Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

A Novel Lichte Schade Paradigm voor gebruik in retinale Regeneration Studies in Adult zebravis

doi: 10.3791/51017 Published: October 24, 2013

Summary

Meerdere lichte schade protocollen zijn beschreven schade fotoreceptoren en dientengevolge een netvlies regeneratie respons bij volwassen zebravissen induceren. Dit protocol beschrijft een verbeterde werkwijze die kan worden gebruikt in gepigmenteerde dieren en beschadigt de meeste staafjes en kegeltjes fotoreceptoren over de gehele retina.

Abstract

Licht-geïnduceerde retinale degeneratie (LIRD) wordt gebruikt op zowel knaagdieren en zebravis schade staafjes en kegeltjes fotoreceptoren. Bij volwassen zebravissen, fotoreceptor degeneratie triggers Müller gliacellen opnieuw in te voeren de celcyclus en produceren voorbijgaande versterkende voorlopers. Deze voorlopers blijven prolifereren als ze migreren naar het beschadigde gebied, waar zij uiteindelijk tot nieuwe fotoreceptoren. Momenteel zijn er twee algemeen gebruikte LIRD paradigma's, die elk resulteert in verschillende graden van fotoreceptor verlies en overeenkomstige verschillen in de regeneratie reactie. Naarmate meer genetische en farmacologische hulpmiddelen zijn beschikbaar om de rol van individuele genen van belang tijdens de regeneratie testen, is er behoefte aan een robuuste LIRD paradigma ontwikkelen. Hier een LIRD protocol beschrijven we dat resulteert in wijdverspreide en consistente verlies van zowel de staafjes en kegeltjes fotoreceptoren waarin we het gebruik van twee eerder vastgestelde LIRD technieken gecombineerd. BovendienDit protocol kan worden uitgebreid voor gebruik in gepigmenteerde dieren, die de noodzaak om transgene lijnen van rente te handhaven op de albino achtergrond voor LIRD studies elimineert.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Licht-geïnduceerde retinale degeneratie (LIRD) wordt gebruikt op zowel knaagdieren en zebravis schade staafjes en kegeltjes fotoreceptoren. Bij volwassen zebravissen, fotoreceptor degeneratie triggers Müller gliacellen opnieuw in te voeren de celcyclus en produceren voorbijgaande versterkende voorlopers. Deze voorlopers blijven prolifereren als ze migreren naar het beschadigde gebied, waar zij uiteindelijk tot nieuwe fotoreceptoren. Momenteel zijn er twee algemeen gebruikte LIRD paradigma's, die elk resulteert in verschillende graden van fotoreceptor verlies en overeenkomstige verschillen in de regeneratie reactie. Naarmate meer genetische en farmacologische hulpmiddelen zijn beschikbaar om de rol van individuele genen van belang tijdens de regeneratie testen, is er behoefte aan een robuuste LIRD paradigma ontwikkelen. Hier een LIRD protocol beschrijven we dat resulteert in wijdverspreide en consistente verlies van zowel de staafjes en kegeltjes fotoreceptoren waarin we het gebruik van twee eerder vastgestelde LIRD technieken gecombineerd. BovendienDit protocol kan worden uitgebreid voor gebruik in gepigmenteerde dieren, die de noodzaak om transgene lijnen van rente te handhaven op de albino achtergrond voor LIRD studies elimineert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle in dit protocol beschreven procedures werden goedgekeurd door de commissie gebruik van dieren aan de Wayne State University School of Medicine.

1. Dark Aanpassing

  1. Transfer ~ 10 volwassen albino of gepigmenteerde vissen uit de normale huisvestingssysteem in een donkere kast. Indien beschikbaar, gebruik dan een donkere behuizing die is ingebouwd in de zebravis behuizing module, die het mogelijk maakt voor de normale waterstroom door de tank. (Indien een dergelijk systeem niet beschikbaar is, plaatst u het aquarium in een volledig donkere ruimte, en zorg ervoor dat de vis beluchten met zuurstof).
  2. Houd de vis in het donker gedurende 10 dagen. Bij het voeren van de dieren of het toevoegen van nieuwe vis aan de donkere doos, zorg ervoor om zo snel mogelijk te verplaatsen om te voorkomen dat het blootstellen van de vis aan een lange periode van licht.

2. UV Light Exposure

  1. Zorg ervoor dat de stroom naar de UV-bron is UIT. Verwijder het UV-licht gloeidraad van tl stereomicroscoop.
    1. Gebruik een omgekeerde15 cm diameter glazen petrischaal (of iets van een soortgelijke 2 cm hoogte) als een standaard voor de UV-filament. Tape de petrischaal naar het lab bank.
    2. Tape het UV-licht gloeidraad naar de top van de omgekeerde petrischaal. Regelen zodat ~ 2 mm van het uiteinde van het filament hangt de petrischaal.
  2. Verkrijgen van een ml bekerglas 250. Bedek ½ van de bodem, zijkanten en achterkant van het bekerglas met aluminiumfolie en zorg ervoor dat de "glanzende" kant van de folie wordt geconfronteerd met de binnenkant van de beker. Als de beker is afgestudeerd, hebben betrekking op de geformuleerde helft van het bekerglas met folie, waardoor het heldere helft van de beker blootgesteld.
  3. Vul het bekerglas van 250 ml met 100 ml water uit de vis faciliteit systeem.
  4. Plaats het bekerglas van 250 ml in een 4 L beker. Vul de 4 L bekerglas met water totdat het waterpeil is zelfs met de 100 ml water lijn in het bekerglas van 250 ml.
  5. Voeg maximaal 10 dark-behandelde dieren het bekerglas van 250 ml. Dek het bekerglas van 250 ml met een klein stukje aluminiumfolie.
  6. Plaats het bekerglas gehele inrichting direct naast de UV filament. De filament dient de buitenzijde van de beker 4 L raken en tegenover de blootgestelde gedeelte van het bekerglas 250 ml. Zorg ervoor dat het bekerglas 250 ml is gecentreerd op de bodem van de 4 L beker.
  7. Plaats een groot, ondoorzichtig scherm achter de 4L beker, waardoor de dieren worden blootgesteld, maar voorkomen dat laboratoriumpersoneel zien van het uiteinde van de UV filament. WAARSCHUWING: zorg ervoor dat deze barrière is op zijn plaats VOORDAT u de stroom naar de UV-bron.
  8. Schakel de UV-krachtbron. Stel timer voor 30 minuten. Plaatsen wat nodig waarschuwingslabels om ervoor te zorgen dat nietsvermoedende laboratoriumpersoneel niet per ongeluk zichzelf bloot aan UV-straling.
  9. Na 30 minuten, schakel de UV stroombron. Verwijder het bekerglas van 250 met de vis. OPMERKING: als er meerdere rondes van UV-blootstelling vereist zijn, laat de krachtbron afkoelen (~ 20 min) voordat men het protocol belichting. Zorg ervoor te vervangen thij 100 ml water met verse systeem water voor elke opname. Het water in de beker 4 L niet te worden vervangen.

3. Halogeen Lamp Light Exposure

  1. Breng de vis van 250 ml bekerglas in een 1,8 L helder acryl aquarium. Vul de tank op de overloop merk.
  2. Opzetten van de halogeen lamp licht te behandelen gebied. Krijgen vier 250 W halogeen lampen nut van een plaatselijke bouwmarkt. Geconfronteerd met twee lampen in dezelfde richting, regelen 29 cm van elkaar op centrum. Leg de overige twee lampen in een soortgelijke manier.
    1. Plaats de tweede set lampen, zodat zij worden geconfronteerd met de eerste set lampen, waardoor ~ 73 cm tussen de twee sets van de lampen. Dit creëert een rechthoek-vormige lichtbehandeling oppervlakte van 29 x 73 cm.
  3. Verkrijgen van een kleine ventilator van een plaatselijke bouwmarkt. Plaats de ventilator op gelijke afstand tussen de twee sets van lampen, net buiten het licht te behandelen gebied.
  4. Plaats twee 1,8 L tanks vol met water in het midden van delicht te behandelen gebied, op gelijke afstand tussen de twee sets van lampen. De afstand tussen de lampen en de buitenwand van de tank moet ~ 29 cm. Opmerking: zelfs als slechts de behandeling van 10 vissen in een 1,8 L tank, gebruik maken van deze regeling. Beide tanks nodig zijn watertemperatuur van elke tank binnen de juiste grenzen te houden.
  5. Plaats een zuurstof beluchter in elke tank.
  6. Bedek elke tank met helder acryl deksels, waardoor een ~ 2 cm afstand op het einde het dichtst bij de ventilator. Schik de ventilator, zodat het zal de lucht blazen in deze kloof. Plaats een thermometer in een van de tanks of beide.
  7. Schakel de stroom naar de verlichting, ventilator, en beluchters. Onderhouden lichte behandeling voor maximaal 4 dagen. De vis mag niet worden gevoerd tijdens de lichtbehandeling, omdat dit van invloed op de waterkwaliteit en resulteren in meer stress bij de dieren.
  8. Bewaken temperatuur en waterniveau op een dagelijkse basis. Handhaaf de temperatuur op 30-33 ° C. Pas indien nodig de ventilatorsnelheid en / of de afstand tussen de tanks en de lights.
    1. Boven uit elke tank met het systeem zo nodig water, meestal dagelijks.
    2. Gebruik altijd gezond volwassen zebravissen (meestal 6-9 maanden oud) voor een overlevingspercentage van bijna 100% te handhaven. Echter, als een vis dood is gevonden in de tank, onmiddellijk te verwijderen en het water in de hele tank te vervangen.

4. Tissue Collection

  1. 48 uur na het begin van de halogeen lichtbehandeling verwijder de vis uit het behandelde gebied.
    1. Bereid verse ethanol formaldehyde fixatief (1 deel 37% formaldehyde, 9 delen 100% ethanol).
    2. Euthanize zebravis met een verdovende overdosis van 2-fenoxyethanol (0,4 mg / L).
    3. Breng de gedood zebravis een papieren handdoek. Ophelderen het oog met behulp van gebogen pincet.
    4. Plaats enucleated ogen in fixatief en winkel O / N bij 4 ° C.
  2. Cryoprotect de ogen.
    1. De ogen wassen in 5% sucrose 1x PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, daarna vervangenverse 5% sucrose 1x PBS gedurende 2 uur. Vervolgens wassen de ogen in 30% sucrose 1x PBS O / N bij 4 ° C. De ogen wassen in een 1:1 (gelijke delen) van weefsel invriesmedium en 30% sucrose 1x PBS O / N bij 4 ° C.
  3. Integreer de ogen in 100% weefsel bevriezen middelgrote en bewaar bij -80 ° C. Plaats de ogen zodat cryosectioning van het weefsel wordt uitgevoerd op de dorsale / ventrale as.
  4. Cryosection het weefsel en plaats op glasplaatjes. Warme slides 2 uur bij 55 ° C. Store slides bij -80 ° C of onmiddellijk uitvoeren standaard immunohistochemie.
  5. Presteren standaard immunohistochemie op coupes weefsel en afbeelding met fluorescentie microscopie 40,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De hiervoor beschreven licht behandelprotocol werd vergeleken aan elke individuele wijze van LIRD. In donkere behandelde volwassen albino dieren (figuren 3-5), de individuele licht behandelingen resulteerden in een significant verlies van staaf (figuur 3) en de conus (figuur 4) fotoreceptoren. Zowel individuele behandelingen hoofdzakelijk beschadigd fotoreceptoren in de dorsale helft van het netvlies, waardoor de ventrale netvlies relatief beschermd tegen licht behandelingen (figuren 3 en 4). In vergelijking met halogeenlicht behandeling, de UV behandeling beschadigd more conus fotoreceptoren in de dorsale helft van het netvlies (vergelijk figuren 4B C respectievelijk). Het combineren van de UV-en halogeenlicht behandelingen resulteerde in een significant groter verlies aan zowel staafjes en kegeltjes fotoreceptoren hele netvlies, grotendeels elimineren van de neuroprotection van de ventrale helft van de retina (figuren 3 en 4). Vergeleken met de individuele LIRD methoden, werd een overeenkomstige toename van proliferatie ook waargenomen in het ventrale netvlies wanneer het gecombineerde licht behandelingsprotocol werd gebruikt (figuur 5).

Gepigmenteerde dieren beter bestand tegen LIRD door retinale pigmentepitheel, die licht absorbeert en beschermt de fotoreceptoren van fototoxiciteit. Zoals verwacht, donker aangepaste gepigmenteerde dieren werden bijna volledig bestand tegen het halogeenlicht behandeling alleen (figuren 6B, J en N). Wij vonden dat 48 uur na het aanzetten van licht, werden rod fotoreceptoren verlaagd in de dorsale netvlies, maar niet ventrale netvlies (figuur 6E, F en Q). Kegel photoreceptor kernen aanwezig waren in normale aantallen (Figuur 6R). In vergelijking met onbehandelde netvliezen, halogeenlichtbehandeling alleen ook niet te verhogen Müller gliacellen proliferatie 48 uur na het aanzetten van licht (figuren 7B en F). In albino dieren, UV-licht behandeling alleen in een iets grotere schade aan zowel de staafjes en kegeltjes fotoreceptoren in het dorsale netvlies (figuren 3I en 4I). In gepigmenteerde dieren, UV behandeling alleen niet significant verminderen staaf of cone celaantal (figuren 6C, G, K, O, Q en R). Bovendien, alleen UV-behandeling veroorzaakte een slechts zwakke regeneratieve respons in de dorsale helft van het netvlies gepigmenteerde dieren (Figuur 7C). In tegenstelling tot de afzonderlijke LIRD resultaten, het combineren van de UV-en halogeen behandelingen resulteerden in significant grotere fotoreceptor schade en regeneratieve respons in gepigmenteerde dieren. Belangrijk aanzienlijk verlies van zowel staafjes en kegeltjes werd waargenomen in zowel de dorsa l en ventrale netvlies (figuur 6D, H, L, P, Q en R). In vergelijking met onbehandelde en individuele LIRD methoden, werd een overeenkomstige stijging van proliferatie ook waargenomen in zowel dorsale en ventrale helften van de retina bij de gecombineerde licht behandelingsprotocol werd gebruikt (figuur 5).

Figuur 1
Figuur 1. De foto die van het halogeenlicht behandeling setup. Twee sets van vier 250 W halogeenlampen werden verdeeld 29 cm aan weerszijden van twee heldere 1,8 L acryl tanks. De beluchter en slangen waren zo geplaatst als niet aan het licht belemmeren. De deksels van de tanks waren gebarsten 2 cm tot luchtstroom van de ventilator. Een thermometer werd in een van de tanks geplaatst voor de temperatuur te bewaken.Arget = "_blank"> Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2
Figuur 2. De foto die van het UV-licht behandeling setup. De UV-lichtbron van een tl-stereomicroscoop werd bevestigd aan een glazen petrischaal ~ 2 cm van de bank top. Een 250 ml glazen beker, deels verpakt in folie, werd gevuld zal 100 ml water systeem. De vissen werden geplaatst in het bekerglas van 250 ml. Het bekerglas van 250 ml werd geconcentreerd in een 4 L beker, die was gevuld met water-systeem op het niveau van het water in het bekerglas van 250 ml. De 4 L beker werd geplaatst aangrenzend aan het licht gloeidraad gecentreerd op het bekerglas van 250 ml. Een groot ondoorzichtig schild werd geplaatst rond de hele setup. Klik hier voor grotere afbeelding .


Figuur 3. Rod fotoreceptor verlies in albino zebravis na diverse lichte schade paradigma netvlies secties uit volwassen Tg (NRD: EGFP). / Alb immunolabeled met GFP tot staaf fotoreceptor dichtheid (groen) in de dorsale (AD) en ventrale tonen (EH) halveert van het netvlies . A, E) Voorafgaand aan het aanzetten van licht (0 uur), EGFP-positieve staaf fotoreceptor kernen (ONL) en buitenste segmenten (ROS) kan worden gevisualiseerd. B, F) Op 48 hr volgende halogeenlicht onset (HLT), afgeknotte ROS en significant minder rod kernen (I) aanwezig in de dorsale, maar niet ventrale netvlies. CG) op 48 uur na 30 minuten blootstelling aan UV (hpUV), significant minder staaf kernen in de dorsale en ventrale netvlies waren dan bij 0 uur (C, G < / Strong>), maar niet 48 HLT behandelingen (G, I). DH) 48 hr volgende begin gecombineerde lichttherapie (30 min UV belichting gevolgd door halogeen behandeling; UV +48 HLT), bijna geen ROS aanwezig dorsale en ventrale netvlies waren, naast een aanzienlijk verlies van staaf fotoreceptor kernen (I) . I) Kwantificering van staaf fotoreceptor kernen over 300 micrometer van de centrale dorsale of ventrale netvlies. Significante verschillen (p ≤ 0,05) tussen groepen worden weergegeven als: "een" voor verschillende van 0 uur, "b" voor verschillende van 48 HLT en "c" voor verschillende van 48 hpUV. Schaal bar in paneel A staat voor 50 micrometer en geldt voor panelen AH. Klik hier voor grotere afbeelding .

iles/ftp_upload/51017/51017fig4.jpg "width =" 500px "/>
Figuur 4. Dubbelkegel verlies in albino zebravis na diverse lichte schade paradigma. Retina secties van volwassen albino zebravissen immunolabeled met zpr-1 tot dubbele kegels (goud) in de dorsale (AD) en ventrale (EH) helften van het netvlies te tonen na elk van het licht schade paradigma (48 HLT, 48 hpUV en UV +48 HLT). A, E) Bij 0 uur, dubbele kegel kernen aanwezig waren in de dorsale en ventrale netvlies. B, F) Na 48 HLT, significant minder dubbele kegels aanwezig waren alleen het ventrale netvlies (F, I). CG) Op 48 hpUV, significant minder dubbele kegels (I) en een grote hoeveelheid afval aanwezig in alleen de dorsale netvlies (C), terwijl er geen veranderingen waargenomen in het ventrale netvlies (G). DH) Bij UV 48 HLT, beduidend minder dubbele conuss (I) en zeer weinig vuil aanwezig in dorsale en ventrale netvlies. I) Kwantificering van dubbele kegels over 300 micrometer van de centrale dorsale of ventrale netvlies. Significante verschillen (p ≤ 0,05) tussen groepen worden weergegeven als "a" voor niet 0 uur, "b" voor verschillende van 48 HLT en "c" voor verschillende van 48 hpUV. Schaalbalk in panel A vertegenwoordigt 100 micrometer en geldt voor panelen AH. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 5
Figuur 5. Veranderingen is proliferatie respons na diverse lichte schade paradigma. Retina secties van volwassen albino zebravissen immunolabeled met PCNA tot celproliferatie (rood) weergegeven inde dorsale (AD) en ventrale (EH) halveert van het netvlies na elk van de lichte schade paradigma (48 HLT, 48 hpUV en UV +48 HLT). AE) Bij 0 uur, proliferatie was afwezig bij de binnenste nucleaire laag ( INL). B, F) bij 48 HLT, enkele progenitorcellen aanwezig in de INL in de dorsale retina en in een klein gedeelte van de ventrale netvlies. CG) bij 48 hpUV, kolommen progenitorcellen aanwezig in de dorsale netvlies, terwijl slechts enkele progenitorcellen aanwezig in een klein gedeelte van de ventrale netvlies. D, H) in UV +48 HLT, grote kolommen van stamcellen aanwezig in de dorsale en ventrale netvlies. Schaalbalk in panel A vertegenwoordigt 100 micrometer en geldt voor panelen AH. Klik hier voor grotere afbeelding .


Figuur 6. Staafjes en kegeltjes photoreceptor verlies in gepigmenteerde zebravis na diverse lichte schade paradigma netvlies secties van volwassen wild-type (AB) zebravis gekleurd met TO-PRO-3 om alle kernen (AP; blauwe) tonen. En immunolabeled met zpr-3 op stang te tonen buitenste segmenten (AH, magenta) of zpr-1 tot dubbele kegels (IP, goud) in de dorsale (AD, IJ) en ventrale (EH, MP) helften van het netvlies na elk van de lichte schade paradigma (48 HLT, 48 hpUV en UV +48 HLT). AH) Significante verlagingen in staaf fotoreceptor kernen aanwezig in de dorsale netvlies 48 HLT (B, Q) en de dorsale en ventrale netvlies UV 48 HLT (D, H, Q) . IP) Hoewel conus kernen werden hypertrophied i n de dorsale netvlies aan 48 hpUV (K), geen significante dalingen in dubbelkegel kernen aanwezig waren op 48 HLT of 48 hpUV (JK, NO, O). Significante dalingen kegel kernen aanwezig waren in de dorsale en ventrale netvlies aan UV 48 HLT (L, P, R). QR) Kwantificering van staaf fotoreceptor en dubbele conus kernen over 300 micrometer van de centrale dorsale of ventrale netvlies. Significante verschillen (p ≤ 0,05) tussen groepen worden weergegeven als "a" voor niet 0 uur, "b" voor verschillende van 48 HLT en "c" voor verschillende van 48 hpUV. Schaalbalk in panel A vertegenwoordigt 200 micrometer en geldt voor panelen AH. Klik hier voor grotere afbeelding .

g7.jpg "width =" 500px "/>
Figuur 7. Proliferatie respons in gepigmenteerde zebravis na diverse lichte schade paradigma. Retina secties van volwassen wild-type (AB) zebravis immunolabeled met PCNA tot celproliferatie (rood) tonen in de dorsale (AD) en ventrale (EH) halveert van het netvlies na elk van de lichte schade paradigma (48 HLT, 48 hpUV en UV 48 HLT). AD) in de dorsale netvlies, op slechts een paar enkele voorlopercellen aanwezig waren in het INL op 48 HLT en 48 hpUV (B, C), terwijl de kolommen progenitorcellen aanwezig waren UV HLT 48 (D). EH) In de ventrale retina, werden geen veranderingen in proliferatie waargenomen behalve bij UV HLT 48 (H), waarna kolommen progenitorcellen aanwezig waren. Schaalbalk in panel A vertegenwoordigt 100 micrometer en geldt voor panelen AH.7/51017fig7highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hier laten we zien dat het combineren van een korte blootstelling aan UV met een continue blootstelling aan fel licht resulteert in wijdverspreide photoreceptor verlies en een robuuste regeneratie respons. Vergeleken met de individuele LIRD methoden, deze gecombineerde werkwijze is ook de meest effectieve protocol zowel staafjes en kegeltjes beschadigen beide helften van de retina. Belangrijk is dat deze behandeling effectief in gepigmenteerde dieren en albinodieren.

Hoewel wij leveren het bewijs dat de gecombineerde protocol resulteert in meer wijdverspreid en consistent schade vergeleken met de individuele LIRD methoden, moeten wetenschappelijke overwegingen voordat u een LIRD paradigma worden besproken. Onze gegevens suggereren dat de gecombineerde methode moet worden toegepast wanneer de gehele netvliesweefsel wordt verzameld voor analyse (dwz proteomics, real-time PCR). We vonden dat de gecombineerde methode had het grootste letselgrootte, gevolgd door de belichting halogeen en tenslotte de UV blootstelling. Wij stellen voordat de gecombineerde methode ook worden gebruikt bij het onderzoeken van een gen of route die verschillend kunnen beïnvloeden staafjes en kegeltjes regeneratie. Indien dit niet mogelijk is om praktische redenen, onze gegevens suggereren dat de UV-blootstelling de volgende beste methode voor deze studies, indien de analyse beperkt tot het centrale dorsale netvlies.

Praktische overwegingen worden ook geboden bij het selecteren van de juiste LIRD methode. De eerste zorg is de kosten van de benodigde apparatuur. Alle protocollen vereisen langere donkeradaptatie (gegevens niet getoond). Een self-contained donkere behuizing die is ingebouwd in de zebravis behuizing module is zeer handig, maar niet noodzakelijk. Zelfs een kartonnen doos kan worden gebruikt, indien zorg is genomen om tape of verzegelen van de naden, en het water wordt bewaakt. De halogeen-gebaseerde LIRD methode is zeer voordelig en handig. Alle items kunnen worden gekocht voor minder dan $ 100 US bij een lokale hardware winkel en het opzetten duurt slechts enkele minuten. Thij enige praktische nadeel van deze methode is het ongemak van het werken in dezelfde kamer als het licht behandeling. De lampen genereren een goede hoeveelheid warmte wanneer continu draaien voor 4 dagen en de lichtintensiteit is zowel afleidend en potentieel schadelijk voor de menselijke visie. De UV en gecombineerde werkwijzen vereisen een UV-bron, die niet beschikbaar is voor elk laboratorium. Daarnaast moet grote zorg worden genomen om de veiligheid van het lab leden waarborgen bij het uitvoeren van een UV-lichtbehandeling. Dus, terwijl het is handiger om het halogeenlicht apparaat in een geïsoleerde ruimte, de bezorgdheid over de veiligheid van de UV-behandeling moet een dergelijke ruimte. Dit wordt een extra ongemak als de UV bron voor de lichtbehandeling wordt ook typisch gebruikt voor een fluorescentiemicroscoop gehuisvest in een "microscoop room" of Imaging Core. Het uitvoeren van meerdere rondes van UV-behandelingen voor de controle en experimentele groepen dieren noodzakelijk zou afsluiten van de microscoop ruimte voor een extensive tijdsduur.

Misschien is het grootste voordeel van het gebruik van de gecombineerde methode is het vermogen om retinale regeneratie studies uitgevoerd op gepigmenteerde dieren. We tonen aan dat noch individuele methode resulteert in een aanzienlijk verlies van staafjes en kegeltjes in de dorsale en ventrale netvlies. In tegenstelling, de gecombineerde LIRD paradigma leidt tot vergelijkbare niveaus van wijdverspreide staafjes en kegeltjes verlies zowel gepigmenteerde en albino dieren. De mogelijkheid om deze LIRD methode toe te passen gepigmenteerde dieren slaat de onderzoeker aanzienlijke ruimte, tijd, en per diem dier zorgkosten (indien aanwezig), als het elimineert de noodzaak om de transgene lijnen van de rente op de albino achtergrond voor het netvlies regeneratie studies te genereren en te behouden . Samen hebben we het gevoel dat de wetenschappelijke en praktische voordelen opwegen tegen de mogelijke nadelen van deze verbeterde LIRD methode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag Xixia Luo bedanken voor uitstekende vis veeteelt en technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health subsidies R21EY019401 (RT) en P30EY04068 (RT), en start-up middelen aan RT, waaronder een onbeperkte subsidie ​​van onderzoek ter voorkoming van Blindheid aan de Wayne State University, Afdeling Oogheelkunde. JT werd ondersteund door een Thomas C. Rumble Fellowship verstrekt door de Wayne State University Graduate School.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV light source Leica EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm) Sigma-Aldrich/Pyrex CLS3160152BO
250 ml glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS1000250
4 L glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS10004L
Aluminum foil Fisher 01-213-105
250 W halogen lamps Workforce 265-669
1.8 L clear acrylic tanks Aquaneering ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids Aquaneering ZT180LCL
Fan Honeywell HT-900
Aerator Tetra 77853-900
Thermometer Cole-Parmer YO-08008-58
Bent forceps (5/45) World Precision Instruments 504155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J. Neurosci. 27, 7028-7040 (2007).
  2. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J. Neurosci. 26, 6303-6313 (2006).
  3. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  4. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  5. Thummel, R., et al. Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration. Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).
  6. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).
  7. Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish. Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).
  8. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
  9. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).
  10. Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev. Biol. 6, 36 (2006).
  11. Thummel, R., et al. Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration. Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).
  12. Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina. Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).
  13. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. J. Comp. Neurol. 518, 800-814 (2010).
  14. Morris, A. C., Scholz, T. L., Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetic dissection reveals two separate pathways for rod and cone regeneration in the teleost retina. Dev. Neurobiol. 68, 605-619 (2008).
  15. Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Muller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp. Eye Res. 28, 63-69 (1979).
  16. Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).
  17. Bringmann, A., Wiedemann, P. Muller glial cells in retinal disease. Ophthalmologica. 227, 1-19 (2012).
  18. Eisenfeld, A. J., Bunt-Milam, A. H., Sarthy, P. V. Muller cell expression of glial fibrillary acidic protein after genetic and experimental photoreceptor degeneration in the rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25, 1321-1328 (1984).
  19. Anderson, D. H., Guerin, C. J., Erickson, P. A., Stern, W. H., Fisher, S. K. Morphological recovery in the reattached retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 168-183 (1986).
  20. Bruce, A. E., Oates, A. C., Prince, V. E., Ho, R. K. Additional hox clusters in the zebrafish: divergent expression patterns belie equivalent activities of duplicate hoxB5 genes. Evol. Dev. 3, 127-144 (2001).
  21. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  22. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Muller cell outgrowth after retinal detachment: association with cone photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 1542-1545 (2000).
  23. Fischer, A. J., Bongini, R. Turning Muller glia into neural progenitors in the retina. Mol. Neurobiol. 42, 199-209 (2010).
  24. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends Mol. Med. 16, 193-202 (2010).
  25. Close, J. L., Liu, J., Gumuscu, B., Reh, T. A. Epidermal growth factor receptor expression regulates proliferation in the postnatal rat retina. Glia. 54, 94-104 (2006).
  26. Das, A. V., et al. Neural stem cell properties of Muller glia in the mammalian retina: regulation by Notch and Wnt signaling. Dev. Biol. 299, 283-302 (2006).
  27. Ikeda, T., Puro, D. G. Regulation of retinal glial cell proliferation by antiproliferative molecules. Exp. Eye Res. 60, 435-443 (1995).
  28. Liu, B., et al. Wnt signaling promotes muller cell proliferation and survival after injury. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, 444-453 (2013).
  29. Osakada, F., et al. Wnt signaling promotes regeneration in the retina of adult mammals. J. Neurosci. 27, 4210-4219 (2007).
  30. Wan, J., et al. Preferential regeneration of photoreceptor from Muller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. 48, 223-234 (2008).
  31. Wan, J., Zheng, H., Xiao, H. L., She, Z. J., Zhou, G. M. Sonic hedgehog promotes stem-cell potential of Muller glia in the mammalian retina. Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 347-354 (2007).
  32. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (1002).
  33. Chang, G. Q., Hao, Y., Wong, F. Apoptosis: final common pathway of photoreceptor death in rd, rds, and rhodopsin mutant mice. Neuron. 11, 595-605 (1993).
  34. Marc, R. E., et al. Extreme retinal remodeling triggered by light damage: implications for age related macular degeneration. Mol. Vis. 14, 782-806 (2008).
  35. Portera-Cailliau, C., Sung, C. H., Nathans, J., Adler, R. Apoptotic photoreceptor cell death in mouse models of retinitis pigmentosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 974-978 (1994).
  36. Noell, W. K., Walker, V. S., Kang, B. S., Berman, S. Retinal damage by light in rats. Invest. Ophthalmol. 5, 450-473 (1966).
  37. Wenzel, A., Grimm, C., Samardzija, M., Reme, C. E. Molecular mechanisms of light-induced photoreceptor apoptosis and neuroprotection for retinal degeneration. Prog. Retin. Eye Res. 24, 275-306 (2005).
  38. Cicerone, C. M. Cones survive rods in the light-damaged eye of the albino rat. Science. 194, 1183-1185 (1976).
  39. La Vail, M. M. Survival of some photoreceptor cells in albino rats following long-term exposure to continuous light. Invest. Ophthalmol. 15, 64-70 (1976).
  40. Thomas, J. L., Nelson, C. M., Luo, X., Hyde, D. R., Thummel, R. Characterization of multiple light damage paradigms reveals regional differences in photoreceptor loss. Exp. Eye Res. 97, 105-116 (2012).
  41. Qin, Z., et al. FGF signaling regulates rod photoreceptor cell maintenance and regeneration in zebrafish. Exp. Eye Res. 93, 726-734 (2011).
  42. Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).
  43. Morris, A. C., Schroeter, E. H., Bilotta, J., Wong, R. O., Fadool, J. M. Cone survival despite rod degeneration in XOPS-mCFP transgenic zebrafish. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 4762-4771 (2005).
  44. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Muller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  45. Powell, C., Elsaeidi, F., Goldman, D. Injury-dependent Muller glia and ganglion cell reprogramming during tissue regeneration requires Apobec2a and Apobec2b. J. Neurosci. 32, 1096-1109 (2012).
  46. Ramachandran, R., Reifler, A., Wan, J., Goldman, D. Application of Cre-loxP recombination for lineage tracing of adult zebrafish retinal stem cells. Methods Mol. Biol. 884, 129-140 (2012).
  47. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/Dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15858-15863 (2011).
  48. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Insm1a-mediated gene repression is essential for the formation and differentiation of Muller glia-derived progenitors in the injured retina. Nat. Cell Biol. 14, 1013-1023 (2012).
  49. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev. Cell. 22, 334-347 (2012).
  50. Morris, A. C., Forbes-Osborne, M. A., Pillai, L. S., Fadool, J. M. Microarray analysis of XOPS-mCFP zebrafish retina identifies genes associated with rod photoreceptor degeneration and regeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 2255-2266 (2011).
  51. Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J. Vis. Exp. (58), e3603 (2011).
A Novel Lichte Schade Paradigm voor gebruik in retinale Regeneration Studies in Adult zebravis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).More

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter