Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Роман Paradigm причинение легкого для использования в сетчатке Исследования Регенерация в взрослых данио рерио

doi: 10.3791/51017 Published: October 24, 2013

Summary

Несколько протоколов свет повреждения были описаны повреждения фоторецепторов и, следовательно, вызвать регенерацию сетчатки в ответ взрослых данио. Этот протокол описывает усовершенствованный способ, который можно использовать в пигментированных животных и который повреждает подавляющее большинство палочек и колбочек фоторецепторов по всей сетчатки.

Abstract

Светоиндуцированный дегенерации сетчатки (LIRD) обычно используется как у грызунов и рыбок данио к стержню повреждения и конус фоторецепторов. В взрослых данио, вызывает дегенерацию фоторецепторов Müller глиальные клетки, чтобы вновь войти в клеточный цикл и оказывать кратковременное усиливающее предшественников. Эти предшественники продолжают размножаться, как они мигрируют в поврежденную область, где они в конечном счете привести к появлению новых фоторецепторов. В настоящее время существует два широко используемых LIRD парадигмы, каждый из которых приводит к различной степени потери фоторецепторов и соответствующих различий в регенерации ответа. Чем больше генетических и фармакологические средства доступны для проверки роли отдельных интересующих генов в процессе регенерации, существует необходимость в разработке надежной LIRD парадигме. Здесь мы опишем LIRD протокол, который приводит к широко распространенной и последовательной потере и палочек и колбочек, фоторецепторы, в котором мы объединили использование двух ранее установленных LIRD методов. Более того, Этот протокол может быть расширен для использования в пигментированных животных, что устраняет необходимость поддержания трансгенных линий процентов на альбиноса фон для исследования LIRD.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Светоиндуцированный дегенерации сетчатки (LIRD) обычно используется как у грызунов и рыбок данио к стержню повреждения и конус фоторецепторов. В взрослых данио, вызывает дегенерацию фоторецепторов Müller глиальные клетки, чтобы вновь войти в клеточный цикл и оказывать кратковременное усиливающее предшественников. Эти предшественники продолжают размножаться, как они мигрируют в поврежденную область, где они в конечном счете привести к появлению новых фоторецепторов. В настоящее время существует два широко используемых LIRD парадигмы, каждый из которых приводит к различной степени потери фоторецепторов и соответствующих различий в регенерации ответа. Чем больше генетических и фармакологические средства доступны для проверки роли отдельных интересующих генов в процессе регенерации, существует необходимость в разработке надежной LIRD парадигме. Здесь мы опишем LIRD протокол, который приводит к широко распространенной и последовательной потере и палочек и колбочек, фоторецепторы, в котором мы объединили использование двух ранее установленных LIRD методов. Более того, Этот протокол может быть расширен для использования в пигментированных животных, что устраняет необходимость поддержания трансгенных линий процентов на альбиноса фон для исследования LIRD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все процедуры, описанные в этом протоколе были утверждены Комитетом использования животных в Wayne State University школы медицины.

1. Адаптации к темноте

  1. Передача ~ 10 взрослых белых или пигментированные рыбу от нормальной системы жилищного в темном шкафу. По возможности используйте темные корпуса, который встроен в корпус модуля данио, что позволяет нормальный поток воды через бак. (Если такая система отсутствует, разместить аквариум в совершенно темном корпусе, убедившись, чтобы проветрить рыбы с кислородом).
  2. Держать рыбу в темноте в течение 10 дней. При кормлении животных или добавлении новых рыб в темную коробку, убедитесь, чтобы двигаться как можно быстрее, чтобы не подвергать рыбу длительное света.

