Summary
Vi præsenterer en ny polyacrylamidhydrogel, kaldet hydroxy-PAAM, der tillader en direkte binding af ECM-proteiner med minimale omkostninger eller ekspertise. Kombinationen af hydroxy-PAAM hydrogeler med microcontact udskrivning letter uafhængig styring af mange tidskoder af den naturlige celle mikromiljø for at studere cellulær mechanostransduction.
Abstract
Det er nu veletableret, at mange cellulære funktioner reguleres af interaktioner af celler med fysisk-kemiske og mekaniske tidskoder af deres ekstracellulære matrix (ECM) miljø. Eukaryote celler fornemmer hele tiden deres lokale mikromiljø gennem overfladen mechanosensors at transducere fysiske ændringer af ECM i biokemiske signaler, og integrere disse signaler for at opnå specifikke ændringer i genekspression. Interessant, at fysisk-kemiske og mekaniske parametre ECM kan par med hinanden regulere celleskæbnen. Derfor er en nøgle til forståelse mechanotransduction er at afkoble relative bidrag ECM tidskoder på cellulære funktioner.
Her præsenterer vi en detaljeret forsøgsprotokol til hurtigt og nemt generere biologisk relevante hydrogeler til den uafhængige tuning af mechanotransduction stikord in vitro. Vi kemisk modificerede polyacrylamid hydrogeler (PAAM) for at overvinde de fra naturens hånd ikke-ADHESive egenskaber ved at inkorporere hydroxyl-funktionaliseret acrylamidmonomerer under polymerisationen. Vi opnåede en roman PAAM hydrogel, kaldet hydroxy-PAAM, som tillader immobilisering af enhver ønsket art af ECM-proteiner. Kombinationen af hydroxy-PAAM hydrogeler med microcontact udskrivning giver mulighed for selvstændigt at styre morfologi af enkelt-celler, matrix stivhed, arten og tætheden af ECM-proteiner. Vi giver en enkel og hurtig metode, der kan sættes op i hver biologi laboratorium til at studere in vitro celle mechanotransduction processer. Vi validerer denne roman todimensionale platform ved at foretage eksperimenter på endotelceller, der viser en mekanisk kobling mellem ECM stivhed og kernen.
Introduction
Mange aspekter af den lokale cellulære mikromiljø (f.eks stivhed, porestørrelse, natur af proteiner eller celle-ligand-densitet) give en koordinat sæt af regulatoriske signaler, der styrer cellulære processer såsom motilitet, celleproliferation, differentiering og genekspression. Modifikationer af de fysisk-kemiske egenskaber af det ekstracellulære miljø kan opfattes af celler og forårsage forskellige fysiologiske konsekvenser, herunder deformation af cellulær polarisering, migration og differentiering. Det forbliver imidlertid uklart, hvordan celler oversætte ECM ændringer i cellulære biokemiske signaler. Det er derfor af stor betydning at konstruere kontrolleret in vitro mikromiljøer, der kan gengive samspillet mellem celler og deres mikromiljø for at studere mechanotransduction veje. For at løse dette problem, har vi for nylig indført en ny metode 1, kaldet hydroxy-PAAM hydrogeler, til nemt at generere to-dimennsional bløde matricer, der tillader til selvstændigt at styre vigtige mechanotransduction stikord: matrix stivhed, celle geometri og indeslutning, art af de proteiner og celle-liganddensitet.
ECM dirigerer cellulære processer via gradienter i morfogener (kemotaksis), klæbende proteiner (haptotaxis) og stivhed (durotaxis). I de seneste årtier har avanceret in vitro-platforme er blevet udviklet til at isolere disse ekstracellulære signaler for at drille ud af, hvordan celler er i stand til at oversætte biokemiske og biofysiske egenskaber i fysiologiske processer 2-5. Elektronstråle 6 fotolitografi 7, fotokemisk immobilisering 8 eller plasma-assisteret teknikker 9 er blevet udviklet til at styre væksten af levende celler på mikromønstrede substrater. Selv om disse teknikker har givet vigtige resultater, de fleste af dem ikke tillade forskelsbehandling mellem den enkelte indflydelse forskellige tidskoder på celle adfærdog de kræver tekniske faciliteter at få laboratorier kan betale. Blandt disse teknikker, microcontact udskrivning (μCP), har vist sig som en robust og tilgængelig metode til at skabe celle-klæbende mikro-øerne 10. For nylig har en omfattende indsats 11-14 blevet gjort for at udvikle μCP på hydrogeler med justerbare stivheder for at reproducere den brede vifte af stivheder observeret i levende væv. Blandt disse værker har polyacrylamid (PAAM) blevet populær 15 og er allerede en af de mest almindeligt anvendte polymer-baserede matricer til celle biomekanik assays.
PAAM overflader er almindeligt funktionaliseret med den heterobifunktionelle krydsbinder N-sulfosuccinimidyl-6-[4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) og ECM-proteiner er bundet til overfladen ved UV-aktivering af sulfo-SANPAH nitrophenyl azidgrupper 16. En anden teknik består i kobling hydrazin til proteiner, der er blevet alvorligt oxideretmed periodat 17. Hynd og medarbejdere indført en teknik til mønstring biomimetiske hydrogel overflader med protein og peptider, som kræver fotopolymerisation i nærvær af en acroyl streptavidin monomer 18. Mere for nylig, Tseng et al. Har rapporteret en ny micropatterning metode 19 baseret på dyb UV-eksponering af PAAM gennem en optisk kvarts maske, der kræver at inkubere aktiverede PA geler med 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimid-hydrochlorid (EDC) og N-hydroxysuccinimid (NHS) vandopløsninger forud at tilføje proteinet. Trods evnen af disse teknikker til at skabe ensartede og reproducerbare proteiner micropatterns, de fleste af dem lider store begrænsninger: lang syntese processer (fx dialyse, lyofilisering, etc.), dyre kemiske forbindelser (f.eks hyaluronsyre, sulfo-SANPAH) eller dyb UV bestråling. Hertil kommer, at disse teknikker ikke give uafhængige modulering af substrat stivhed, micropatterngeometri, ECM protein natur, og celle-liganddensitet.
Under disse begrænsninger i betragtning, har vi udviklet en ny og enkel acrylamid-baserede tilgang, der tillader immobilisering af en række proteiner og biomolekyler på bløde hydrogeler og tillader uafhængig tuning af mechanotransduction stikord for at dechifrere deres rolle på cellulære funktioner. I stedet for at behandle PAAM hydrogeler med skrappe kemiske forbindelser, introducerer vi en kommerciel acrylamidmonomer med hydroxylgrupper løbet PAAM polymerisation. Denne enkle betjening overvinder den iboende anti-klæbende egenskab af PAAM hydrogeler uden andre tekniske krav.
Tilstedeværelsen af hydroxylgrupper fører til en høj affinitet hydroxy-PAAM hydrogeler til proteiner og biomolekyler, der danner hydrogenbindende interaktioner. I kombination med μCP, hydroxy-PAAM hydrogeler muliggør en hurtig generering af to-dimensionelle kultur platform med en uafhængig kontrolpå matrix-stivhed, type ECM-proteiner, celle-liganddensitet og begrænses klæbeevne, der er forudset til at være en stærk platform for at studere mechanotransduction.
Formålet med denne protokol er at give de nødvendige oplysninger til nemt gør hydroxy-PAAM hydrogeler uden nogen form for ekspertise i materialevidenskab. Det ultimative mål er at give et middel for forskere til at stille fysiologisk relevante spørgsmål på de cellulære og væv niveauer, der kan føre til en bedre forståelse af mechanotransduction veje involveret i patofysiologiske mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aktivering af Overfladen af dækglas
- Sted glas cirkulære dækglas (diameter 25 mm) i en petriskål og smøre 0,1 M NaOH-opløsning på den i 5 min (kemisk stinkskab anbefales).
- Tag NaOH-opløsning, og fordyb dækglas med sterilt Hedeselskabet 2 O i 20 min, mens blidt vuggende på en vippende plade i en steril kultur hætte.
