Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

A Novel Lett Skade Paradigm for bruk i Retinal Regeneration Studies in Adult sebrafisk

doi: 10.3791/51017 Published: October 24, 2013

Summary

Flere lette skader protokoller har blitt beskrevet å skade fotoreseptorer og dermed indusere en retinal regenerering respons i voksen sebrafisk. Denne protokollen beskriver en forbedret fremgangsmåte som kan brukes i pigmenterte dyr, og som skader det store flertallet av stang-og kjegle fotoreseptorer tvers av hele netthinnen.

Abstract

Lysindusert retinal degenerasjon (LIRD) er ofte brukt i både gnagere og sebrafisk til skade stang og kjegle fotoreseptorer. I voksen sebrafisk, utløser fotoreseptor degenerasjon Müller gliaceller å re-gå inn i cellen syklus og produsere transient-forsterke stamfedre. Disse stamfedre fortsette å spre seg som de vandrer til det skadede området, hvor de til slutt gi opphav til nye fotoreseptorer. For tiden er det to svært utbredte LIRD paradigmer, som hver resulterer i varierende grad av fotoreseptoren tap og tilsvarende forskjeller i regenerering respons. Som mer genetiske og farmakologiske verktøy er tilgjengelige for å teste rollen av individuelle gener av interesse under regenereringen, er det behov for å utvikle et robust LIRD paradigme. Her beskriver vi en LIRD protokoll som resulterer i omfattende og konsekvent tap av både stang og kjegle fotoreseptorer der vi har kombinert bruk av to tidligere etablerte LIRD teknikker. Videre, Kan denne protokollen bli utvidet til bruk i pigmenterte dyr, noe som eliminerer behovet for å opprettholde transgene linjer av interesse på albino bakgrunnen for LIRD studier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lysindusert retinal degenerasjon (LIRD) er ofte brukt i både gnagere og sebrafisk til skade stang og kjegle fotoreseptorer. I voksen sebrafisk, utløser fotoreseptor degenerasjon Müller gliaceller å re-gå inn i cellen syklus og produsere transient-forsterke stamfedre. Disse stamfedre fortsette å spre seg som de vandrer til det skadede området, hvor de til slutt gi opphav til nye fotoreseptorer. For tiden er det to svært utbredte LIRD paradigmer, som hver resulterer i varierende grad av fotoreseptoren tap og tilsvarende forskjeller i regenerering respons. Som mer genetiske og farmakologiske verktøy er tilgjengelige for å teste rollen av individuelle gener av interesse under regenereringen, er det behov for å utvikle et robust LIRD paradigme. Her beskriver vi en LIRD protokoll som resulterer i omfattende og konsekvent tap av både stang og kjegle fotoreseptorer der vi har kombinert bruk av to tidligere etablerte LIRD teknikker. Videre, Kan denne protokollen bli utvidet til bruk i pigmenterte dyr, noe som eliminerer behovet for å opprettholde transgene linjer av interesse på albino bakgrunnen for LIRD studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen ble godkjent av dyr bruk komiteen ved Wayne State University School of Medicine.

En. Mørk Adaptation

  1. Transfer ~ 10 voksen albino eller pigmentert fisk fra normal bolig system inn i et mørkt skap. Hvis tilgjengelig, kan du bruke en mørk kabinett som er bygget inn i sebrafisk bolig modul, som gjør det mulig for normal vannføring gjennom tanken. (Hvis et slikt system ikke er tilgjengelig, legg fisken tank i et helt mørkt kabinett, og pass på å lufte fisken med oksygen).
  2. Holde fisken i mørket i 10 dager. Ved mating av dyrene eller legge ny fisk til den mørke boksen, sørg for å bevege seg så raskt som mulig for å unngå å utsette fisken til en lang periode med lys.

2. UV Lyseksponering

  1. Pass på at strømmen til UV-kilden er OFF. Ta av UV-lys glødetråd fra fluorescerende stereomikroskop.
    1. Bruk en invertert15 cm diameter glass petriskål (eller noe av en lignende 2 cm høyde) som et standpunkt for UV glødetråd. Tape petriskål til laboratoriet benken.
    2. Tape UV-lys filament til toppen av den omvendte petriskål. Ordne slik at ~ 2 mm av enden av glødetråden overheng petriskål.
  2. Skaff en 250 ml glass begerglass. Dekk ½ av bunnen, sidene og baksiden av begeret med aluminiumsfolie, slik at de "blanke" side av folien vender det indre av begeret. Hvis begeret er gradert, dekke formulert halvparten av begerglasset med folie, og etterlater den klare halvdel av begerglasset eksponert.
  3. Fyll 250 ml begerglass med 100 ml vann fra fisken innretningen system.
  4. Plasser 250 ml begerglass i et 4 l begerglass. Fyll 4. l begerglass med vann til vannivået kommer jevnt med 100 ml vann linje i 250 ml begerglass.
  5. Legge til maksimalt 10 dark-behandlede dyr til 250 ml begerglass. Dekk til 250 ml begerglass med et lite stykke av aluminiumfolie.
  6. Plasser hele begeret apparat i umiddelbar nærhet til UV glødetråd. Filamentet må berøre utsiden av 4 l begerglass og vender mot den eksponerte delen av det 250 ml begerglass. Kontroller at 250 ml begerglass er sentrert i undersiden av 4 l begerglass.
  7. Plasser en stor, ugjennomsiktig skjerm bak 4L begerglasset, slik at for de dyr som skal eksponeres, men hindre eventuelle lab-personell fra å se spissen av UV-filament. ADVARSEL: Pass på at denne barrieren er på plass før du slår på strømmen til UV kilden.
  8. Slå på UV strømkilde. Sett timeren i 30 min. Plasser det nødvendige varselskilt for å sikre at intetanende lab personell ikke tilfeldigvis utsette seg for UV-stråling.
  9. Etter 30 min, slå av UV strømkilde. Fjern 250 ml begerglass med fisken. MERK: Hvis flere runder med UV-eksponering er nødvendig, la strømkilden avkjøles (~ 20 min) før du gjentar eksponering protokollen. Sørg for å skifte than 100 ml vann med friskt vann-system for hver eksponering. Vannet i 4 l begerglass ikke trenger å skiftes ut.

3. Halogen Lamp Lyseksponering

  1. Overføre fisken fra 250 ml beger inn en 1,8 L klar akryl fisk tank. Fyll tanken til overløp mark.
  2. Sett opp halogenlampe lysbehandling området. Skaff fire 250 W halogen verktøyet lamper fra en lokal jernvarehandel. Overfor to lamper i samme retning, arrangere 29 cm fra hverandre på midten. Ordne de to andre lamper på en lignende måte.
    1. Plasser det andre sett av lamper, slik at de står overfor det første sett av lyskilder, forlater ~ 73 cm mellom de to sett av lamper. Dette skaper et rektangel-formet lysbehandling areal på 29 x 73 cm.
  3. Skaff en liten vifte fra en lokal jernvarehandel. Plasser viften like langt mellom de to sett med lamper, like utenfor lyset behandlingsområdet.
  4. Plassere to 1,8 l kar fylt med vann i midten avlysbehandling område, like langt mellom de to sett med lamper. Avstanden mellom lampene og utenfor veggen av tanken skal være ~ 29 cm. Merk: selv om bare å behandle 10 fisk i en 1,8 L tank, bruker denne ordningen. Begge tankene er nødvendig for å holde vanntemperaturen på hver tank innenfor det aktuelle området.
  5. Plasser en oksygen tut i hver tank.
  6. Dekke hver tank med klare akryl lokk, etterlot seg en ~ 2 cm gap på slutten nærmest viften. Ordne viften slik at det vil blåse luft inn i dette gapet. Setter et termometer i en eller begge av tankene.
  7. Slå på strømmen til lysene, vifte, og ventilasjonsanleggene. Opprettholde lysbehandling for opp til 4 dager. Fisken bør ikke mates under lysbehandling, da denne påvirker vannkvaliteten og resultere i mer stress for dyrene.
  8. Overvåke temperatur-og vann-nivået på en daglig basis. Oppretthold temperaturen ved 30-33 ° C. Om nødvendig, justere viftehastigheten og / eller avstanden mellom tankene og lights.
    1. Toppen av hver tank med systemet vann etter behov, vanligvis daglig.
    2. Bruk alltid sunn voksen sebrafisk (vanligvis 6-9 måneder) for å opprettholde en overlevelse på nær 100%. Hvis imidlertid en fisk blir funnet død i tanken, fjerne den umiddelbart og erstatte vannet i hele tanken.

4. Tissue Collection

  1. 48 timer etter utbruddet av halogen lys behandling fjerne fisken fra behandlingsområdet.
    1. Forbered frisk etanol formaldehyd bindemiddel (1 del 37% formaldehyd, 9 deler 100% etanol).
    2. Avlive zebrafisk med en bedøvelse overdose av 2-fenoksy-etanol (0,4 mg / l).
    3. Overfør avlives sebrafisk til et papirhåndkle. Enucleate øyet med buede tang.
    4. Plasser enucleated øyne i festing og store O / N ved 4 ° C.
  2. Cryoprotect øynene.
    1. Vask øynene i 5% sukrose 1x PBS i 30 min ved romtemperatur, deretter erstatte medfrisk 5% sukrose 1X PBS i 2 timer. Deretter vaske øynene i 30% sukrose 1x PBS O / N ved 4 ° C. Vask øynene i en 1:1 (like deler) av vev frysemedium og 30% sukrose 1X PBS O / N ved 4 ° C.
  3. Bygge inn i øynene i 100% vevet frysing medium og oppbevar ved -80 ° C. Orienter øyne så frysesnitt av vevet er utført på dorsal / ventral akse.
  4. Cryosection vevet og legg på glassplater. Varme lysbilder for to timer ved 55 ° C. Oppbevar lysbilder ved -80 ° C eller umiddelbart utføre standard immunhistokjemi.
  5. Utfør standard immunhistokjemi på seksjonert vev og bilde med fluoriserende mikroskopi 40,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den hittil beskrevet lysbehandling protokollen ble sammenlignet med hver enkelt metode for LIRD. I mørke-behandlede voksne albino dyr (figur 3-5), resulterte de enkelte lys behandlinger i betydelig tap av stang (figur 3) og konen (figur 4) fotoreseptorer. Imidlertid, både individuelle behandlinger primært skadet fotoreseptorer i dorsal halvdel av retina, og etterlater den ventrale netthinnen relativt beskyttet fra lys behandlinger (figurene 3 og 4). I tillegg, sammenlignet med halogen lysbehandling, skades den UV-lys behandling flere kjegle fotoreseptorer i dorsal halvdel av netthinnen (sammenlign figurene 4B med C, henholdsvis). Kombinere UV og halogen lys behandlinger resulterte i betydelig større tap for både stang og kjegle fotoreseptorer hele netthinnen, i stor grad eliminerer neuroprotection av den ventrale halvdel av netthinnen (figurene 3 og 4). Sammenlignet med de enkelte LIRD metodene, ble en tilsvarende økning i proliferasjon også observert i det ventrale retina når den kombinerte lys behandlingsprotokoll ble benyttet (Figur 5).

Pigmenterte dyr er mer motstandsdyktig mot LIRD grunn av retinal pigmentert epitel, som absorberer lys og beskytter fotoreseptorer fra fototoksistet. Som forventet, mørk-tilpasset pigmenterte dyr var nesten fullstendig resistente mot halogen behandling alene (figurene 6B, J og N). Vi fant at 48 timer etter lett utbruddet ble stang fotoreseptorer redusert i dorsal netthinne, men ikke ventrale netthinnen (figurene 6E, F og Q). Kjegle fotoreseptoren kjerner var tilstede i normale tall (figur 6R). Sammenlignet med ubehandlet netthinne, halogen lysbehandling alene også ikke økte Müller glial celleproliferasjon 48 timer etter lett utbruddet (Tall 7B og F). I albino dyr, resulterte UV lys behandling alene i litt større skade på både stang og kjegle fotoreseptorer i dorsal netthinnen (Tall 3I og 4I). Men i pigmenterte dyr, hvor UV-lys behandling alene ikke i betydelig grad redusere stang eller kjegle celle nummer (figur 6C, G, K, O, Q, R). I tillegg, UV-behandling alene bare fremkalte en svak regenerativ respons i dorsal halvdel av retina hos pigmenterte dyr (figur 7C). I motsetning til de enkelte LIRD resultater, kombinere UV og halogen lys behandlinger resulterte i signifikant større fotoreseptoren skader og regenerativ respons hos pigmenterte dyr. Viktigere, ble betydelig tap av både stenger og kjegler observert i både Dorsa l og ventral netthinner (figurene 6D, H, L, P, Q og R). Sammenlignet med ubehandlede og individuell LIRD metoder, ble en tilsvarende økning i proliferasjon også observert i både dorsale og ventrale halvdeler av netthinnen når den kombinerte lys behandlingsprotokoll ble benyttet (Figur 5).

Figur 1
Figur 1. Fotografi som avbilder den halogenlys behandling oppsett. To sett med fire 250 W halogenlamper ble plassert 29 cm på hver side av to klare 1,8 L akryl tanks. Den tut og slange ble plassert slik at de ikke hindrer lyset. Lokkene av tankene var sprakk 2 cm slik at luften fra viften. Et termometer ble plassert i en av tankene for den temperatur som skal overvåkes.Arget = "_blank"> Klikk her for å se større bilde.

Figur 2
Figur 2. Fotografi som avbilder UV-lyset behandling oppsett. UV lyskilde fra et fluorescerende stereomikroskop var godt festet til et glass petriskål ~ 2 cm fra benken toppen. Et 250 ml begerglass, delvis innpakket i folie, ble fylt vil 100 ml vann-system. Fisken ble plassert inne i 250 ml begerglass. Den 250 ml begerglass ble sentrert inne i et 4 l begerglass, som var fylt med systemet vann til nivået av vannet i 250 ml begerglass. De 4 L beger ble plassert ved siden av lys filament sentrert i 250 ml begerglass. En stor ugjennomsiktig skjold ble plassert rundt hele oppsettet. Klikk her for å se større bilde .


Figur 3. Rod fotoreseptoren tap i albino sebrafisk etter ulike lys skade paradigmer Retinal seksjoner fra voksen Tg (NRD: EGFP). / Alb immunolabeled med GFP å vise stang fotoreseptoren tetthet (grønn) i dorsal (AD) og ventral (EH) halvdeler av netthinnen . A, E) Før lys utbruddet (0 timer), EGFP-positive stang fotoreseptoren kjerner (onl) og ytre segmenter (ROS) kan visualiseres. B, F) På 48 hr følgende halogen lys utbruddet (HLT), avkortet ROS og betydelig færre stang kjerner (I) var tilstede i dorsal, men ikke ventrale netthinnen. CG) etter 48 timer etter 30 min UV-eksponering (hpUV), betydelig færre stang nuclei var tilstede i den dorsale og ventrale netthinne sammenlignet med 0 hr (C, G < / Strong>), men ikke 48 HLT behandlinger (G, I). DH) 48 timer etter inntreden av lys kombinerte behandling (30 min UV-eksponering fulgt av behandling halogen; UV 48 HLT), nesten ingen ROS var tilstede i dorsal og ventrale netthinner, i tillegg til et betydelig tap av stangen fotoreseptoren kjerner (I) . jeg) Kvantifisering av stang fotoreseptoren kjerner over 300 mikrometer i det sentrale dorsal eller ventral netthinnen. Signifikante forskjeller (p ≤ 0,05) mellom gruppene er avbildet som: "a" for forskjellig fra 0 hr, "b" for forskjellig fra 48 HLT og "c" for forskjellig fra 48 hpUV. Skalalinje i panel A er 50 mikrometer og gjelder for paneler AH. Klikk her for å se større bilde .

iles/ftp_upload/51017/51017fig4.jpg "width =" 500px "/>
Figur 4. Dobbel membran tap i albino sebrafisk etter ulike lys skade paradigmer. Retinal seksjoner fra voksen albino sebrafisk immunolabeled med ZPR-en for å vise to membranene (gull) i dorsal (AD) og ventral (EH) halvdeler i netthinnen etter hver av lyset skade paradigmer (48 HLT, 48 hpUV, og UV 48 HLT). A, E) 0 hr, dobbel kjegle atomkjerner var til stede i rygg-og ventral netthinne. B, F) Ved 48 HLT, var signifikant færre to membranene til stede i ventrale netthinnen bare (F, I). CG) På 48 hpUV, betydelig færre to membranene (I) og en stor mengde rusk var til stede i dorsal netthinnen bare (C), mens ingen endringer ble observert i ventrale netthinnen (G). DH) Ved UV 48 HLT, betydelig færre dobbel membrans (I), og svært lite avfall var til stede i dorsal og ventrale netthinner. I) Kvantifisering av to membranene over 300 mikrometer i det sentrale dorsal eller ventral netthinnen. Signifikante forskjeller (p ≤ 0,05) mellom gruppene er avbildet som, "a" for forskjellig fra 0 hr, "b" for forskjellig fra 48 HLT og "c" for forskjellig fra 48 hpUV. Skalalinje i panel A er 100 mikrometer og gjelder for paneler AH. Klikk her for å se større bilde .

Figur 5
Figur 5. Endringer er spredning respons etter ulike lys skade paradigmer. Retinal seksjoner fra voksen albino sebrafisk immunolabeled med PCNA å vise celleproliferasjon (rød) idorsal (AD) og ventral (EH) halvdeler av netthinnen etter hver av de lette skader paradigmer (48 HLT, 48 hpUV, og UV 48 HLT). AE) Ved 0 hr, var spredning fraværende fra den indre kjernefysiske lag ( INL). B, F) ved 48 HLT, enkelt-progenitorceller var tilstede i INL tvers dorsal netthinnen og i en liten del av den ventrale netthinnen. CG) Ved 48 hpUV, var kolonner av progenitor-celler til stede i dorsal netthinnen, mens bare én progenitorceller var tilstede i en mindre del av den ventrale netthinnen. D, h) ved UV-48 HLT ble store kolonner av progenitor-celler til stede på tvers av den dorsale og ventrale netthinnen. Skalalinje i panel A er 100 mikrometer og gjelder for paneler AH. Klikk her for å se større bilde .


Figur 6. Stang og kjegle fotoreseptoren tap i pigmentert sebrafisk etter ulike lys skade paradigmer Retinal seksjoner fra voksen vill-type (AB) sebrafisk farget med TO-PRO-3 for å vise alle kjerner (AP, blå). Og immunolabeled med ZPR-tre vise stang ytre segmenter (AH, magenta) eller ZPR-en til to membranene (IP; gull) i dorsal (AD, IJ) og ventral (EH, MP) halverer av netthinnen etter hver av de lette skader paradigmer (48 HLT, 48 hpUV, og UV 48 HLT). AH) Betydelige reduksjoner i stang fotoreseptoren kjerner var tilstede i dorsal netthinnen 48 HLT (B, Q) og i dorsal og ventral netthinnen UV 48 HLT (D, H, Q) . IP) Selv kjegle kjerner ble hypertrophied jeg n dorsal netthinnen 48 hpUV (K), vesentlig nedgang i dobbel membran kjerner var til stede på 48 HLT eller 48 hpUV (JK, NO, R). Betydelig nedgang i kjegle atomkjerner var tilstede i dorsal og ventral netthinnen UV 48 HLT (L, P, R). QR) Kvantifisering av stang fotoreseptoren og dobbel membran kjerner over 300 mikrometer i det sentrale dorsal eller ventral netthinnen. Signifikante forskjeller (p ≤ 0,05) mellom gruppene er avbildet som, "a" for forskjellig fra 0 hr, "b" for forskjellig fra 48 HLT og "c" for forskjellig fra 48 hpUV. Skalalinje i panel A er 200 mikrometer og gjelder for paneler AH. Klikk her for å se større bilde .

g7.jpg "width =" 500px "/>
Figur 7. Spredning respons i pigmentert sebrafisk etter ulike lys skade paradigmer. Retinal seksjoner fra voksen vill-type (AB) sebrafisk immunolabeled med PCNA å vise celleproliferasjon (rød) i dorsal (AD) og ventral (EH) halvdeler av netthinnen etter at hver av lyset skade paradigmer (48 HLT, 48 hpUV, og UV 48 HLT). AD) i dorsal netthinnen, var bare noen få enkeltrom stamceller til stede i INL på 48 HLT og 48 hpUV (B, C), mens kolonner stamceller som var til stede på UV 48 HLT (D). EH) I ventrale netthinnen, ble ingen endringer i spredning observert unntatt ved UV 48 HLT (H) inn, er søyler av stamceller var til stede. Skalalinje i panel A er 100 mikrometer og gjelder for paneler AH.7/51017fig7highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her viser vi at å kombinere en kort UV-eksponering med en kontinuerlig sterkt lys eksponering fører til utbredt fotoreseptoren tap og en robust regenerering respons. Sammenlignet med de enkelte LIRD metoder, er denne kombinerte metode også den mest effektive protokollen til å føre til skade både staver og tapper i begge halvdeler av netthinnen. Viktigere, er denne behandlingen effektiv i pigmenterte dyr samt albino dyr.

Selv om vi dokumentere at de samlede protokollen gir mer utbredt og konsistent skader sammenlignet med de enkelte LIRD metoder, bør vitenskapelige betraktninger diskuteres før du velger en LIRD paradigme. Våre data tyder på at den kombinerte metoden skal benyttes når hele retinal vev samles for analyse (dvs. proteomikk, real-time PCR). Vi har funnet at den kombinerte metode hadde størst lesjon størrelse, etterfulgt av halogen eksponering, og til slutt den UV-eksponering. Vi foreslårat den kombinerte metode også benyttes når undersøke et gen eller bane som kan bevirke differensielt stang og konus regenerering. Hvis dette ikke er mulig av praktiske grunner, våre data at UV-eksponering er den nest beste metoden for disse studiene, hvis analyse er begrenset til den sentrale dorsale netthinnen.

Praktiske hensyn er også garantert når du velger den riktige LIRD metoden. Den første bekymring er kostnaden for det nødvendige utstyr. Alle protokollene krever en lengre periode med mørke tilpasning (data ikke vist). Et selvstendig mørk kabinett som er bygget inn i sebrafisk bolig modulen er svært praktisk, men ikke nødvendig. Enda en pappeske kunne brukes, hvis behandling er tatt for å tape eller forsegle sømmene, og vann parametre overvåkes. Den halogen-baserte LIRD metoden er svært økonomisk og praktisk. Alle elementer kan kjøpes for under $ 100 US på en lokal jernvarehandel og sette opp tar bare noen få minutter. Than bare praktisk ulempe med denne metoden er ulempen med å jobbe i samme rom som lysbehandling. Lysene generere en god mengde varme når du kjører kontinuerlig i fire dager, og lysintensiteten er både forstyrrende og potensielt skadelig for menneskelig visjon. De UV-og kombinerte metoder krever en UV-kilde, som ikke er tilgjengelige for alle laboratorier. I tillegg bør det utvises stor forsiktighet for å sikre sikkerheten til lab medlemmer når du utfører en UV-behandling. Således, mens det er mer praktisk å ha halogen lys apparat i en isolert plass, sikkerhet bekymringer av UV-behandling nødvendiggjør en slik plass. Dette blir en ytterligere ulempe dersom UV kilden som brukes for den lette behandlingen er også typisk til et fluorescerende mikroskop som ligger i en "mikroskop rom" eller avbildning kjerne. Utføre flere runder med UV-behandlinger for kontroll og eksperimentelle grupper av dyr vil nødvendiggjøre nedleggelse mikroskopet rom for en extensive lang tid.

Kanskje den største fordel ved å bruke den kombinerte metode er muligheten til å utføre studier på retinal regenerering pigmenterte dyr. Vi viser at verken individuelle metoden gir betydelig tap av stenger og kjegler i dorsal og ventral netthinnen. I kontrast til de kombinerte LIRD paradigme resulterer i lignende nivåer av utstrakt stang og konus tap i begge pigmenterte og Albinodyr. Evnen til å anvende denne LIRD metode for å pigmenterte dyr sparer forskeren betydelig plass, tid, og per diem dyr omsorg kostnader (hvis noen), som det eliminerer behovet for å generere og vedlikeholde transgene linjer av interesse på albino bakgrunnen for netthinnens regenerering studier . Sammen føler vi at de vitenskapelige og praktiske fordeler oppveier mulige ulemper av denne forbedrede LIRD metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Xixia Luo for utmerket fisk dyrehold og teknisk støtte. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health tilskudd R21EY019401 (RT) og P30EY04068 (RT), og oppstart midler til RT, inkludert et ubegrenset tilskudd fra forskning for å hindre blindhet til Wayne State University, Department of Ophthalmology. JT ble støttet av en Thomas C. Rumble Fellowship levert av Wayne State University Graduate School.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV light source Leica EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm) Sigma-Aldrich/Pyrex CLS3160152BO
250 ml glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS1000250
4 L glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS10004L
Aluminum foil Fisher 01-213-105
250 W halogen lamps Workforce 265-669
1.8 L clear acrylic tanks Aquaneering ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids Aquaneering ZT180LCL
Fan Honeywell HT-900
Aerator Tetra 77853-900
Thermometer Cole-Parmer YO-08008-58
Bent forceps (5/45) World Precision Instruments 504155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J. Neurosci. 27, 7028-7040 (2007).
  2. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J. Neurosci. 26, 6303-6313 (2006).
  3. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  4. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  5. Thummel, R., et al. Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration. Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).
  6. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).
  7. Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish. Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).
  8. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
  9. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).
  10. Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev. Biol. 6, 36 (2006).
  11. Thummel, R., et al. Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration. Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).
  12. Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina. Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).
  13. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. J. Comp. Neurol. 518, 800-814 (2010).
  14. Morris, A. C., Scholz, T. L., Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetic dissection reveals two separate pathways for rod and cone regeneration in the teleost retina. Dev. Neurobiol. 68, 605-619 (2008).
  15. Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Muller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp. Eye Res. 28, 63-69 (1979).
  16. Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).
  17. Bringmann, A., Wiedemann, P. Muller glial cells in retinal disease. Ophthalmologica. 227, 1-19 (2012).
  18. Eisenfeld, A. J., Bunt-Milam, A. H., Sarthy, P. V. Muller cell expression of glial fibrillary acidic protein after genetic and experimental photoreceptor degeneration in the rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25, 1321-1328 (1984).
  19. Anderson, D. H., Guerin, C. J., Erickson, P. A., Stern, W. H., Fisher, S. K. Morphological recovery in the reattached retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 168-183 (1986).
  20. Bruce, A. E., Oates, A. C., Prince, V. E., Ho, R. K. Additional hox clusters in the zebrafish: divergent expression patterns belie equivalent activities of duplicate hoxB5 genes. Evol. Dev. 3, 127-144 (2001).
  21. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  22. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Muller cell outgrowth after retinal detachment: association with cone photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 1542-1545 (2000).
  23. Fischer, A. J., Bongini, R. Turning Muller glia into neural progenitors in the retina. Mol. Neurobiol. 42, 199-209 (2010).
  24. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends Mol. Med. 16, 193-202 (2010).
  25. Close, J. L., Liu, J., Gumuscu, B., Reh, T. A. Epidermal growth factor receptor expression regulates proliferation in the postnatal rat retina. Glia. 54, 94-104 (2006).
  26. Das, A. V., et al. Neural stem cell properties of Muller glia in the mammalian retina: regulation by Notch and Wnt signaling. Dev. Biol. 299, 283-302 (2006).
  27. Ikeda, T., Puro, D. G. Regulation of retinal glial cell proliferation by antiproliferative molecules. Exp. Eye Res. 60, 435-443 (1995).
  28. Liu, B., et al. Wnt signaling promotes muller cell proliferation and survival after injury. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, 444-453 (2013).
  29. Osakada, F., et al. Wnt signaling promotes regeneration in the retina of adult mammals. J. Neurosci. 27, 4210-4219 (2007).
  30. Wan, J., et al. Preferential regeneration of photoreceptor from Muller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. 48, 223-234 (2008).
  31. Wan, J., Zheng, H., Xiao, H. L., She, Z. J., Zhou, G. M. Sonic hedgehog promotes stem-cell potential of Muller glia in the mammalian retina. Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 347-354 (2007).
  32. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (1002).
  33. Chang, G. Q., Hao, Y., Wong, F. Apoptosis: final common pathway of photoreceptor death in rd, rds, and rhodopsin mutant mice. Neuron. 11, 595-605 (1993).
  34. Marc, R. E., et al. Extreme retinal remodeling triggered by light damage: implications for age related macular degeneration. Mol. Vis. 14, 782-806 (2008).
  35. Portera-Cailliau, C., Sung, C. H., Nathans, J., Adler, R. Apoptotic photoreceptor cell death in mouse models of retinitis pigmentosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 974-978 (1994).
  36. Noell, W. K., Walker, V. S., Kang, B. S., Berman, S. Retinal damage by light in rats. Invest. Ophthalmol. 5, 450-473 (1966).
  37. Wenzel, A., Grimm, C., Samardzija, M., Reme, C. E. Molecular mechanisms of light-induced photoreceptor apoptosis and neuroprotection for retinal degeneration. Prog. Retin. Eye Res. 24, 275-306 (2005).
  38. Cicerone, C. M. Cones survive rods in the light-damaged eye of the albino rat. Science. 194, 1183-1185 (1976).
  39. La Vail, M. M. Survival of some photoreceptor cells in albino rats following long-term exposure to continuous light. Invest. Ophthalmol. 15, 64-70 (1976).
  40. Thomas, J. L., Nelson, C. M., Luo, X., Hyde, D. R., Thummel, R. Characterization of multiple light damage paradigms reveals regional differences in photoreceptor loss. Exp. Eye Res. 97, 105-116 (2012).
  41. Qin, Z., et al. FGF signaling regulates rod photoreceptor cell maintenance and regeneration in zebrafish. Exp. Eye Res. 93, 726-734 (2011).
  42. Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).
  43. Morris, A. C., Schroeter, E. H., Bilotta, J., Wong, R. O., Fadool, J. M. Cone survival despite rod degeneration in XOPS-mCFP transgenic zebrafish. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 4762-4771 (2005).
  44. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Muller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  45. Powell, C., Elsaeidi, F., Goldman, D. Injury-dependent Muller glia and ganglion cell reprogramming during tissue regeneration requires Apobec2a and Apobec2b. J. Neurosci. 32, 1096-1109 (2012).
  46. Ramachandran, R., Reifler, A., Wan, J., Goldman, D. Application of Cre-loxP recombination for lineage tracing of adult zebrafish retinal stem cells. Methods Mol. Biol. 884, 129-140 (2012).
  47. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/Dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15858-15863 (2011).
  48. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Insm1a-mediated gene repression is essential for the formation and differentiation of Muller glia-derived progenitors in the injured retina. Nat. Cell Biol. 14, 1013-1023 (2012).
  49. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev. Cell. 22, 334-347 (2012).
  50. Morris, A. C., Forbes-Osborne, M. A., Pillai, L. S., Fadool, J. M. Microarray analysis of XOPS-mCFP zebrafish retina identifies genes associated with rod photoreceptor degeneration and regeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 2255-2266 (2011).
  51. Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J. Vis. Exp. (58), e3603 (2011).
A Novel Lett Skade Paradigm for bruk i Retinal Regeneration Studies in Adult sebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).More

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter