Summary
Vi presenterar en ny polyakrylamid hydrogel, som kallas hydroxy-PAAM, som gör att en direkt bindning av ECM-proteiner med minimal kostnad eller sakkunskap. Kombinationen av hydroxy-PAAM hydrogeler med mikrokontakttryckning underlättar oberoende kontroll av många ledtrådar i den naturliga cellmikromiljö för att studera cellulära mechanostransduction.
Abstract
Det är nu väl etablerat att många cellulära funktioner regleras av interaktioner av celler med fysikalisk-kemiska och mekaniska signaler i deras extracellulära matrisen (ECM) miljö. Eukaryota celler ständigt känna sin lokala mikromiljö genom ytan mechanosensors att omvandla fysiska förändringar av ECM till biokemiska signaler, och integrera dessa signaler för att åstadkomma specifika förändringar i genuttryck. Intressant att fysiokemiska och mekaniska parametrarna hos ECM kan par med varandra reglera cell öde. Därför är en nyckel till förståelsen mechanotransduction är att frikoppla den relativa betydelsen av ECM ledtrådar på cellulära funktioner.
Här presenterar vi ett detaljerat försöksprotokoll för att snabbt och enkelt skapa biologiskt relevanta hydrogeler för oberoende inställning av mechanotransduction ledtrådar in vitro. Vi kemiskt modifierade polyakrylamid hydrogeler (PAAM) för att övervinna sin naturligt icke-ADHESive egenskaper genom att införliva hydroxyl-funktionaliserad akrylamidmonomerer under polymerisationen. Vi fick en ny PAAM hydrogel, som kallas hydroxy-PAAM, som medger immobilisering av önskad karaktär ECM-proteiner. Kombinationen av hydroxy-PAAM hydrogeler med microcontact utskrift gör det möjligt att självständigt styra morfologi enkelceller, matrisen styvhet, natur och tätheten av ECM-proteiner. Vi erbjuder en enkel och snabb metod som kan sättas upp i varje biologi labb för att studera i cell mechanotransduction vitro processer. Vi validerar denna roman tvådimensionell plattform genom att utföra experiment på endotelceller som visar en mekanisk koppling mellan ECM styvhet och kärnan.
Introduction
Många aspekter av den lokala cellulära mikromiljön (t.ex. styvhet, porstorlek, typ av proteiner eller cell ligandtäthet) ge en koordinat uppsättning regulatoriska signaler som styr cellulära processer som motilitet, celltillväxt, differentiering och genuttryck. Modifieringar av de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos den extracellulära miljön kan uppfattas av celler och orsakar olika fysiologiska konsekvenser, inklusive deformation av cellulär polarisering, migration och differentiering. Det förblir dock oklart hur celler översätter ECM ändringar i cellulära biokemiska signaler. Det är därför av stor vikt att konstruera kontrolleras in vitro mikromiljöer som kan återge samspelet mellan celler och deras mikromiljö för att studera mechanotransduction vägar. För att lösa detta problem har vi nyligen infört en ny metod 1, som kallas hydroxy-PAAM hydrogel, för att enkelt skapa två-dimensional mjuka matriser som tillåter att självständigt styra viktiga mechanotransduction ledtrådar: matrisstyvhet, cellgeometri och inneslutnings, slag av protein och cell ligandtäthet.
ECM styr cellulära processer via gradienter i morfogener (kemotaxi), självhäftande proteiner (haptotaxis) och stelhet (durotaxis). Under de senaste decennierna, avancerade in vitro-plattformar har utvecklats för att isolera dessa extracellulära signaler för att locka fram hur celler kan översätta biokemiska och biofysiska funktioner i fysiologiska processer 2-5. Elektronstråle 6, fotolitografi 7, fotokemisk immobilisering 8 eller plasmaassisterade tekniker 9 har utvecklats för att styra tillväxten av levande celler på micropatterned substrat. Har gett Även om dessa tekniker viktiga resultat, de flesta av dem tillåter inte diskriminering mellan den individuella påverkan av olika ledtrådar på cellens beteendeoch de kräver tekniska anläggningar som få laboratorier har råd. Bland dessa tekniker, microcontact utskrift (μCP), har framträtt som en robust och tillgänglig metod för att skapa cell självhäftande mikro öar 10. På senare tid har ett omfattande arbete 11-14 gjorts för att utveckla μCP på hydrogeler med sökbara stelheter för att återge de många stelheter som observerats i levande vävnader. Bland dessa verk, har polyakrylamid (PAAM) blivit populära 15 och är redan en av de vanligaste polymerbaserade matriser för cell biomekanik analyser.
PAAM ytor är vanligtvis funktionaliserad med den heterobifunktionella tvärbindaren N-sulfosuccinimidyl-6-[4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) och ECM-proteiner är kopplade till ytan genom UV-aktivering av sulfo-SANPAH nitrofenyl azid grupper 16. En annan teknik består i kopplings hydrazin till proteiner som har svårt oxiderademed perjodat 17. Hynd och medarbetare infört en teknik för mönstring biomimetiska hydrogelpartiklar ytor med protein och peptider som kräver fotopolymerisation i närvaro av ett acroyl-streptavidin monomeren 18. Mer nyligen, Tseng et al. Har rapporterat en ny micropatterning metod 19 baseras på djup UV-exponering av PAAM genom en optisk kvartsmask som kräver att inkubera aktiverade PA-geler med en-etyl-3-[3-dimetylaminopropyl] karbodiimid-hydroklorid (EDC) och N-hydroxisuccinimid (NHS) vattenlösningar före lägg proteinet. Trots möjligheten för dessa tekniker för att skapa homogena och reproducerbara proteiner micropatterns, de flesta av dem lider stora begränsningar: långa syntesprocesser (t.ex. dialys, frystorkning, etc), dyra kemiska föreningar (t.ex. hyaluronsyra, sulfo-SANPAH) eller djup UV bestrålning. Dessutom har dessa tekniker tillåter inte oberoende modulering av substrat stelhet, micropatterngeometri, ECM-protein natur, och cell-ligandtäthet.
Med dessa begränsningar i beaktande, har vi utvecklat en ny och enkel akrylamid baserad metod som gör att immobilisering av en mängd olika proteiner och biomolekyler på mjuka hydrogeler och medger oberoende justering av mechanotransduction ledtrådar för att dechiffrera deras roll på cellulära funktioner. Istället för att behandla PAAM hydrogeler med hårda kemiska föreningar, introducerar vi en kommersiell akrylamidmonomer med hydroxylgrupper under PAAM polymerisation. Denna enkla operation övervinner den inneboende antiklister egendom PAAM hydrogeler utan andra tekniska krav.
Närvaron av hydroxylgrupper leder till en hög affinitet för hydroxy-PAAM hydrogel för proteiner och biomolekyler som bildar vätebindande interaktioner. I kombination med μCP, hydroxy-PAAM hydrogeler möjliggör en snabb generation tvådimensionell kultur plattform med en oberoende kontrollpå matrix stelhet, typ av ECM-proteiner, cell ligandtäthet och begränsade vidhäftning, som är tänkt att vara en kraftfull plattform för att studera mechanotransduction.
Syftet med detta protokoll är att ge den information som behövs för att enkelt göra hydroxy-PAAM hydrogeler utan kompetens inom materialvetenskap. Det slutliga målet är att tillhandahålla ett sätt för forskare att ställa fysiologiskt relevanta frågor på cellulär och vävnadsnivåer som kan leda till en bättre förståelse av mechanotransduction involverade i patofysiologiska mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Aktivera Ytan av täckglas
- Placera glas runda täckglas (25 mm diameter) i en petriskål och smeta 0,1 M NaOH-lösning på den i 5 min (dragskåp rekommenderas).
- Avlägsna NaOH-lösning och helt fördjupa täck med steril DDH 2 O i 20 minuter samtidigt som du försiktigt gunga på en gungplatta i en steril kultur huva.
- Tappa sterila DDH 2 O och upprepa steg 1.2.
- Avlägsna täckglasen med sterila pincett och placera dem i en ny petriskål med den aktiverade uppåt.
- Torra täck enligt ett stadigt flöde av högrent kvävgas.
- I en steril kultur huva, smeta ett tunt lager av 3-(trimetoxisilyl) propyl-akrylat (92%) på den aktiverade sidan av täckglas för en timme.
- Omfattande tvätta täckglas med 3 tvättar sterilt DDH 2 O och sänk dem i steril DDH 2 O i en ny petriskål.
- Tryck på petriskålmed Parafilm och placera den på en rocker platta under försiktig omrörning i 10 minuter.
- Ta bort täckglasen från DDH 2 O med sterila pincett med fina spetsar och placera dem i en ny petriskål med den aktiverade uppåt.
- Förvara vid RT på en torr plats med aluminiumfolie för att undvika damm fastnar på täckglas.
2 Beredning av hydroxy-PAAM Hydrogeler
- Bered en vikt av 65 mg N-hydroxietyl akrylamid (HEA) i ett 1,5 ml Eppendorf-rör. Det är viktigt att förbereda en färsk HEA lösning.
- Tillsätt 1 ml 50 mM HEPES buffert till HEA och blanda med hjälp av en virvel tills hela HEA upplösning.
- Lägg 400 | il av 40% vikt / vikt i HEPES-lösning akrylamid och erforderlig volym av 2% vikt / vikt i HEPES bis-akrylamidlösning (se tabell 1) för att nå den önskade hydrogelen styvhet. Justera med 50 mM HEPES till en slutlig volym av 5 ml.
- Blanda lösningen med en virvelblandare och avgasa deti en vakuumkammare för 20 min i syfte att minska syrekoncentrationen i lösningen, vilket förhindrar hydroxi-PAAM polymerisation.
- Under en steril huva, filtrera avgasas lösning med 0,2 um porstorlek filter för att sterilisera den.
- Aktivera runda glas täckglas (22 mm diameter) i en UV / ozon renare under 7 min.
- Bered 100 pl 10% ammoniumpersulfat (APS)-lösning, är att 10 mg APS i 100 ^ DDH 2 O. Det är viktigt att framställa en färsk lösning APS.
- Lägg 2,5 | il tetrametylendiamin (TEMED) och 25 ul av lösningen APS till den steriliserade hydroxi-PAAM lösning (steg 2,5) för att initiera polymerisationen. Blanda lösningen genom tre successiva pipettings utan införande av bubblor, under sterila betingelser.
- Under en steril huva, placera en 25 l droppe av hydroxy-PAAM lösning på en 25 mm täckglas (tillgänglig från steg 1,9) och omedelbart placera en 22 mm glass täckglas (framställd på steg 2,5) på toppen av droppen för att pressa den hydroxi-PAAM lösning. Centrera 22 mm täckglas med sterila pincetter och jämna ut eventuella bubblor.
- Tillåt hydroxy-PAAM hydrogeler polymerisera vid RT i 15 min. Invertera manuellt återstående hydroxi-PAAM lösningen i Eppendorf-rör för att följa fullbordandet av polymerisationsprocessen.
- Fullt fördjupa täck med steril DDH 2 O och noga skilja 22 mm täckglas genom att kanten av ett rakblad mellan 22 mm täckglas och hydroxy-PAAM hydrogelskikt.
- Tvätta hydroxy-PAAM hydrogeler med steril PBS (3 utbyten av PBS) och låt gelerna helt nedsänkta i steril PBS att upprätthålla hydrering.
- Förvara hydroxy-PAAM hydrogel i steril PBS vid 4 ° C i upp till 3 dagar.
3 Polydimetylsiloxan (PDMS) Microstamp Fabrication
OBS: Tillverkningen av en kisel mästare krävs före start PDMS microstamp fabrikation. Denna mikrofabrikation av en kisel mästare kan göras med litografiska metoder, vilket kräver specialiserad utrustning och utbildning. Samarbeten med en nanotillverkning anläggning uppmuntras att tillverka kisel mästare. Alternativt, kontakta ett företag som tillverkar skräddarsydda mikro kisel mästare på efterfrågan. Det är viktigt att notera att tillverkningen av kisel befälhavaren behöver bara göras en gång. I själva verket kan mikrostrukturerade kisel mästare användas på obestämd tid för att producera elastomer frimärken.
- Blanda PDMS och härdaren i en 10: 1-förhållande i en plastbägare och blanda noggrant med användning av en pipett för 10 min.
- Avgasa PDMS blandningen under vakuum för att avlägsna luftbubblor som bildats under steg 3,1.
- Placera mikro kisel mästare i en petriskål och kastade en 10-mm tjockt lager av avgasad PDMS blandningen på det utan att det bildas bubblor.
- Låta bota PDMS för 2 timmar vid 60 ° C i ettugn.
- I en dammfri miljö, peel-off PDMS lager och punktskatter 1 cm 2 microstamps med en skalpell.
- Använd pincett, placera PDMS microstamps mönster-up i en petriskål.
4. Micropatterning Hydroxi-PAAM Hydrogeler
- Place PDMS microstamps i en etanol / vatten (50/50)-lösning och sonikeras under 15 min.
- Torka stämplarna med en ström av kväve flöde och placera dem mönster upp i en UV / Ozon renare (λ <200 nm) under 7 min.
- Under en steril huva, placera en 150-ul droppe av en önskad proteinlösning (t.ex., 100 ^ g / ml laminin i PBS eller 25 | ig / ml fibronektin i PBS) på den mikrostrukturerade ytan av en 1-cm 2 PDMS stämpel.
- Valfritt: Ändra koncentrationen av proteinlösningen för att modulera cell ligandtäthet.
- Sprid proteinlösningen över stämpelns yta genom att flytta den med en steril spets på en pipett mot varje hörn avstämpeln.
- Lämna proteinlösningen för att adsorbera på PDMS stämpeln för 60 minuter under en steril huva. Stäng av lampor för att undvika proteinskada.
- Under en steril huva, överför hydroxi-PAAM belagda täckglas (tillgängliga från steg 2,13) i en petriskål.
- Ta bort överflödigt PBS från ytan av hydroxy-PAAM substrat med låg kväveström under sterila förhållanden. Stoppa förfarandet så snart några tecken på stående vatten på gelytan observeras. Gelen får inte torkas ordentligt i det här skedet.
- Torka försiktigt den strukturerade ytan av PDMS stämpel med en jämn ström av hög renhet kvävgas.
- Ta tag i proteinbelagda stämpel med dressing vävnad pincett och placera den strukturerade ytan i kontakt med den torkade hydrogel ytan. Applicera korta tryckpunkter med spetsen på en pincett på toppen av PDMS stämpeln för att säkerställa en god kontakt mellan stämpel microfeatures och hydrogelen ytan.
- Låt PDMS stämpel på the hydrogel yta under 1 h vid RT.
- Ta försiktigt bort PDMS frimärken från hydroxy-PAAM hydrogeler med dressing vävnad pincett och följ steg 4.1 för att rengöra stämpeln.
- Tvätta utför stämplade hydroxy-PAAM hydrogel med 3 utbyten av PBS (pH = 7,4) i sterila förhållanden i 10 min per utbyte.
- Valfria: Ytterligare micropatterns av andra ECM-proteiner kan tillsättas till den hydroxi-PAAM yta genom att följa steg 4,5-4,11.
- Passivera icke tryckta zoner med en steril lösning av BSA vid 5 mg / ml i PBS under en natt vid 4 ° C under försiktig omrörning på en gungande platta.
- Tvätta i stor utsträckning av 3 utbyten av PBS (pH = 7,4) i sterila förhållanden i 10 min per utbyte. I detta skede kan stämplas hydroxy-PAAM hydrogeler lagras vid 4 ° C i upp till en vecka.
5. Cell Deposition på micropatterned hydroxy-PAAM Hydrogeler
- Inkubera täckglas i cell media för 30-45 min före plätering calnar.
- Tvätta adherenta celler odlade i en 75 cm 2 odlingskolv med steril PBS vid 37 ° C och ta loss den med 3 ml trypsin-EDTA eller Accutase för 10 min.
- Överför den önskade mängden av förvärmda komplett tillväxtmedium lämpliga för den cellinje in i kolven innehållande de lösgjorda cellerna och centrifugera cellsuspensionen för 3 min vid 650 x g.
- Avlägsna supernatanten med en mikropipett och återsuspendera cellerna i komplett odlingsmedium vid 15-20.000 celler / ml.
- Lägg 4 ml av cellösningen till en micropatterned täckglas (erhållen från steg 5,1) och placera cellen täckta täckglas i en odlingsinkubator vid 37 ° C och 5% fuktighet under 1 till 2 timmar.
- Sug försiktigt obundna celler och byt odlingsmedium. Returnera bifogade cellerna till inkubatorn och låt dem spridas fullständigt (3-6 h, beroende på celltypen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A visar sampolymerisation av akrylamid (AAm) och bisakrylamid (bis-AAm) med N-hydroxyethylacrylamide (HEA) monomerer som innehåller en primär hydroxylgrupp bildas av slump radikalpolymerisering en hydrofil nätverk av polyakrylamid med inbäddade hydroxylgrupper (hydroxy-PAAM) . I detta protokoll måste en vikt 65 mg HEA spädas i en volym av 1 ml HEPES. Att veta att tätheten av HEA är ungefär lika med ett, antar vi att vi får en arbetsvolym på 1,065 l (HEA + HEPES). Såsom presenteras i tabell 1, den totala tillsatsen av 1065 pl till 400 pl av AAm och 50 pl av bisAAm leder till en volym av 1515 ^ il. Därför behövs en volym av 3485 ul av HEPES för att justera lösningen till en slutlig volym av 5 ml. Såsom indikeras i steg 2,6, måste ytan på 22 mm täckglas aktiveras under 7 minuter i en UV / ozon i syfte att avlägsna den utan att orsakaeventuella skador på hydrogel ytan. I själva verket blir mer hydrofil efter UV / ozon behandlingen glasytan och kan därför lätt avlägsnas genom nedsänkning av hela systemet i vatten. Dessutom förhindrar UV / ozonbehandling kemisk kontaminering av 22 mm täckglas, som är i direkt kontakt med hydrogelen ytan. Detta medger teknik för erhållande av en plan cirkulär polyakrylamid yta (22 mm i diameter) bunden till ett täckglas (25 mm i diameter).
Som visas i figur 1B, kan micropatterns av proteiner skapas på ytan av hydroxy-PAAM hydrogel med microcontact utskrift. I denna experimentella förfarande, UV / Ozon exponeringar tillåter att tillfälligt minska den inneboende hydrofobicitet PDMS frimärken genom att bilda silanolgrupper på ytan. Faktum är att 185 nm linjen producerar ozon från molekylärt syre medan 254 nm linjen omvandlar ozonet till atomärt syre. Denna reaktiva arterna angriper siloxan backbone av PDMS att bilda syrerika SiOx kiseldioxid liknande skikt och Si-OH ytgrupper. Den oxiderade PDMS ytan är känd för att återfå sin hydrofobicitet på bara timmar efter exponering för luft på grund av migration av lågmolekylära otvärbundna polymerkedjor från bulkfasen till ytan. Denna strategi hjälper spridning av proteinlösningen på ytan av PDMS stämpeln.
En av de viktigaste fördelarna med denna metod är att självständigt modulera matrisstyvhet (Figur 2A), micropattern geometri (figur 2B), cell ligandtäthet (figur 2C), och protein natur (Figur 3A och 3B). Såsom visas i fig 2A, hydroxisubstituerade PAAM hydrogeler visar ett linjärt beroende av elasticitetsmodul på tvärbindare koncentration från några kPa till flera dussin kPa, vilket gör fina reproduktion av styvheten hos den cellulära mikromiljön. Figur 2B Figur 2C visar att cellen -liganden densitet kan moduleras genom att variera koncentrationen av proteinlösningen som används för att inkubera PDMS frimärken. Figur 3 presenterar ett fluorescensbild av kollagen linjer stämplade tvärs laminin och fibronektin-linjer genom användning av sekventiella mikrokontakt tryckningar.
Det är intressant för läsarna att notera att olika storlekar och former av micropatterns har stämplats effektivt oavsett hydrogelen styvhet. Vi har reproduceras väl microfeatures av proteiner med skarpa kanter (t.ex. trianglar och stjärnor) och raka (t.ex. linjer) eller krökta (t.ex. cirklar) former, vilket visar att det inte finns någon major begränsning för mönster komplexitet. För enkelcellexperiment, var den micropattern ytarea mellan 400 och 2500 ^ m 2, det lägre värde motsvarande gränsen för enkel cellviabilitet. Som många andra mikrotryck baserade metoder, den största begränsningen av det presenterade metoden avser dess rumsliga upplösningen. På styva hydrogeler (E> 10 kPa), är den rumsliga upplösningen runt mikrometer och bestäms huvudsakligen av upplösningen av stämpeln, medan den "mjuka" hydrogel, blir gränsen för upplösningen bestäms delvis av ytan deformation som kan inträffa under proteinöverföring.
Toxiciteten av hydroxy-PAAM hydrogelema undersöktes genom att kvantifiera livskraft primära endotelceller klädd för en, 2, och 3 dagar i kultur på homogent belagda och microprinted mjuka hydroxy-PAAM hydrogeler (Figur 4A). Cirka 80% av HUVECs pläterade på micropatterned mjuka hydroxy-PAAM hydrogel hållnaderas livsduglighet för tre dagar, vilket visar biokompatibiliteten hos hydroxi-PAAM hydrogeler för cellodling. Intressant var likartad livskraft erhållits i vårt laboratorium med primära kortikala neuron celler. Dessutom de primära endotelceller föröka mer på "hård" (500 kPa) jämfört med "mjuka" (25 kPa) substrat (Figur 4B), vilket tyder på att denna metod ger en lämplig mikromiljö för att studera cellulär proliferation inom ett brett spektrum av stelheter .
För att frikoppla effekten av substrat styvhet och spridningsareal på mechanotransduction ades primära endotelceller (HUVEC) pläterade på rektangulära FN belagda micropatterns (konstant yta på 1.200 um 2) deponeras på hydroxy-PAAM hydrogeler av tre olika styvheter (2.5, 8.5, och 25 kPa). Då var HUVECs färgades för aktinfilament, vinkulin och DNA genom att följa en standard immuncytokemi förfarande, som används för mammaLian celler utstrukna på glassubstrat. På de mjukaste substraten, HUVEC uppvisar låg aktin fiberdensitet och en rundad kärna, medan om styvare substrat, aktinfibrer är rakare och tjockare och kärnan deformeras (Figur 5). Förändringar i substrat styvhet vid konstant spridningsområdet modulera spänningen och distribution av aktin påfrestning fibrer, vilket resulterar i remodellering av kärnan. Denna observation antyder en mekanisk koppling mellan matrisstyvhet, cytoskelettet och kärnan.
| Slutlig AAm / bisAAm förhållande | AAm 40% (pl) | Vikt av HEA att upplösas i en ml HEPES (mg) | bis AAm (2%) (Il) | HEPES (il) | Youngs modul (10 3 Pa) |
| 0,2 / 50 0,5 / 50 1/50 2/50 3/50 | 400 400 400 400 400 | 65 65 65 65 65 | 50 125 250 500 750 | 3485 3410 3285 3035 2785 | ~ 1,4 ~ 3,6 ~ 8,7 ~ 17,2 ~ 25 |
Tabell 1 Beredning av hydroxy-PAAM hydrogeler med olika trögheter. Fungerande lösningar för att förbereda hydroxy-PAAM hydrogeler med slut styvhet varierar från 1,4 till 25 kPa.
Figur 1 (A) Akrylamid (AAm, i svart), N, N-metylenbisakrylamid (bis-AAm, i blått) och N-hydroxyethylacrylamide (HEA, i rött) blandades ihop till hydroxi- PAAM hydrogel. (B) Schematisk bild av de olika stegen i micropatterning proceduren på hydroxy-PAAM hydrogel. En lösning av proteinet först inkuberas under 1 timme på strukturen ansiktet av en microstamp (steg 1). Hydrogelen ytan torkas försiktigt med ett kväveflöde (steg # 2). Den microstamp placeras därefter i formell kontakt med den hydroxi-PAAM ytan under 1 h (steg 3 #). Efter successiva tvättningar, är microprinted ytan passiveras med en steril BSA-lösning avsattes O / N vid 4 ° C (steg # 5) för att blockera icke tryckta områden. Slutligen microprinted hydroxy-PAAM ytan tvättas flera gånger med steril PBS och är redo för cellsådd (steg nr 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1010 / 51010fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2 (A) Utvecklingen av styvheten hydroxy-PAAM hydrogel är linjärt korrelerad med mängden bis-AAm tvärbindare (den röda linjen är en linjär regression med R2 = 0,995). (B) Fluorescens bilder av rektangulär laminin mikro funktioner stämplat på hydroxi-PAAM hydrogeler med olika styvheter (E = 2,5, 15, och 40 kPa). Skalstrecken motsvarar (A) 65 | am, (B) 80 | im, och (C) 50 | im. (C) Parallella linjer av 15 | im bredd bildar en LM-gradient på en 25 kPa hydroxi-PAAM hydrogel, såsom anges av evolutionen av fluorescensintensiteten profilen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
n "src =" / filer / ftp_upload / 51010 / 51010fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3 (A) Immunofluorescens bild av fibronektin (i rött) och laminin (i grönt) ränder korsade i 90 °. (B) Multilabeling av fibronektin (i rött), laminin (i grönt) och kollagen (i blått) ränder microprinted därefter på en 25 kPa hydrogel PAAM substrat. Skala barer motsvarar 30 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 (A) Kvantifiering av cellviabilitet uppvisat utmärkt cellöverlevnad vid 24, 48 och 72 tim efter att den pläterade på homogent drage och micropatterned hydroxi-PAAM ytor. Antalet anges vidner på varje stapel motsvarar det totala antalet räknade celler för livskraft analysen. (B) Kvantifiering av HUVECs spridning på 25 och 500 kPa homogent belagda substrat efter 1 (vita staplar) och 7 (streckade staplar) dagars odling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Fluorescerande bilder av immunostained primära endotelceller odlade på rektangulära FN drage micropatterns, vilka är avsatta på hydroxi-PAAM hydrogeler av 2,5 kPa, 8,5 kPa och 25 kPa (från vänster till höger). De aktin spänningsfibrer (i grönt ) färgades med Alexa Fluor 488 phalloidin, fokala sammanväxningar (i rött) färgades med en mus polyclonal primär antikropp och märkt med en röd-fluorescerande IgG sekundär antikropp och DNA färgades i blått med DAPI. Skal staplarna motsvarar 17 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Många in vitro-observationer i modern cellbiologi har utförts på styva täckglas av glas, ofta belagda med ett tunt skikt av ECM-proteiner eller syntetiska peptider innehållande RGD-sekvensen. Dock en sådan grundläggande odlingssubstrat inte rekapitulera hela fysikalisk-kemiska komplexitet ECM och därmed inte ger en exakt modell för att studera cellulära mechanotransduction processer. För att lösa detta problem föreslår vi ett enkelt alternativ till funktionalisera tvådimensionella hydrogeler med någon önskad mängd och typ av ECM-proteiner. Denna metod tillåter oberoende kontroll av viktiga mechanotransduction ledtrådar, till exempel matrisstyvhet, cellulär morfologi och förlossning eller cell ligandtäthet. Dessutom hydroxy-PAAM hydrogelema vinna en av de största begränsningarna i nuvarande funktionalisemetoder, vilket är en oförmåga att immobilisera och styra den geografiska fördelningen av flera ECM-proteinet. På grund av den höga affiniteten hos hydroxy-PAAM hydrogeler för biomolekyler, kan man styra den geografiska fördelningen av olika ECM-proteiner på samma yta, oavsett matrisen styvhet, med hjälp av sekventiella microprintings, som inte kräver någon extra utrustning.
Vi föreslår ett nytt förfarande grundat på införlivandet av hydroxylgrupper inom hydrogeler akrylamid att övervinna sina inneboende icke-vidhäftande egenskaper med minimala krav på kostnad eller sakkunskap. I jämförelse med befintliga tekniker för mönstring proteiner på hydrogel, undviker hydroxy-PAAM metoden att använda hårda giftiga kemikalier (t.ex. hydrazinhydrat), dyra fotoreaktiva tvärbindnings (t.ex. sulfo-SANPAH) och beroendet av UV-lampa makt och positionering funktionalisera mjuka hydrogel. Hydroxy-PAAM hydrogeler förblir stabila och aktiv i flera veckor, kan massproduceras, lätt microprinted och deras höga affinitet för biomolekyler gör det möjligt att undersöka synergieffekterkonjugerade ECM-proteiner på cellfunktioner. Dessutom kan hydroxi-PAAM hydrogeler användas för att kvantitativt undersöka mängden av kontraktila krafter som utövas av celler på deras omgivande mikromiljö. I själva verket har vi visat tidigare 1,20 att fluorescerande kulor lätt kan bäddas in hydroxy-PAAM hydrogel, för att använda cell dragkraft mikroskopi (TFM) för att mäta förskjutningen fältet och uppskatta den resulterande dragkraft fältet utövas av eukaryota celler ut på tvådimensionella micropatterns.
Som många andra mikrotryck baserade metoder, den största begränsningen av hydroxy-PAAM hydrogel rör den rumsliga upplösningen av protein microfeatures. På styva hydrogeler (E> 10 kPa), är den rumsliga upplösningen kring en mikrometer och bestäms huvudsakligen av upplösningen av stämpeln, beroende på litografiteknik som används för att tillverka kiselform. På mjukare hydrogel, blir den rumsliga upplösningen delvis av the ytdeformation under proteinöverföring, som blir den främsta begränsningen för att nå mikrometer rumslig upplösning. Den metod som presenteras här är för närvarande begränsad till tvådimensionella substrat. Denna metod är dock mycket skalbar och ytterligare studier pågår för närvarande i vårt laboratorium för att utvidga denna metod till tredimensionella strukturer.
Vi hoppas att hydroxy-PAAM hydrogeler kan hjälpa till att dechiffrera viktiga mekanismer för komplexa cellulära och vävnadsprocesser som är intimt kopplade till de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos cellens mikro 21,22, inklusive fosterutveckling, inflammatoriska svar, sårläkning, neuritutväxt, vuxen vävnad homeostas, och patogenesen av sjukdomar såsom fibros och cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0.2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin (rabbit) | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
References
- Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
- Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking. Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).
- Atmanli, A., Domian, I. J. Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing. J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).
- Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays. Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).
- Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes. Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).
- Rundqvist, J., et al. High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation. J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).
- Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications. Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).
- Holden, M. A., Cremer, P. S. Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces. J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).
- Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture. Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching. Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).
- Tseng, Q., et al. New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS ONE. 7, e51499 (2012).
- Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli. Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Hemphill, M. A., et al. A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury. PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).
- Tseng, Q., et al. new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells. Nat. Commun. 3, 671 (2012).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus. Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).
- Trappman, B., Chen, C. S. How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective. Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).