- Dræn steril Hedeselskabet 2 O og gentag trin 1.2.
- Fjern dækglas med sterile pincetter og placere dem i en ny petriskål med den aktiverede opad.
- Tørre dækglas under en lind strøm af høj renhed kvælstof gas.
- I en steril kultur hætte, smøre et tyndt lag 3 (trimethoxysilyl) propylacrylat (92%) af den aktiverede side af dækglasset i 1 time.
- Ekstensivt vaske dækglas med 3 vaske sterilt Hedeselskabet 2 O og nedsænke dem i sterilt Hedeselskabet 2 O i en ny petriskål.
- Tryk petriskålenmed Parafilm og læg den på en rocker plade under forsigtig omrøring i 10 min.
- Fjern dækglas fra Hedeselskabet 2 O med sterile pincet med fine spidser og placere dem i en ny petriskål med den aktiverede opad.
- Opbevares ved stuetemperatur på et tørt sted med alufolie for at undgå støv fra stikning til dækglas.
2. Fremstilling af hydroxy-PAAM hvdroqeler
- Forbered en vægt på 65 mg N-hydroxyethyl-acrylamid (HEA) i et 1,5 ml Eppendorf-rør. Det er vigtigt at fremstille en frisk HEA opløsning.
- Der tilsættes 1 ml 50 mM HEPES-buffer til HEA og blandes under anvendelse af en vortex indtil hele HEA opløsning.
- Tilsæt 400 pi af 40% vægt / vægt i HEPES acrylamid opløsning, og den nødvendige mængde 2% vægt / vægt i HEPES bis-acrylamid-opløsning (se tabel 1) for at nå den ønskede hydrogel stivhed. Juster med 50 mM HEPES til et slutvolumen på 5 ml.
- Bland opløsningen ved hjælp af en vortex og afgasse deni et vakuumkammer til 20 min for at reducere iltkoncentrationen i opløsningen, hvilket forhindrer hydroxy-PAAM polymerisation.
- Under en steril hætte, foretage afgasset opløsning med en 0,2 um porestørrelse for at sterilisere det.
- Aktiver cirkulære dækglas (22 mm diameter) i et UV / ozon renere under 7 min.
- Forbered 100 pi 10% ammoniumpersulfat (APS) løsning, der er 10 mg APS i 100 ul Hedeselskabet 2 O. Det er vigtigt at fremstille en frisk APS opløsning.
- Tilføj 2,5 pi tetramethylendiamin (TEMED) og 25 pi af APS-opløsning til den steriliserede hydroxy-PAAM opløsning (trin 2.5) for at starte polymerisationen. Bland opløsningen ved 3 på hinanden afpipetteringer uden indførelse af bobler under sterile betingelser.
- Under en steril hætte, placere en 25 ul dråbe af hydroxy-PAAM løsning på et 25 mm dækglas (tilgængelig fra trin 1.9) og straks placere en 22 mm glrøv dækglas (fremstillet i trin 2.5) oven på dråben at klemme hydroxy-PAAM opløsning. Centrer dækglas 22 mm med sterile pincetter og udglatte eventuelle bobler.
- Tillad hydroxy-PAAM hydrogeler til at polymerisere ved stuetemperatur i 15 min. Vend manuelt resterende hydroxy-PAAM løsning i Eppendorf-rør til at følge afslutningen af polymerisationsprocessen.
- Nedsænkes dækglas med sterilt dobbeltdestilleret 2 O og omhyggeligt adskille de 22 mm dækglas ved at indføre kanten af et barberblad mellem 22 mm dækglas og hydroxy-PAAM hydrogel lag.
- Vask hydroxy-PAAM hydrogeler med sterilt PBS (3 udvekslinger af PBS) og lad geler helt nedsænket i sterilt PBS at opretholde væskebalancen.
- Opbevar hydroxy-PAAM hydrogeler i sterilt PBS ved 4 ° C i op til 3 dage.
3. Polydimetylsiloxan (PDMS) Microstamp Fabrication
BEMÆRK: fremstilling af en silicium mester er påkrævet forud for start PDMS microstamp fabrikation. Denne mikrofabrikation af en silicium mester kan gøres ved litografiske teknikker, som kræver specialiseret udstyr og uddannelse. Samarbejde med en nanofabrikation facilitet opfordres til at fremstille silicium mester. Du kan også kontakte et firma, der fabrikerer skræddersyede mikrostruktur silicium mestre på efterspørgslen. Det er vigtigt at bemærke, at fremstillingen af silicium føreren skal kun udføres én gang. Faktisk kan mikrostrukturerede silicium mestre anvendes på ubestemt tid til at fremstille elastomere frimærker.
- Bland PDMS og hærdningsmidlet i en 10: 1-forhold i et plastbæger og blandes grundigt med en pipette i 10 min.
- Afgasses PDMS blandingen under vakuum for at fjerne luftbobler, som blev dannet under trin 3.1.
- Placer mikrostrukturerede silicium mester i en petriskål og kastede en 10-mm tykt lag af afgasset PDMS blanding på det uden at danne bobler.
- Lade helbrede PDMS i 2 timer ved 60 ° C i enovn.
- I et støvfrit miljø, peel-off PDMS lag og punktafgifter 1 cm 2 microstamps med en skalpel.
- Ved hjælp af en pincet, sted PDMS microstamps mønster op i en petriskål.
4. Micropatterning Hydroxy-PAAM hvdroqeler
- Place PDMS microstamps i en ethanol / vand (50/50) opløsning og sonikeres i 15 minutter.
- Tør stemplerne med en strøm af nitrogen flow og placere dem mønster op i et UV / Ozon renere (λ <200 nm) i 7 min.
- Under en steril hætte, placere en 150 ul dråbe af et ønsket protein opløsning (fx 100 ug / ml laminin i PBS eller 25 pg / ml fibronectin i PBS) på den mikrostrukturerede overflade af et 1 cm 2 PDMS stempel.
- Valgfrit: Ændring af koncentration af proteinopløsningen at modulere celle-ligand-densitet.
- Spred proteinopløsningen tværs stempel overflade ved at flytte det med en steril spids af en pipette mod hvert hjørne afstemplet.
- Lad proteinopløsningen at adsorbere på PDMS stempel 60 min under en steril hætte. Sluk lamper for at undgå protein skader.
- Under en steril hætte, overføre hydroxy-PAAM overtrukne dækglas (tilgængelig fra trin 2.13) i en petriskål.
- Fjern overskydende PBS fra overfladen af hydroxy-PAAM substrater med en lav nitrogenstrøm under sterile betingelser. Stop, så snart der ikke observeret tegn på stående vand på gelen overflade. Gelen bør ikke tørres grundigt på dette stadium.
- Tør omhyggeligt den strukturerede overflade PDMS stempel med en lind strøm af høj renhed kvælstof gas.
- Tag fat i protein-coatede stempel med dressing væv pincet og placere den strukturerede overflade i kontakt med det tørrede hydrogel overflade. Anvend korte trykpunkter med spidsen af pincetten på toppen af PDMS stempel for at sikre en god kontakt mellem stempel microfeatures og hydrogelen overflade.
- Lad PDMS stempel på the hydrogel overflade i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern forsigtigt PDMS frimærker fra hydroxy-PAAM hydrogeler med dressing væv pincet og følg trin 4.1 til at rense stemplet.
- Vask udstrakt stemplede hydroxy-PAAM hydrogeler med 3 udvekslinger af PBS (pH = 7,4) i sterile betingelser i 10 minutter pr bytte.
- Valgfrit: Ekstra micropatterns af andre ECM-proteiner kan føjes til den hydroxy-PAAM overflade ved at følge trin 4,5-4,11.
- Passivere ikke-trykte zoner med en steril opløsning af BSA ved 5 mg / ml i PBS i løbet af en nat ved 4 ° C under en blid omrøring på en vippende plade.
- Vask i udstrakt grad af 3 udvekslinger af PBS (pH = 7,4) i sterile betingelser i 10 minutter pr bytte. På dette tidspunkt kan stemplet hydroxy-PAAM hydrogeler opbevares ved 4 ° C i op til en uge.
5. Cell Deposition på mikromønstrede hydroxy-PAAM hvdroqeler
- Inkubér dækglas i cellemedier i 30-45 minutter før udpladning calen.
- Vask adhærente celler dyrket i en 75 cm 2 dyrkningskolbe med sterilt PBS ved 37 ° C, og tag det med 3 ml trypsin-EDTA eller Accutase i 10 min.
- Overfør den ønskede mængde forvarmet komplet vækstmedium passende for din cellelinje til kolben, der indeholder de løsrevne celler og centrifuger cellesuspensionen i 3 minutter ved 650 x g.
- Fjern supernatanten med en mikropipette og cellerne resuspenderes i komplet dyrkningsmedium på 15-20.000 celler / ml.
- Tilsæt 4 ml af celle opløsningen til en mikromønstrede dækglas (opnået fra trin 5.1) og placer celle-dækket dækglas i en kultur inkubator ved 37 ° C og 5% fugtighed i 1-2 timer.
- Aspirer blidt fastgjorte celler og erstatte dyrkningsmedium. Returnere vedlagte celler til inkubatoren og lad dem spredt helt (3-6 timer, afhængigt af celletypen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser co-polymerisation af acrylamid (AAM) og bisacrylamid (bis-AAM) med N-hydroxyethylacrylamide (HEA) monomerer, der indeholder en primær hydroxylgruppe dannet ved tilfældig radikalpolymerisation en hydrofil netværk af polyacrylamid med indlejrede hydroxylgrupper (hydroxy-PAAM) . I denne protokol, skal en vægt 65 mg HEA fortyndes i et volumen på 1 ml HEPES. Vel vidende, at tætheden af HEA er omtrent lig med en, antager vi, at vi får en arbejdsgruppe volumen på 1.065 pi (HEA + HEPES). Som vist i tabel 1, den samlede tilsætning af 1065 pl til 400 pi AAM og 50 pi bisAAm fører til et volumen på 1515 ul. Derfor er der behov for et volumen på 3485 pi HEPES at justere opløsningen til et slutvolumen på 5 ml. Som anført i trin 2.6, skal overfladen af 22 mm dækglas aktiveres under 7 minutter i et UV / Ozon for at fjerne det uden at forårsageEventuelle skader på hydrogel overflade. Faktisk bliver mere hydrofil efter UV / Ozon behandling glasoverfladen og kan derfor let fjernes ved at nedsænke hele systemet i vand. Desuden UV / Ozon behandling forebygger kemisk forurening af 22 mm dækglas, der er i direkte kontakt med hydrogelen overflade. Denne teknik tillader at opnå en flad cirkulær polyacrylamid overflade (22 mm i diameter) bundet til et dækglas (25 mm i diameter).
Som vist i figur 1B, kan oprettes micropatterns proteiner på overfladen af hydroxy-PAAM hydrogeler ved microcontact udskrivning. I denne eksperimentelle procedure, UV / Ozone engagementer muligt midlertidigt at nedsætte den iboende hydrofobicitet PDMS stempler ved dannelse af silanolgrupper på overfladen. Faktisk 185 nm linje producerer ozon fra molekylær ilt, mens 254 nm linje omdanner ozon til atomart oxygen. Denne reaktive arter angriber siloxan backbone PDMS til dannelse iltrigt SiOx silica-lag, og Si-OH-overfladegrupper. Det oxiderede PDMS overflade er kendt for at genvinde sin hydrofobicitet i få timer efter udsættelse for luft som følge af migration af lavmolekylære tværbundne polymerkæder fra bulkfasen til overfladen. Denne strategi hjælper spredningen af proteinopløsningen på overfladen af PDMS stempel.
En af de vigtigste fordele ved denne metode er at uafhængigt modulere matrix stivhed (figur 2A), micropattern geometri (figur 2B), celle-ligand-densitet (figur 2C), og protein natur (figur 3A og 3B). Som vist i figur 2A, hydroxy-PAAM hydrogeler viser en lineær afhængighed af elasticitetsmoduler på tværs linker koncentration fra få kPa til flere dusin kPa, så fint gengivelse af stivheden af den cellulære mikromiljø. 2B Figur 2C viser, at cellen -liganden tæthed kan moduleres ved at variere koncentrationen af proteinet opløsning, der anvendes til at inkubere PDMS frimærker. Figur 3 viser et fluorescens-billede af collagen linjer stemplet tværs laminin og fibronectin linjer ved hjælp af sekventielle mikrokontakt oplag.
Det er interessant for læserne at bemærke, at forskellige størrelser og udformninger af micropatterns er blevet stemplet effektivt, uanset hydrogel stivhed. Vi har gengivet succes microfeatures af proteiner med skarpe kanter (f.eks trekanter og stjerner) og lige (fx linjer) eller buede (f.eks cirkler) figurer, der viser, at der ikke er nogen major begrænsning til det mønster kompleksitet. Til enkelt celle eksperiment blev micropattern overfladearealet var mellem 400 og 2.500 um 2, den lavere værdi, der svarer til grænsen for enkelt cellelevedygtighed. Som mange andre mikrotryk-baserede metoder, den vigtigste begrænsning af denne procedure vedrører dens rumlige opløsning. På stive hydrogeler (E> 10 kPa), den rumlige opløsning er omkring mikrometer og hovedsagelig bestemt af løsningen af det stempel, der henviser til "bløde" hydrogeler, bliver grænsen for beslutningen delvist bestemt af overfladen deformation, der kan opstå under protein-overførsel.
Toksiciteten af hydroxy-PAAM hydrogeler blev undersøgt ved at kvantificere levedygtigheden af primære endotelceller udpladet for 1, 2 og 3 dage i kultur på homogent belagt og mikroskrift bløde hydroxy-PAAM hydrogeler (figur 4A). Ca. 80% af HUVEC'er udpladet på mikromønstrede bløde hydroxy-PAAM hydrogeler opretholdtderes levedygtighed i tre dage, hvilket viser biokompatibilitet hydroxy-PAAM hydrogeler til celledyrkning. Interessant nok blev lignende levedygtighed opnået i vores laboratorium med primære kortikale neuron celler. Desuden primære endotelceller prolifererer mere om "stiv" (500 kPa) i forhold til "bløde" (25 kPa) substrater (figur 4B), hvilket indikerer, at denne metode giver en passende mikromiljø for at studere cellulær proliferation tværs af en bred vifte af stivheder .
For at afkoble effekt af substrat stivhed og spredning område på mechanotransduction blev primære endotelceller (HUVEC'er) udpladet på rektangulære FN-overtrukne micropatterns (konstant område på 1.200 um 2) aflejret på hydroxy-PAAM hydrogeler tre forskellige stivheder (2.5, 8.5, og 25 kPa). Derefter blev HUVEC'er farvet for actinfilamenter, vinculin og DNA ved at følge en standard immuncytokemi procedure, som anvendes til mammaLian udpladede celler på glas substrater. På blødeste substrater, HUVEC'er udviser lav actin fibertæthed og en afrundet kerne, mens den stivere substrater, actin fibre er lige og tykkere og kernen deformeres (figur 5). Ændringer i substrat stivhed ved konstant spredning område modulere spænding og distribution af actin stress fibre, hvilket resulterer i omdannelse af kernen. Denne observation tyder på en mekanisk kobling mellem matrix stivhed, cytoskelet, og kernen.
| Final AAM / bisAAm forholdet | AAM 40% (ul) | Vægt HEA opløses i 1 ml HEPES (mg) | bis AAM (2%) (Ul) | HEPES (ul) | Youngs modul (10 3 Pa) |
| 0,2 / 50 0,5 / 50 1/50 2/50 3/50 | 400 400 400 400 400 | 65 65 65 65 65 | 50 125 250 500 750 | 3.485 3.410 3.285 3.035 2.785 | ~ 1.4 ~ 3.6 ~ 8.7 ~ 17.2 ~ 25 |
Tabel 1. Fremstilling af hydroxy-PAAM hydrogeler med forskellige stivheder. Arbejdsvilkårene løsninger til at forberede hydroxy-PAAM hydrogeler med afsluttende stivhed spænder fra 1,4 til 25 kPa.
Figur 1. (A) acrylamid (AAM i sort), N, N'-methylenbisacrylamid (bis-AAM, blå) og N-hydroxyethylacrylamide (HEA, rød) blev blandet sammen til dannelse af hydroxy PAAM hydrogeler. (B) Skematisk repræsentation af de forskellige trin i micropatterning proceduren på hydroxy-PAAM hydrogeler. En opløsning af protein inkuberes først i løbet af 1 time på strukturen ansigtet af en microstamp (trin # 1). Hydrogelen overflade forsigtigt tørret med en nitrogenstrøm (trin 2). Den microstamp anbringes derefter i formel kontakt med hydroxy-PAAM overflade i løbet af 1 time (trin 3 #). Efter successive vaske er mikroskrift overflade passiviseret med en steril BSA-opløsning deponeret O / N-ved 4 ° C (trin 5) for at blokere ikke-trykte områder. Endelig mikroskrift hydroxy-PAAM overflade vaskes flere gange med sterilt PBS og er klar til cellepodning (trin # 6). Klik her for at se en større version af dette tal.
1010 / 51010fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. (A) Udviklingen af stivheden af hydroxy-PAAM hydrogeler er lineært korreleret med mængden af bis-AAM tværbindingsmiddel (den røde linje er en lineær regression med R2 = 0,995). (B) Fluorescens-billeder af rektangulære laminin mikro-funktioner, stemplet på hydroxy-PAAM hydrogeler forskellige stivheder (E = 2.5, 15 og 40 kPa). Skalapanelerne svarer til (A), 65 um, (B) 80 um, og (C) 50 um. (C) Parallelle linjer 15 um bredde danner en LM-gradient på 25 kPa hydroxy-PAAM hydrogel, som indikeret ved udviklingen af fluorescensintensiteten profilen. Klik her for at se en større version af dette tal.
n "src =" / filer / ftp_upload / 51010 / 51010fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. (A) Immunofluorescens billede af fibronectin (i rødt) og laminin (i grøn) striber krydsede ved 90 °. (B) Multilabeling af fibronectin (i rødt), laminin (grøn) og kollagen (i blå) striber mikroskrift derefter på en 25 kPa hydrogel PAAM substrat. Skalapanelerne svarer til 30 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. (A) kvantificering af cellelevedygtighed demonstreret fremragende celleoverlevelse ved 24, 48 og 72 timer efter at være udpladet på homogent coatet og mikromønstrede hydroxy-PAAM overflader. Den angivne nummerbunden af hver søjle svarer til det samlede antal celler tælles for levedygtighedsassay (B) Kvantificering af HUVEC'er spredning på 25 og 500 kPa homogent-substrater efter 1 (hvide søjler) og 7 (skraverede søjler) dages dyrkning.. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Fluorescerende billeder af immunfarvet primære endotelceller dyrket på rektangulære FN-belagte micropatterns, som blev aflejret på hydroxy-PAAM hydrogeler 2,5 kPa, 8,5 kPa og 25 kPa (fra venstre til højre). Actin stress fibre (grønt ) blev farvet med Alexa Fluor 488 phalloidin, fokale sammenvoksninger (i rødt) blev farvet med en mus polycloudg primære antistof og mærket med en rød-fluorescerende IgG-sekundært antistof og DNA blev farvet i blåt med DAPI. Skalaen søjler svarer til 17 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange in vitro-observationer i moderne cellebiologi er blevet udført på stive dækglas, ofte belagt med et tyndt lag af ECM-proteiner eller syntetiske peptider, der indeholder RGD-sekvensen. Men sådanne grundlæggende kultur substrater ikke rekapitulere hele fysisk-kemiske kompleksitet ECM og dermed ikke give en nøjagtig model til at studere cellulære mechanotransduction processer. For at løse dette problem foreslår vi et simpelt alternativ til funktionalisere todimensionale hydrogeler med enhver ønsket mængde og art af ECM-proteiner. Denne metode giver uafhængig kontrol over vigtige mechanotransduction tidskoder, såsom matrix stivhed, cellulær morfologi og indespærring eller celle-liganddensitet. Desuden hydroxy-PAAM hydrogeler overvinde en af de største begrænsninger, den nuværende funktionalisering metoder, som er den manglende evne til at immobilisere og styre den rumlige fordeling af mere end én ECM protein. På grund af den høje affinitet af hydroxy-PAAM hydrogeler til biomolekyler, kan man styre den rumlige fordeling af forskellige ECM-proteiner på den samme overflade, uanset matrix stivhed ved hjælp af sekventielle microprintings, som ikke kræver nogen supplerende udstyr.
Vi foreslår en ny procedure baseret på inkorporering af hydroxylgrupper inden acrylamid hydrogeler at overvinde deres iboende ikke-klæbende egenskaber med minimale krav i omkostninger eller ekspertise. I sammenligning med eksisterende teknikker til mønstring proteiner på hydrogeler, hydroxy-PAAM metode undgår brug af skrappe toksiske kemikalier (f.eks hydrazinhydrat), dyre fotoreaktive tværbindere (fx sulfo-SANPAH) og afhængighed af UV-lampe kraft og positionering for at funktionalisere bløde hydrogeler. Hydroxy-PAAM hydrogeler forbliver stabile og aktive i flere uger, kan masseproduceres, let mikroskrift og deres høje affinitet for biomolekyler gør det muligt at undersøge synergistiske virkningerkonjugerede ECM proteiner på cellulære funktioner. Desuden kan hydroxy-PAAM hydrogeler anvendes til kvantitativt at undersøge mængden af kontraktile udøves af celler på deres omgivende mikromiljø. Faktisk har vi vist tidligere 1,20 at fluorescerende perler kan nemt indlejres i hydroxy-PAAM hydrogeler, for at kunne bruge celle trækkraft mikroskopi (TFM) til at måle feltet fordrivelse og estimere den resulterende trækkraft område udøves af eukaryote celler belagt på todimensionale micropatterns.
Som mange andre mikrotryk-baserede metoder, den største begrænsning af hydroxy-PAAM hydrogeler vedrører den rumlige opløsning af protein microfeatures. På stive hydrogeler (E> 10 kPa), den rumlige opløsning er omkring en mikrometer og hovedsagelig bestemt af løsningen af det stempel, afhængigt af litografisk teknik, der anvendes til at fremstille silicium skimmel. På blødere hydrogeler, bliver den rumlige opløsning delvist bestemt af the overflade deformation under protein overførsel, som bliver den væsentligste begrænsning for at nå mikrometer rumlig opløsning. Den tilgang, der præsenteres her, er i øjeblikket begrænset til to-dimensionelle substrater. Men denne metode er meget skalerbar og yderligere undersøgelser er i øjeblikket i gang i vores laboratorium for at udvide denne metode til tredimensionale strukturer.
Vi håber, at hydroxy-PAAM hydrogeler kan bidrage til at dechifrere de vigtigste mekanismer for komplekse cellulære og væv processer, der er nært forbundet med de fysisk-kemiske egenskaber af cellen mikromiljø 21,22, herunder fosterudvikling, inflammatoriske reaktioner, sårheling, neuritudvæksten, voksent væv homeostase og patogenesen af sygdomme, såsom fibrose og cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0.2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin (rabbit) | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
References
- Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
- Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking. Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).
- Atmanli, A., Domian, I. J. Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing. J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).
- Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays. Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).
- Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes. Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).
- Rundqvist, J., et al. High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation. J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).
- Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications. Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).
- Holden, M. A., Cremer, P. S. Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces. J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).
- Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture. Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching. Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).
- Tseng, Q., et al. New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS ONE. 7, e51499 (2012).
- Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli. Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Hemphill, M. A., et al. A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury. PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).
- Tseng, Q., et al. new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells. Nat. Commun. 3, 671 (2012).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus. Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).
- Trappman, B., Chen, C. S. How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective. Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).
