. Om dit probleem aan te pakken, hebben we onlangs een nieuwe methode 1, genaamd hydroxy-PAAM hydrogels, om eenvoudig genereren twee-dimensional zachte matrices die toelaten om zelfstandig te beheersen belangrijke mechanotransduction aanwijzingen: matrix stijfheid, cel geometrie en opsluiting, de aard van de eiwitten en cel-ligand dichtheid.
ECM stuurt cellulaire processen via hellingen in morphogens (chemotaxis), lijm-eiwitten (haptotaxis) en stijfheid (durotaxis). In de afgelopen decennia, geavanceerde in vitro platformen werden ontwikkeld om deze extracellulaire signalen te isoleren om te plagen uit hoe cellen zijn in staat om biochemische en biofysische eigenschappen te vertalen naar fysiologische processen 2-5. Elektronenbundel 6, 7 fotolithografie, fotochemische immobilisatie 8 of plasma geassisteerde technieken 9 zijn ontwikkeld om de groei van levende cellen op micropatterned substraten sturen. Hoewel deze technieken belangrijke resultaten hebben opgeleverd, de meeste van hen geen onderscheid tussen de individuele invloed van verschillende signalen op mobiele gedrag toestaanen ze technische faciliteiten die paar laboratoria kunnen veroorloven, verlangen. Onder deze technieken, microcontactprinten (μCP), heeft zich ontpopt als een robuuste en toegankelijke methode om cel-lijm micro-eilanden 10 te creëren. Meer recent zijn omvangrijke inspanningen 11-14 werden geleverd om μCP ontwikkelen op hydrogels met instelbare starheid om de brede waaier van rigiditeiten waargenomen in levende weefsels te reproduceren. Onder deze werken, heeft polyacrylamide (PAAM) populair 15 geworden en is nu al een van de meest gebruikte polymeren gebaseerde matrices voor mobiele biomechanica assays.
PAAM oppervlakken worden vaak gefunctionaliseerd met de heterobifunctionele verknoper N-sulfosuccinimidyl-6-[4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) en ECM eiwitten zijn gekoppeld aan het oppervlak door UV activering van de sulfo-SANPAH nitrofenyl azide groepen 16. Een andere techniek bestaat uit het koppelen hydrazine eiwitten die zwaar zijn geoxideerdmet perjodaat 17. Hynd en medewerkers introduceerde een techniek voor patroonvorming biomimetische hydrogel oppervlakken eiwitten en peptiden die fotopolymerisatie in aanwezigheid van een acroyl streptavidine monomeer 18 vereist. Meer recent Tseng et al. Hebben een nieuwe methode micropatterning 19 gebaseerd op diepe UV blootstelling van PAAM via een optische kwartsmasker die vereist geactiveerde PA gels incuberen met 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) gerapporteerd en N-hydroxysuccinimide (NHS) wateroplossingen vóór het eiwit voegen. Ondanks het vermogen van deze technieken die homogene en reproduceerbare eiwitten micropatterns creëren meeste lijden belangrijke beperkingen: lange synthesewerkwijzen (bijvoorbeeld dialyse, vriesdrogen, etc), dure chemische verbindingen (bijvoorbeeld, hyaluronzuur, sulfo-SANPAH) of diepe UV bestraling. Bovendien zijn deze technieken niet onafhankelijk modulatie substraat stijfheid, micropattern toestaangeometrie, ECM eiwit natuur, en cel-ligand dichtheid.
Rekening houdend met deze beperkingen, hebben we een nieuwe en eenvoudige-acrylamide gebaseerde aanpak die immobilisatie van een verscheidenheid van eiwitten en biomoleculen op zachte hydrogels maakt en maakt onafhankelijk afstemmen van mechanotransduction signalen om hun rol in cellulaire functies ontcijferen ontwikkeld. In plaats van het behandelen van PAAM hydrogels met agressieve chemische stoffen, introduceren we een commerciële acrylamide monomeer met hydroxylgroepen tijdens PAAM polymerisatie. Deze eenvoudige handeling overwint de intrinsieke anti-klevende eigenschap van PAAM hydrogels, zonder enige andere technische eisen.
De aanwezigheid van hydroxylgroepen leidt tot een hoge affiniteit van hydroxy-PAAM hydrogels voor eiwitten en biomoleculen die waterstofbinding interacties vormen. In combinatie met μCP, hydroxy-PAAM hydrogels maken een snelle generatie van tweedimensionale cultuur platform met een onafhankelijke controleop matrix stijfheid, type ECM eiwitten, cel-ligand dichtheid en kleverigheid beperkt, die beoogd een krachtig platform voor het bestuderen mechanotransduction zijn.
Het doel van dit protocol is om de nodige informatie voor het eenvoudig maken van hydroxy-PAAM hydrogels zonder enige expertise in materiaalkunde bieden. Het uiteindelijke doel is om een middel te bieden voor onderzoekers om fysiologisch relevante vragen op cellulair en weefselniveau die kunnen leiden tot een beter begrip van mechanotransduction routes betrokken bij pathofysiologische mechanismen te vragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Activeren van de Oppervlakte van de dekglaasjes
- Plaats glas ronde dekglaasjes (25 mm diameter) in een petrischaal en uitstrijkje 0,1 M NaOH-oplossing op het voor 5 minuten (zuurkast aanbevolen).
- Verwijder de NaOH-oplossing en dekglaasjes volledig onder te dompelen met steriele DDH 2 O voor 20 min, terwijl zachtjes rocken op een rockende plaat in een steriele cultuur kap.
- Drain steriele DDH 2 O en herhaal de stap 1.2.
- Verwijder de dekglaasjes met steriele pincet en plaats ze in een nieuwe petrischaal met de geactiveerde boven.
- Droog dekglaasjes onder een gestage stroom van hoogzuiver stikstofgas.
- In een steriele cultuur kap, smeer een dunne laag 3 (trimethoxysilyl) propyl acrylaat (92%) van de geactiveerde kant van het dekglaasje gedurende 1 uur.
- Veelvuldig wassen dekglaasjes met 3 wasbeurten van steriele DDH 2 O en dompel ze in steriele DDH 2 O in een nieuwe petrischaal.
- Tik op de petrischaalmet Parafilm en plaats het op een rocker plaat onder zacht schudden gedurende 10 minuten.
- Verwijder de dekglaasjes van DDH 2 O met een steriele pincet met fijne tips en plaats ze in een nieuwe petrischaal met de geactiveerde boven.
- Bewaar bij kamertemperatuur op een droge plaats met aluminiumfolie om stof van het vasthouden aan de dekglaasjes voorkomen.
2 Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen
- Bereid een gewicht van 65 mg N-hydroxyethyl acrylamide (HEA) in een 1,5 ml Eppendorf buis. Het is belangrijk om een nieuwe HEA te bereiden.
- Voeg 1 ml van 50 mM HEPES buffer HEA en meng met een vortexer tot een totale HEA oplossen.
- Voeg 400 ul van 40% w / w in HEPES acrylamide-oplossing en het vereiste volume van 2% w / w in HEPES bis-acrylamide-oplossing (zie tabel 1) op de gewenste hydrogel stijfheid bereikt. Aanpassen met 50 mM HEPES tot een eindvolume van 5 ml.
- Meng de oplossing met behulp van een vortexer en ontgast hetin een vacuümkamer gedurende 20 min om de zuurstofconcentratie in de oplossing, die hydroxy-PAAM polymerisatie voorkomt.
- Onder een steriele kap Filtreer de oplossing ontgast met een 0,2 micrometer poriegrootte om te steriliseren.
- Activeren ronde glazen dekglaasjes (22 mm diameter) in een UV / ozon reiniger gedurende 7 min.
- Bereid 100 ul van 10% ammoniumpersulfaat (APS)-oplossing, dat is 10 mg APS in 100 ul DDH 2 O. Het is belangrijk om een nieuwe APS te bereiden.
- Voeg 2,5 gl tetramethyleendiamine (TEMED) en 25 gl APS oplossing van het gesteriliseerde hydroxy-PAAM oplossing (stap 2.5) om de polymerisatie te initiëren. Meng de oplossing door 3 opeenvolgende pipettings zonder introductie van bellen, onder steriele omstandigheden.
- Onder een steriele kap, plaats een 25 ul druppel van het hydroxy-PAAM oplossing op een 25 mm dekglaasje (verkrijgbaar bij stap 1.9) en onmiddellijk plaats een 22 mm glass dekglaasje (bereid in stap 2.5) bovenop de druppel de hydroxy-PAAM oplossing knijpen. Centreer de 22 mm glas dekglaasje met een steriele pincet en glad uit eventuele luchtbellen.
- Laat hydroxy-PAAM hydrogels polymeriseren bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Inverteer handmatig de resterende hydroxy-PAAM oplossing in de Eppendorf buis tot de voltooiing van de polymerisatie volgen.
- Volledig dompel dekglaasjes met steriele DDH 2 O en 22 mm dekglaasjes zorgvuldig gescheiden door invoering van de rand van een scheermes tussen de 22 mm dekglaasjes en hydroxy-PAAM hydrogel laag.
- Wassen hydroxy-PAAM hydrogels met steriele PBS (3 uitwisseling van PBS) en laat de gel volledig ondergedompeld in steriele PBS om hydratatie te behouden.
- WINKEL hydroxy-PAAM hydrogels in steriele PBS bij 4 ° C gedurende maximaal 3 dagen.
3 Polydimethylsiloxaan (PDMS) Microstamp Fabrication
OPMERKING: De fabricage van een silicium meester wordt voorafgaand aan sta vereistrt het PDMS microstamp fabricage. Dit microfabrication van een silicium meester kan worden gedaan door lithografische technieken, die gespecialiseerde apparatuur en training vereist. Samenwerkingen met een nanofabricage faciliteit worden aangemoedigd om het silicium meester fabriceren. U kunt ook contact opnemen met een bedrijf dat op maat gemaakte microstructured silicium masters fabriceert op de vraag. Het is belangrijk op te merken dat de fabricage van het silicium meester hoeft slechts eenmaal te worden gedaan. Inderdaad, microgestructureerde silicium masters onbeperkt worden gebruikt elastomere stempels produceren.
- Mix PDMS en het hardingsmiddel in een verhouding 10: 1 in een plastic beker en meng met een pipet voor 10 minuten.
- Ontgas de PDMS mengsel onder vacuüm om luchtbellen die tijdens de stap 3.1 gevormd verwijderen.
- Plaats de microstructuur silicium meester in een petrischaal en wierp een 10-mm dikke laag ontgast PDMS mengsel op het zonder de vorming van luchtbellen.
- Genees de PDMS 2 uur bij 60 ° C in eenoven.
- In een stofvrije omgeving, peel-off van de PDMS laag en accijnzen 1 cm 2 microstamps met een scalpel.
- Behulp van een tang, plaats PDMS microstamps patroon-up in een petrischaal.
4 Micropatterning Hydroxy-PAAM Hydrogelen
- Plaats PDMS microstamps in een ethanol / water (50/50)-oplossing en ultrasone trillingen gedurende 15 minuten.
- Droog de stempels een stikstofstroom stroming en plaats ze-patroon in een UV / ozon cleaner (λ <200 nm) gedurende 7 minuten.
- Onder een steriele kap, plaats een 150-ul druppel gewenste eiwitoplossing (bijvoorbeeld 100 ug / ml laminine in PBS of 25 ug / ml fibronectine in PBS) op het microgestructureerde oppervlak van 1 cm2 PDMS stempel.
- Optioneel: Wijzig de concentratie van de eiwitoplossing om de cel-ligand dichtheid moduleren.
- Spreid de eiwitoplossing over het stempel oppervlak door het bewegen met een steriele punt van een pipet naar elke hoek vande stempel.
- Laat de eiwitoplossing geadsorbeerd aan het PDMS stempel voor 60 minuten onder een steriele kap. Schakel lampen aan eiwit schade te voorkomen.
- Onder een steriele kap, overdragen hydroxy-PAAM gecoate dekglaasjes (beschikbaar vanaf stap 2.13) in een petrischaal.
- Verwijder overtollig PBS uit het oppervlak van hydroxy-PAAM substraten met een lage stikstofstroom onder steriele omstandigheden. Stop de procedure zodra geen bewijs van stilstaand water op het gel oppervlak waargenomen. De gel dient niet grondig worden gedroogd in dit stadium.
- Droog zorgvuldig de gestructureerde oppervlak van het PDMS stempel met een gestage stroom van hoogzuiver stikstofgas.
- Pak de met eiwit beklede stempel met dressing weefsel pincet en plaats het gestructureerde oppervlak in contact met het gedroogde hydrogel oppervlak. Toepassen korte drukpunten met de punt van pincet op de bovenkant van de PDMS stempel om een goed contact tussen stempel microfeatures en hydrogel oppervlak te verkrijgen.
- Laat de PDMS stempel op The hydrogel oppervlak gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder voorzichtig PDMS postzegels uit hydroxy-PAAM hydrogels met dressing weefsel tang en volg de stap 4.1 op de stempel te reinigen.
- Was grondig de gestempelde hydroxy-PAAM hydrogels door 3 uitwisseling van PBS (pH = 7,4) in steriele omstandigheden gedurende 10 minuten per uitwisseling.
- Optioneel: Extra micropatterns van andere ECM eiwitten kunnen aan de hydroxy-PAAM oppervlak worden toegevoegd door de volgende stappen 4,5-4,11.
- Passiveren onbedrukte zones met een steriele oplossing van BSA bij 5 mg / ml in PBS gedurende een nacht bij 4 ° C onder zacht schudden op een schommelende plaat.
- Was uitgebreid door 3 uitwisseling van PBS (pH = 7,4) in steriele omstandigheden gedurende 10 minuten per uitwisseling. In dit stadium kan gestempeld hydroxy-PAAM hydrogels worden bewaard bij 4 ° C maximaal een week.
5. Cell Afzetting op micropatterned hydroxy-PAAM Hydrogelen
- Incubeer dekglaasjes in celmedium gedurende 30-45 min vóór plateren cells.
- Was hechtende cellen gekweekt in een 75 cm2 kolf met steriele PBS bij 37 ° C en verwijder met 3 ml trypsine-EDTA of Accutase gedurende 10 minuten.
- Breng de gewenste hoeveelheid voorverwarmde compleet groeimedium geschikt is voor uw cellijn in de kolf die de vrijstaande cellen en centrifuge de celsuspensie gedurende 3 min bij 650 x g.
- Verwijder het supernatant met een micropipet en resuspendeer de cellen in compleet kweekmedium 15-20,000 cellen / ml.
- Voeg 4 ml van de celoplossing een micropatterned dekglaasje (verkregen uit stap 5.1) en plaats het cel bedekte dekglaasje in een incubator bij 37 ° C en 5% vochtigheid gedurende 1-2 uur.
- Zuig zachtjes losse cellen en vervang kweekmedium. Bijgesloten cellen naar de incubator laten verspreiden volledig (3-6 uur, afhankelijk van het celtype).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A toont de co-polymerisatie van acrylamide (AAm) en bisacrylamide (bis-AAm) met N-hydroxyethylacrylamide (HEA) monomeren die een primair hydroxyl gevormd door willekeurig radicaalpolymerisatie- een hydrofiele netwerk van polyacrylamide met ingebedde hydroxylgroepen (hydroxy-PAAM) . In dit protocol moet een gewicht 65 mg HEA worden verdund in een volume van 1 ml HEPES. Wetende dat de dichtheid van HEA is ongeveer gelijk aan een, gaan we ervan uit dat we een werkvolume van 1.065 pi (HEA + HEPES) te verkrijgen. Zoals in Tabel 1, de totale toevoeging van 1,065 ul tot 400 ul van AAm en 50 pl bisAAm tot een volume van 1.515 ul. Daarom een volume van 3.485 gl HEPES nodig om de oplossing tot een eindvolume van 5 ml passen. Zoals aangegeven in stap 2.6, moet het oppervlak van de 22 mm glazen dekglaasje worden geactiveerd gedurende 7 min in een UV / ozon volledig te verwijderen zonder dateventuele schade aan de hydrogel oppervlak. Inderdaad, het glazen oppervlak beter hydrofiel na de UV / ozon behandeling en kan dus gemakkelijk worden verwijderd door onderdompeling van het gehele systeem in water. Bovendien, de UV / ozon behandeling voorkomt chemische besmetting van de 22 mm dekglaasje, dat in direct contact met de hydrogel oppervlak. Deze techniek maakt het mogelijk om een plat cirkelvormig vlak polyacrylamide (22 mm in diameter) gebonden aan een glazen dekglaasje (25 mm diameter) te verkrijgen.
Zoals weergegeven in figuur 1B, kan micropatterns eiwitten worden gemaakt op het oppervlak van hydroxy-PAAM hydrogels door microcontactprinten. In deze experimentele procedure, UV / ozon posities toe om tijdelijk intrinsieke hydrofobiciteit van het PDMS stempels verminderen door het vormen silanolgroepen aan de oppervlakte. Inderdaad, de 185 nm lijn produceert ozon van moleculaire zuurstof, terwijl de 254 nm lijn zet de ozon aan atomaire zuurstof. Deze reactieve species valt de siloxaan backbone van PDMS aan zuurstofrijke SiOx silica-achtige laag en Si-OH groepen oppervlak vormen. De geoxideerde PDMS oppervlak bekend zijn hydrofobiciteit herstellen enkele uren na blootstelling aan lucht door de migratie van laagmoleculaire verknoopte polymeerketens uit de bulk fase het oppervlak. Deze strategie helpt de verspreiding van de eiwitoplossing op het oppervlak van het PDMS stempel.
Een van de belangrijkste voordelen van deze methode is onafhankelijk moduleren stijfheid matrix (figuur 2A), micropattern geometrie (figuur 2B), cel-ligand dichtheid (figuur 2C) en proteïne-karakter (Figuren 3A en 3B). Zoals getoond in figuur 2A, hydroxy-PAAM hydrogelen vertonen een lineaire afhankelijkheid van elastische moduli on verknopingsmiddel concentratie van enkele kPa tot enkele tientallen kPa, waardoor fijne weergave van de stijfheid van de cellulaire micro-omgeving. Figuur 2B Figuur 2C toont dat de cel ligand dichtheid worden gemoduleerd door het variëren van de concentratie van het eiwit is gebruikt voor PDMS stempels incuberen. Figuur 3 toont een fluorescentiebeeld van collageen lijnen gestempeld over laminine en fibronectine lijnen met opeenvolgende microcontact drukken.
Het is interessant om de lezer te merken dat verschillende afmetingen en vormen van micropatterns zijn efficiënt gestempeld, ongeacht de hydrogel stijfheid. We hebben met succes microfeatures van proteïnen met scherpe hoeken (bijvoorbeeld driehoeken en sterren) en rechte (bijvoorbeeld lijnen), of gebogen (bijvoorbeeld, cirkels) vormen weergegeven, waaruit blijkt dat er geen major beperkt de complexiteit patroon. Voor enkele cel experiment, het micropattern oppervlak was tussen 400 en 2.500 um 2, de onderste overeenkomt met de grens van afzonderlijke cellevensvatbaarheid. Zoals vele andere-microschrift gebaseerde methoden, de belangrijkste beperking van de gepresenteerde methode betreft de ruimtelijke resolutie. Op stijve hydrogels (E> 10 kPa), de ruimtelijke resolutie is rond de micrometer en met name bepaald door de resolutie van de stempel, terwijl op "zachte" hydrogels, de limiet van de resolutie wordt mede bepaald door het oppervlak vervormingen die zouden kunnen optreden tijdens de eiwit-overdracht.
De toxiciteit van hydroxy-PAAM hydrogels werd onderzocht door het kwantificeren van de levensvatbaarheid van primaire endotheliale cellen uitgeplaat voor 1, 2 en 3 dagen in kweek op homogeen gecoat en microprinted soft hydroxy-PAAM hydrogels (Figuur 4A). Ongeveer 80% van HUVECs uitgeplaat op micropatterned zachte hydroxy-PAAM hydrogels onderhoudenhun levensvatbaarheid gedurende drie dagen, het aantonen van de biocompatibiliteit van hydroxy-PAAM hydrogels voor celcultuur. Interessant levensvatbaarheidswaarden werd verkregen in ons laboratorium met primaire corticale neuron cellen. Bovendien, de primaire endotheelcellen prolifereren meer voor "stiff" (500 kPa) in vergelijking met "zachte" (25 kPa) substraten (figuur 4B), wat aangeeft dat deze methode een geschikte micro-omgeving voor het bestuderen van cellulaire proliferatie in een breed scala van rigiditeit .
Om het effect van substraat stijfheid en verspreidingsgebied op mechanotransduction ontkoppelen, werden primaire endotheelcellen (HUVEC) uitgeplaat op rechthoekige FN-beklede micropatterns (constant gebied van 1.200 pm2) afgezet op hydroxy-PAAM hydrogels drie verschillende stijfheden (2.5, 8.5, en 25 kPa). Vervolgens HUVEC werden gekleurd voor actine filamenten, vinculin en DNA door na een standaard immunocytochemie procedure als voor mammalian cellen op glas substraten. Op de zachtste substraten HUVEC vertonen lage actine vezeldichtheid en een ronde kern, terwijl op stijver substraten actine vezels rechter en dikker en de kern vervormd (figuur 5). Veranderingen in substraat stijfheid bij constante verspreidingsgebied moduleren spanning en verdeling van actine stressvezels, waardoor de herinrichting van de kern. Deze observatie suggereert een mechanische koppeling tussen matrix stijfheid, cytoskelet, en kern.
| Final AAm / bisAAm verhouding | AAm 40% (pl) | Gewicht van HEA te lossen in 1 ml HEPES (mg) | AAm bis (2%) (Pl) | HEPES (pl) | Young's modulus (10 3 Pa) |
| 0,2 / 50 0.5 / 50 1/50 2/50 3/50 | 400 400 400 400 400 | 65 65 65 65 65 | 50 125 250 500 750 | 3.485 3.410 3.285 3.035 2.785 | -1,4 ~ 3.6 ~ 8.7 ~ 17.2 ~ 25 |
Tabel 1: Voorbereiding van de hydroxy-PAAM hydrogels met verschillende rigiditeiten. Working oplossingen voor hydroxy-PAAM hydrogels te bereiden met de uiteindelijke stijfheid variërend 1,4-25 kPa.
Figuur 1 (A) Acrylamide (AAm, zwart), N, N'-methyleenbisacrylamide (bis-AAm, blauw) en N-hydroxyethylacrylamide (HEA, rood) werden tezamen gemengd hydroxy vormen PAAM hydrogels. (B) Schematische weergave van de verschillende stappen van de procedure micropatterning op hydroxy-PAAM hydrogels. Een oplossing van eiwit eerst geïncubeerd gedurende 1 uur op de structuur gezicht van een microstamp (stap 1). De hydrogel oppervlak voorzichtig gedroogd met een stikstofstroom (stap 2). De microstamp wordt dan in formele contact met de hydroxy-PAAM oppervlak gedurende 1 uur (stap # 3). Na opeenvolgende wasbeurten wordt de microprinted oppervlak gepassiveerd met een steriele BSA oplossing afgezet O / N bij 4 ° C (stap 5) tot onbedrukt gebieden blokkeren. Ten slotte wordt de microprinted hydroxy-PAAM oppervlak meerdere malen gewassen met steriel PBS en is klaar voor de cel zaaien (stap 6). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
1010 / 51010fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 2 (A) De ontwikkeling van de stijfheid van hydroxy-PAAM hydrogels lineair gecorreleerd met de hoeveelheid bis-AAm vernetter (rode lijn is een lineaire regressie met R2 = 0,995). (B) Fluorescentie afbeeldingen laminine rechthoekige micro-elementen gestempeld hydroxy-PAAM hydrogels verschillende stijfheden (E = 2,5, 15 en 40 kPa). Scale corresponderen met (A) 65 urn, (B) 80 urn, en (C) 50 urn. (C) Parallelle lijnen van 15 urn breed vorm een LM gradiënt op een 25 kPa hydroxy-PAAM hydrogel, zoals aangegeven door de ontwikkeling van de fluorescentie-intensiteit profiel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
n "src =" / files / ftp_upload / 51010 / 51010fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 3 (A) Immuunfluorescentie beeld van fibronectine (in rood) en Laminin (in het groen) strepen gekruist op 90 °. (B) Multilabeling van fibronectine (in rood), Laminin (in het groen) en collageen (in het blauw) strepen microprinted vervolgens op een 25 kPa hydrogel PAAM substraat. Schaalbalken overeen met 30 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 (A) De kwantificering van cellevensvatbaarheid aangetoond uitstekende celoverleving 24, 48 en 72 uur na uitgeplaat op homogeen beklede en micropatterned hydroxy-PAAM oppervlakken. Het nummer aangegeven opde bodem van elke balk komt overeen met het totale aantal getelde cellen voor de levensvatbaarheid assay. (B) Kwantificering van HUVEC proliferatie 25 en 500 kPa homogeen beklede substraten na 1 (witte staven) en 7 (hash staven) dagen kweken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 Fluorescent afbeeldingen immuun-primaire endotheelcellen gekweekt op rechthoekige FN-beklede micropatterns die werden op-hydroxy PAAM hydrogels van 2,5 kPa, 8,5 kPa en 25 kPa (van links naar rechts). Het actine stressvezels (groen ) werden gekleurd met Alexa Fluor 488 phalloidin, focale adhesies (in het rood) werden gekleurd met een muis polyclonal primair antilichaam en gemerkt met een rode fluorescerende IgG secundair antilichaam en het DNA werd gekleurd met blauw met DAPI. De schaal corresponderen met 17 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veel in vitro waarnemingen in de moderne celbiologie uitgevoerd op harde dekglaasjes, vaak bekleed met een dunne laag van ECM eiwitten of synthetische peptiden die de RGD-sequentie. Echter, zulke fundamentele cultuur substraten niet recapituleren de hele fysisch-chemische complexiteit van de ECM en dus niet voorzien van een nauwkeurig model voor het bestuderen van cellulaire processen mechanotransduction. Om dit probleem aan te pakken, stellen we een eenvoudig alternatief voor tweedimensionale hydrogels functionaliseren met elke gewenste hoeveelheid en de aard van ECM eiwitten. Deze methode maakt het onafhankelijke controle van belangrijke mechanotransduction signalen, zoals matrix stijfheid, cellulaire morfologie en opsluiting of cel-ligand dichtheid. Bovendien hydroxy-PAAM hydrogels overwinnen een van de grootste beperkingen van de huidige functionalisering methoden die het onvermogen te immobiliseren en de ruimtelijke verdeling van meerdere ECM eiwit beheersen. Door de hoge affiniteit van hydroxy-PAAM hydrogelen voor biomoleculen, kan men de ruimtelijke verdeling van verschillende ECM eiwitten op hetzelfde oppervlak, ongeacht de matrix stijfheid door sequentiële microprintings, die geen aanvullende apparatuur vereisen bedienen.
Wij stellen voor een nieuwe procedure op basis van de integratie van hydroxylgroepen binnen acrylamide hydrogels hun intrinsiek niet-klevende eigenschappen te overwinnen met minimale eisen van de kosten of deskundigheid. In vergelijking met bestaande technieken voor patroonvorming eiwitten op hydrogels, vermijdt het gebruik van agressieve giftige chemicaliën (bijvoorbeeld hydrazine hydraat), duur fotoreactieve verknopingsmiddelen (bijvoorbeeld Sulfo-SANPAH) en de afhankelijkheid van UV lampvermogen en positionering van de hydroxy-PAAM methode functionaliseren zachte hydrogels. Hydroxy-PAAM hydrogels blijven stabiel en actief voor meerdere weken, kan de massa worden geproduceerd, gemakkelijk microprinted en hun hoge affiniteit voor biomoleculen mogelijk om synergistische effecten te onderzoekengeconjugeerde ECM eiwitten op cellulaire functies. Daarnaast kunnen hydroxy-PAAM hydrogels worden gebruikt om kwantitatief de hoeveelheid contractiele krachten uitgeoefend door cellen op hun omgeving micro onderzoeken. Inderdaad hebben we eerder aangetoond dat 1,20 fluorescerende korrels gemakkelijk kan worden ingebed in hydroxy-PAAM hydrogels, om cel trekkracht microscopie (TFM) om het veld verplaatsing meten en schatten het resulterende veld tractie uitgeoefend door eukaryotische cellen op tweedimensionale micropatterns.
Zoals veel andere microprint gebaseerde werkwijzen, de belangrijkste beperking van hydroxy-PAAM hydrogels betreft de ruimtelijke resolutie van eiwitten microfeatures. Op stijve hydrogels (E> 10 kPa), de ruimtelijke resolutie is ongeveer een micrometer en voornamelijk bepaald door de resolutie van de stempel, afhankelijk van de lithografie techniek voor het silicium matrijs vervaardigen. Bij zachtere hydrogels, wordt de ruimtelijke resolutie mede bepaald door the oppervlakte vervorming tijdens het eiwit overdracht, die de voornaamste beperking tot micrometer ruimtelijke resolutie te bereiken wordt. De hier gepresenteerde benadering is momenteel beperkt tot tweedimensionale substraten. Deze methode is echter zeer schaalbaar en verdere studies zijn momenteel in ons laboratorium om deze methode uit te breiden tot driedimensionale structuren.
We hopen dat hydroxy-PAAM hydrogels kunnen bijdragen tot belangrijke mechanismen van complexe cellulaire en weefsel processen die nauw verband houden met de fysisch-chemische eigenschappen van de cel micro 21,22, waaronder embryonale ontwikkeling, ontstekingsreacties, wondheling, neuriet uitgroei, volwassen weefsel ontcijferen homeostase en de pathogenese van ziekten zoals fibrose en kanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0.2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin (rabbit) | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
References
- Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
- Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking. Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).
- Atmanli, A., Domian, I. J. Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing. J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).
- Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays. Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).
- Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes. Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).
- Rundqvist, J., et al. High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation. J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).
- Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications. Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).
- Holden, M. A., Cremer, P. S. Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces. J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).
- Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture. Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching. Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).
- Tseng, Q., et al. New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS ONE. 7, e51499 (2012).
- Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli. Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Hemphill, M. A., et al. A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury. PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).
- Tseng, Q., et al. new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells. Nat. Commun. 3, 671 (2012).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus. Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).
- Trappman, B., Chen, C. S. How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective. Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).
