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Neuroscience

A Novel Luce Danni Paradigma per l'uso in retina Rigenerazione Studi in Zebrafish adulti

doi: 10.3791/51017 Published: October 24, 2013

Summary

Protocolli multipli danni leggeri sono stati descritti da fotorecettori danni e di conseguenza indurre una risposta rigenerazione della retina in zebrafish adulto. Questo protocollo descrive un metodo migliorato che può essere utilizzato in animali pigmentate e che danneggia la stragrande maggioranza di canna e cono fotorecettori attraverso l'intera retina.

Abstract

Indotto dalla luce degenerazione retinica (LIRD) è comunemente usato in entrambi i roditori e zebrafish per asta danni e fotorecettori cono. In zebrafish adulto, la degenerazione dei fotorecettori innesca Müller cellule gliali di rientrare nel ciclo cellulare e produrre progenitori transitoria-amplificazione. Questi progenitori continuano a proliferare quando migrano alla zona danneggiata, dove in ultima analisi, danno luogo a nuovi fotorecettori. Attualmente esistono due paradigmi LIRD ampiamente usate, ognuna delle quali provoca vari gradi di perdita dei fotorecettori e corrispondenti differenze nella risposta rigenerazione. Come strumenti più genetici e farmacologici sono disponibili per testare il ruolo dei singoli geni di interesse durante la rigenerazione, vi è la necessità di sviluppare un paradigma LIRD robusto. Qui si descrive un protocollo LIRD che si traduce in perdita diffusa e costante di entrambe bastoncelli e coni in cui abbiamo combinato l'uso di due tecniche LIRD stabiliti in precedenza. Inoltre, Questo protocollo può essere esteso ad animali pigmentati, che elimina la necessità di mantenere le linee transgeniche di interesse sullo sfondo albino per gli studi LIRD.

Introduction

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Indotto dalla luce degenerazione retinica (LIRD) è comunemente usato in entrambi i roditori e zebrafish per asta danni e fotorecettori cono. In zebrafish adulto, la degenerazione dei fotorecettori innesca Müller cellule gliali di rientrare nel ciclo cellulare e produrre progenitori transitoria-amplificazione. Questi progenitori continuano a proliferare quando migrano alla zona danneggiata, dove in ultima analisi, danno luogo a nuovi fotorecettori. Attualmente esistono due paradigmi LIRD ampiamente usate, ognuna delle quali provoca vari gradi di perdita dei fotorecettori e corrispondenti differenze nella risposta rigenerazione. Come strumenti più genetici e farmacologici sono disponibili per testare il ruolo dei singoli geni di interesse durante la rigenerazione, vi è la necessità di sviluppare un paradigma LIRD robusto. Qui si descrive un protocollo LIRD che si traduce in perdita diffusa e costante di entrambe bastoncelli e coni in cui abbiamo combinato l'uso di due tecniche LIRD stabiliti in precedenza. Inoltre, Questo protocollo può essere esteso ad animali pigmentati, che elimina la necessità di mantenere le linee transgeniche di interesse sullo sfondo albino per gli studi LIRD.

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Protocol

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Tutte le procedure descritte in questo protocollo è stato approvato dal comitato di utilizzo degli animali presso la Wayne State University School of Medicine.

1. Adattamento al buio

  1. Trasferimento ~ 10 pesci adulti albino o pigmentato dal sistema abitativo normale in un involucro scuro. Se disponibile, utilizzare un involucro scuro che è incorporata nel modulo alloggiamento zebrafish, che consente il flusso dell'acqua normale attraverso il serbatoio. (Se un tale sistema non sia disponibile, posizionare il serbatoio di pesce in un involucro completamente buio, avendo cura di aerare il pesce con l'ossigeno).
  2. Conservare il pesce al buio per 10 giorni. Quando l'alimentazione degli animali o l'aggiunta di nuovi pesci alla casella buio, assicurarsi di muoversi il più rapidamente possibile per evitare di esporre il pesce ad un lungo periodo di luce.

2. L'esposizione ai raggi UV della luce

  1. Assicurarsi che l'alimentazione alla sorgente di raggi UV è OFF. Rimuovere il filamento della luce UV da stereomicroscopio a fluorescenza.
    1. Utilizzare un inverted15 cm di diametro in vetro Petri (o qualcosa di simile due centimetri altezza) come supporto per il filamento UV. Tape la capsula di Petri di banco di laboratorio.
    2. Nastro il filamento luce UV alla parte superiore del piatto rovesciato Petri. Disporre modo che ~ 2 mm fine degli aggetti filamento capsula di Petri.
  2. Ottenere un bicchiere di vetro da 250 ml. Coprire ½ del fondo, laterale e posteriore del becher con foglio di alluminio, assicurandosi che il lato "splendente" della lamina affronta l'interno del bicchiere. Se il bicchiere è graduato, coprire la metà formulazione del bicchiere con un foglio, lasciando la chiara metà del bicchiere esposto.
  3. Riempire il becher da 250 ml con 100 ml di acqua dal sistema di impianto pesce.
  4. Porre il bicchiere da 250 ml in un bicchiere 4 L. Riempire il bicchiere 4 L con acqua finché il livello dell'acqua è anche con la linea 100 ml di acqua nel becher da 250 ml.
  5. Aggiungere un massimo di 10 animali scuro trattati al bicchiere da 250 ml. Coprire il bicchiere da 250 ml, con un piccolo pezzo di alluminiosventare.
  6. Posizionare l'intero apparato becher immediatamente adiacente al filamento UV. Il filamento deve toccare la parte esterna del bicchiere 4 L e rivolta verso la porzione esposta del becher da 250 ml. Assicurarsi che il bicchiere da 250 ml è centrata nel fondo del becher 4 L.
  7. Posizionare un grande schermo opaco dietro il becher 4L, consentendo gli animali siano esposti, ma impedendo qualsiasi personale di laboratorio di vedere la punta del filamento UV. ATTENZIONE: assicurarsi che questa barriera è a posto prima di accendere l'alimentazione alla sorgente di raggi UV.
  8. Accendere la fonte di energia UV. Imposta il timer per 30 min. Luogo con qualsiasi etichette di avvertimento necessarie per garantire che il personale di laboratorio ignari non si espongono accidentalmente a radiazioni UV.
  9. Dopo 30 minuti, spegnere la fonte di energia UV. Rimuovere il becher da 250 ml con il pesce. NOTA: se sono necessari più cicli di esposizione ai raggi UV, lasciare che la fonte di alimentazione raffreddare (~ 20 min) prima di ripetere il protocollo di esposizione. Assicurarsi di sostituire tha 100 ml di acqua con acqua fresca sistema per ogni esposizione. L'acqua nel becher 4 L non necessita di essere sostituito.

3. Lampada alogena Luce Esposizione

  1. Trasferire il pesce da 250 ml in un bicchiere L acrilico serbatoio di pesci 1.8. Riempire il serbatoio fino al segno di overflow.
  2. Posizionare la lampada zona da trattare luce alogena. Ottenere quattro 250 W Lampade alogene utilità da un negozio di ferramenta locale. Di fronte a due lampade nella stessa direzione, organizzare 29 centimetri a parte sul centro. Disporre le altre due lampade in modo simile.
    1. Posizionare la seconda serie di lampade in modo che essi sono di fronte alla prima serie di lampade, lasciando ~ 73 cm tra gli insiemi di due lampade. Questo crea una zona di trattamento luce a forma di rettangolo di 29 x 73 cm.
  3. Ottenere un piccolo ventilatore da un negozio di ferramenta locale. Posizionare la ventola equidistante tra le due serie di lampade, appena al di fuori della zona di trattamento luce.
  4. Posizionare due 1.8 L serbatoi pieni di acqua nel centro delzona di trattamento luce, equidistante tra le due serie di lampade. La distanza tra le lampade e la parete esterna del serbatoio dovrebbe essere ~ 29 cm. Nota: anche se solo trattamento 10 pesci in un serbatoio di 1,8 L, utilizzare questo accordo. Sono necessari entrambi i serbatoi per mantenere la temperatura dell'acqua di ciascun serbatoio all'interno della gamma appropriata.
  5. Inserire un aeratore ossigeno in ogni serbatoio.
  6. Coprire ogni serbatoio con chiare coperchi acrilici, lasciando un ~ 2 centimetri vuoto a fine vicina alla ventola. Disporre la ventola in modo che possa soffiare aria in questa lacuna. Posizionare un termometro in uno o entrambi i serbatoi.
  7. Attivare l'alimentazione per le luci, ventole e aeratori. Mantenere il trattamento della luce per un massimo di 4 giorni. Il pesce non deve essere alimentato durante il trattamento con la luce, per non compromettere la qualità dell'acqua e provocare più stress agli animali.
  8. Monitorare il livello di temperatura e di acqua su una base quotidiana. Mantenere la temperatura a 30-33 ° C. Se necessario, regolare la velocità della ventola e / o la distanza tra i serbatoi e il lights.
    1. Top fuori ogni serbatoio con acqua sistema, se necessario, di solito tutti i giorni.
    2. Usare sempre sano zebrafish adulto (tipicamente 6-9 mesi di età) a mantenere un tasso di sopravvivenza di quasi il 100%. Tuttavia, se un pesce viene trovato morto nel serbatoio, rimuoverla immediatamente e sostituire l'acqua nel serbatoio intero.

4. Collezione tessuti

  1. 48 ore dopo l'inizio del trattamento con luce alogena togliere il pesce dalla zona da trattare.
    1. Preparare fresco fissativo formaldeide etanolica (1 parte di formaldeide al 37%, 9 parti di 100% di etanolo).
    2. Euthanize zebrafish con una dose eccessiva di anestetico 2-fenossietanolo (0,4 mg / L).
    3. Trasferire il pesce zebra eutanasia di un tovagliolo di carta. Enucleare l'occhio usando pinze curve.
    4. Mettere gli occhi enucleati in fissativo e negozio O / N a 4 ° C.
  2. Cryoprotect gli occhi.
    1. Lavare gli occhi in 5% di saccarosio 1x PBS per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi sostituire confresco 5% di saccarosio 1x PBS per 2 h. Successivamente, lavare gli occhi nel 30% saccarosio PBS 1x O / N a 4 ° C. Lavare gli occhi in un 01:01 (parti uguali) del tessuto congelamento medie e il 30% di saccarosio 1x PBS O / N a 4 ° C.
  3. Incorpora gli occhi in 100% tessuto congelamento medio e conservare a -80 ° C. Orientare gli occhi in modo che criosezionamento del tessuto viene eseguita sul asse dorsale / ventrale.
  4. Cryosection il tessuto e posto su vetrini. Diapositive caldi per 2 ore a 55 ° C. Conservare i vetrini a -80 ° C o eseguire immediatamente immunoistochimica standard.
  5. Eseguire immunoistochimica standard su tessuto sezionato e immagine con la microscopia a fluorescenza 40,51.

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Representative Results

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Il protocollo di trattamento finora descritto luce è stata confrontata con ogni singolo metodo di LIRD. Nel buio trattati con animali adulti albini (Figure 3-5), i singoli trattamenti di luce determinato una notevole perdita di canna (figura 3) e il cono (Figura 4) fotorecettori. Tuttavia, entrambi i trattamenti individuali principalmente danneggiati fotorecettori nella metà dorsale della retina, lasciando la retina ventrale relativamente protetto dai trattamenti di luce (figure 3 e 4). Inoltre, rispetto al trattamento con luce alogena, il trattamento luce UV danneggiato più cono fotorecettori nella metà dorsale della retina (confrontare Figure 4B con C, rispettivamente). Combinando i raggi UV e alogene trattamenti di luce provocato significativamente maggiore perdita di entrambi asta e cono fotorecettori tutta la retina, eliminando in gran parte il neuroprotection della metà ventrale della retina (figure 3 e 4). Rispetto ai singoli metodi LIRD, un corrispondente incremento della proliferazione stato osservato anche nella retina ventrale quando è stato utilizzato il protocollo di trattamento combinato luce (Figura 5).

Animali pigmentate sono più resistenti alle LIRD causa di epitelio pigmentato retinico, che assorbe la luce e protegge i fotorecettori di fototossicità. Animali pigmentate come previsto, adattata al buio erano quasi completamente resistente al trattamento luce alogena da solo (Figure 6B, J e N). Abbiamo trovato che 48 ore dopo l'insorgenza luce, bastoncelli stati ridotti nella retina dorsale, ma non retina ventrale (figure 6E, F e Q). Cono fotorecettore nuclei erano presenti in numero normale (Figura 6R). Rispetto alle retine non trattati, luce alogenatrattamento da solo, inoltre, non ha aumentato Müller proliferazione delle cellule gliali a 48 ore dopo l'insorgenza della luce (figure 7B e F). Negli animali albini, trattamento UV solo provocato leggermente maggiore danno a entrambi coni e bastoncelli fotorecettori della retina dorsale (figure 3i e 4i). Tuttavia, negli animali pigmentati, trattamento della luce UV da solo non ha ridotto in modo significativo asta o numero di cellule cono (figure 6c, G, K, O, Q e R). Inoltre, il solo trattamento UV causato solo una risposta rigenerativa debole nella metà dorsale della retina in animali pigmentate (Figura 7C). In contrasto con i singoli risultati LIRD, combinando il trattamenti di luce alogena UV e provocato significativamente maggiore danno fotorecettori e risposta rigenerativa in animali pigmentate. Soprattutto, perdita significativa di entrambe le aste e coni è stata osservata sia il Dorsa L e ventrale retine (Figure 6D, H, L, P, Q e R). Rispetto ai metodi LIRD non trattati e individuale, un corrispondente incremento della proliferazione è stata anche osservata in entrambe le metà dorsale e ventrale della retina quando è stato utilizzato il protocollo di trattamento combinato luce (Figura 5).

Figura 1
Figura 1. Fotografia che ritrae la luce alogena configurazione trattamento. Due gruppi di quattro lampade alogene da 250 W sono stati distanziati 29 centimetri su entrambi i lati di due vasche acriliche chiare 1,8 L. L'aeratore e tubi sono stati collocati in modo da non ostruire la luce. I coperchi dei serbatoi erano incrinate due centimetri per permettere il flusso d'aria della ventola. Un termometro è stato posto in una delle vasche per la temperatura da monitorare.arget = "_blank"> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2
Figura 2. Fotografia che ritrae il setup UV trattamento della luce. La sorgente di luce UV da uno stereomicroscopio a fluorescenza è stato fissato saldamente ad un piatto di vetro Petri ~ 2 cm da banco. A 250 ml bicchiere di vetro, parzialmente avvolto in un foglio, era piena volontà 100 ml di acqua del sistema. I pesci sono stati collocati all'interno del becher da 250 ml. Il bicchiere da 250 ml è stata centrata all'interno di un becher 4 L, che è stato riempito con acqua sistema al livello dell'acqua nel becher da 250 ml. Il bicchiere 4 L è stato collocato adiacente al filamento luce centrato in becher da 250 ml. Un grande schermo opaco è collocato intorno l'intero setup. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .


Figura 3. Rod perdita dei fotorecettori in zebrafish albino seguendo diversi paradigmi danno luce sezioni retiniche da adulto Tg (NRD: EGFP). / Alb immunolabeled con GFP per mostrare asta densità di fotorecettori (verde) nella dorsale (AD) e ventrale (EH) dimezza della retina . A, E) Prima dell'inizio della luce (0 ore), EGFP-positiva asta fotorecettori nuclei (ONL) e segmenti esterni (ROS) possono essere visualizzati. B, F) a 48 ore seguenti insorgenza luce alogena (HLT), troncato ROS e significativamente meno nuclei asta (I) erano presenti nella dorsale, ma non retina ventrale. CG) a 48 ore dopo 30 minuti di esposizione ai raggi UV (hpUV), significativamente meno nuclei asta erano presenti nelle retine dorsale e ventrale rispetto a 0 ore (C, G < / Strong>), ma non 48 trattamenti HLT (G, I). DH) 48 hr seguente all'inizio del trattamento combinato luce (30 minuti di esposizione ai raggi UV seguita dal trattamento alogeno; UV 48 HLT), quasi nessuna ROS erano presenti in retine dorsale o ventrale, oltre ad una significativa perdita di rod nuclei fotorecettori (I) i.) Quantificazione dei rod fotorecettori nuclei attraverso 300 micron della dorsale centrale o retina ventrale. Differenze significative (p ≤ 0,05) tra i gruppi vengono descritti come: "a" per diverso da 0 hr, "b" per diverso da 48 HLT e "C" per la differente da 48 hpUV. Barra di scala nel pannello A rappresenta 50 micron e si applica ai pannelli AH. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Figura 4. Perdita di doppio cono in zebrafish albino seguendo diversi paradigmi danno chiaro. Sezioni retiniche da adulto zebrafish albino immunolabeled con zpr-1 per mostrare due coni (oro) nella dorsale (AD) e ventrale (EH) Metà della retina a seguito di ciascuna luce paradigmi danno (48 HLT, 48 hpUV e UV +48 HLT). A, E) a 0 ore, doppio cono nuclei erano presenti in retine dorsale e ventrale. B, F) a 48 HLT, un numero significativamente inferiore coni doppi erano presenti in solo la retina ventrale (F, I). CG) A 48 hpUV, significativamente meno coni doppi (I) e una grande quantità di detriti era presente solo la retina dorsale (C), mentre non sono stati osservati cambiamenti nella retina ventrale (G). DH) A UV +48 HLT, significativamente meno doppio conos (I) e molto poco detriti era presente in retine dorsale e ventrale. I) Quantificazione dei doppi coni in tutto 300 micron della dorsale centrale o retina ventrale. Differenze significative (p ≤ 0,05) tra i gruppi sono dipinti come, "a" per diverso da 0 hr, "b" per diverso da 48 HLT e "C" per la differente da 48 hpUV. Barra di scala nel pannello A rappresenta 100 micron e si applica ai pannelli AH. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 5
Figura 5. Cambia è la risposta proliferazione seguendo diversi paradigmi danno chiaro. Sezioni retiniche da adulto zebrafish albino immunolabeled con PCNA per mostrare la proliferazione cellulare (rosso)la dorsale (AD) e ventrale (EH), metà della retina a seguito di ciascuno dei paradigmi danni leggeri (48 HLT, 48 hpUV e UV +48 HLT). AE) A 0 ORE, proliferazione era assente dallo strato nucleare interno ( INL). B, F) a 48 HLT, cellule progenitrici singoli erano presenti nel INL attraverso la retina dorsale e in una piccola porzione della retina ventrale. CG) a 48 hpUV, colonne di cellule progenitrici erano presenti nella retina dorsale, mentre solo le cellule progenitrici singoli erano presenti in una piccola porzione della retina ventrale. D, H) Alla UV 48 HLT, grandi colonne di cellule progenitrici erano presenti in tutta la retina dorsale e ventrale. Barra di scala nel pannello A rappresenta 100 micron e si applica ai pannelli AH. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .


Figura 6. Rod e cono perdita dei fotorecettori in zebrafish pigmentato seguendo diversi paradigmi danno luce sezioni retiniche da adulto wild-type (AB) zebrafish colorate con TO-PRO-3 per mostrare tutti i nuclei (AP, blu). Ed immunolabeled con zpr-3 per mostrare asta segmenti esterni (AH; magenta) o zpr-1 a due coni (IP; oro) nella dorsale (AD, IJ) e ventrale (EH, MP) Metà della retina a seguito di ciascuno dei paradigmi danni leggeri (HLT 48, 48 hpUV e UV +48 HLT). AH) diminuzioni significative di rod fotorecettori nuclei erano presenti nella retina dorsale a 48 HLT (B, Q) e nella retina dorsale e ventrale a UV +48 HLT (D, H, Q) . IP) Sebbene nuclei cono stati ipertrofico i n la retina dorsale a 48 hpUV (K), non significative diminuzioni doppia nuclei cono erano presenti alla 48 HLT o 48 hpUV (JK, NO, R). Diminuzioni significative nei nuclei cono erano presenti nella retina dorsale e ventrale a UV +48 HLT (L, P, R). QR) Quantificazione dei rod fotorecettori e doppio nuclei cono attraverso 300 micron della dorsale centrale o retina ventrale. Differenze significative (p ≤ 0,05) tra i gruppi sono dipinti come, "a" per diverso da 0 hr, "b" per diverso da 48 HLT e "C" per la differente da 48 hpUV. Barra di scala nel pannello A rappresenta 200 micron e si applica ai pannelli AH. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Figura 7. Risposta di proliferazione in zebrafish pigmentato seguendo vari leggeri danni paradigmi. Sezioni retiniche da adulto wild-type (AB) zebrafish immunolabeled con PCNA per mostrare la proliferazione cellulare (rosso) nella dorsale (AD) e ventrale (EH) dimezza della retina a seguito di ciascuno dei i paradigmi di luce danno (48 HLT, 48 hpUV e UV +48 HLT). AD) nel retina dorsale, solo poche cellule progenitrici singoli erano presenti nel INL a 48 HLT e 48 hpUV (B, C), mentre le colonne di cellule progenitrici erano presenti UV 48 HLT (D). EH) Nella retina ventrale, nessun cambiamento nella proliferazione stati osservati se non a UV 48 HLT (H), in cui le colonne temporali di cellule progenitrici erano presenti. Barra di scala nel pannello A rappresenta 100 micron e si applica ai pannelli AH.7/51017fig7highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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Discussion

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Qui mostriamo che la combinazione di una breve esposizione ai raggi UV, con un continuo brillante luce i risultati di esposizione nella perdita dei fotorecettori capillare e una risposta rigenerazione robusto. Rispetto ai singoli metodi LIRD, questo metodo combinato è anche il protocollo più efficace per danneggiare entrambe le aste e coni in entrambe le metà della retina. È importante sottolineare che questo trattamento è efficace in animali pigmentati così come gli animali albini.

Anche se forniamo la prova che i risultati dei protocolli combinati a danni più diffusa e coerente rispetto ai singoli metodi LIRD, considerazioni scientifiche dovrebbero essere discusse prima di scegliere un paradigma LIRD. I nostri dati suggeriscono che il metodo combinato dovrebbe essere utilizzato quando l'intero tessuto retinico viene raccolto per l'analisi (cioè proteomica, real-time PCR). Abbiamo trovato che il metodo combinato ha avuto la maggiore dimensione della lesione, seguito dall'esposizione alogeno, e infine la esposizione ai raggi UV. Suggeriamoche il metodo combinato essere utilizzato anche quando indagare un gene o un percorso che potrebbe influenzare differenzialmente asta e rigenerazione cono. Se questo non è possibile per motivi pratici, i nostri dati suggeriscono che l'esposizione UV è il metodo migliore seguente per questi studi, se l'analisi si limita alla retina dorsale centrale.

Considerazioni pratiche sono coperti da garanzia quando si seleziona il metodo LIRD appropriato. La prima preoccupazione è il costo delle attrezzature necessarie. Tutti i protocolli richiedono un prolungato periodo di adattamento al buio (dati non mostrati). Un self-contained involucro scuro che è integrato nel modulo alloggiamento zebrafish è estremamente conveniente, ma non necessario. Anche una scatola di cartone può essere utilizzato, se si fa attenzione a nastro o sigillare le cuciture, ed i parametri dell'acqua sono monitorati. Il metodo LIRD base alogena è estremamente economico e conveniente. Tutti gli articoli possono essere acquistati per meno di 100 $ US in un negozio di ferramenta locale e configurare in pochi minuti. Tegli solo svantaggio pratico di questo metodo è l'inconveniente di lavoro nella stessa stanza come il trattamento con la luce. Le luci di generare una buona quantità di calore durante il funzionamento in continuo per 4 giorni e l'intensità della luce è sia fonte di distrazione e potenzialmente dannoso per la visione umana. I metodi UV e combinati richiedono una fonte UV, che non è disponibile per ogni laboratorio. Inoltre, grande attenzione dovrebbe essere presa per garantire la sicurezza dei membri del laboratorio durante l'esecuzione di un trattamento con luce UV. Così, mentre è più conveniente avere l'apparato luce alogena in uno spazio isolato, i problemi di sicurezza del trattamento UV richiedono un tale spazio. Questo diventa un inconveniente addizionale se la sorgente UV utilizzata per il trattamento di luce viene inoltre utilizzato per un microscopio a fluorescenza alloggiata in una camera "microscopio" o nucleo di imaging. Esecuzione di vari cicli di trattamenti UV per il controllo e gruppi sperimentali di animali richiederebbe la chiusura della stanza microscopio per un extlunghezza ensive di tempo.

Forse il più grande vantaggio di utilizzare il metodo combinato è la capacità di eseguire studi su animali rigenerazione retiniche pigmentate. Mostriamo che né metodo risultati individuali in una significativa perdita di coni e bastoncelli della retina dorsale e ventrale. Al contrario, i risultati combinati LIRD paradigma in livelli simili di asta diffusa e perdita cono sia negli animali pigmentati e albino. La capacità di applicare questo metodo LIRD agli animali pigmentate salva spazio ricercatore significativo, il tempo, e giornaliere costi di cura degli animali (se presenti), in quanto elimina la necessità di generare e mantenere linee transgeniche di interesse sullo sfondo albino per gli studi di rigenerazione della retina . Insieme, riteniamo che i vantaggi scientifici e pratici superano i potenziali inconvenienti di questo metodo LIRD migliorata.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Xixia Luo per un'eccellente allevamento di pesci e di supporto tecnico. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health sovvenzioni R21EY019401 (RT) e P30EY04068 (RT), e fondi di start-up a RT, tra cui una sovvenzione illimitata di ricerca per prevenire la cecità alla Wayne State University, Dipartimento di Oftalmologia. JT è stato sostenuto da un Thomas C. Rumble Fellowship fornito dalla Wayne State University Graduate School.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV light source Leica EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm) Sigma-Aldrich/Pyrex CLS3160152BO
250 ml glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS1000250
4 L glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS10004L
Aluminum foil Fisher 01-213-105
250 W halogen lamps Workforce 265-669
1.8 L clear acrylic tanks Aquaneering ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids Aquaneering ZT180LCL
Fan Honeywell HT-900
Aerator Tetra 77853-900
Thermometer Cole-Parmer YO-08008-58
Bent forceps (5/45) World Precision Instruments 504155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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A Novel Luce Danni Paradigma per l&#39;uso in retina Rigenerazione Studi in Zebrafish adulti
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Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).More

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).

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