Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

A Novel Light Damage Paradigm til Anvendelse i Retinal Regeneration Studies i Adult zebrafisk

doi: 10.3791/51017 Published: October 24, 2013

Summary

Flere lys skader protokoller er blevet beskrevet til skade fotoreceptorer og dermed fremkalde en retinal regenerering respons hos voksne zebrafisk. Denne protokol beskriver en forbedret metode, der kan anvendes i pigmenterede dyr, og at skader størstedelen af ​​stang og kegle fotoreceptorer tværs af hele nethinden.

Abstract

Light-induceret retinal degeneration (LIRD) er almindeligt anvendt i både gnavere og zebrafisk for skader stang og kegle fotoreceptorer. Hos voksne zebrafisk, udløser fotoreceptordegenerering Müller gliaceller at genindtræde cellecyklus og producere forbigående-forstærkende stamceller. Disse forfædre fortsætter med at formere sig, når de trækker til det beskadigede område, hvor de i sidste ende giver anledning til nye fotoreceptorer. I øjeblikket er der to udbredte LIRD paradigmer, som hver resulterer i varierende grader af fotoreceptor tab og tilsvarende forskelle i regenerering reaktion. Som mere genetiske og farmakologiske værktøjer er tilgængelige til at teste betydningen af ​​enkelte gener af interesse under regenereringen, er der behov for at udvikle en robust LIRD paradigme. Her beskriver vi en LIRD protokol, der resulterer i udbredt og sammenhængende tab af både stang og kegle fotoreceptorer, hvor vi har kombineret brug af to tidligere anvendte LIRD teknikker. EndvidereKan denne protokol udvides til brug i pigmenterede dyr, hvilket eliminerer behovet for at opretholde transgene linier af interesse på albino baggrund for LIRD studier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Light-induceret retinal degeneration (LIRD) er almindeligt anvendt i både gnavere og zebrafisk for skader stang og kegle fotoreceptorer. Hos voksne zebrafisk, udløser fotoreceptordegenerering Müller gliaceller at genindtræde cellecyklus og producere forbigående-forstærkende stamceller. Disse forfædre fortsætter med at formere sig, når de trækker til det beskadigede område, hvor de i sidste ende giver anledning til nye fotoreceptorer. I øjeblikket er der to udbredte LIRD paradigmer, som hver resulterer i varierende grader af fotoreceptor tab og tilsvarende forskelle i regenerering reaktion. Som mere genetiske og farmakologiske værktøjer er tilgængelige til at teste betydningen af ​​enkelte gener af interesse under regenereringen, er der behov for at udvikle en robust LIRD paradigme. Her beskriver vi en LIRD protokol, der resulterer i udbredt og sammenhængende tab af både stang og kegle fotoreceptorer, hvor vi har kombineret brug af to tidligere anvendte LIRD teknikker. EndvidereKan denne protokol udvides til brug i pigmenterede dyr, hvilket eliminerer behovet for at opretholde transgene linier af interesse på albino baggrund for LIRD studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle procedurer er beskrevet i denne protokol blev godkendt af brug af dyr udvalget på Wayne State University School of Medicine.

1.. Mørk Tilpasning

  1. Transfer ~ 10 voksne albino eller pigmenteret fisk fra det normale staldsystem ind i et mørkt skab. Hvis den er tilgængelig, kan du bruge en mørk kabinet, der er bygget ind i zebrafisk bolig-modul, som giver mulighed for normal vandstrøm gennem tanken. (Hvis et sådant system ikke er tilgængelig, skal du placere akvarium i et helt mørkt kabinet, og sørg for at lufte fisk med ilt).
  2. Hold fisken i mørke i 10 dage. Ved fodring af dyrene eller tilføje nye fisk til den mørke boks, så sørg for at bevæge sig så hurtigt som muligt for at undgå at udsætte fisk til en lang periode med lys.

2.. UV-lys Eksponering

  1. Sørg for, at strømmen til UV-kilden er OFF. Fjern UV-lys glødetråd fra fluorescerende stereomikroskop.
    1. Brug en omvendt15 cm i diameter glas petriskål (eller noget af en lignende 2 cm højde) som en stand for UV glødetråd. Tape petriskålen til laboratoriet bænken.
    2. Tape UV-lyset glødetråd til toppen af ​​det omvendte petriskål. Arrangere således at ~ 2 mm fra enden af ​​filamentet udhæng petriskålen.
  2. Opnå en 250 ml glasbæger. Cover ½ af bunden, sider, og bagsiden af ​​bægeret med aluminiumsfolie, og sørg for "shiny" side af folien vender det indre af bægeret. Hvis bægeret er gradueret, dække formuleret halvdelen af ​​bægeret med folie, så den klare halvdelen af ​​den udsatte bægeret.
  3. Fyld 250 ml bægerglas med 100 ml vand fra fisken facilitet systemet.
  4. Anbring 250 ml bægerglas i en 4 L bægerglas. Fyld 4 liters bægerglas med vand, indtil vandniveauet er selv med 100 ml vand linje i 250 ml bægerglas.
  5. Tilføj maksimalt 10 dark-behandlede dyr til 250 ml bægerglas. Dæk 250 ml bægerglas med en lille stykke aluminiumfolie.
  6. Placere hele bægeret apparatet umiddelbart støder op til UV glødetråd. Glødetråden skal berøre ydersiden af ​​4 L bægerglas, og vender den blotlagte del af 250 ml bægerglas. Sørg for at 250 ml bægerglas er centreret i bunden af ​​4 L bægerglas.
  7. Placer en stor, uigennemsigtig skærm bag 4L bæger, der giver mulighed for dyrene at blive udsat, men forhindre enhver lab personel fra at se spidsen af ​​UV glødetråd. ADVARSEL: Sørg denne barriere er på plads, INDEN du tænder for strømmen til UV-kilden.
  8. Tænd UV strømkilde. Indstil timeren til 30 min. Placer uanset nødvendige advarselsmærker at sikre, at intetanende lab personale ikke ved et uheld udsætter sig for UV-stråling.
  9. Efter 30 minutter, slukke UV strømkilde. Fjern 250 ml bægerglas med fisk. BEMÆRK: hvis flere runder af UV-eksponering er påkrævet, lad strømkilde køle ned (~ 20 min), før du gentager eksponeringen protokollen. Sørg for at udskifte than 100 ml vand med frisk system, vand for hver eksponering. Vandet i 4 liters bægerglas behøver ikke at blive udskiftet.

3.. Halogen lampe lys Eksponering

  1. Overfør fisk fra 250 ml bægerglas i en 1,8 L klar akryl akvarium. Fyld tanken til overflow-mærket.
  2. Opsæt halogenlampe lysbehandling område. Opnå fire 250 W halogenlamper nytte lamper fra en lokal isenkræmmer. Facing to lamper i samme retning, arrangere 29 cm fra hinanden på midten. Arrangere de andre to lygter på en lignende måde.
    1. Placer det andet sæt af lamper, så de står over for det første sæt af lamper, der forlader ~ 73 cm i mellem de to sæt af lamper. Dette skaber et rektangel-formet lys behandling areal på 29 x 73 cm.
  3. Anskaf en lille ventilator fra en lokal isenkræmmer. Placer blæseren lige langt mellem de to sæt af lamper, lige uden for lyset behandlingsområdet.
  4. Placere to 1.8 L tanke fulde af vand i midten aflysbehandling område, lige langt mellem de to sæt lamper. Afstanden mellem lamper og ydervæggen af ​​tanken skal være ~ 29 cm. Bemærk: selv om det kun behandle 10 fisk i en 1,8 L tank, bruge denne ordning. Begge tanke er nødvendig for at holde vandets temperatur på hver tank inden for det passende område.
  5. Placer en ilt perlator i hver tank.
  6. Dæk hver tank med klar akryl låg, efterlader en ~ 2 cm hul i enden nærmest ventilatoren. Arrangere ventilatoren så det vil blæse luft ind i dette hul. Placer et termometer i en eller begge af tankene.
  7. Tænd for strømmen til lys, luft og beluftere. Bevar lys behandling i op til 4 dage. Fiskene skal ikke fodres i lyset behandling, da dette vil påvirke vandkvaliteten og resultere i mere stress for dyrene.
  8. Overvåg temperatur og vandstand på daglig basis. Temperaturen holdes på 30-33 ° C. Hvis det er nødvendigt, justeres blæserhastigheden og / eller afstanden mellem tankene og lights.
    1. Top off hver tank med systemet vand efter behov, normalt dagligt.
    2. Brug altid sund voksen zebrafisk (typisk 6-9 måneder) for at opretholde en overlevelse på næsten 100%. Men hvis en fisk bliver fundet død i tanken, fjerne det straks og erstatte vandet i hele tanken.

4.. Tissue Collection

  1. 48 timer efter starten af ​​halogen lysbehandling fjerne fisk fra behandlingsområdet.
    1. Forbered frisk ethanolisk formaldehyd fiksativ (1 del 37% formaldehyd, 9 dele 100% ethanol).
    2. Aflive zebrafisk med en bedøvende overdosis af 2-phenoxyethanol (0,4 mg / l).
    3. Overfør aflives zebrafisk til et stykke køkkenrulle. Enucleate øjet med buet pincet.
    4. Placer kerneløs øjne i fiksativ og opbevar O / N ved 4 ° C.
  2. Cryoprotect øjnene.
    1. Vaske øjnene i 5% saccharose 1x PBS i 30 minutter ved stuetemperatur, og derefter erstatte medfriske 5% sucrose 1x PBS i 2 timer. Dernæst vaskes øjnene i 30% sucrose 1x PBS O / N ved 4 ° C. Vaske øjnene i et 1:1 (ens portioner) af væv frysemedium og 30% saccharose 1x PBS O / N ved 4 ° C.
  3. Integrer øjnene i 100% vævet frysemedium og opbevares ved -80 ° C. Orientere øjne, så cryosectioning af vævet udføres på den dorsale / ventrale akse.
  4. Kryosektion vævet og sted på objektglas. Varm slides i 2 timer ved 55 ° C. Opbevar slides ved -80 ° C eller umiddelbart udføre standard immunhistokemi.
  5. Udfør standard immunhistokemi på sektioneret væv og image med fluorescerende mikroskopi 40,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den hidtil beskrevne lysbehandling protokol blev sammenlignet med hver enkelt metode LIRD. I mørke behandlede voksne albinodyr (figurerne 3-5), resulterede de enkelte lys behandlinger i betydeligt tab af stangen (figur 3) og kegle (Figur 4) fotoreceptorer. Men begge individuelle behandlinger primært beskadigede fotoreceptorer i den dorsale halvdel af nethinden, forlader ventrale nethinden relativt beskyttet mod lys behandlinger (figur 3 og 4). Desuden, sammenlignet med halogen lysbehandling UV lys behandling beskadiget flere kegle fotoreceptorer i den dorsale halvdel af nethinden (sammenlign figur 4B med C). Kombinere UV og halogen lys behandlinger resulterede i signifikant større tab til både stang og kegle fotoreceptorer hele nethinden, hovedsagelig fjerne neuroprotection af den ventrale halvdel af nethinden (figur 3 og 4). Sammenlignet med de individuelle LIRD metoder, blev en tilsvarende stigning i proliferation også observeret i den ventrale nethinden, når den kombinerede lysbehandling protokol blev anvendt (Figur 5).

Pigmenterede dyr er mere modstandsdygtige over for LIRD grundet retinal pigmenteret epitel, som absorberer lys og beskytter fotoreceptorer fra fototoksicitet. Som forventet mørke-tilpassede pigmenterede dyr var næsten fuldstændig modstår halogen lys behandling alene (figur 6B, J og N). Vi fandt, at 48 timer efter påbegyndelse af lys, blev stang fotoreceptorer reduceret i den dorsale nethinden, men ikke ventrale nethinden (figur 6E, F og Q). Kegle fotoreceptor kerner var til stede i normale tal (figur 6R). Sammenlignet med ubehandlede nethinder, halogenlysbehandling alene heller ikke øge Müller glia celleproliferation 48 timer efter påbegyndelse af lys (figur 7B og F). I albino dyr resulterede UV-lys behandling alene i lidt større skader både stang og kegle fotoreceptorer i den dorsale nethinden (figur 3I og 4I). Men i pigmenterede dyr, havde UV-lys behandling alene ikke væsentligt reducere stang eller kegle celletal (figur 6C, G, K, O, Q og R). Endvidere er det kun UV-behandling alene fremkaldte en svag regenerativ reaktion i den dorsale halvdel af nethinden i pigmenterede dyr (figur 7C). I modsætning til de enkelte LIRD resultater resulterede kombinere UV og halogen lys behandlinger i signifikant større fotoreceptor skader og regenerativ respons i pigmenterede dyr. Vigtigt er det, var betydeligt tab af både stave og tappe observeret i både Dorsa l og ventrale nethinder (figur 6D, H, L, P, Q og R). Sammenlignet med ubehandlede og individuel LIRD metoder, blev en tilsvarende stigning i proliferation også observeret i både dorsale og ventrale halvdele af nethinden, når den kombinerede lysbehandling protokol blev anvendt (Figur 5).

Figur 1
Figur 1. Foto skildrer halogenlys behandling setup. To sæt af fire 250 W halogenlamper blev fordelt 29 cm på hver side af to klare 1,8 L akryl tanke. Perlator og slange var placeret, så de ikke spærrer for lyset. Lågene tankene blev krakket 2 cm for at tillade luftstrøm fra blæseren. Et termometer blev anbragt i en af ​​tankene for at temperaturen kan overvåges.Arget = "_blank"> Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2. Foto skildrer UV-lys behandling setup. Den UV-lyskilde fra en fluorescerende stereomikroskop var forsvarligt fastgjort til et glas petriskål ~ 2 cm fra bænken toppen. En 250 ml bægerglas, delvist indpakket i folie, blev fyldt vilje 100 ml systemets vand. Fiskene blev placeret inde i 250 ml bægerglas. 250 ml bægerglas blev centreret inde i en 4 liters bægerglas, der var fyldt med systemet vand til niveauet af vandet i 250 ml bægerglas. Den 4 liters bægerglas blev placeret ved siden af ​​lys glødetråd centreret ved 250 ml bægerglas. En stor uigennemsigtig skjold blev placeret rundt i hele opsætningen. Klik her for at se større billede .


Figur 3. Rod fotoreceptorer tab albino zebrafisk efter forskellige lys skader paradigmer Retinale sektioner fra voksne Tg (NRD: EGFP). / ALB immunolabeled med GFP at vise stangen fotoreceptorer densitet (grøn) i den dorsale (AD) og ventrale (EH) halverer af nethinden . A, E) Forud for lys debut (0 timer), EGFP-positive stang fotoreceptorer kerner (ONL) og ydre segmenter (ROS) kan visualiseres. B, F) Efter 48 timer efter halogenlys debut (HLT), afkortet ROS og væsentligt færre stang kerner (I) var til stede i den dorsale, men ikke ventrale nethinden. CG) ved 48 timer efter 30 min af UV-eksponering (hpUV), signifikant færre stang kerner var til stede i de dorsale og ventrale nethinder sammenlignet med 0 timer (C, G < / Strong>), men ikke 48 HLT behandlinger (G, I). DH) 48 HR efter indtræden af kombineret lys behandling (30 minutters UV-eksponering efterfulgt af halogen behandling, UV +48 HLT), næsten ingen ROS var til stede i dorsale eller ventrale nethinder, i tillæg til et betydeligt tab af stang fotoreceptor kerner (I) . Jeg) Kvantificering af stangen fotoreceptor kerner tværs 300 um i det centrale dorsale eller ventrale nethinden. Signifikante forskelle (p ≤ 0,05) mellem grupperne er afbildet som: "a" for forskellig fra 0 hr, "b" for forskellig fra 48 HLT og "c" for forskellig fra 48 hpUV. Målestokken i panel A repræsenterer 50 um og gælder for paneler AH. Klik her for at se større billede .