2. Ультрафиолетовых лучей

  1. Убедитесь, что питание на источник УФ-выключено. Снимите УФ света с лампами накаливания от люминесцентных стереомикроскоп.
    1. Используйте перевернутый15 см в диаметре стекла чашки Петри (или что-то подобное высотой 2 см) в качестве подставки для УФ нити. Лента чашку Петри на лабораторном столе.
    2. Лента УФ света с лампами накаливания в верхней части перевернутой чашки Петри. Организовать так, что ~ 2 мм от конца нити выступы чашки Петри.
  2. Получение 250-мл химический стакан. Крышка ½ от дна, боковых стенок и задней стакан с алюминиевой фольгой, убедившись, что "блестящий" сторону фольги обращен внутрь стакана. Если стакан закончил, покрытие сформулирован половине стакана фольгой, оставляя ясно половине стакана подвергается.
  3. Наполните 250 мл стакане с 100 мл воды из системы средство рыбы.
  4. Поместите 250 мл стакан в 4 л стакан. Заполните 4 л стакан с водой, пока уровень воды не сравняется с 100 мл воды линию в 250 мл стакан.
  5. Добавить максимум 10 темно-обработанных животных в 250 мл химический стакан. Обложка 250 мл стакан с небольшой кусочек алюминияфольгой.
  6. Поместить все устройство стакан, непосредственно примыкающей к УФ нити. Нить должна касаться внешней стороны 4 л стакан и перед открытой части 250 мл химический стакан. Убедитесь, что в 250-миллилитровый химический стакан находится в центре нижней части 4 л стакан.
  7. Поместите большой, непрозрачный экран за 4L стакан, позволяя для животных подвергаться воздействию, но предотвращая любые лаборатории персонала от видеть кончик УФ нити. ВНИМАНИЕ: Не забудьте этот барьер на месте до включения питания на источник УФ.
  8. Включите УФ источника питания. Установите таймер на 30 мин. Поместите все необходимые предупредительные надписи, чтобы убедиться, что ничего не подозревающих сотрудников лаборатории случайно не подвергать себя УФ-излучения.
  9. Через 30 минут, выключите УФ источника питания. Удалить 250 мл химический стакан с рыбой. Примечание: Если несколько раундов ультрафиолетового облучения требуется, пусть источник питания остыть (~ 20 мин) перед повторением воздействия протокола. Не забудьте заменить тон 100 мл воды со свежей водной системы для каждой экспозиции. Вода в 4 л стакан не нуждается в замене.

3. Галогенные лампы освещенность

  1. Передача рыбы из 250 мл стакан в 1,8 л емкости очищенной рыбы акрил. Залить в бак к переполнению марки.
  2. Настройте свет галогенных ламп области лечения. Получим четыре 250 Вт галогенные лампы утилита от местного хозяйственного магазина. Сталкивается с двумя лампами в том же направлении, организовать 29 см друг от друга по центру. Разместите другие две лампы аналогичным образом.
    1. Поместите второй набор ламп так, что они сталкиваются с первым набором ламп, оставляя ~ 73 см между двумя группами ламп. Это создает прямоугольную форму светолечение площадью 29 х 73 см.
  3. Получить небольшой вентилятор от местного хозяйственного магазина. Ставьте вентилятор на равном расстоянии между двумя группами ламп, недалеко от светлой области лечения.
  4. Поместите два 1,8 л танки полны воды в центреСветлая область лечения, на равном расстоянии между двумя группами ламп. Расстояние между лампами и внешней стенки резервуара должна быть ~ 29 см. Примечание: даже если только 10 рыб лечении в одной бака 1,8 л, используйте эту договоренность. Оба танка, необходимые для поддержания температуры воды каждого бака в пределах соответствующего диапазона.
  5. Наведите кислорода аэратора в каждом баке.
  6. Обложка каждого танка с ясными акриловыми крышками, оставляя ~ 2 см зазор на конце, ближайшем к вентилятору. Расположите вентилятор таким образом, это будет удар воздуха в этот пробел. Место термометр в одном или обоих резервуарах.
  7. Включите питание на фары, вентилятор, и аэраторы. Поддерживать светолечение до 4 дней. Рыбы, не должны подаваться в течение светового лечения, так как это повлияет на качество воды и в результате больше стресса для животных.
  8. Мониторинг температуры и уровня воды на ежедневной основе. Поддерживайте температуру в 30-33 ° C. При необходимости регулировать скорость вентилятора и / или расстояния между танками и ЛиGHTS.
    1. Топ с каждого бака с системой воду по мере необходимости, как правило, ежедневно.
    2. Всегда используйте здоровых взрослых данио (обычно 6-9 месяцев), чтобы сохранить выживаемость приближается к 100%. Тем не менее, если рыба найдена мертвой в баке, немедленно извлеките его и замените воду в весь бак.

4. Коллекция тканей

  1. 48 ч после начала лечения светом галогенных удалить рыб из зоны обработки.
    1. Подготовьте свежий этанольного фиксатором формальдегида (1 часть 37%-ного формальдегида, 9 частей 100% этанол).
    2. Эвтаназии данио с анестетиком передозировки 2-феноксиэтанол (0,4 мг / л).
    3. Передача эвтаназии данио бумажным полотенцем. Выяснять глаз с помощью пинцетов.
    4. Наведите энуклеированными глаза в магазине фиксатор и O / N при 4 ° C.
  2. Cryoprotect глаз.
    1. Промыть глаза в 5% сахарозы 1x PBS в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем заменитьсвежий 5% сахарозы 1x PBS в течение 2 часов. Затем промыть глаза в 30% сахарозе 1x PBS O / N при 4 ° С. Промыть глаза 1:1 (равные части) в среде тканевой замораживание и 30% сахарозы, 1 × PBS O / N при 4 ° С.
  3. Вставить глаза в 100% среде тканевой замораживания и хранить при температуре -80 ° С. Восток глаза так, что cryosectioning ткани выполняется на спинной / вентральной оси.
  4. Cryosection ткани и места на предметных стеклах. Теплый слайды в течение 2 ч при 55 ° С. Магазин слайды при -80 ° С или сразу выполнять стандартные иммуногистохимии.
  5. Выполнять стандартные иммуногистохимии секционного ткани и изображение с флуоресцентной микроскопией 40,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Описано ранее протокол светолечение сравнивали с каждого отдельного метода LIRD. В темных обработанных взрослых белых животных (рис. 3-5), индивидуальные процедуры света приводило к значительным потерям стержня (рис. 3) и конус (рис. 4) фоторецепторов. Тем не менее, как отдельные процедуры в основном повреждены фоторецепторов в спинной половине сетчатки, в результате чего вентральной части сетчатки относительно защищенном от света месте лечения (фиг. 3 и 4). Кроме того, по сравнению с лечением галогенной лампы, УФ света лечения повреждения более конус фоторецепторов в спинной половине сетчатки (сравните фиг.4В с С, соответственно). Сочетание УФ и галогенной лампы лечение привело к значительному большей потерей для обеих палочек и колбочек, фоторецепторы по всей сетчатке, к почти полному исчезновению Neuroprotection вентральной половине сетчатки (рис. 3 и 4). По сравнению с отдельными LIRD методов, соответствующим увеличением пролиферации наблюдалось также в вентральной части сетчатки при комбинированном лечении протокола свет был использован (рис. 5).

Пигментные животные более устойчивы к LIRD из-за пигментного эпителия сетчатки, которое поглощает свет и защищает от фоторецепторов фототоксичности. Как и ожидалось, адаптированных к темноте пигментированные животные были почти полностью устойчивы к лечению галогенная лампа одна (рис. 6В, J и N). Мы обнаружили, что 48 часа после начала света, Род фоторецепторы были уменьшены в дорсальной части сетчатки, но не вентральной части сетчатки (рис. 6E, F и Q). Колбочек ядер присутствовали в нормальное число (рис. 6R). По сравнению с необработанными сетчатки, галогенная лампатолько в лечении также не увеличило Müller глиальных пролиферации клеток 48 ч после начала света (рис. 7В и F). В альбиносов, УФ-свет в одиночку лечения приводит к небольшому большему ущербу для обеих палочек и колбочек, фоторецепторы в сетчатке спинной (рис. 3I и 4I). Тем не менее, в пигментированных животных, УФ света лечения только существенно не уменьшить стержень или конуса числа клеток (фиг. 6C, G, K, O, Q и R). Кроме того, УФ обработки только лишь вызывали слабое регенеративный ответ в спинной половине сетчатки в пигментированных животных (фиг. 7С). В отличие от отдельных LIRD результатов, сочетая УФ и лечения галогенной лампы привело к значительно большее повреждение фоторецептора и регенеративный ответ в пигментированных животных. Важно отметить, что значительная потеря обеих палочек и колбочек наблюдалось как в тыльных поверхностей стоп л и вентральной сетчатки (рис. 6D, H, L, P, Q и R). По сравнению с необработанными и индивидуальные методы LIRD, соответствующее увеличение пролиферации наблюдалось также в обоих спинных и брюшных половин сетчатки при комбинированном лечении протокола свет был использован (рис. 5).

Рисунок 1
Рисунок 1. Фотография изображающий лечение галогенной лампы установки. Два комплекта из четырех 250 Вт галогенных ламп находились на расстоянии 29 см по обе стороны от два четких 1,8-литровых чанах акрила. Аэратор и трубки были размещены так, чтобы не загораживать свет. Крышки танки были сломаны 2 см, чтобы поток воздуха от вентилятора. Термометром, помещали в одном из резервуаров для температуры для мониторинга.Arget = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2
Рисунок 2. Фотография изображающая установку УФ лечение светом. Источник УФ-излучения от флуоресцентной стереомикроскоп был надежно закреплен в стеклянную чашку Петри ~ 2 см от настольного. 250 мл стеклянный стакан, частично завернутые в фольгу, был заполнен будет 100 мл воды в системе. Рыбы были помещены в 250 мл химический стакан. 250 мл химический стакан было сосредоточено в 4 л стакан, который был заполнен воды в системе до уровня воды в 250 мл химический стакан. 4 л химический стакан помещали на свет нить с центром в 250 мл химический стакан. Большие непрозрачные щита была помещена вокруг всей установки. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .


Рисунок 3. Род фоторецепторов потери альбиноса данио после различных парадигм повреждения сетчатки светом разделов от взрослых Tg (НРД: EGFP). / ALB immunolabeled с GFP, чтобы показать стержень фоторецепторов плотности (зеленый) в спинной (AD) и вентральной (EH) половин сетчатки . A, E) Перед началом света (0 ч), EGFP-позитивных стержень фоторецепторов ядер (ОНЛ) и наружные сегменты (ROS) может быть отображено. B, F) при 48 ч после появления галогенной лампы (HLT), усеченные ROS и значительно меньше стержня ядер (Я) присутствовали в спинной, но не вентральной части сетчатки. CG) через 48 часов после 30 минут УФ-облучения (hpUV), значительно меньше стержня ядер присутствовали в спинной и брюшной сетчатки по сравнению с 0 часов (C, G < / STRONG>), но не 48 HLT лечения (G, I). DH) 48 часов следующих начала комбинированного лечения светом (30 мин, ультрафиолетовое облучение последующей обработки галоген; УФ +48 HLT), почти не ROS не присутствовали в спинной или вентральной сетчатки, в дополнение к значительной потере ядер стержень фоторецепторов (I) . I) Количественная оценка стержень фоторецепторов ядер через 300 мкм центральной спинной или вентральной части сетчатки. Значительные различия (р ≤ 0,05) между группами изображены как: «а» для различных от 0 ч, "б" для различных от 48 HLT и "в" для различных от 48 hpUV. Шкала бар в панели составляет 50 мкм, а относится к панели AH. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

iles/ftp_upload/51017/51017fig4.jpg "ширина =" 500px "/>
Рисунок 4. Двухместный конус потерь у белых рыбок данио после различных парадигм легкий ущерб. Сетчатки секций от взрослых белых рыбок данио immunolabeled с Zpr-1, чтобы показать двойные конусы (золото) в спинной (AD) и вентральной (EH) половин сетчатки после каждого света повреждение парадигм (48 HLT, 48 hpUV и УФ +48 HLT)., Е) При 0 ч, двойной ядер конус присутствовали в спинной и брюшной сетчатки. B, F) при 48 HLT, значительно меньше двойного конуса присутствовали в вентральной части сетчатки только (F, I). CG) На 48 hpUV, значительно меньше двойных конусов (I) и большое количество мусора присутствовал в дорсальной части сетчатки только (C), в то время никаких изменений не наблюдалось в вентральной части сетчатки (G). DH) в УФ +48 HLT, значительно меньше двойного конусаS (I) и очень мало мусора присутствовал в спинной и брюшной сетчатки. I) Количественная оценка двойными диффузорами через 300 мкм центральной спинной или вентральной части сетчатки. Значительные различия (р ≤ 0,05) между группами изображены как "а" на отлично от 0 часов, "б" для различных от 48 HLT и "в" для различных от 48 hpUV. Шкала бар в панели составляет 100 мкм, а относится к панели AH. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

Рисунок 5
Рисунок 5. Изменений является распространение реакции после различных парадигм легкий ущерб. Сетчатки секций от взрослых белых рыбок данио immunolabeled с PCNA, чтобы показать клеточной пролиферации (красный) вдорсальную (AD) и брюшной (EH) половин сетчатки после каждого светового парадигм повреждений (48 HLT, 48 hpUV и УФ +48 HLT). AE) При 0 ч, распространение отсутствовал внутренний ядерный слой ( INL). B, F) при 48 HLT, один клеток-предшественников, которые присутствовали в INL через спинной сетчатки и в небольшой части вентральной части сетчатки. КГ) В 48 hpUV, колонны клеток-предшественников, которые присутствовали в дорсальной части сетчатки, в то время как только один клеток-предшественников, которые присутствовали в небольшой части вентральной части сетчатки. D, H) при УФ +48 HLT, большие колонны клеток-предшественников присутствовали через спинной и брюшной сетчатки. Шкала бар в панели составляет 100 мкм, а относится к панели AH. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .


Рисунок 6. Род и колбочек потери пигментированные данио после различных парадигм повреждения сетчатки светом секций от взрослого дикого типа (AB) данио окрашивали TO-PRO-3, чтобы показать все ядра (AP, синий). Immunolabeled и с Zpr-3, чтобы показать стержня наружные сегменты (AH; пурпурный) или Zpr-1 двойного конуса (IP, золото) в спинной (AD, IJ) и вентральной (EH, MP) половин сетчатки после каждого свете парадигмы повреждений (HLT 48, 48 hpUV и УФ +48 HLT). AH) Значительное сокращение в ядрах стержень фоторецепторов присутствовали в дорсальной части сетчатки на 48 HLT (B, Q) и в спинной и брюшной сетчатку в УФ +48 HLT (D, H, Q) . IP) Хотя конус ядер были гипертрофированные я N дорсальной части сетчатки на 48 hpUV (K), не значительное снижение двойного конуса ядер присутствовали на 48 или 48 HLT hpUV (JK, NO, R). Значительное снижение конуса ядер присутствовали в спинной и брюшной сетчатку в УФ +48 HLT (L, P, R). QR) Количественная оценка стержень фоторецепторов и двойного конуса ядер через 300 мкм центральной спинной или вентральной части сетчатки. Значительные различия (р ≤ 0,05) между группами изображены как "а" на отлично от 0 часов, "б" для различных от 48 HLT и "в" для различных от 48 hpUV. Шкала бар в панель представляет 200 мкм и распространяется на панели AH. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

g7.jpg "ширина =" 500px "/>
Рисунок 7. Распространение ответ в пигментированных данио после различных повреждений свет парадигм. Сетчатки секций от взрослого дикого типа (АВ) данио immunolabeled с PCNA, чтобы показать пролиферации клеток (красный) в спинном (AD) и брюшной (EH) половин сетчатки после каждого света парадигм повреждений (48 HLT, 48 hpUV и УФ +48 HLT). AD) в дорсальной части сетчатки, только несколько отдельных клеток предшественников присутствовали в INL при 48 HLT и 48 hpUV (B, C), а столбцы клеток-предшественников, присутствующих на УФ +48 HLT (D). EH) в вентральной части сетчатки, то никаких изменений в пролиферации не наблюдалось за исключением УФ +48 HLT (H), после чего столбцов клеток-предшественников присутствовали. Шкала бар в панели составляет 100 мкм, а относится к панели AH.7/51017fig7highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Здесь мы показываем, что сочетание короткого ультрафиолетового облучения с постоянным ярким светом воздействие приводит к массовой гибели фоторецепторов и устойчивых мер в ответ регенерации. По сравнению с отдельными методами LIRD, это комбинированный метод также является наиболее эффективным протоколом к ​​повредить как палочки и колбочки в обеих половинах сетчатки. Важно отметить, что такое лечение является эффективным в пигментированных животных, а также альбиносов.

Хотя мы предоставляем доказательства того, что объединенные результаты протоколов в более широкое и последовательное повреждение по сравнению с индивидуальными LIRD методы, научные соображения должны обсуждаться, прежде чем выбрать LIRD парадигмы. Наши данные показывают, что комбинированный метод должен быть использован, когда вся ткань сетчатки собирают для анализа (т.е. протеомики, ПЦР в реальном времени). Мы обнаружили, что комбинированный метод был наибольший размер поражения, а затем галогена экспозиции, и, наконец, ультрафиолетового облучения. Мы предлагаемчто комбинированный метод также может быть использован при исследовании гена или путь, который может дифференциально осуществления палочек и колбочек регенерации. Если это невозможно по практическим причинам, наши данные свидетельствуют о том, что ультрафиолетовое облучение следующий лучший способ для этих исследований, если анализ ограничен центральной спинной сетчатки.

Практические соображения также оправдано при выборе соответствующей LIRD методом. Первый проблемой является стоимость необходимого оборудования. Все протоколы требуют длительного периода адаптации к темноте (данные не показаны). Автономные темные корпуса, который встроен в корпус модуля данио очень удобно, но не обязательно. Даже картонная коробка может быть использована, если приняты меры на ленту или уплотнения швов, и параметры воды контролируются. На основе галогенов LIRD способ крайне экономичными и удобными. Все детали можно приобрести по цене ниже $ 100 долларов в местном магазине аппаратное обеспечение и настроить занимает всего несколько минут. TОн единственный практический Недостатком этого метода является неудобством работы в той же комнате, как свет лечения. Огни генерировать хорошее количество тепла, когда работает непрерывно в течение 4 дней и интенсивность света как отвлекающее и потенциально опасные для человеческого зрения. УФ и комбинированные методы требуют источника УФ, которая не доступна каждой лаборатории. Кроме того, большое внимание должно уделяться обеспечению безопасности членов лаборатории при выполнении обработки УФ-излучением света. Таким образом, в то время как это более удобно иметь аппарат галогенной лампы в изолированном пространстве, проблемы безопасности УФ обработки необходимость такого пространства. Это становится дополнительным неудобство, если источник ультрафиолетового излучения используются для светолечение также обычно используется для флуоресцентного микроскопа расположен в "микроскоп номер» или изображений сердечник. Выполнение нескольких раундах УФ лечения контрольной и экспериментальной групп животных потребует отключения микроскопа места для добensive периода времени.

Возможно, самое большое преимущество в использовании комбинированного метода является способность выполнять исследования регенерации сетчатки на пигментированные животных. Мы покажем, что ни личная способ приводит к значительной потере палочек и колбочек в спинной и брюшной сетчатки. В противоположность этому, комбинированное парадигма LIRD приводит к сходным уровнем широко палочек и колбочек, потери в обоих пигментированные и альбиносов. Способность применять эту LIRD метод пигментированные животные сохраняет исследователь значительное пространство, время, и суточные расходы по уходу за животными (если таковые имеются), так как она избавляет от необходимости создавать и поддерживать трансгенных линий процентов на альбиноса фон для регенерации сетчатки исследований . Вместе, мы считаем, что научно-практические преимущества перевешивают потенциальные неудобства этого усовершенствованного способа LIRD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Xixia Ло за отличную рыбу хозяйство и техническую поддержку. Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья гранты R21EY019401 (RT) и P30EY04068 (RT), а стартовый капитал до комнатной температуры, в том числе неограниченный грант от научных исследований до предотвратить слепоту в Wayne State University, кафедра офтальмологии. JT была поддержана Томас К. Rumble стипендий, предоставляемых Wayne State университета Высшая школа.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV light source Leica EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm) Sigma-Aldrich/Pyrex CLS3160152BO
250 ml glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS1000250
4 L glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS10004L
Aluminum foil Fisher 01-213-105
250 W halogen lamps Workforce 265-669
1.8 L clear acrylic tanks Aquaneering ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids Aquaneering ZT180LCL
Fan Honeywell HT-900
Aerator Tetra 77853-900
Thermometer Cole-Parmer YO-08008-58
Bent forceps (5/45) World Precision Instruments 504155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J. Neurosci. 27, 7028-7040 (2007).
  2. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J. Neurosci. 26, 6303-6313 (2006).
  3. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  4. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  5. Thummel, R., et al. Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration. Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).
  6. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).
  7. Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish. Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).
  8. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
  9. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).
  10. Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev. Biol. 6, 36 (2006).
  11. Thummel, R., et al. Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration. Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).
  12. Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina. Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).
  13. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. J. Comp. Neurol. 518, 800-814 (2010).
  14. Morris, A. C., Scholz, T. L., Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetic dissection reveals two separate pathways for rod and cone regeneration in the teleost retina. Dev. Neurobiol. 68, 605-619 (2008).
  15. Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Muller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp. Eye Res. 28, 63-69 (1979).
  16. Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).
  17. Bringmann, A., Wiedemann, P. Muller glial cells in retinal disease. Ophthalmologica. 227, 1-19 (2012).
  18. Eisenfeld, A. J., Bunt-Milam, A. H., Sarthy, P. V. Muller cell expression of glial fibrillary acidic protein after genetic and experimental photoreceptor degeneration in the rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25, 1321-1328 (1984).
  19. Anderson, D. H., Guerin, C. J., Erickson, P. A., Stern, W. H., Fisher, S. K. Morphological recovery in the reattached retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 168-183 (1986).
  20. Bruce, A. E., Oates, A. C., Prince, V. E., Ho, R. K. Additional hox clusters in the zebrafish: divergent expression patterns belie equivalent activities of duplicate hoxB5 genes. Evol. Dev. 3, 127-144 (2001).
  21. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  22. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Muller cell outgrowth after retinal detachment: association with cone photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 1542-1545 (2000).
  23. Fischer, A. J., Bongini, R. Turning Muller glia into neural progenitors in the retina. Mol. Neurobiol. 42, 199-209 (2010).
  24. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends Mol. Med. 16, 193-202 (2010).
  25. Close, J. L., Liu, J., Gumuscu, B., Reh, T. A. Epidermal growth factor receptor expression regulates proliferation in the postnatal rat retina. Glia. 54, 94-104 (2006).
  26. Das, A. V., et al. Neural stem cell properties of Muller glia in the mammalian retina: regulation by Notch and Wnt signaling. Dev. Biol. 299, 283-302 (2006).
  27. Ikeda, T., Puro, D. G. Regulation of retinal glial cell proliferation by antiproliferative molecules. Exp. Eye Res. 60, 435-443 (1995).
  28. Liu, B., et al. Wnt signaling promotes muller cell proliferation and survival after injury. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, 444-453 (2013).
  29. Osakada, F., et al. Wnt signaling promotes regeneration in the retina of adult mammals. J. Neurosci. 27, 4210-4219 (2007).
  30. Wan, J., et al. Preferential regeneration of photoreceptor from Muller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. 48, 223-234 (2008).
  31. Wan, J., Zheng, H., Xiao, H. L., She, Z. J., Zhou, G. M. Sonic hedgehog promotes stem-cell potential of Muller glia in the mammalian retina. Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 347-354 (2007).
  32. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (1002).
  33. Chang, G. Q., Hao, Y., Wong, F. Apoptosis: final common pathway of photoreceptor death in rd, rds, and rhodopsin mutant mice. Neuron. 11, 595-605 (1993).
  34. Marc, R. E., et al. Extreme retinal remodeling triggered by light damage: implications for age related macular degeneration. Mol. Vis. 14, 782-806 (2008).
  35. Portera-Cailliau, C., Sung, C. H., Nathans, J., Adler, R. Apoptotic photoreceptor cell death in mouse models of retinitis pigmentosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 974-978 (1994).
  36. Noell, W. K., Walker, V. S., Kang, B. S., Berman, S. Retinal damage by light in rats. Invest. Ophthalmol. 5, 450-473 (1966).
  37. Wenzel, A., Grimm, C., Samardzija, M., Reme, C. E. Molecular mechanisms of light-induced photoreceptor apoptosis and neuroprotection for retinal degeneration. Prog. Retin. Eye Res. 24, 275-306 (2005).
  38. Cicerone, C. M. Cones survive rods in the light-damaged eye of the albino rat. Science. 194, 1183-1185 (1976).
  39. La Vail, M. M. Survival of some photoreceptor cells in albino rats following long-term exposure to continuous light. Invest. Ophthalmol. 15, 64-70 (1976).
  40. Thomas, J. L., Nelson, C. M., Luo, X., Hyde, D. R., Thummel, R. Characterization of multiple light damage paradigms reveals regional differences in photoreceptor loss. Exp. Eye Res. 97, 105-116 (2012).
  41. Qin, Z., et al. FGF signaling regulates rod photoreceptor cell maintenance and regeneration in zebrafish. Exp. Eye Res. 93, 726-734 (2011).
  42. Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).
  43. Morris, A. C., Schroeter, E. H., Bilotta, J., Wong, R. O., Fadool, J. M. Cone survival despite rod degeneration in XOPS-mCFP transgenic zebrafish. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 4762-4771 (2005).
  44. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Muller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  45. Powell, C., Elsaeidi, F., Goldman, D. Injury-dependent Muller glia and ganglion cell reprogramming during tissue regeneration requires Apobec2a and Apobec2b. J. Neurosci. 32, 1096-1109 (2012).
  46. Ramachandran, R., Reifler, A., Wan, J., Goldman, D. Application of Cre-loxP recombination for lineage tracing of adult zebrafish retinal stem cells. Methods Mol. Biol. 884, 129-140 (2012).
  47. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/Dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15858-15863 (2011).
  48. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Insm1a-mediated gene repression is essential for the formation and differentiation of Muller glia-derived progenitors in the injured retina. Nat. Cell Biol. 14, 1013-1023 (2012).
  49. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev. Cell. 22, 334-347 (2012).
  50. Morris, A. C., Forbes-Osborne, M. A., Pillai, L. S., Fadool, J. M. Microarray analysis of XOPS-mCFP zebrafish retina identifies genes associated with rod photoreceptor degeneration and regeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 2255-2266 (2011).
  51. Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J. Vis. Exp. (58), e3603 (2011).
Роман Paradigm причинение легкого для использования в сетчатке Исследования Регенерация в взрослых данио рерио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).More

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter