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Neuroscience

A Novel leichte Schäden Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafisch

doi: 10.3791/51017 Published: October 24, 2013

Summary

Mehrere leichte Schäden Protokolle, um Schäden Photorezeptoren beschrieben worden und folglich induzieren eine Netzhautregeneration Reaktion in erwachsenen Zebrafisch. Dieses Protokoll beschreibt ein verbessertes Verfahren, das in pigmentierten Tieren verwendet werden kann und dass Schäden, die überwiegende Mehrheit der lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen über die gesamte Netzhaut.

Abstract

Licht-induzierte Degeneration der Netzhaut (LIRD) wird häufig in beiden Nager und Zebrafisch, um Schäden lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen verwendet. Bei erwachsenen Zebrafisch, löst Photorezeptordegeneration Müller Gliazellen um wieder in den Zellzyklus und erzeugen transiente verstärkenden Vorläuferzellen. Diese Vorläuferzellen weiter zu vermehren, wie sie wandern auf den beschädigten Bereich, wo sie letztlich Anlass zu neuen Photorezeptoren. Derzeit gibt es zwei weit verbreitete LIRD Paradigmen, die jeweils Ergebnisse in verschiedenen Graden der Photorezeptor Verlust und entsprechende Unterschiede in der Regeneration Antwort. Als weitere genetische und pharmakologische Werkzeuge zur Verfügung, die Rolle einzelner Gene von Interesse während der Regeneration zu testen sind, besteht ein Bedarf an einer robusten LIRD Paradigma zu entwickeln. Hier beschreiben wir eine LIRD Protokoll, dass die Ergebnisse weit verbreitet und konsequente Verlust beider lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen, in denen wir die Verwendung von zwei vorher festgelegten LIRD Techniken kombiniert haben. FernerKann dieses Protokoll für den Einsatz in pigmentierten Tieren, die die Notwendigkeit einer transgenen Linien von Interesse auf der Albino Hintergrund für LIRD Untersuchungen aufrechtzuerhalten beseitigt verlängert werden.

Introduction

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Licht-induzierte Degeneration der Netzhaut (LIRD) wird häufig in beiden Nager und Zebrafisch, um Schäden lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen verwendet. Bei erwachsenen Zebrafisch, löst Photorezeptordegeneration Müller Gliazellen um wieder in den Zellzyklus und erzeugen transiente verstärkenden Vorläuferzellen. Diese Vorläuferzellen weiter zu vermehren, wie sie wandern auf den beschädigten Bereich, wo sie letztlich Anlass zu neuen Photorezeptoren. Derzeit gibt es zwei weit verbreitete LIRD Paradigmen, die jeweils Ergebnisse in verschiedenen Graden der Photorezeptor Verlust und entsprechende Unterschiede in der Regeneration Antwort. Als weitere genetische und pharmakologische Werkzeuge zur Verfügung, die Rolle einzelner Gene von Interesse während der Regeneration zu testen sind, besteht ein Bedarf an einer robusten LIRD Paradigma zu entwickeln. Hier beschreiben wir eine LIRD Protokoll, dass die Ergebnisse weit verbreitet und konsequente Verlust beider lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen, in denen wir die Verwendung von zwei vorher festgelegten LIRD Techniken kombiniert haben. FernerKann dieses Protokoll für den Einsatz in pigmentierten Tieren, die die Notwendigkeit einer transgenen Linien von Interesse auf der Albino Hintergrund für LIRD Untersuchungen aufrechtzuerhalten beseitigt verlängert werden.

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Protocol

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Alle Vorgänge in diesem Protokoll beschrieben wurden durch die Verwendung von Tieren Ausschuss an der Wayne State University School of Medicine genehmigt.

1. Dunkle Anpassung

  1. Übertragen ~ 10 erwachsene Albino oder pigmentierte Fisch aus dem normalen Gehäuse-System in einen dunklen Schrank. Wenn vorhanden, mit einem dunklen Gehäuse, in das Gehäuse Zebrafisch-Modul, das für die normale Wassermenge durch den Tank ermöglicht gebaut wird. (Wenn ein solches System nicht verfügbar ist, legen Sie das Aquarium in einem völlig dunklen Gehäuse, achten Sie darauf, die Fische mit Sauerstoff belüften).
  2. Halten Sie den Fisch in der Dunkelheit für 10 Tage. Bei der Fütterung der Tiere oder das Hinzufügen neuer Fisch an den dunklen Kasten, vergewissern Sie sich so schnell wie möglich zu bewegen, um zu vermeiden, dass die Fische mit einem langen Zeitraum des Lichts.

2. UV-Licht Exposition

  1. Sicherstellen, dass die Stromversorgung der UV-Quelle ist AUS. Entfernen Sie das UV-Licht fluoreszierenden Filament aus Stereomikroskop.
    1. Verwenden Sie einen umgekehrten15 cm Durchmesser Glas Petrischale (oder etwas von einem ähnlichen 2 cm Höhe) als Ständer für die UV-Filament. Kleben Sie die Petrischale auf dem Labortisch.
    2. Kleben Sie die UV-Licht Filament des umgekehrten Petrischale oben. So anzuordnen, dass ca. 2 mm von dem Ende des Filaments Überhänge die Petrischale.
  2. Besorgen Sie sich einen 250 ml Becherglas. Titelbild ½ der Boden, Seiten und Rückseite des Bechers mit Alufolie, so dass das "glänzende" Seite der Folie steht das Innere des Bechers. Wenn der Becher ist abgestuft, decken Sie den Wortlaut Hälfte des Bechers mit Folie, so dass die klare Hälfte des Bechers ausgesetzt.
  3. Füllen Sie den 250-ml-Becherglas mit 100 ml Wasser aus dem Fisch Facility Systeme.
  4. Legen Sie die 250 ml Becherglas in einem 4 L Becherglas. Füllen Sie den 4 L Becherglas mit Wasser, bis der Wasserstand sogar mit dem 100 ml Wasser-Linie in der 250 ml-Becher ist.
  5. In maximal 10 dunkel-behandelten Tieren der 250-ml-Becherglas. Bedecken Sie den 250-ml-Becherglas mit einem kleinen Stück aus Aluminiumvereiteln.
  6. Platzieren Sie den ganzen Becher Apparat unmittelbar neben dem UV-Filament. Der Faden soll an die Außenseite des 4 L-Becherglas gegeben und mit Blick auf den freiliegenden Teil der 250-ml-Becherglas. Stellen Sie sicher, dass die 250-ml-Becherglas in den Boden des 4 L Becherglas zentriert ist.
  7. Positionieren Sie einen großen, undurchsichtigen Schirm hinter dem 4L Becherglas, so dass für die Tiere ausgesetzt werden, sondern die Verhinderung jeglicher Laborpersonal vom Sehen der Spitze des UV Filament. WARNUNG: Stellen Sie sicher, dass diese Barriere ist, bevor Sie das Gerät einschalten, um die UV-Quelle.
  8. Schalten Sie die UV-Stromquelle. Set Timer für 30 min. Platzieren, was notwendig Warnschilder um sicherzustellen, dass ahnungslose Laborpersonal nicht versehentlich setzen sich gegen UV-Strahlung.
  9. Nach 30 min, Absperren der UV Stromquelle. Nehmen Sie die 250 ml-Becher mit dem Fisch. Hinweis: Wenn mehrere Runden von UV-Belichtung, die erforderlich sind, lassen Sie die Stromquelle abkühlen (~ 20 min) vor der Wiederholung der Exposition Protokoll. Achten Sie darauf, t ersetzener 100 ml Wasser mit frischem Wasser-System für jede Aufnahme. Das Wasser im 4 L Becherglas nicht ersetzt werden müssen.

3. Halogen Lamp Light Exposure

  1. Übertragen Sie die Fische aus 250 ml Becherglas in einem 1,8 L klaren Acryl-Aquarium. Füllen Sie den Tank bis zum Überlauf Marke.
  2. Richten Sie das Licht einer Halogenlampe Behandlungsbereich. Erhalten vier 250 W Halogen-Lampen-Dienstprogramm von einem lokalen Baumarkt. Mit Blick auf zwei Lampen in der gleichen Richtung, ordnen 29 cm auseinander auf Mitte. Ordnen Sie die anderen zwei Lampen in einer ähnlichen Weise.
    1. Platzieren des zweiten Satzes von Lampen, so dass sie gegenüber dem ersten Satz von Lampen, wobei ~ 73 cm zwischen den beiden Sätzen von Lampen. Dies erzeugt eine Rechteck-Form-Licht Behandlung Fläche von 29 x 73 cm.
  3. Besorgen Sie sich einen kleinen Ventilator von einem lokalen Baumarkt. Platzieren Sie den Lüfter genau zwischen den beiden Gruppen von Lampen, etwas außerhalb des Licht-Behandlung Bereich.
  4. Legen Sie zwei 1,8 L Behälter voll Wasser in der Mitte desLicht Behandlungsbereich, genau zwischen den beiden Sätzen von Lampen. Der Abstand zwischen den Lampen und der Außenwand des Behälters sollte ~ 29 cm betragen. Hinweis: Selbst wenn nur die Behandlung von 10 Fische in einem 1,8 l-Tank, verwenden diese Anordnung. Beide Behälter sind erforderlich, um die Temperatur des Wassers von jedem Behälter in dem geeigneten Bereich zu halten.
  5. Legen Sie ein Sauerstoff-Luftsprudler in jedem Tank.
  6. Cover jede Tank mit klarem Acryl Deckel, so dass ein ~ 2 cm Lücke am Ende in der Nähe des Lüfters. Ordnen Sie den Lüfter so, dass es Luft in diesen Spalt blasen wird. Setzen Sie ein Thermometer in einem oder beiden der Tanks.
  7. Schalten Sie das Gerät auf die Lichter, Lüfter-und Belüfter. Pflegen Licht-Behandlung für bis zu 4 Tage. Der Fisch sollte nicht während der Licht-Behandlung zugeführt werden, da dies die Wasserqualität und führen zu mehr Stress für die Tiere zu beeinträchtigen.
  8. Überwachen Temperatur und Wasserstand auf einer täglichen Basis. Pflegen Sie die Temperatur bei 30-33 ° C. Wenn nötig, stellen Sie die Lüftergeschwindigkeit und / oder den Abstand zwischen den Tanks und der lights.
    1. Krönung jeder Tank mit Wasser-System nach Bedarf, in der Regel täglich.
    2. Verwenden Sie immer gesunden erwachsenen Zebrafisch (in der Regel 6-9 Monate alt), um eine Überlebensrate von nahezu 100% zu halten. Allerdings, wenn ein Fisch tot im Becken gefunden, entfernen Sie es sofort, und ersetzen Sie das Wasser im gesamten Tank.

4. Gewebeentnahme

  1. 48 Stunden nach Beginn der Behandlung zu entfernen Halogenlicht die Fische aus dem Behandlungsbereich.
    1. Bereiten Sie frischen ethanolischen Formaldehyd Fixativ (1 Teil 37% Formaldehyd, 9 Teilen 100% Ethanol).
    2. Euthanize Zebrafisch mit einem Anästhetikum Überdosierung von 2-Phenoxyethanol (0,4 mg / L).
    3. Übertragen Sie die eingeschläfert Zebrafisch zu einem Papiertuch. Enucleate das Auge mit einer gebogenen Pinzette.
    4. Zeigen entkernte Augen in Fixiermittel und Speicher O / N bei 4 ° C.
  2. Cryoprotect die Augen.
    1. Waschen der Augen in 5% Saccharose 1x PBS für 30 min bei Raumtemperatur gerührt, dann mit ersetzenfrische 5% Saccharose 1x PBS für 2 Stunden. Anschließend waschen Sie die Augen in 30% Saccharose 1x PBS O / N bei 4 ° C. Waschen der Augen in einem 1:1 (gleiche Teile) des Gewebes Einfriermedium und 30% Saccharose 1x PBS O / N bei 4 ° C.
  3. Integrieren Sie die Augen in 100% Gewebe Einfrieren Medium und bei -80 ° C Orient die Augen, so daß Kryoschneiden des Gewebes auf der dorsal / ventral Achse.
  4. Kryoschnitt das Gewebe und auf Glasplatten. Warm Folien für 2 Stunden bei 55 ° C. Shop Objektträger bei -80 ° C oder sofort ausführen Standard Immunhistochemie.
  5. Führen Standard Immunhistochemie auf geschnittene Gewebe und Bild mit Fluoreszenzmikroskopie 40,51.

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Representative Results

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Die bisher beschriebenen Licht-Behandlung Protokoll wurde zu jedem einzelnen Verfahren LIRD verglichen. In dunkel-behandelten erwachsenen Albinos (Abbildungen 3-5), führte die einzelnen Licht-Behandlungen in signifikanten Verlust der Stange (Abbildung 3) und Kegel (Abbildung 4) Photorezeptoren. Doch sowohl die einzelnen Behandlungen in erster Linie Photorezeptoren in der dorsalen Hälfte der Netzhaut beschädigt, so dass der ventralen Retina relativ von den Licht-Behandlungen (Abbildungen 3 und 4) geschützt. Darüber hinaus, verglichen mit dem Halogen-Licht Behandlung, beschädigt das UV-Licht Behandlung mehr Zapfen-Photorezeptoren in der dorsalen Hälfte der Netzhaut (vergleiche 4B mit C, respectively). Die Kombination der UV-und Halogen-Licht-Behandlungen in deutlich größeren Verlust sowohl lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen der Netzhaut während führte, weitgehend eliminiert die neuroprotection der ventralen Hälfte der Netzhaut (3 und 4). Im Vergleich mit den einzelnen LIRD Methoden wurde eine entsprechende Erhöhung der Proliferation auch im ventralen Netzhaut beobachtet, wenn das kombinierte Licht Behandlung-Protokoll verwendet wurde (Abbildung 5).

Pigmentierte Tiere sind resistent gegen durch retinale Pigmentepithel, die Licht absorbiert und schützt die Photorezeptoren von Phototoxizität LIRD. Wie erwartet, Dunkel-adaptierten pigmentierten Tiere waren fast völlig resistent gegen das Halogenlicht Behandlung allein (6B, J und N). Wir fanden, dass 48 h nach Beginn Licht, Stäbchendichte im dorsalen Retina reduziert wurden, jedoch nicht ventralen Netzhaut (6E, F und Q). Cone Photorezeptorkerne waren anwesend in normale Zahlen (Abbildung 6R). Im Vergleich zu unbehandelten Netzhaut, HalogenlichtBehandlung allein auch nicht zu einer Erhöhung Müller Gliazellen Zellproliferation 48 Stunden nach Beginn Licht (7B und F). In Albinos geführt UV-Licht-Behandlung allein in etwas größere Schäden an beiden lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen in der dorsalen Retina (Abb. 3E und 4E). In pigmentierten Tieren hat UV-Licht-Behandlung allein nicht wesentlich verringern Stab oder Konus Zellzahl (6C, G, K, O, Q und R). Darüber hinaus UV-Behandlung allein nur eine schwache hervorgerufen regenerative Reaktion in der dorsalen Hälfte der Netzhaut in pigmentierten Tieren (Fig. 7C). Im Gegensatz zu den einzelnen LIRD Ergebnisse, die Kombination der UV-und Halogen-Behandlungen führten zu signifikant größer Photorezeptor Schäden und regenerative Reaktion in pigmentierten Tieren. Wichtig ist, dass signifikanten Verlust der beiden Stäbchen und Zapfen in der sowohl dorsa beobachtet l und ventralen Netzhaut (6D, H, L, P, Q und R). Im Vergleich zu unbehandelten einzelnen LIRD Methoden wurde eine entsprechende Erhöhung der Proliferation auch in beiden dorsalen und ventralen Hälften der Netzhaut beobachtet, wenn das kombinierte Licht Behandlung-Protokoll verwendet wurde (Abbildung 5).

Abbildung 1
Abbildung 1. Fotografie, die das Halogenlicht Behandlung Setup. Zwei Sätze von vier 250 W Halogenlampen 29 cm wurden auf beiden Seiten der zwei klare 1,8 L Acryl Tanks angeordnet. Der Belüfter und Schläuche wurden so das Licht nicht zu behindern platziert. Die Deckel der Tanks wurden 2 cm geknackt, um den Luftstrom aus dem Gebläse zu ermöglichen. Wurde ein Thermometer in einen der Behälter, bis die Temperatur überwacht werden, platziert.arget = "_blank"> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 2
Abbildung 2. Fotografie, die das UV-Licht Behandlung Setup. Die UV-Lichtquelle von einem fluoreszierenden Stereomikroskop sicher in einem Glas Petrischale ~ 2 cm von der Tischplatte befestigt. Ein 250 ml Becherglas, teilweise in Folie verpackt, wurde gefüllt werden 100 ml des Systems Wasser. Die Fische wurden in der 250 ml-Becherglas gegeben. Die 250 ml-Becherglas wurde in einem 4 l-Becherglas, das mit dem System Wasser an die Höhe des Wassers in der 250 ml-Becherglas gefüllt zentriert. Das 4 L Becherglas wurde angrenzend platziert, um den Glühfaden im 250 ml Becher zentriert. Ein großes Schild undurchsichtig wurde um das gesamte Setup platziert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .


Abbildung 3. Rod Photorezeptor Verlust in Albino Zebrafisch nach verschiedenen leichte Schäden Paradigmen Retinal Abschnitte aus adulten Tg (nrd: egfp). / Alb immunmarkiert mit GFP, um die Stange Photorezeptor Dichte (grün) in der Rückenflosse (AD) und ventralen zeigen (EH) Hälften der Netzhaut . A, E) Vor Licht Beginn (0 h), EGFP-positive Stange Photorezeptorkerne (ONL) und äußeren Segmente (ROS) visualisiert werden können. B, F) Nach 48 hr folgende Halogenlicht Beginn (HLT), verkürzte ROS und deutlich weniger Stäbchenkerne (I) waren in der dorsalen, aber nicht ventralen Netzhaut. CG) Nach 48 h Nach 30 min UV-Bestrahlung (hpUV) waren deutlich weniger Stäbchenkerne in den dorsalen und ventralen Netzhaut im Vergleich zu 0 h (C, G < / Strong>), aber nicht 48 HLT Behandlungen (G, I). DH) 48 hr folgenden Beginn der kombinierten Licht-Behandlung (30 min UV-Bestrahlung durch Halogen Behandlung gefolgt; UV +48 HLT), fast keine ROS waren in dorsal oder ventral Netzhaut, zusätzlich zu einem erheblichen Verlust der Stange Photorezeptorkerne (I) . I) Quantifizierung der Stange Photorezeptorkerne über 300 um des zentralen dorsalen oder ventralen Netzhaut. "A" für von 0 verschiedene hr, "b" für verschiedene von 48 HLT und "c" für die verschiedenen von 48 hpUV: Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) zwischen den Gruppen sind, wie dargestellt. Maßstab in Panel A 50 um und gilt für Platten AH. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Abbildung 4. Doppelkegel Verlust in Albino Zebrafisch nach verschiedenen leichte Schäden Paradigmen. Retinal Abschnitte aus erwachsene Albino Zebrafisch mit Zpr-1 immunmarkiert zu Doppelkegel (gold) in der Rückenflosse (AD) und ventralen (EH) Hälften der Netzhaut nach jedem der Licht zeigen Schäden Paradigmen (48 HLT, 48 hpUV und UV +48 HLT). A, E) bei 0 h, Doppelkegel Kerne waren in dorsale und ventrale Netzhaut. B, F) Bei 48 HLT, waren deutlich weniger Doppelkegel in die ventrale Netzhaut nur (F, I). CG) Bei 48 hpUV deutlich weniger Doppelkegel (I) und eine große Menge von Verunreinigungen war im dorsalen Netzhaut nur (C), während keine Änderung in der ventralen Netzhaut (G) beobachtet wurden. DH) Bei UV +48 HLT, deutlich weniger Doppelkegels (I) und sehr wenig Schmutz war in dorsalen und ventralen Netzhaut. I) Die Quantifizierung der Doppelkegel über 300 um des zentralen dorsalen oder ventralen Netzhaut. Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) zwischen den Gruppen werden als "a" für verschiedene von 0 hr, "b" für verschiedene aus 48 HLT und "c" für verschiedene aus 48 hpUV dargestellt. Maßstab in Panel A 100 um und gilt für Platten AH. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Abbildung 5
Abbildung 5. Veränderungen ist Proliferationsantwort nach verschiedenen leichte Schäden Paradigmen. Retinal Abschnitte aus erwachsene Albino Zebrafisch mit PCNA immunmarkiert die Zellproliferation (rot) in zeigendie dorsale (AD) und ventralen (EH) Hälften der Netzhaut nach jedem der leichte Schäden Paradigmen (48 HLT, 48 hpUV und UV +48 HLT). AE) bei 0 h, die Proliferation abwesend von der inneren Körnerschicht ( INL). B, F) mit 48 HLT, single-Vorläuferzellen vorhanden waren in der INL über den dorsalen Retina und in einem kleinen Teil des ventralen Netzhaut. CG) Bei 48 hpUV waren Spalten von Vorläuferzellen in der dorsalen Retina, während nur einzelne Progenitorzellen in einem kleinen Teil des ventralen Netzhaut. D, H) in die UV +48 HLT waren große Spalten von Vorläuferzellen vorhanden über den dorsalen und ventralen Netzhaut. Maßstab in Panel A 100 um und gilt für Platten AH. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .


Abbildung 6. Rod und Kegel Photorezeptor Verlust in pigmentierten Zebrafisch nach verschiedenen leichte Schäden Paradigmen Retinal Abschnitte aus adulten Wildtyp-(AB) Zebrafisch mit TO-PRO-3 gefärbt, um alle Kerne (AP; blau) zeigen. Immunmarkiert und mit Zpr-3, um die Stange zeigen äußeren Segmente (AH; magenta) oder Zpr-1 Doppel-Kegel (IP; Gold) in der Rückenflosse (AD, IJ) und ventralen (EH, MP) Hälften der Netzhaut nach jedem der leichte Schäden Paradigmen (48 HLT, 48 hpUV und UV +48 HLT). AH) Deutliche Rückgänge in Stange Photorezeptorkerne waren anwesend in der dorsalen Retina bei 48 HLT (B, Q) und in der dorsalen und ventralen Retina an UV +48 HLT (D, H, Q) . IP) Obwohl Kegel Kerne wurden hypertrophisch i n der dorsalen Retina bei 48 hpUV (K), keine signifikanten Rückgänge in Doppelkegel Kerne waren bei 48 oder 48 HLT hpUV (JK, NO, R). Deutliche Rückgänge in Kegel Kerne waren in der dorsalen und ventralen Retina an UV +48 HLT (L, P, R). QR) Quantifizierung der Stange Photorezeptor und Doppelkegel Kerne über 300 um des zentralen dorsalen oder ventralen Netzhaut. Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) zwischen den Gruppen werden als "a" für verschiedene von 0 hr, "b" für verschiedene aus 48 HLT und "c" für verschiedene aus 48 hpUV dargestellt. Maßstab in Panel A 200 um und gilt für Platten AH. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Abbildung 7. Proliferation Reaktion in pigmentierten Zebrafisch nach verschiedenen leichte Schäden Paradigmen. Retinal Abschnitte aus adulten Wildtyp-(AB) Zebrafisch mit PCNA immunmarkiert die Zellproliferation (rot) in der Rückenflosse (AD) und ventralen (EH) zeigen Hälften der Netzhaut nach jeder die leichte Schäden Paradigmen (48 HLT, 48 hpUV und UV +48 HLT). n. Chr.) In der dorsalen Retina, waren nur ein paar einzelne Progenitorzellen in der INL bei 48 und 48 HLT hpUV (B, C), während Spalten von Vorläuferzellen waren bei UV +48 HLT (D). EH) In der ventralen Retina wurden keine Änderungen in Proliferation außer an UV +48 HLT (H), zu welchem ​​Zeitpunkt Spalten von Vorläuferzellen waren anwesend beobachtet. Maßstab in Panel A 100 um und gilt für Platten AH.7/51017fig7highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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Discussion

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Hier zeigen wir, dass die Kombination eine kurze UV-Bestrahlung mit einer kontinuierlichen helles Licht Exposition Ergebnisse in weit verbreiteten Photorezeptor Verlust und eine robuste Regeneration Antwort. Verglichen mit den einzelnen LIRD Methoden ist dies kombiniert Verfahren auch die effektivste Protokoll sowohl Stäbchen und Zapfen in beiden Hälften der Netzhaut beschädigen. Wichtig ist, dass diese Behandlung wirksam bei pigmentierten Tieren sowie Albinos.

Obwohl wir den Beweis, dass die kombinierten Ergebnisse in Protokoll weiter verbreitet und konsistenten Schaden mit den einzelnen Methoden LIRD Vergleich zu stellen, sollte die wissenschaftliche Überlegungen, bevor Sie eine LIRD Paradigma diskutiert werden. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die kombinierte Verfahren verwendet werden sollte, wenn die gesamte Netzhaut Gewebe zur Analyse gesammelt wird (dh Proteomik, real-time PCR) werden. Wir fanden, dass die kombinierte Verfahren die größte Größe der Läsion, die Halogen Belichtung folgt, und schließlich die UV-Exposition hatte. Wir schlagen vor,dass die kombinierte Methode auch verwendet werden, wenn die Untersuchung ein Gen oder ein Weg, die unterschiedlich bewirken könnte Stäbchen und Zapfen Regeneration werden. Ist dies aus praktischen Gründen nicht möglich ist, legen unsere Daten, dass die UV-Belichtung die nächste beste Verfahren für diese Studien ist, wenn die Analyse auf die zentrale Netzhaut dorsal begrenzt ist.

Praktische Überlegungen werden auch geboten, wenn Sie die entsprechende LIRD Verfahren. Die erste Sorge ist, die Kosten für die notwendige Ausrüstung. Alle Protokolle erfordern längere Dunkeladaption (Daten nicht gezeigt). Ein in sich geschlossenes Gehäuse, das in dunklen Zebrafisch Gehäusemoduls gebaut wird, ist es extrem komfortabel, aber nicht notwendig. Auch ein Karton können verwendet werden, wenn darauf auf Band genommen wird oder die Nähte zu versiegeln, und das Wasser werden überwacht. Die Halogen-basierte LIRD Methode ist extrem sparsam und bequem. Alle Einzelteile können für unter 100 US-Dollar bei einem örtlichen Baumarkt gekauft werden und Einrichten dauert nur ein paar Minuten. Ter nur praktischer Nachteil dieser Methode ist, die Unannehmlichkeiten, die im selben Raum wie die Licht-Behandlung. Die Lichter erzeugen eine gute Menge an Wärme beim Laufen kontinuierlich für 4 Tage und die Lichtintensität ist sowohl störende und potenziell schädlich für das menschliche Auge. Die UV-und kombinierte Methoden erfordern eine UV-Quelle, die nicht zur Verfügung steht, um jedes Labor. Darüber hinaus sollte darauf geachtet, die Sicherheit der Mitglieder zu gewährleisten Labor bei der Durchführung einer UV-Licht-Behandlung werden. So, während es bequemer, das Halogenlicht Vorrichtung in einem isolierten Raum haben, ist, erfordern die Sicherheitsbedenken der UV-Behandlung einen solchen Raum. Dies wird eine zusätzliche Unannehmlichkeiten, wenn die UV-Quelle für die Licht-Behandlung verwendet wird, auch in der Regel für eine fluoreszierende Mikroskop in einem "Mikroskop room" oder Bildgebung Kern untergebracht werden. Darstellende mehrere Runden von UV-Behandlungen zur Steuerung und experimentellen Gruppen von Tieren erfordern würden Herunterfahren des Mikroskops Raum für eine extensive Zeitdauer.

Vielleicht der größte Vorteil bei der Verwendung der kombinierten Methode ist die Möglichkeit, Netzhautregeneration Studien pigmentierten Tieren durchzuführen. Wir zeigen, dass weder die einzelnen Verfahren führt zu erheblichen Verlust der Stäbchen und Zapfen in der dorsalen und ventralen Netzhaut. Im Gegensatz dazu die vereinigten LIRD Paradigma Ergebnisse in ähnlichen Ebenen verbreitet Stäbchen und Zapfen Verlust in beiden pigmentiert und Albinos. Die Fähigkeit, diese Methode, um LIRD pigmentierten Tieren gelten speichert die Forscher deutliche Raum, Zeit, und pro Tag Tierpflege Kosten (falls vorhanden), da es die Notwendigkeit zu erzeugen und aufrechtzuerhalten transgenen Linien von Interesse auf der Albino Hintergrund für Netzhautregeneration Studien beseitigt . Zusammen glauben wir, dass die wissenschaftlichen und praktischen Vorteile die möglichen Unannehmlichkeiten dieses verbesserte Verfahren LIRD überwiegen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Xixia Luo für exzellente Fisch Tierhaltung und technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Zuschüsse R21EY019401 (RT) und P30EY04068 (RT) finanziert, und Start-up-Fonds auf RT, darunter eine nicht zweckgebundene Zuwendung von der Forschung bis zur Blindheit Wayne State University, Department of Ophthalmology verhindern. JT wurde von einem Thomas C. Rumble Fellowship von der Wayne State University Graduate School vorgesehen ist.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV light source Leica EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm) Sigma-Aldrich/Pyrex CLS3160152BO
250 ml glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS1000250
4 L glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS10004L
Aluminum foil Fisher 01-213-105
250 W halogen lamps Workforce 265-669
1.8 L clear acrylic tanks Aquaneering ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids Aquaneering ZT180LCL
Fan Honeywell HT-900
Aerator Tetra 77853-900
Thermometer Cole-Parmer YO-08008-58
Bent forceps (5/45) World Precision Instruments 504155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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A Novel leichte Schäden Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafisch
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Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).

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