iles/ftp_upload/51017/51017fig4.jpg "width =" 500px "/>
Figur 4.. Dobbelt kegle tab albino zebrafisk efter forskellige lys skader paradigmer. Retinale sektioner fra voksen albino zebrafisk immunolabeled med ZPR-1 for at vise to membraner (guld) i den dorsale (AD) og ventrale (EH) halvdele af nethinden efter hver af lyset skader paradigmer (48 HLT, 48 hpUV og UV +48 HLT). A, E) ved 0 hr, dobbelt kegle kerner var til stede i ryg og ventral nethinder. B, F) ved 48 HLT, signifikant færre dobbelt kogler var til stede i ventral nethinden kun (F, I). CG) Ved 48 hpUV, signifikant færre to membraner (I) og en stor mængde affald var til stede i den dorsale nethinden kun (C), mens ingen ændringer blev observeret i den ventrale nethinden (G). DH) På UV +48 HLT, betydeligt færre dobbeltkegles (I) og meget lidt snavs var til stede i dorsale og ventrale nethinder. I) Kvantificering af to membraner tværs 300 um i det centrale dorsale eller ventrale nethinden. Signifikante forskelle (p ≤ 0,05) mellem grupperne er afbildet som "a" for forskellig fra 0 hr, "b" for forskellig fra 48 HLT og "c" for forskellig fra 48 hpUV. Målestokken i panel A repræsenterer 100 um og gælder for paneler AH. Klik her for at se større billede .

Figur 5
Figur 5. Ændringer er spredning respons efter forskellige lys skader paradigmer. Retinale sektioner fra voksen albino zebrafisk immunolabeled med PCNA at vise celledeling (rød) idorsale (AD) og ventrale (EH) halverer af nethinden efter hver af de lette skader paradigmer (48 HLT, 48 hpUV, og UV +48 HLT). AE) Ved 0 timer, spredning var fraværende fra det indre nukleare lag ( INL). B, F) ved 48 HLT, var enlige stamceller til stede i INL tværs af dorsale nethinden og i en lille del af den ventrale nethinden. CG) Efter 48 hpUV, kolonner af progenitorceller var til stede i den dorsale nethinden, mens kun enkelt progenitorceller var til stede i en lille del af den ventrale nethinden. D, H) På UV +48 HLT, store søjler af progenitorceller var til stede på tværs af dorsale og ventrale nethinden. Målestokken i panel A repræsenterer 100 um og gælder for paneler AH. Klik her for at se større billede .


Figur 6.. Rod og kegle fotoreceptorer tab pigmenteret zebrafisk efter forskellige lys skader paradigmer Retinale sektioner fra voksne vildtype (AB) zebrafisk farvet med TO-PRO-3 for at vise alle kerner (AP, blå). Og immunolabeled med ZPR-3 for at vise stang ydre segmenter (AH, magenta) eller ZPR-1 til dobbelt kegler (IP, guld) i den dorsale (AD, IJ), og ventral (EH, MP) halvdele af nethinden efter hver af de lette skader paradigmer (48 HLT, 48 hpUV, og UV +48 HLT). AH) signifikante fald i stang fotoreceptor kerner var til stede i den dorsale nethinden ved 48 HLT (B, Q) og i den dorsale og ventrale nethinden UV +48 HLT (D, H, Q) . IP) Selv kegle kerner blev hypertrophied i n ryggens nethinden 48 hpUV (K), ingen signifikante fald i dobbeltkonisk kerner var til stede ved 48 HLT eller 48 hpUV (JK, NO, R). Signifikante fald i kegle kerner var til stede i den dorsale og ventrale nethinden UV +48 HLT (L, P, R). QR) Kvantificering af stangen fotoreceptor og dobbelt kegle kerner tværs 300 um i det centrale dorsale eller ventrale nethinden. Signifikante forskelle (p ≤ 0,05) mellem grupperne er afbildet som "a" for forskellig fra 0 hr, "b" for forskellig fra 48 HLT og "c" for forskellig fra 48 hpUV. Målestokken i panel A repræsenterer 200 um og gælder for paneler AH. Klik her for at se større billede .

g7.jpg "width =" 500px "/>
Figur 7. Proliferation respons i pigmenterede zebrafisk efter forskellige lys skader paradigmer. Retinale sektioner fra voksne vildtype (AB) zebrafisk immunolabeled med PCNA at vise celledeling (rød) i den dorsale (AD) og ventrale (EH) halverer af nethinden efter hver af de lette skader paradigmer (48 HLT, 48 hpUV og UV +48 HLT). ad) for dorsale nethinden, kun nogle få enkelt stamceller var til stede i INL ved 48 HLT og 48 hpUV (B, C), mens kolonner af progenitorceller var til stede ved UV +48 HLT (D). EH) I den ventrale nethinden, ingen ændringer i proliferation observeret bortset fra UV +48 HLT (H), på hvilket tidspunkt kolonner af progenitorceller var til stede. Målestokken i panel A repræsenterer 100 um og gælder for paneler AH.7/51017fig7highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her viser vi, at kombinere en kort UV-eksponering med en kontinuerlig Kraftigt lys resulterer i udbredt fotoreceptor tab og en robust regenerering svar. Sammenlignet med de individuelle LIRD metoder, er dette kombineret metode også den mest effektive protokol til skade både stave og tappe i begge halvdele af nethinden. Vigtigere er det, denne behandling er effektiv i pigmenterede dyr samt albino dyr.

Selvom vi dokumentation for, at de kombinerede protokoller resulterer i mere udbredt og sammenhængende skader sammenlignet med de enkelte LIRD metoder, bør videnskabelige overvejelser drøftes inden du vælger en LIRD paradigme. Vores data tyder på, at den kombinerede metode bør udnyttes, når hele retinavæv indsamles til analyse (dvs. proteomics, real-time PCR). Vi fandt, at den kombinerede metode havde den største læsion størrelse, efterfulgt af halogen eksponering, og endelig UV eksponering. Vi foreslårat den kombinerede metode også bruges, når de efterforsker et gen eller sti, der kunne differentielt påvirke stang og kegle regenerering. Hvis dette ikke er muligt af praktiske grunde vore data tyder på, at UV-eksponering er den næstbedste metode til disse undersøgelser, hvis analysen er begrænset til den centrale dorsale nethinden.

Praktiske overvejelser er også berettiget, når du vælger den rette LIRD metode. Den første bekymring er udgifterne til det nødvendige udstyr. Samtlige protokoller kræver en langvarig periode med mørke tilpasning (data ikke vist). En selvstændig mørk kabinet, der er bygget ind i zebrafisk boliger modulet er yderst bekvemt, men ikke nødvendigt. Selv en papkasse kunne anvendes, hvis omhu for at tape eller forsegle sømmene, og vand parametre overvåges. Halogen-baserede LIRD metoden er yderst økonomisk og praktisk. Alle elementer kan købes for under $ 100 US på en lokal isenkræmmer og oprette tager kun et par minutter. Than kun praktisk ulempe ved denne metode er besværet med at arbejde i samme rum som lysbehandling. Lyset generere en god mængde varme, når de kører uafbrudt i 4 dage og lysintensiteten er både distraherende og potentielt skadelige for menneskers syn. UV og kombineret metoder kræver en UV-kilde, som ikke er tilgængelig for alle laboratorier. Desuden bør man være meget omhyggelig for at sikre sikkerheden for lab medlemmer ved udførelse af en UV-lys behandling. Således, mens det er mere praktisk at have halogenlampe apparat i et isoleret rum, de sikkerhedsmæssige bekymringer UV behandling kræver et sådant rum. Dette bliver en yderligere ulempe, hvis UV-kilden, der anvendes til lysbehandling også anvendes typisk til et fluorescensmikroskop huse i et "mikroskop rum" eller billedbehandling kerne. Udførelse af flere runder af UV behandlinger for kontrol og eksperimentelle grupper af dyr ville nødvendiggøre at lukke mikroskop plads til en extensive tidsrum.

Måske den største fordel ved at bruge kombineret metode er evnen til at udføre retinale regenerering undersøgelser på pigmenterede dyr. Vi viser, at hverken individuelle metode resulterer i betydelige tab af stave og tappe i den dorsale og ventrale nethinden. I modsætning. De kombinerede LIRD paradigme resulterer i tilsvarende niveauer af udbredt stang og kegle tab både pigmenterede og albino dyr Evnen til at anvende denne LIRD metode til at pigmenterede dyr gemmer forskeren betydelig plads, tid og dagpenge dyrepleje omkostninger (hvis nogen), da det eliminerer behovet for at generere og vedligeholde transgene linier af interesse på albino baggrund for retinale regenerering undersøgelser . Sammen føler vi, at de videnskabelige og praktiske fordele opvejer de mulige gener af denne forbedrede LIRD metode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Xixia Luo for fremragende fisk dyrehold og teknisk support. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health tilskud R21EY019401 (RT) og P30EY04068 (RT), og opstart midler til RT, herunder en ubegrænset bevilling fra forskning til at forebygge blindhed til Wayne State University, Department of Ophthalmology. JT blev understøttet af en Thomas C. Rumble Fellowship leveres af Wayne State University Graduate School.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV light source Leica EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm) Sigma-Aldrich/Pyrex CLS3160152BO
250 ml glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS1000250
4 L glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS10004L
Aluminum foil Fisher 01-213-105
250 W halogen lamps Workforce 265-669
1.8 L clear acrylic tanks Aquaneering ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids Aquaneering ZT180LCL
Fan Honeywell HT-900
Aerator Tetra 77853-900
Thermometer Cole-Parmer YO-08008-58
Bent forceps (5/45) World Precision Instruments 504155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J. Neurosci. 27, 7028-7040 (2007).
  2. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J. Neurosci. 26, 6303-6313 (2006).
  3. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  4. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  5. Thummel, R., et al. Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration. Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).
  6. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).
  7. Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish. Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).
  8. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
  9. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).
  10. Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev. Biol. 6, 36 (2006).
  11. Thummel, R., et al. Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration. Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).
  12. Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina. Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).
  13. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. J. Comp. Neurol. 518, 800-814 (2010).
  14. Morris, A. C., Scholz, T. L., Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetic dissection reveals two separate pathways for rod and cone regeneration in the teleost retina. Dev. Neurobiol. 68, 605-619 (2008).
  15. Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Muller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp. Eye Res. 28, 63-69 (1979).
  16. Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).
  17. Bringmann, A., Wiedemann, P. Muller glial cells in retinal disease. Ophthalmologica. 227, 1-19 (2012).
  18. Eisenfeld, A. J., Bunt-Milam, A. H., Sarthy, P. V. Muller cell expression of glial fibrillary acidic protein after genetic and experimental photoreceptor degeneration in the rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25, 1321-1328 (1984).
  19. Anderson, D. H., Guerin, C. J., Erickson, P. A., Stern, W. H., Fisher, S. K. Morphological recovery in the reattached retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 168-183 (1986).
  20. Bruce, A. E., Oates, A. C., Prince, V. E., Ho, R. K. Additional hox clusters in the zebrafish: divergent expression patterns belie equivalent activities of duplicate hoxB5 genes. Evol. Dev. 3, 127-144 (2001).
  21. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  22. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Muller cell outgrowth after retinal detachment: association with cone photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 1542-1545 (2000).
  23. Fischer, A. J., Bongini, R. Turning Muller glia into neural progenitors in the retina. Mol. Neurobiol. 42, 199-209 (2010).
  24. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends Mol. Med. 16, 193-202 (2010).
  25. Close, J. L., Liu, J., Gumuscu, B., Reh, T. A. Epidermal growth factor receptor expression regulates proliferation in the postnatal rat retina. Glia. 54, 94-104 (2006).
  26. Das, A. V., et al. Neural stem cell properties of Muller glia in the mammalian retina: regulation by Notch and Wnt signaling. Dev. Biol. 299, 283-302 (2006).
  27. Ikeda, T., Puro, D. G. Regulation of retinal glial cell proliferation by antiproliferative molecules. Exp. Eye Res. 60, 435-443 (1995).
  28. Liu, B., et al. Wnt signaling promotes muller cell proliferation and survival after injury. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, 444-453 (2013).
  29. Osakada, F., et al. Wnt signaling promotes regeneration in the retina of adult mammals. J. Neurosci. 27, 4210-4219 (2007).
  30. Wan, J., et al. Preferential regeneration of photoreceptor from Muller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. 48, 223-234 (2008).
  31. Wan, J., Zheng, H., Xiao, H. L., She, Z. J., Zhou, G. M. Sonic hedgehog promotes stem-cell potential of Muller glia in the mammalian retina. Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 347-354 (2007).
  32. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (1002).
  33. Chang, G. Q., Hao, Y., Wong, F. Apoptosis: final common pathway of photoreceptor death in rd, rds, and rhodopsin mutant mice. Neuron. 11, 595-605 (1993).
  34. Marc, R. E., et al. Extreme retinal remodeling triggered by light damage: implications for age related macular degeneration. Mol. Vis. 14, 782-806 (2008).
  35. Portera-Cailliau, C., Sung, C. H., Nathans, J., Adler, R. Apoptotic photoreceptor cell death in mouse models of retinitis pigmentosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 974-978 (1994).
  36. Noell, W. K., Walker, V. S., Kang, B. S., Berman, S. Retinal damage by light in rats. Invest. Ophthalmol. 5, 450-473 (1966).
  37. Wenzel, A., Grimm, C., Samardzija, M., Reme, C. E. Molecular mechanisms of light-induced photoreceptor apoptosis and neuroprotection for retinal degeneration. Prog. Retin. Eye Res. 24, 275-306 (2005).
  38. Cicerone, C. M. Cones survive rods in the light-damaged eye of the albino rat. Science. 194, 1183-1185 (1976).
  39. La Vail, M. M. Survival of some photoreceptor cells in albino rats following long-term exposure to continuous light. Invest. Ophthalmol. 15, 64-70 (1976).
  40. Thomas, J. L., Nelson, C. M., Luo, X., Hyde, D. R., Thummel, R. Characterization of multiple light damage paradigms reveals regional differences in photoreceptor loss. Exp. Eye Res. 97, 105-116 (2012).
  41. Qin, Z., et al. FGF signaling regulates rod photoreceptor cell maintenance and regeneration in zebrafish. Exp. Eye Res. 93, 726-734 (2011).
  42. Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).
  43. Morris, A. C., Schroeter, E. H., Bilotta, J., Wong, R. O., Fadool, J. M. Cone survival despite rod degeneration in XOPS-mCFP transgenic zebrafish. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 4762-4771 (2005).
  44. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Muller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  45. Powell, C., Elsaeidi, F., Goldman, D. Injury-dependent Muller glia and ganglion cell reprogramming during tissue regeneration requires Apobec2a and Apobec2b. J. Neurosci. 32, 1096-1109 (2012).
  46. Ramachandran, R., Reifler, A., Wan, J., Goldman, D. Application of Cre-loxP recombination for lineage tracing of adult zebrafish retinal stem cells. Methods Mol. Biol. 884, 129-140 (2012).
  47. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/Dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15858-15863 (2011).
  48. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Insm1a-mediated gene repression is essential for the formation and differentiation of Muller glia-derived progenitors in the injured retina. Nat. Cell Biol. 14, 1013-1023 (2012).
  49. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev. Cell. 22, 334-347 (2012).
  50. Morris, A. C., Forbes-Osborne, M. A., Pillai, L. S., Fadool, J. M. Microarray analysis of XOPS-mCFP zebrafish retina identifies genes associated with rod photoreceptor degeneration and regeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 2255-2266 (2011).
  51. Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J. Vis. Exp. (58), e3603 (2011).
A Novel Light Damage Paradigm til Anvendelse i Retinal Regeneration Studies i Adult zebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).More

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter