Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Yetişkin Zebra balığı Retina Rejenerasyon Çalışmaları Kullanım için Yeni Bir Işık Hasar Paradigma

doi: 10.3791/51017 Published: October 24, 2013

Summary

Çoklu ışık zarar protokolleri zarar fotoreseptör tarif ve dolayısıyla yetişkin zebrafish bir retina rejenerasyon tepki neden olmuştur. Bu protokol, pigmentli hayvanlarda kullanılabilen geliştirilmiş bir yöntem açıklanır ve bu çubuk ve tüm retinada arasında koni fotoreseptörlerin büyük çoğunluğu zarar verir.

Abstract

Işık kaynaklı retina dejenerasyonuna (LIRD) genellikle kemirgenlerde ve hasar çubuk ve koni fotoreseptör için zebrabalıkları hem de kullanılır. Yetişkin Zebra balığı, fotoreseptör dejenerasyonu Müller glial hücreler yeniden girmek hücre döngüsü için tetikler ve geçici-yükselterek ataları üretmek. Bu ataları onlar sonuçta yeni bir fotoreseptör neden hasarlı bölgeye, göç gibi yayılmaya devam etmektedir. Şu anda, iki yaygın olarak kullanılan LIRD paradigmalar, her biri yenilenmesi yanıt olarak fotoreseptör kaybını ve buna tekabül eden farklar değişen derecelerde sonuçlar birçok türü vardır. Daha fazla genetik ve farmakolojik rejenerasyon sırasında ilgi tek tek genlerin rolü test etmek için kullanılabilir gibi, güçlü bir LIRD paradigma geliştirmek için bir ihtiyaç vardır. Burada bir LIRD protokol açıklar biz iki daha önce kurulmuş LIRD tekniklerinin kullanılması birleştirdik hangi çubuk ve koni fotoreseptör hem de yaygın ve tutarlı kaybına neden olur. Ayrıca, Bu protokol LIRD çalışmaları için albino arka planda ilgi transgenik hatları korumak için gereğini ortadan kaldırır pigmentli hayvanlarda kullanılmak üzere uzatılabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Işık kaynaklı retina dejenerasyonuna (LIRD) genellikle kemirgenlerde ve hasar çubuk ve koni fotoreseptör için zebrabalıkları hem de kullanılır. Yetişkin Zebra balığı, fotoreseptör dejenerasyonu Müller glial hücreler yeniden girmek hücre döngüsü için tetikler ve geçici-yükselterek ataları üretmek. Bu ataları onlar sonuçta yeni bir fotoreseptör neden hasarlı bölgeye, göç gibi yayılmaya devam etmektedir. Şu anda, iki yaygın olarak kullanılan LIRD paradigmalar, her biri yenilenmesi yanıt olarak fotoreseptör kaybını ve buna tekabül eden farklar değişen derecelerde sonuçlar birçok türü vardır. Daha fazla genetik ve farmakolojik rejenerasyon sırasında ilgi tek tek genlerin rolü test etmek için kullanılabilir gibi, güçlü bir LIRD paradigma geliştirmek için bir ihtiyaç vardır. Burada bir LIRD protokol açıklar biz iki daha önce kurulmuş LIRD tekniklerinin kullanılması birleştirdik hangi çubuk ve koni fotoreseptör hem de yaygın ve tutarlı kaybına neden olur. Ayrıca, Bu protokol LIRD çalışmaları için albino arka planda ilgi transgenik hatları korumak için gereğini ortadan kaldırır pigmentli hayvanlarda kullanılmak üzere uzatılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol açıklanan tüm prosedürleri Tıp Wayne State Üniversitesi Okulu'nda hayvan kullanımı komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Koyu Adaptasyon

  1. Transferi karanlık bir muhafaza içine normal konut sisteminden 10 yetişkin albino veya pigmentli balık ~. Varsa, tank ile normal su akışını sağlayan Zebra balığı konut modülü, yerleşik bir karanlık muhafaza kullanın. (Böyle bir sistem mevcut değilse, oksijen ile balık havalandırmak için emin olun, tamamen karanlık bir muhafaza içinde akvaryum yerleştirin).
  2. 10 gün boyunca karanlıkta balık tutun. Hayvan besleme veya koyu kutusuna yeni balık eklerken, ışık uzun bir süre için balık maruz kalmasını önlemek için mümkün olduğunca çabuk hareket etmek emin olun.

2. UV Pozlama

  1. UV kaynağı için güç KAPALI olduğundan emin olun. Floresan stereomikroskopta gelen UV ışığı filament çıkarın.
    1. Ters bir kullanmaUV filament için bir stand olarak 15 cm çapında cam Petri kabı (ya da benzer bir 2 cm yüksekliğinde bir şey). Laboratuar tezgah Petri kabı bant.
    2. Bant UV ışığı filament ters Petri kabı dön. Düzenlemek böylece Petri kabı filamanın çıkıntılar sonu ~ 2 mm.
  2. 250 ml'lik bir cam kabın elde edilir. Alt ½, iki ve arka alüminyum folyo ile beher, folyo "parlak" yan beher iç yüzleri emin Kapak. Beher derecelendirilmişse, maruz beher açık yarım bırakarak, folyo ile beher ifadeli yarısını kapsar.
  3. Balık tesisi sistemi, 100 ml su ile 250 ml beher doldurun.
  4. Bir 4 L'lik bir behere 250 ml beher yerleştirin. Su seviyesi, hatta 250 ml beher 100 ml su hattı ile kadar su ile 4 L kaba doldurun.
  5. 250 ml'lik behere 10 koyu ile muamele edilmiş hayvanların, maksimum ekleyin. Alüminyum küçük bir parça ile 250 ml beher Kapakfolyo.
  6. UV filamana hemen bitişiğindeki tüm beher cihaz yerleştirin. Filaman 4 L kaba dış dokunarak ve 250 ml'lik bir açıkta kalan kısmı bakmalıdır. 250 ml'lik 4 L kaba alt merkezli olduğundan emin olun.
  7. Maruz hayvanlar için izin, ancak UV filamanın ucu görmesini herhangi bir laboratuar personeli önlenmesi, 4L beher arkasında büyük, opak ekran yerleştirin. UYARI: Bu bariyer UV kaynağına Gücü açmadan ÖNCE yerinde olduğundan emin olun.
  8. UV güç kaynağı açın. 30 dakika zamanlayıcı ayarlayın. Ne olursa olsun gerekli uyarı etiketleri bu masum laboratuar personeli yanlışlıkla UV ışınlarına kendilerini maruz bırakmayın sağlamak için yerleştirin.
  9. 30 dakika sonra, UV güç kaynağı kapatın. Balık ile 250 ml beher çıkarın. NOT: UV ışınlarına maruz kalma birden fazla tur gerekiyorsa, pozlama protokolü tekrar önce (~ 20 dk) aşağı güç kaynağı soğumasını bekleyin. T yerine emin olunO her teşhir için taze sistemi su ile, 100 ml su. 4 L beher su değiştirilmesi gerekmez.

3. Halojen Lamba Işık Pozlama

  1. 1.8 L açık akrilik akvaryum içine 250 ml kaptan balık aktarın. Taşma işareti doldurun.
  2. Halojen lamba ışığı tedavi alanı ayarlayın. Yerel bir nalburdan dört 250 W halojen lambalar programı edinin. Aynı yönde iki lamba bakan, merkezi dışında 29 cm düzenlemek. Benzer bir şekilde diğer iki lamba düzenleyin.
    1. Bu lambaların her iki set arasında ~ 73 cm bırakarak, lambalar ilk kümesi bakacak şekilde lambaların ikinci kümesi yerleştirin. Bu 29 x 73 cm dikdörtgen şeklinde ışık tedavisi alan oluşturur.
  3. Yerel bir nalburdan küçük bir fan alın. Sadece ışık tedavisi alanı dışında, lambaların iki takım arasında eşit uzaklıkta fan yerleştirin.
  4. Ortasına su dolu iki 1.8 L tank yerleştirinlambaların iki takım arasında eşit uzaklıkta ışık tedavisi alan,. Lambaları ve tankın dış duvar arasındaki mesafe ~ 29 cm olmalıdır. Not: Sadece bir 1,8 L tankta 10 balık tedavi olsa bile, bu düzenleme kullanın. Her iki tank uygun aralık içinde her tankın su sıcaklığı tutmak için gereklidir.
  5. Her tankta bir oksijen havalandırıcı yerleştirin.
  6. Fan en yakın sonunda bir ~ 2 cm boşluk bırakarak, şeffaf akrilik kapaklı her tankı kapağı. Bu boşluğu içine hava darbe böylece fan düzenleyin. Tanklarının biri veya her ikisi bir termometre yerleştirin.
  7. Işıklar, fan ve havalandırıcılar için güç açın. En fazla 4 gün için ışık tedavisi koruyun. Bu hayvanlara daha fazla stres su kalitesi ve sonuç etkileyecek gibi balık, ışık tedavisi sırasında verilmemelidir.
  8. Günlük olarak ısı ve su izleyin. 30-33 ° C sıcaklıkta muhafaza Gerekirse, fan hızı ve / veya tank ve Li arasındaki mesafeyi ayarlamakghts.
    1. Gerektiği gibi, genellikle günlük sistemi su ile her bir tank kapalı üst.
    2. Her zaman% 100 yakın bir hayatta kalma oranı korumak için sağlıklı yetişkin zebrafish (yaş genellikle 6-9 ay) kullanın. Bir balık tankında ölü bulundu Ancak, eğer, hemen çıkarın ve tüm depodaki su değiştirin.

4. Doku Toplama

  1. Halojen ışık tedavinin başlangıcından sonra 48 saat tedavi alanından balık çıkarın.
    1. Taze etanol formaldehit fiksatif (1 kısım% 37 formaldehit, 9 parça% 100 etanol) hazırlayın.
    2. 2-fenoksietanol (0.4 mg / L) bir anestezik doz aşımı ile Zebra balığı euthanize.
    3. Bir kağıt havlu için ötenazi Zebra balığı aktarın. Kavisli bir forseps kullanarak göz tanıttılar.
    4. 4 ° C'de sabitleştirici ve mağaza O / N enüklee gözleri yerleştirin
  2. Gözler cryoprotect.
    1. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 sakkaroz 1x PBS yıkayınız, sonra bunun yerine2 saat boyunca% 5 sakkaroz taze PBS 1x. Daha sonra, 4 ° C'de% 30 sukroz PBS 1x O / N yıkayın 4 ° C'de bir doku dondurma orta ve% 30 sakaroz PBS 1x O / N 1:1 'lik bir (eşit bölümler) içinde yıkayın
  3. -80% 100 doku dondurma orta ve mağaza gözleri Embed ° C Yönlendirmek gözleri böylece doku cryosectioning dorsal / ventral eksen üzerinde gerçekleştirilir.
  4. Cam slaytlar cryosection doku ve yer. 55 ° C'de 2 saat boyunca sıcak slaytlar -80 Mağaza slaytlar ° C veya hemen standart immünhistokimya gerçekleştirin.
  5. Floresan mikroskobu 40,51 ile kesitli doku ve görüntü standart immünhistokimya gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Evvel tarif ışık tedavi protokolü LIRD her bir yöntemi ile karşılaştırılmıştır. Koyu ile tedavi edilen hayvanlarda yetişkin albino (Şekil 3-5), bireysel ışık tedavileri önemli bir çubuk kaybı (Şekil 3) ve koni (Şekil 4) fotoreseptör sonuçlandı. Ancak, her iki bireysel tedaviler öncelikle nispeten ışık tedavileri (Şekil 3 ve 4) korunmaktadır ventral retina bırakarak, retinanın dorsal yarısında fotoreseptör zarar. Buna ek olarak, halojen ışık tedavi ile karşılaştırıldığında, UV ışık tedavisi retina dorsal yarısı (sırasıyla Şekiller 4B C karşılaştırın) daha fazla koni fotoreseptörlerin hasar görmüştür. Büyük ölçüde n ortadan kaldırarak, retina boyunca çubuk ve koni fotoreseptör hem de anlamlı olarak daha fazla kaybı ile sonuçlanan UV ve halojen ışık tedavileri birleştirenretina ventral yarısı (Şekiller 3 ve 4) europrotection. Birleştirilen ışık tedavi protokolünün kullanıldığı zaman tek tek LIRD yöntemleri ile karşılaştırıldığında, proliferasyonunu karşılık gelen bir artış, aynı zamanda ventral retina gözlendi (Şekil 5).

Pigmentli hayvanlar ışığı emer ve fototoksisite gelen fotoreseptör korur retina pigmente epitel, nedeniyle LIRD daha dayanıklıdır. Beklendiği gibi, karanlığa adapte pigmentli hayvan başına halojen ışık tedavisi (Şekil 6B, J ve K) hemen hemen tamamen dirençliydi. Biz 48 saat ışık başlamasından sonra, çubuk fotoreseptör dorsal retinada azaldığını tespit etmiştir, ancak ventral retina (Şekil 6E, F ve Q). Koni fotoreseptör çekirdekleri Normal numaraları (Şekil 6R) mevcuttu. Tedavi edilmeyen retina, halojen ışık ile karşılaştırıldığındatek başına tedavisi de ışık başlangıçlı (Şekil 7B ve F) sonra Müller glial hücre çoğalması 48 saat artmadı. Albino Hayvanlarda, tek başına UV ışık tedavisi dorsal retina (Şekil 3I ve 4I) olarak çubuk ve koni fotoreseptör hem de biraz daha fazla hasara neden olmuştur. Ancak, pigmentli hayvanlarda, tek başına UV ışık tedavisi önemli ölçüde çubuk veya koni hücre sayısı (Şekil 6C, G, K, O, Q, ve R) azaltmadı. Buna ek olarak, tek başına UV tedavi sadece pigmentli hayvanlarda retinanın dorsal yarısı (Şekil 7C) zayıf bir rejeneratif bir yanıtı ortaya çıkardı. Bireysel LIRD sonuçların aksine, UV ve halojen ışık tedavileri birleştirerek önemli ölçüde daha fazla fotoreseptör hasarı ve pigmentli hayvanlarda rejeneratif tepkide sonuçlandı. Önemli olarak, çubuk ve koni de önemli bir kayıp Dorsa hem de gözlenmiştir L ve ventral retinaları (Şekil 6D, H, L, P, Q ve R). Birleştirilen ışık tedavi protokolü (Şekil 5) kullanıldığı zaman tedavi edilmemiş ve bireysel LIRD yöntemleri ile karşılaştırıldığında, proliferasyonunu karşılık gelen bir artış, aynı zamanda, retina dorsal ve ventral iki yarısı gözlenmiştir.

Şekil 1
Şekil 1. Fotoğraf halojen ışık tedavisi kurulum tasvir. Dört 250 W halojen lambalar İki takım iki net 1.8 L akrilik tanklarının iki tarafında 29 cm aralıklı. Işık engel olarak değil havalandırıcı ve boru çok yerleştirildi. Tankların kapakları fan ile hava akımını sağlamak için 2 cm kırık. Bir termometre izlenecek sıcaklık için tankların birinde yerleştirildi.arget = "_blank"> büyük resim görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2,
Şekil 2. Fotoğraf UV ışık tedavisi kurulum tasvir. Floresan stereomikroskopta gelen UV ışık kaynağı güvenli ~ 2 cm tezgah üstü kapalı bir cam Petri kabı tespit edildi. Kısmi folyo ile sarılmış bir 250 ml'lik bir cam kabın, doldurulmuş olan sistem, 100 ml su olacaktır. Balık 250 ml çanak içine yerleştirilmiştir. 250 ml'lik behere 250 ml çanak içinde su seviyesine sistemi su ile doldurulmuş bir 4 L kaba, içinde merkezlenmiştir. 4 L kaba 250 ml beher merkezli hafif filament bitişik yerleştirilmiştir. Büyük bir opak kalkan tüm kurulum etrafına yerleştirildi. Büyük resim görmek için buraya tıklayın .


Şekil 3,. Çeşitli ışık hasarı paradigmalar takip albino zebrafish çubuk fotoreseptör kaybı yetişkin Tg (NRd: egfp) den Retina bölümleri. / Alb çubuk fotoreseptör dorsal yoğunluk (yeşil) (AD) ve ventral göstermek için GFP ile immunolabeled (EH) retinanın yarıya ışık başlangıçlı (0 saat), EGFP pozitif çubuk fotoreseptör çekirdekleri (onl) ve dış kesimleri (ROS) önce. A, E) görüntülenebilir. B, F) 48 saat aşağıdaki halojen ışık başlangıçlı (HLT), kesilmiş ROS anda ve önemli ölçüde daha az çubuk çekirdekleri (I) dorsal mevcuttu, ancak ventral retina. CG) 48 saat az UV ışınlarına maruz kalma (hpUV) 30 dakika sonra, önemli ölçüde daha az çubuk çekirdekleri 0 saat göre dorsal ve ventral retina mevcuttu (C, G < / Strong>), ancak 48 HLT tedaviler (G, I). DH) kombine ışık tedavisi 48 saat aşağıdaki başlangıçlı (halojen madde ile 30 dakika UV ışınlarına maruz kalma; çubuk fotoreseptör çekirdeklerin önemli bir kayıp ek olarak UV +48 HLT), hemen hemen hiç ROS dorsal veya ventral retina mevcuttu, (I) merkezi dorsal veya ventral retina 300 mikron çapında çubuk fotoreseptör çekirdeklerin. I) belirlenmesi. "A" 48 HLT ve 48 hpUV farklı için "c" farklı için 0 saat, "b" farklı için: grup arasında anlamlı fark (p ≤ 0.05) olarak tasvir edilmektedir. Panelinde ölçek çubuğu bir 50 mikron temsil eder ve paneller AH için de geçerlidir. büyük resim görmek için buraya tıklayın .

"iles/ftp_upload/51017/51017fig4.jpg" width = "500px />
Şekil 4. Çeşitli ışık hasarı paradigmalar takip albino zebrafish çift koni kaybı. Retina bölümleri yetişkin albino zebrabalıkları gelen ışık her takip eden dorsal çift koni (altın) (AD) ve retinanın ventral (EH) yarısı göstermek için ZPR-1 ile immunolabeled hasar paradigmalar (48 HLT, 48 hpUV ve UV +48 HLT). A, E) 0 saat, çift koni çekirdekleri az dorsal ve ventral retina mevcuttu. B, F) 48 HLT olarak, önemli ölçüde daha az Çift koni mevcuttu ventral retina sadece (F, I). Herhangi bir değişiklik ventral retina (G) gözlendi ise 48 hpUV, önemli ölçüde daha az Çift koni (I) ve enkaz büyük miktarda az CG), sadece dorsal retina (C) mevcuttu. UV +48 HLT, önemli ölçüde daha az çift koni anda DH)s (I) ve çok az enkaz dorsal ve ventral retina mevcuttu. Ben merkezi dorsal veya ventral retina 300 mikron arasında çift koni) belirlenmesi. Grup arasında anlamlı fark (p ≤ 0.05) "a" 48 HLT ve 48 hpUV farklı için "c" farklı için 0 saat, "b" farklı için, olarak tasvir edilir. Panelinde ölçek çubuğu bir 100 mikron temsil eder ve paneller AH için de geçerlidir. büyük resim görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,
Şekil 5,. Değişiklikler çeşitli ışık hasarı paradigmalar takip çoğalması yanıttır. PCNA ile immunolabeled yetişkin albino zebrafish gelen Retina bölümlerde hücre çoğalması (kırmızı) göstermek içindorsal (AD) ve ventral (EH) 0 saat az ışık zarar paradigmalar her (48 HLT, 48 hpUV ve UV +48 HLT). AE) takip eden retina yarıya, çoğalması iç nükleer tabaka (katılmadı INL). B, F) 48 HLT anda, tek öncü hücreler dorsal retina boyunca INL ve ventral retinanın küçük bir bölümünü mevcuttu. CG) 48 hpUV anda, progenitör hücrelerin sütun, dorsal retina mevcuttu Sadece tek progenitör hücrelerin ventral retinanın küçük bir kısmı mevcut iken. D, H) UV +48 HLT anda, progenitör hücrelerin büyük sütunlar dorsal ve ventral retina üzerinde hazır bulundu. Panelinde ölçek çubuğu bir 100 mikron temsil eder ve paneller AH için de geçerlidir. büyük resim görmek için buraya tıklayın .


6 Şekil. Rod ve çeşitli ışık zarar paradigmalar takip pigmentli Zebra balığı koni fotoreseptör kaybı yetişkin vahşi tip (AB) Zebra balığı gelen Retina bölümler tüm çekirdeklerin (AP, mavi) göstermek için TO-PRO-3 ile boyandı. Ve çubuk göstermek için ZPR-3 ile immunolabeled dış kesimleri (AH, kırmızı) veya çift koni (IP, altın) için ZPR-1 dorsal (AD, IJ) ve ventral (EH, MP) ışığın hasar paradigmaların her takip eden retina (48 HLT, 48 yarıya hpUV ve UV +48 HLT). AH) çubuk fotoreseptör çekirdeklerinde önemli düşüşler UV +48 HLT (D, H, S) az 48 HLT (B, Q) de ve dorsal ve ventral retinada dorsal retina mevcuttu . IP) koni çekirdekleri hipertrofik olmasına rağmen i n 48 hpUV (K), çift koni çekirdeklerinde anlamlı düşüşler de dorsal retina 48 HLT veya 48 hpUV (JK, NO, R) de hazır bulundu. Koni çekirdekleri önemli düşüşler UV +48 HLT (L, P, R) de dorsal ve ventral retina mevcuttu. QR) çubuk fotoreseptör miktarının ve merkezi dorsal veya ventral retina 300 mikron arasında çift koni çekirdekleri. Grup arasında anlamlı fark (p ≤ 0.05) "a" 48 HLT ve 48 hpUV farklı için "c" farklı için 0 saat, "b" farklı için, olarak tasvir edilir. Panelinde ölçek çubuğu bir 200 mikron temsil eder ve paneller AH için de geçerlidir. büyük resim görmek için buraya tıklayın .

"g7.jpg" width = "500px />
Şekil 7. Dorsal (AD) ve ventral (EH) hücre çoğalması (kırmızı) göstermek için PCNA ile immunolabeled yetişkin vahşi tip (AB) Zebra balığı çeşitli ışık zarar paradigmalar. Retina müteakip bölümlerinde pigmentli zebrafish çoğalması yanıt her takip eden retina yarıya hafif hasar paradigmalar (48 HLT, 48 hpUV ve UV +48 HLT). MS) dorsal retina, sadece birkaç tek progenitör hücreler, 48 HLT ve 48 hpUV (B, C) ​​INL mevcut iken sütunlar progenitör hücrelerin UV +48 HLT (D) de hazır bulundu. EH) ventral Retinada, çoğalmasında herhangi bir değişiklik progenitör hücrelerin zaman sütun mevcuttu hangi UV +48 HLT (H), haricinde gözlendi. Panelinde ölçek çubuğu bir 100 mikron temsil eder ve paneller AH için de geçerlidir.7/51017fig7highres.jpg "target =" _blank "> büyük resim görmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada yaygın fotoreseptör kaybı ve güçlü bir yenilenme yanıt olarak sürekli bir parlak ışığa maruz kalma sonucu ile kısa UV ışınlarına maruz kalma birleştirerek olduğunu göstermektedir. Bireysel LIRD yöntem ile karşılaştırıldığında, bu kombine yöntem de retina her iki yarısı da çubuk ve koni hem de zarar için en etkili bir protokoldür. Önemli olarak, bu tedavi pigmentli hayvanların yanı sıra albino hayvanlarda etkilidir.

Daha yaygın ve tutarlı zarar kombine protokol sonuçları bireysel LIRD yöntemlerle karşılaştırıldığında kanıt olsa da, bilimsel düşünceler bir LIRD paradigma seçmeden önce tartışılmalıdır. Bizim Bilgiler tüm retina dokusunun (yani proteomiks, gerçek zamanlı PCR) analizi için toplandığı zaman kombine yöntemi kullanılmalıdır öneririz. Bu, kombine yöntemi halojen maruz bırakmanın büyük lezyon boyutu, ve son olarak da UV ışınlarına maruz olduğu bulundu. Biz öneririzfarklı şekilde çubuk ve koni rejenerasyon etkisi olabilecek bir gen ya da yol araştırılırken kombine yöntemi de kullanılabilir olduğunu. Bu pratik nedenlerle mümkün değilse, bizim veri analizi merkezi dorsal retinaya sınırlı ise UV ışınlarına maruz kalma, bu çalışmalar için bir sonraki en iyi yöntem olduğunu göstermektedir.

Uygun LIRD yöntemi seçerken pratik hususlar da garanti altındadır. Ilk endişe gerekli ekipman maliyetidir. Tüm protokol karanlık adaptasyonu (veriler gösterilmemiştir) uzun bir süre gerektirir. Zebra balığı konut modülü yerleşik bir kendi kendine yeten bir karanlık muhafaza gerekli son derece uygun, ama değil. Bakım teybe alınan veya dikişler mühür olsa bile bir karton kutu, kullanılabilir, ve su parametreleri izlenir. Halojen tabanlı LIRD yöntemi son derece ekonomik ve uygundur. Tüm öğeler yerel nalburdan 100 $ altında ABD için satın alınan ve sadece birkaç dakika sürer kurulabilir. To bu yöntemin sadece pratik dezavantajı, ışık tedavisi aynı odada çalışma rahatsızlık. 4 gün boyunca sürekli çalıştırırken ışıklar ısı iyi bir miktarda üretmek ve ışık yoğunluğu rahatsız edici ve insan vizyonuna zararlı hem de. UV ve kombine yöntemler her laboratuvar için kullanılabilir olmayan bir UV kaynağı gerektirir. Buna ek olarak, büyük bir özenle bir UV ışık tedavisi yaparken laboratuar üyelerinin güvenliğini sağlamak için alınmalıdır. Bu izole bir alanda halojen ışık cihazı için daha uygun iken Böylece, UV tedavisinin güvenlik endişeleri böyle bir boşluk gerektirir. Işık tedavisinde kullanılan UV kaynağı da genellikle bir "mikroskop oda" ya da görüntüleme çekirdek içinde yer bir floresan mikroskop için kullanılan bu ek bir rahatsızlık olur. Kontrolü ve hayvan deney grupları için UV tedavi birden fazla mermi Sahne bir dahili için mikroskop oda kapatılıyor gerektirecekzaman ensive uzunluğu.

Belki de kombine yöntemi kullanarak büyük avantajı pigmentli hayvanlar üzerinde retina rejenerasyon çalışmaları gerçekleştirmek için yeteneğidir. Biz gösteriyor ki çubuklar ve dorsal ve ventral retina koni önemli bir kayıp olarak ne bireysel yöntemi sonuçları. Bunun aksine, yaygın çubuk ve pigmentli ve albino hem hayvanlarda hem de konik kaybı benzer seviyelerde uygulanan kombine LIRD paradigması ile sonuçlanır. Bu retina yenilenme çalışmaları için albino arka planda ilgi transgenik hatları oluşturmak ve korumak için gereğini ortadan kaldırır olarak pigmentli hayvanlara bu LIRD yöntemi uygulama yeteneği, araştırmacı önemli uzay, zaman, ve harcırah hayvan bakım maliyetleri (varsa) kaydeder . Birlikte, bilimsel ve pratik avantajlar bu gelişmiş LIRD yöntemin potansiyel sakıncaları fazla olduğunu hissediyorum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar mükemmel balık yetiştiriciliği ve teknik destek için Xixia Luo teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık hibe R21EY019401 (RT) ve P30EY04068 (RT) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edilen ve Wayne State Üniversitesi, Göz Hastalıkları Anabilim Dalı için Körlük Önleme Araştırma tarafından sınırsız ödenekle de dahil olmak üzere, RT para start-up oldu. JT Wayne State Üniversitesi Enstitü tarafından sağlanan Thomas C. Rumble Bursu ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV light source Leica EL600
Glass Petri dish (150 x 20 mm) Sigma-Aldrich/Pyrex CLS3160152BO
250 ml glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS1000250
4 L glass beaker Sigma-Aldrich/Pyrex CLS10004L
Aluminum foil Fisher 01-213-105
250 W halogen lamps Workforce 265-669
1.8 L clear acrylic tanks Aquaneering ZT180T
1.8 L clear acrylic tank lids Aquaneering ZT180LCL
Fan Honeywell HT-900
Aerator Tetra 77853-900
Thermometer Cole-Parmer YO-08008-58
Bent forceps (5/45) World Precision Instruments 504155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J. Neurosci. 27, 7028-7040 (2007).
  2. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J. Neurosci. 26, 6303-6313 (2006).
  3. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  4. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  5. Thummel, R., et al. Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration. Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).
  6. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).
  7. Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish. Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).
  8. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
  9. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).
  10. Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev. Biol. 6, 36 (2006).
  11. Thummel, R., et al. Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration. Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).
  12. Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina. Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).
  13. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. J. Comp. Neurol. 518, 800-814 (2010).
  14. Morris, A. C., Scholz, T. L., Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetic dissection reveals two separate pathways for rod and cone regeneration in the teleost retina. Dev. Neurobiol. 68, 605-619 (2008).
  15. Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Muller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp. Eye Res. 28, 63-69 (1979).
  16. Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).
  17. Bringmann, A., Wiedemann, P. Muller glial cells in retinal disease. Ophthalmologica. 227, 1-19 (2012).
  18. Eisenfeld, A. J., Bunt-Milam, A. H., Sarthy, P. V. Muller cell expression of glial fibrillary acidic protein after genetic and experimental photoreceptor degeneration in the rat retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25, 1321-1328 (1984).
  19. Anderson, D. H., Guerin, C. J., Erickson, P. A., Stern, W. H., Fisher, S. K. Morphological recovery in the reattached retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 168-183 (1986).
  20. Bruce, A. E., Oates, A. C., Prince, V. E., Ho, R. K. Additional hox clusters in the zebrafish: divergent expression patterns belie equivalent activities of duplicate hoxB5 genes. Evol. Dev. 3, 127-144 (2001).
  21. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Res. Bull. 49, 377-391 (1999).
  22. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Muller cell outgrowth after retinal detachment: association with cone photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 1542-1545 (2000).
  23. Fischer, A. J., Bongini, R. Turning Muller glia into neural progenitors in the retina. Mol. Neurobiol. 42, 199-209 (2010).
  24. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends Mol. Med. 16, 193-202 (2010).
  25. Close, J. L., Liu, J., Gumuscu, B., Reh, T. A. Epidermal growth factor receptor expression regulates proliferation in the postnatal rat retina. Glia. 54, 94-104 (2006).
  26. Das, A. V., et al. Neural stem cell properties of Muller glia in the mammalian retina: regulation by Notch and Wnt signaling. Dev. Biol. 299, 283-302 (2006).
  27. Ikeda, T., Puro, D. G. Regulation of retinal glial cell proliferation by antiproliferative molecules. Exp. Eye Res. 60, 435-443 (1995).
  28. Liu, B., et al. Wnt signaling promotes muller cell proliferation and survival after injury. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54, 444-453 (2013).
  29. Osakada, F., et al. Wnt signaling promotes regeneration in the retina of adult mammals. J. Neurosci. 27, 4210-4219 (2007).
  30. Wan, J., et al. Preferential regeneration of photoreceptor from Muller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. 48, 223-234 (2008).
  31. Wan, J., Zheng, H., Xiao, H. L., She, Z. J., Zhou, G. M. Sonic hedgehog promotes stem-cell potential of Muller glia in the mammalian retina. Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 347-354 (2007).
  32. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (1002).
  33. Chang, G. Q., Hao, Y., Wong, F. Apoptosis: final common pathway of photoreceptor death in rd, rds, and rhodopsin mutant mice. Neuron. 11, 595-605 (1993).
  34. Marc, R. E., et al. Extreme retinal remodeling triggered by light damage: implications for age related macular degeneration. Mol. Vis. 14, 782-806 (2008).
  35. Portera-Cailliau, C., Sung, C. H., Nathans, J., Adler, R. Apoptotic photoreceptor cell death in mouse models of retinitis pigmentosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 974-978 (1994).
  36. Noell, W. K., Walker, V. S., Kang, B. S., Berman, S. Retinal damage by light in rats. Invest. Ophthalmol. 5, 450-473 (1966).
  37. Wenzel, A., Grimm, C., Samardzija, M., Reme, C. E. Molecular mechanisms of light-induced photoreceptor apoptosis and neuroprotection for retinal degeneration. Prog. Retin. Eye Res. 24, 275-306 (2005).
  38. Cicerone, C. M. Cones survive rods in the light-damaged eye of the albino rat. Science. 194, 1183-1185 (1976).
  39. La Vail, M. M. Survival of some photoreceptor cells in albino rats following long-term exposure to continuous light. Invest. Ophthalmol. 15, 64-70 (1976).
  40. Thomas, J. L., Nelson, C. M., Luo, X., Hyde, D. R., Thummel, R. Characterization of multiple light damage paradigms reveals regional differences in photoreceptor loss. Exp. Eye Res. 97, 105-116 (2012).
  41. Qin, Z., et al. FGF signaling regulates rod photoreceptor cell maintenance and regeneration in zebrafish. Exp. Eye Res. 93, 726-734 (2011).
  42. Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).
  43. Morris, A. C., Schroeter, E. H., Bilotta, J., Wong, R. O., Fadool, J. M. Cone survival despite rod degeneration in XOPS-mCFP transgenic zebrafish. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 4762-4771 (2005).
  44. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Muller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  45. Powell, C., Elsaeidi, F., Goldman, D. Injury-dependent Muller glia and ganglion cell reprogramming during tissue regeneration requires Apobec2a and Apobec2b. J. Neurosci. 32, 1096-1109 (2012).
  46. Ramachandran, R., Reifler, A., Wan, J., Goldman, D. Application of Cre-loxP recombination for lineage tracing of adult zebrafish retinal stem cells. Methods Mol. Biol. 884, 129-140 (2012).
  47. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/Dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15858-15863 (2011).
  48. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Insm1a-mediated gene repression is essential for the formation and differentiation of Muller glia-derived progenitors in the injured retina. Nat. Cell Biol. 14, 1013-1023 (2012).
  49. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev. Cell. 22, 334-347 (2012).
  50. Morris, A. C., Forbes-Osborne, M. A., Pillai, L. S., Fadool, J. M. Microarray analysis of XOPS-mCFP zebrafish retina identifies genes associated with rod photoreceptor degeneration and regeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 2255-2266 (2011).
  51. Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J. Vis. Exp. (58), e3603 (2011).
Yetişkin Zebra balığı Retina Rejenerasyon Çalışmaları Kullanım için Yeni Bir Işık Hasar Paradigma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).More

Thomas, J. L., Thummel, R. A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (80), e51017, doi:10.3791/51017 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter