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Neuroscience

वयस्क Zebrafish में रेटिना पुनर्जनन अध्ययन में इस्तेमाल के लिए एक उपन्यास लाइट नुकसान प्रतिमान

doi: 10.3791/51017 Published: October 24, 2013

Summary

एकाधिक प्रकाश क्षति प्रोटोकॉल क्षति photoreceptors को बताया और फलस्वरूप वयस्क zebrafish में एक रेटिना उत्थान प्रतिक्रिया को प्रेरित किया गया है. इस प्रोटोकॉल रंजित पशुओं में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक बेहतर विधि का वर्णन करता है और उस छड़ी और पूरे रेटिना भर कोन photoreceptors के विशाल बहुमत को नुकसान.

Abstract

प्रकाश प्रेरित रेटिना अध: पतन (LIRD) सामान्यतः कृन्तकों और नुकसान रॉड और कोन photoreceptors को zebrafish दोनों में प्रयोग किया जाता है. वयस्क zebrafish में, फोटोरिसेप्टर अध: पतन मुलर glial कोशिकाओं फिर से दर्ज सेल चक्र को चलाता है और क्षणिक-amplifying के पूर्वज उत्पादन. ये पूर्वज वे अंततः नया photoreceptors को जन्म दे जहां क्षतिग्रस्त क्षेत्र की ओर पलायन के रूप में पैदा करने के लिए जारी है. वर्तमान में, दो व्यापक रूप से इस्तेमाल LIRD मानदंड, जिनमें से प्रत्येक के उत्थान के जवाब में फोटोरिसेप्टर नुकसान और इसी मतभेद की डिग्री बदलती में परिणाम है. रहे हैं अधिक आनुवंशिक और औषधीय उपकरण उत्थान के दौरान ब्याज की व्यक्तिगत जीन की भूमिका का परीक्षण करने के लिए उपलब्ध हैं, एक मजबूत LIRD प्रतिमान विकसित करने की जरूरत है. यहाँ हम एक LIRD प्रोटोकॉल का वर्णन है कि हम दो पहले से स्थापित LIRD तकनीकों के उपयोग के संयुक्त है जिसमें रॉड और कोन फोटोरिसेप्टर दोनों के व्यापक और लगातार नुकसान में परिणाम है. और भी, इस प्रोटोकॉल LIRD पढ़ाई के लिए सूरजमुखी मनुष्य पृष्ठभूमि पर ब्याज की ट्रांसजेनिक लाइनों को बनाए रखने की आवश्यकता समाप्त जो रंजित पशुओं में उपयोग करते हैं, के लिए बढ़ाया जा सकता है.

Introduction

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प्रकाश प्रेरित रेटिना अध: पतन (LIRD) सामान्यतः कृन्तकों और नुकसान रॉड और कोन photoreceptors को zebrafish दोनों में प्रयोग किया जाता है. वयस्क zebrafish में, फोटोरिसेप्टर अध: पतन मुलर glial कोशिकाओं फिर से दर्ज सेल चक्र को चलाता है और क्षणिक-amplifying के पूर्वज उत्पादन. ये पूर्वज वे अंततः नया photoreceptors को जन्म दे जहां क्षतिग्रस्त क्षेत्र की ओर पलायन के रूप में पैदा करने के लिए जारी है. वर्तमान में, दो व्यापक रूप से इस्तेमाल LIRD मानदंड, जिनमें से प्रत्येक के उत्थान के जवाब में फोटोरिसेप्टर नुकसान और इसी मतभेद की डिग्री बदलती में परिणाम है. रहे हैं अधिक आनुवंशिक और औषधीय उपकरण उत्थान के दौरान ब्याज की व्यक्तिगत जीन की भूमिका का परीक्षण करने के लिए उपलब्ध हैं, एक मजबूत LIRD प्रतिमान विकसित करने की जरूरत है. यहाँ हम एक LIRD प्रोटोकॉल का वर्णन है कि हम दो पहले से स्थापित LIRD तकनीकों के उपयोग के संयुक्त है जिसमें रॉड और कोन फोटोरिसेप्टर दोनों के व्यापक और लगातार नुकसान में परिणाम है. और भी, इस प्रोटोकॉल LIRD पढ़ाई के लिए सूरजमुखी मनुष्य पृष्ठभूमि पर ब्याज की ट्रांसजेनिक लाइनों को बनाए रखने की आवश्यकता समाप्त जो रंजित पशुओं में उपयोग करते हैं, के लिए बढ़ाया जा सकता है.

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Protocol

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इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रक्रियाओं चिकित्सा की वेन स्टेट यूनिवर्सिटी स्कूल में जानवर उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. तमोनुकूलन

  1. स्थानांतरण एक अंधेरे बाड़े में सामान्य आवास की व्यवस्था से 10 वयस्क सूरजमुखी मनुष्य या pigmented मछली ~. उपलब्ध हैं, टैंक के माध्यम से सामान्य जल प्रवाह के लिए अनुमति देता है जो zebrafish आवास मॉड्यूल में बनाया गया है कि एक अंधेरे बाड़े का उपयोग करें. (एक ऐसी प्रणाली उपलब्ध नहीं है, तो ऑक्सीजन के साथ मछली हवा में रखना सुनिश्चित करने के लिए एक पूरी तरह से अंधेरा बाड़े में मछली टैंक जगह).
  2. 10 दिनों तक अंधेरे में मछली रखो. पशुओं को खिलाने या अंधेरे बॉक्स के लिए नई मछली जोड़ने, प्रकाश की एक लंबी अवधि के लिए मछली को प्रकाश में लाने से बचने के लिए जल्दी से जल्दी स्थानांतरित करने के लिए सुनिश्चित करें.

2. यूवी लाइट एक्सपोजर

  1. यूवी स्रोत के लिए बिजली बंद है सुनिश्चित करें. फ्लोरोसेंट stereomicroscope से पराबैंगनी प्रकाश रेशा निकालें.
    1. एक औंधा का प्रयोग करेंयूवी फिलामेंट के लिए एक स्टैंड के रूप में 15 सेमी व्यास गिलास पेट्री डिश (या एक समान 2 सेमी ऊंचाई के कुछ). प्रयोगशाला बेंच को पेट्री डिश टेप.
    2. टेप पराबैंगनी प्रकाश रेशा उल्टे पेट्री डिश के शीर्ष करने के लिए. व्यवस्थित करें ताकि पेट्री डिश रेशा overhangs के अंत की ~ 2 मिमी.
  2. एक 250 मिलीलीटर कांच बीकर प्राप्त करते हैं. नीचे का आधा, पक्षों, और वापस एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बीकर का, पन्नी का "चमकदार" पक्ष बीकर के इंटीरियर का सामना कर सुनिश्चित कर रही है कवर. बीकर स्नातक की उपाधि प्राप्त की है, तो उजागर बीकर का स्पष्ट आधा छोड़ने, पन्नी के साथ बीकर के शब्दों में आधा कवर.
  3. मछली सुविधा प्रणाली से पानी की 100 मिलीलीटर के साथ 250 मिलीलीटर बीकर भरें.
  4. एक 4 एल बीकर में 250 मिलीलीटर बीकर रखें. जल स्तर भी 250 मिलीलीटर बीकर में 100 मिलीलीटर पानी की लाइन के साथ है जब तक पानी के साथ 4 एल बीकर भरें.
  5. 250 मिलीलीटर बीकर से 10 अंधेरे का इलाज पशुओं की अधिकतम जोड़ें. एल्यूमीनियम का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ 250 मिलीलीटर बीकर कवरपन्नी.
  6. यूवी रेशा को तुरंत आसन्न पूरे बीकर उपकरण रखें. रेशा 4 एल बीकर के बाहर छू और 250 मिलीलीटर बीकर के संपर्क में भाग सामना होना चाहिए. 250 मिलीलीटर बीकर 4 एल बीकर के तल में केन्द्रित है सुनिश्चित करें.
  7. उजागर करने जानवरों के लिए अनुमति देता है, लेकिन यूवी रेशा की नोक देखने से किसी भी प्रयोगशाला कर्मियों को रोकने, 4L बीकर के पीछे एक बड़ी, अपारदर्शी स्क्रीन स्थिति. चेतावनी: इस बाधा यूवी स्रोत से बिजली चालू करने से पहले स्थान पर है सुनिश्चित करें.
  8. यूवी शक्ति के स्रोत पर बारी. 30 मिनट के लिए टाइमर सेट. जो भी आवश्यक चेतावनी के लेबल है कि पहले से न सोचा प्रयोगशाला कर्मियों गलती से पराबैंगनी विकिरण के लिए खुद को बेनकाब नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए रखें.
  9. 30 मिनट के बाद, यूवी शक्ति के स्रोत बंद. मछली के साथ 250 मिलीलीटर बीकर निकालें. नोट: यूवी जोखिम के कई दौर की आवश्यकता होती है, तो जोखिम प्रोटोकॉल दोहरा से पहले (~ 20 मिनट) नीचे शक्ति का स्रोत शांत करते हैं. टी बदलने के लिए सुनिश्चित करेंवह प्रत्येक प्रदर्शन के लिए ताजा प्रणाली पानी के साथ पानी की 100 मिलीलीटर. 4 एल बीकर में पानी के लिए जगह की जरूरत नहीं है.

3. हैलोजन लैंप लाइट एक्सपोजर

  1. एक 1.8 एल स्पष्ट ऐक्रेलिक मछली टैंक में 250 मिलीलीटर बीकर से मछली स्थानांतरण. अतिप्रवाह चिह्नित करने के लिए टैंक भरें.
  2. हलोजन दीपक प्रकाश उपचार क्षेत्र की स्थापना की. एक स्थानीय हार्डवेयर की दुकान से चार 250 डब्ल्यू हलोजन उपयोगिता दीपक प्राप्त करते हैं. एक ही दिशा में दो दीपक सामना, केंद्र पर अलग 29 सेमी की व्यवस्था. इसी तरह फैशन में अन्य दो लैंप की व्यवस्था.
    1. वे दीपक के दो सेट के बीच में ~ 73 सेमी छोड़ने, दीपक के पहले सेट का सामना कर रहे हैं इतना है कि दीपक के दूसरे सेट रखें. यह 29 x 73 सेमी की एक आयत के आकार का प्रकाश उपचार क्षेत्र बनाता है.
  3. एक स्थानीय हार्डवेयर की दुकान से एक छोटे से प्रशंसक प्राप्त करते हैं. सिर्फ प्रकाश उपचार क्षेत्र के बाहर, दीपक के दो सेट के बीच समदूरस्थ प्रशंसक रखें.
  4. के केंद्र में पानी से भरे दो 1.8 एल टैंक जगहदीपक के दो सेट के बीच समदूरस्थ प्रकाश उपचार क्षेत्र,. दीपक और टैंक के बाहर दीवार के बीच की दूरी ~ 29 सेमी होना चाहिए. नोट: केवल एक 1.8 एल टैंक में 10 मछली के इलाज, भले ही इस व्यवस्था का उपयोग करें. दोनों टैंक उचित सीमा के भीतर प्रत्येक टैंक के पानी का तापमान बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं.
  5. प्रत्येक टैंक में एक ऑक्सीजन जलवाहक रखें.
  6. प्रशंसक के सबसे करीब अंत में एक ~ 2 सेमी अंतराल छोड़ रहा है, स्पष्ट ऐक्रेलिक lids के साथ प्रत्येक टैंक कवर. यह इस अंतर को हवा में उड़ा देंगे तो पंखे की व्यवस्था. टैंकों में से एक या दोनों में एक थर्मामीटर रखें.
  7. लाइट, पंखे, और वातकों को सत्ता पर बारी. ऊपर 4 दिनों के लिए प्रकाश उपचार बनाए रखें. यह जानवरों के लिए अधिक तनाव में पानी की गुणवत्ता और परिणाम को प्रभावित करेगा के रूप में मछली, प्रकाश उपचार के दौरान नहीं खिलाया जाना चाहिए.
  8. एक दैनिक आधार पर तापमान और पानी के स्तर की निगरानी करें. 30-33 में तापमान बनाए रखने डिग्री सेल्सियस यदि आवश्यक हो, पंखे की गति और / या टैंक और ली के बीच की दूरी को समायोजितghts.
    1. जरूरत के रूप में, आमतौर पर दैनिक प्रणाली पानी के साथ प्रत्येक टैंक के ऊपर.
    2. हमेशा 100% के पास से एक जीवित रहने की दर बनाए रखने के लिए स्वस्थ वयस्क zebrafish (उम्र के आम तौर पर 6-9 महीने) का उपयोग करें. एक मछली टैंक में मृत पाया गया है, हालांकि, अगर इसे तुरंत हटाने और पूरे टैंक में पानी की जगह.

4. ऊतक संग्रह

  1. हलोजन प्रकाश उपचार के शुरू होने के बाद 48 घंटे के उपचार के क्षेत्र से मछली को हटा दें.
    1. ताजा ethanolic फॉर्मेल्डीहाइड लगानेवाला (1 हिस्सा 37% formaldehyde, 9 भागों 100% इथेनॉल) तैयार करें.
    2. 2 phenoxyethanol (0.4 मिलीग्राम / एल) के एक संवेदनाहारी अधिक मात्रा के साथ zebrafish euthanize.
    3. एक कागज तौलिया के लिए euthanized zebrafish के स्थानांतरण. घुमावदार संदंश का उपयोग आंख साफ करना.
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर लगानेवाला और दुकान ओ / एन में enucleated आँखों रखें
  2. आंखों Cryoprotect.
    1. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 5% सूक्रोज 1x पीबीएस में आंखें धो लें, तो साथ की जगह2 घंटे के लिए नए सिरे से 5% सूक्रोज 1x पीबीएस. अगला, 4 डिग्री सेल्सियस से कम 30% सूक्रोज 1x पीबीएस हे / एन में आंखें धोने 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक ठंड मध्यम और 30% sucrose के 1x पीबीएस हे / एन की एक 1:1 (बराबर भागों) में आंखें धो लें
  3. -80 पर 100% ऊतक ठंड मध्यम और दुकान में आंखों एम्बेड डिग्री सेल्सियस ओरिएंट आँखें इतना है कि ऊतक के cryosectioning पृष्ठीय / वेंट्रल अक्ष पर किया जाता है.
  4. गिलास स्लाइड पर cryosection ऊतक और जगह. 55 डिग्री सेल्सियस से कम 2 घंटे के लिए गर्म स्लाइड -80 पर स्टोर स्लाइड डिग्री सेल्सियस या तुरंत मानक immunohistochemistry प्रदर्शन करते हैं.
  5. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी 40,51 साथ sectioned ऊतक और छवि पर मानक immunohistochemistry के प्रदर्शन.

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Representative Results

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पहले वर्णित प्रकाश उपचार प्रोटोकॉल LIRD के प्रत्येक व्यक्ति विधि की तुलना में था. अंधेरे का इलाज वयस्क सूरजमुखी मनुष्य जानवरों (आंकड़े 3-5) में, व्यक्तिगत प्रकाश उपचार महत्वपूर्ण रॉड की हानि (चित्रा 3) और कोन (चित्रा 4) फोटोरिसेप्टर में हुई. हालांकि, दोनों व्यक्तिगत उपचार मुख्य रूप से अपेक्षाकृत प्रकाश उपचार (आंकड़े 3 और 4) से सुरक्षित उदर रेटिना छोड़ने, रेटिना के पृष्ठीय आधे में photoreceptors क्षतिग्रस्त. इसके अलावा, हलोजन प्रकाश उपचार के साथ तुलना में, पराबैंगनी प्रकाश उपचार रेटिना के पृष्ठीय आधे (क्रमशः, सी के साथ 4 बी आंकड़े की तुलना) में अधिक कोन फोटोरिसेप्टर क्षतिग्रस्त. मोटे तौर पर पता नष्ट करने, रेटिना भर रॉड और कोन फोटोरिसेप्टर दोनों के लिए काफी अधिक नुकसान के परिणामस्वरूप यूवी और हलोजन प्रकाश उपचार का मेलरेटिना के उदर आधे (आंकड़े 3 और 4) के europrotection. संयुक्त प्रकाश उपचार प्रोटोकॉल इस्तेमाल किया गया था जब व्यक्ति LIRD तरीकों के साथ तुलना में, प्रसार में एक इसी वृद्धि भी उदर रेटिना में मनाया गया (चित्रा 5).

Pigmented जानवरों प्रकाश अवशोषित और phototoxicity से फोटोरिसेप्टर की रक्षा करता है जो रेटिना वर्णक उपकला के कारण LIRD लिए प्रतिरोधी रहे हैं. जैसी कि उम्मीद थी, काले अनुकूलित रंजित जानवरों अकेले हलोजन प्रकाश उपचार (आंकड़े 6B, जम्मू, और एन) के लिए लगभग पूरी तरह से प्रतिरोधी थे. हम 48 घंटे प्रकाश शुरू होने के बाद, रॉड फोटोरिसेप्टर पृष्ठीय रेटिना में कम हो गई थी कि पाया, लेकिन नहीं उदर रेटिना (आंकड़े 6E, एफ, और क्यू). कोन फोटोरिसेप्टर नाभिक सामान्य संख्या (चित्रा 6R) में मौजूद थे. अनुपचारित रेटिना, हलोजन प्रकाश के साथ तुलना मेंअकेले उपचार भी प्रकाश शुरुआत (आंकड़े 7B और एफ) के बाद मुलर glial सेल प्रसार 48 घंटा वृद्धि नहीं था. सूरजमुखी मनुष्य जानवरों में, अकेले पराबैंगनी प्रकाश उपचार पृष्ठीय रेटिना (आंकड़े 3I और 4I) में रॉड और कोन फोटोरिसेप्टर दोनों को थोड़ा अधिक से अधिक क्षति हुई. हालांकि, रंजित जानवरों में, अकेले पराबैंगनी प्रकाश उपचार काफी छड़ी या कोन सेल नंबर (आंकड़े 6C, जी, कश्मीर, हे, क्यू, और आर) को कम नहीं किया. इसके अलावा, अकेले यूवी इलाज केवल रंजित पशुओं में रेटिना के पृष्ठीय आधे (चित्रा 7C) में एक कमजोर पुनर्योजी प्रतिक्रिया हासिल. व्यक्तिगत LIRD परिणाम के विपरीत, यूवी और हलोजन प्रकाश उपचार के संयोजन काफी अधिक फोटोरिसेप्टर नुकसान और pigmented पशुओं में पुनर्योजी प्रतिक्रिया में हुई. महत्वपूर्ण बात है, छड़ और शंकु दोनों की महत्वपूर्ण नुकसान Dorsa दोनों में मनाया गया एल और उदर रेटिना (आंकड़े 6D, एच, एल, पी, क्यू, और आर). संयुक्त प्रकाश उपचार प्रोटोकॉल (चित्रा 5) का इस्तेमाल किया गया था जब अनुपचारित और व्यक्तिगत LIRD तरीकों के साथ तुलना में, प्रसार में एक इसी वृद्धि भी रेटिना के पृष्ठीय और उदर दोनों हिस्सों में मनाया गया.

चित्रा 1
चित्रा 1. तस्वीर हलोजन प्रकाश उपचार सेटअप चित्रण. चार 250 डब्ल्यू हलोजन लैंप के दो सेट दो स्पष्ट 1.8 एल ऐक्रेलिक टैंक के दोनों तरफ 29 सेमी दूरी पर थे. प्रकाश रूकावट डालने के लिए नहीं के रूप में जलवाहक और ट्यूबिंग इसलिए रखा गया. टैंक का ढक्कन पंखे से airflow की अनुमति देने के लिए 2 सेमी टूट गए थे. एक थर्मामीटर निरीक्षण किये जा रहे तापमान के लिए टैंक में से एक में रखा गया था.arget = "_blank"> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. तस्वीर यूवी प्रकाश उपचार सेटअप चित्रण. एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope से पराबैंगनी प्रकाश स्रोत सुरक्षित ~ 2 सेमी बेंच ऊपर से एक गिलास पेट्री डिश के लिए तय की गई थी. आंशिक रूप से पन्नी में लिपटे एक 250 मिलीलीटर कांच बीकर, भरा हुआ था प्रणाली पानी की 100 मिलीलीटर होगा. मछली 250 मिलीलीटर बीकर के अंदर रखा गया था. 250 मिलीलीटर बीकर 250 मिलीलीटर बीकर में पानी के स्तर के लिए प्रणाली पानी से भर गया था जो एक 4 एल बीकर, अंदर केंद्रित था. 4 एल बीकर 250 मिलीलीटर बीकर पर केंद्रित प्रकाश रेशा से सटे रखा गया था. एक बड़े अपारदर्शी ढाल पूरे सेटअप के आसपास रखा गया था. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 3. विभिन्न प्रकाश क्षति मानदंड का पालन सूरजमुखी मनुष्य zebrafish में रॉड फोटोरिसेप्टर नुकसान वयस्क टीजी (nRD: EGFP) से रेटिना वर्गों. / जुब्बा रॉड फोटोरिसेप्टर पृष्ठीय में घनत्व (हरा) (ई.) और उदर को दिखाने के लिए GFP के साथ immunolabeled (एह) रेटिना के आधा प्रकाश शुरुआत (0 मी), EGFP पॉजिटिव रॉड फोटोरिसेप्टर नाभिक (ONL) और बाहरी क्षेत्रों (आरओएस) से पहले. ए, ई) देखे जा सकते हैं. बी, एफ) 48 घंटा निम्नलिखित हलोजन प्रकाश शुरुआत (HLT), छोटा कर दिया आरओएस में और काफी कम रॉड नाभिक (मैं) पृष्ठीय में मौजूद थे, लेकिन नहीं उदर रेटिना. तटरक्षक) 48 घंटा में यूवी जोखिम (hpUV) के 30 मिनट के बाद, काफी कम रॉड नाभिक 0 घंटा की तुलना में पृष्ठीय और उदर रेटिना में मौजूद थे (सी, जी < / मजबूत>), लेकिन नहीं 48 HLT उपचार (जी, मैं). डीएच) संयुक्त प्रकाश उपचार के 48 घंटा निम्न शुरुआत (हलोजन उपचार के बाद 30 मिनट यूवी जोखिम, रॉड फोटोरिसेप्टर नाभिक का एक महत्वपूर्ण नुकसान के अलावा यूवी 48 HLT), लगभग कोई आरओएस पृष्ठीय या उदर रेटिना में मौजूद थे, (मैं) केंद्रीय पृष्ठीय या उदर रेटिना के 300 माइक्रोन भर रॉड फोटोरिसेप्टर नाभिक की. मैं) मात्रा. "एक" 48 HLT और 48 hpUV से अलग के लिए 'ग' से अलग के लिए 0 घंटा, "ख" से अलग के लिए: समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर (पी ≤ 0.05) के रूप में चित्रित कर रहे हैं. पैनल में स्केल बार एक 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है और पैनलों मुख्यालय पर लागू होता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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4 चित्रा. विभिन्न प्रकाश क्षति मानदंड का पालन सूरजमुखी मनुष्य zebrafish में डबल शंकु नुकसान. रेटिना वर्गों वयस्क सूरजमुखी मनुष्य zebrafish से प्रकाश की प्रत्येक निम्नलिखित पृष्ठीय में डबल शंकु (सोना) (ई.) और रेटिना के उदर (एह) आधा दिखाने के लिए ZPR-1 के साथ immunolabeled नुकसान मानदंड (48 HLT, 48 hpUV, और यूवी 48 HLT). ए, ई) 0 घंटा, डबल शंकु नाभिक में पृष्ठीय और उदर रेटिना में मौजूद थे. बी, एफ) 48 HLT में काफी कम डबल शंकु में उपस्थित थे उदर रेटिना केवल (एफ, आई). कोई परिवर्तन उदर रेटिना (जी) में मनाया गया, जबकि 48 hpUV, काफी कम डबल शंकु (आई) और मलबे की एक बड़ी राशि पर सीजी), केवल पृष्ठीय रेटिना (सी) में उपस्थित थे. यूवी 48 HLT, काफी कम डबल शंकु में डीएच)एस (मैं) और बहुत कम मलबे पृष्ठीय और उदर रेटिना में मौजूद थे. मैं केंद्रीय पृष्ठीय या उदर रेटिना के 300 मीटर के पार डबल शंकु की) मात्रा. समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर (पी ≤ 0.05) "एक" 48 HLT और 48 hpUV से अलग के लिए 'ग' से अलग के लिए 0 घंटा, "ख" से अलग करने के लिए, के रूप में चित्रित कर रहे हैं. पैनल में स्केल बार एक 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है और पैनलों मुख्यालय पर लागू होता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. परिवर्तन विभिन्न प्रकाश क्षति मानदंड का पालन प्रसार प्रतिक्रिया है. PCNA साथ immunolabeled वयस्क सूरजमुखी मनुष्य zebrafish से रेटिना वर्गों में सेल प्रसार (लाल) को दिखाने के लिएपृष्ठीय (ई.) और उदर (एह) 0 घंटे पर प्रकाश क्षति मानदंड के प्रत्येक (48 HLT, 48 hpUV, और यूवी 48 HLT). एई) के बाद रेटिना के आधा, प्रसार भीतर परमाणु परत (से अनुपस्थित था लीग). बी, एफ) 48 HLT में, एकल पूर्वज कोशिकाओं पृष्ठीय रेटिना भर लीग में और उदर रेटिना के एक छोटे से हिस्से में मौजूद थे. तटरक्षक) 48 hpUV पर, पूर्वज कोशिकाओं का कॉलम, पृष्ठीय रेटिना में मौजूद थे केवल एक पूर्वज कोशिकाओं उदर रेटिना के एक छोटे से हिस्से में मौजूद थे. डी, एच) यूवी 48 HLT पर, पूर्वज कोशिकाओं के बड़े स्तंभों पृष्ठीय और उदर रेटिना में मौजूद थे. पैनल में स्केल बार एक 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है और पैनलों मुख्यालय पर लागू होता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .


6 चित्रा. रॉड और विभिन्न प्रकाश क्षति मानदंड का पालन रंजित zebrafish में कोन फोटोरिसेप्टर नुकसान वयस्क जंगली प्रकार (एबी) zebrafish से रेटिना वर्गों सभी नाभिक (एपी, नीला) को दिखाने के लिए प्रो-3 के साथ दाग. और रॉड को दिखाने के लिए ZPR-3 के साथ immunolabeled बाहरी क्षेत्रों (आह, मैजेंटा) या डबल शंकु (आईपी, सोना) को ZPR -1 पृष्ठीय (ई., आईजे) और उदर (एह, मध्य प्रदेश) में प्रकाश क्षति मानदंड के प्रत्येक निम्नलिखित रेटिना (48 HLT, 48 का आधा hpUV, और यूवी 48 HLT). मुख्यालय) रॉड फोटोरिसेप्टर नाभिक में महत्वपूर्ण कम हो जाती है यूवी 48 HLT (डी, एच, क्यू) को 48 HLT (बी, क्यू) और पृष्ठीय और उदर रेटिना में पृष्ठीय रेटिना में मौजूद थे . आईपी) कोन नाभिक पौष्टिक पदार्थों के कारण विस्तृत थे हालांकि मैं एन 48 hpUV (कश्मीर), डबल शंकु नाभिक में कोई महत्वपूर्ण घटने पर पृष्ठीय रेटिना 48 HLT या 48 hpUV (जेके, सं, आर) में मौजूद थे. कोन नाभिक में महत्वपूर्ण घटने यूवी 48 HLT (एल, पी, आर) पर पृष्ठीय और उदर रेटिना में मौजूद थे. मूल्यांकन) रॉड फोटोरिसेप्टर की मात्रा और केंद्रीय पृष्ठीय या उदर रेटिना के 300 मीटर के पार डबल शंकु नाभिक. समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर (पी ≤ 0.05) "एक" 48 HLT और 48 hpUV से अलग के लिए 'ग' से अलग के लिए 0 घंटा, "ख" से अलग करने के लिए, के रूप में चित्रित कर रहे हैं. पैनल में स्केल बार एक 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है और पैनलों मुख्यालय पर लागू होता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 7. पृष्ठीय (ई.) और उदर (एह) में सेल प्रसार (लाल) दिखाने के लिए PCNA साथ immunolabeled वयस्क जंगली प्रकार (एबी) zebrafish से विभिन्न प्रकाश क्षति मानदंड. रेटिना वर्गों का पालन रंजित zebrafish में प्रसार प्रतिक्रिया की प्रत्येक निम्नलिखित रेटिना के आधा प्रकाश क्षति मानदंड (48 HLT, 48 hpUV, और यूवी 48 HLT). ई.) पृष्ठीय रेटिना में, केवल कुछ ही पूर्वज कोशिकाओं, 48 HLT और 48 hpUV (बी, सी) में लीग में उपस्थित थे, जबकि कॉलम पूर्वज कोशिकाओं की यूवी 48 HLT (डी) में मौजूद थे. एह) उदर रेटिना में, प्रसार में कोई बदलाव नहीं पूर्वज कोशिकाओं के समय स्तंभ मौजूद थे जिस पर यूवी 48 HLT (एच), पर छोड़कर मनाया गया. पैनल में स्केल बार एक 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है और पैनलों मुख्यालय पर लागू होता है.7/51017fig7highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

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यहाँ हम व्यापक फोटोरिसेप्टर नुकसान और एक मजबूत उत्थान के जवाब में एक निरंतर उज्ज्वल प्रकाश जोखिम परिणामों के साथ एक छोटी यूवी जोखिम के संयोजन दिखाओ. व्यक्तिगत LIRD तरीकों के साथ तुलना में, इस संयुक्त विधि भी रेटिना के दोनों हिस्सों में छड़ और शंकु दोनों को नुकसान करने के लिए सबसे प्रभावी प्रोटोकॉल है. महत्वपूर्ण बात, इस उपचार रंजित जानवरों के साथ ही सूरजमुखी मनुष्य जानवरों में प्रभावी है.

हम और अधिक व्यापक और लगातार नुकसान में संयुक्त प्रोटोकॉल परिणाम व्यक्तिगत LIRD तरीकों के साथ तुलना में है कि सबूत प्रदान करते हैं, वैज्ञानिक विचार एक LIRD प्रतिमान का चयन करने से पहले चर्चा की जानी चाहिए. हमारे आंकड़े पूरे रेटिना ऊतक (यानी प्रोटिओमिक्स, वास्तविक समय पीसीआर) के विश्लेषण के लिए एकत्र किया जाता है जब संयुक्त विधि का उपयोग किया जाना चाहिए. हम संयुक्त विधि हलोजन जोखिम द्वारा पीछा सबसे बड़ा घाव आकार, और अंत में यूवी जोखिम था. हम सुझावविभिन्न रॉड और कोन उत्थान प्रभाव सकता है कि एक जीन या मार्ग की जांच जब संयुक्त विधि भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इस व्यावहारिक कारणों के लिए संभव नहीं है, तो हमारे डेटा विश्लेषण केंद्रीय पृष्ठीय रेटिना तक सीमित है अगर यूवी जोखिम, इन अध्ययनों के लिए अगले सबसे अच्छा तरीका है कि सुझाव.

उचित LIRD विधि का चयन करते समय व्यावहारिक कारणों से भी warranted रहे हैं. पहली चिंता आवश्यक उपकरणों की लागत है. सभी प्रोटोकॉल तमोनुकूलन (नहीं दिखाया डेटा) की एक लम्बी अवधि की आवश्यकता होती है. Zebrafish आवास मॉड्यूल में बनाया गया है कि एक आत्म निहित अंधेरे बाड़े आवश्यक अत्यंत सुविधाजनक है, लेकिन नहीं है. देखभाल टेप करने के लिए ले लिया है या तेजी से सील किया जाता है तो यह भी एक गत्ते का डिब्बा, इस्तेमाल किया जा सकता है, और पानी मापदंडों निगरानी कर रहे हैं. हलोजन आधारित LIRD विधि अत्यंत किफायती और सुविधाजनक है. सभी आइटम एक स्थानीय हार्डवेयर की दुकान पर $ 100 के तहत अमेरिका के लिए खरीदा है और कुछ ही मिनट लगते हैं स्थापित किया जा सकता है. टीवह इस पद्धति का ही व्यावहारिक नुकसान प्रकाश इलाज के रूप में एक ही कमरे में काम करने की असुविधा है. 4 दिनों के लिए लगातार चल रहा है जब रोशनी गर्मी का एक अच्छा राशि पैदा करते हैं और प्रकाश की तीव्रता को ध्यान भंग और मानव दर्शन करने के लिए संभावित हानिकारक दोनों है. यूवी और संयुक्त तरीकों हर प्रयोगशाला के लिए उपलब्ध नहीं है जो एक यूवी स्रोत की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, बड़ी सावधानी एक यूवी प्रकाश उपचार जब प्रदर्शन प्रयोगशाला के सदस्यों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए. यह एक अलग अंतरिक्ष में हलोजन प्रकाश उपकरण के लिए और अधिक सुविधाजनक है, जबकि इस प्रकार, यूवी इलाज की सुरक्षा चिंताओं को इस तरह के एक अंतरिक्ष की जरूरत. प्रकाश के इलाज के लिए इस्तेमाल किया यूवी स्रोत भी आम तौर पर एक "माइक्रोस्कोप कमरे" या इमेजिंग कोर में रखे एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के लिए प्रयोग किया जाता है, तो यह एक अतिरिक्त असुविधा हो जाता है. नियंत्रण और जानवरों की प्रयोगात्मक समूहों के लिए यूवी उपचार के कई दौर का निष्पादन एक ext के लिए माइक्रोस्कोप कमरा नीचे बंद की जरूरत होगीसमय की ensive लंबाई.

शायद संयुक्त विधि का उपयोग करने के लिए सबसे बड़ा लाभ रंजित जानवरों पर रेटिना उत्थान अध्ययन प्रदर्शन करने की क्षमता है. हम बताते हैं कि छड़ और पृष्ठीय और उदर रेटिना में शंकु की महत्वपूर्ण नुकसान में न तो व्यक्तिगत विधि का परिणाम है. इसके विपरीत, बड़े पैमाने पर रॉड और pigmented और सूरजमुखी मनुष्य जानवरों दोनों में कोन नुकसान के समान स्तर में संयुक्त LIRD प्रतिमान का परिणाम है. यह रेटिना उत्थान के अध्ययन के लिए सूरजमुखी मनुष्य पृष्ठभूमि पर ब्याज की ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्न करने और बनाए रखने के लिए की आवश्यकता समाप्त के रूप में रंजित जानवरों को इस LIRD पद्धति लागू करने की क्षमता, शोधकर्ता महत्वपूर्ण स्थान, समय, और प्रति दिन जानवरों की देखभाल की लागत (यदि हो तो) बचाता है . साथ में, हम वैज्ञानिक और व्यावहारिक लाभ यह सुधार LIRD विधि के संभावित असुविधाओं पल्ला झुकना कि लग रहा है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों उत्कृष्ट मछली पालन और तकनीकी सहायता के लिए Xixia लुओ धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के स्वास्थ्य अनुदान R21EY019401 (आरटी) और P30EY04068 (आर टी) के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित है, और वेन स्टेट यूनिवर्सिटी, नेत्र विज्ञान विभाग को दृष्टिहीनता को रोकने के लिए अनुसंधान से एक अप्रतिबंधित अनुदान सहित आरटी के लिए धन को शुरू किया गया था. संयुक्त वेन स्टेट यूनिवर्सिटी ग्रेजुएट स्कूल द्वारा प्रदान की गई थॉमस सी. रंबल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV light source Leica EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm) Sigma-Aldrich/Pyrex CLS3160152BO
250 ml glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS1000250
4 L glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS10004L
Aluminum foil Fisher 01-213-105
250 W halogen lamps Workforce 265-669
1.8 L clear acrylic tanks Aquaneering ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids Aquaneering ZT180LCL
Fan Honeywell HT-900
Aerator Tetra 77853-900
Thermometer Cole-Parmer YO-08008-58
Bent forceps (5/45) World Precision Instruments 504155

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References

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वयस्क Zebrafish में रेटिना पुनर्जनन अध्ययन में इस्तेमाल के लिए एक उपन्यास लाइट नुकसान प्रतिमान
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Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).More

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).

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