Summary
Techniques physiologiques et anatomiques sont démontrés pour traiter la fonction et la structure des propriocepteurs communes et des récepteurs de la tension musculaire dans les membres de marche de crustacés.
Abstract
Le principal objectif de ces procédures est de démontrer à des fins d'enseignement et de recherche comment enregistrer l'activité des neurones sensoriels primaires responsables de la proprioception vivre comme ils détectent la position commune et le mouvement, et la tension musculaire. L'activité électrique de propriocepteurs crustacés et les récepteurs de tension est enregistrée par l'instrumentation de base neurophysiologique, et un transducteur est utilisé pour mesurer simultanément la force générée par la stimulation d'un nerf moteur. En outre, nous démontrons comment colorer les neurones pour une évaluation rapide de leur disposition anatomique ou pour la fixation permanente. La coloration révèle organisation anatomique qui est représentative de la plupart des organes chordotonaux en crustacés. En comparant les réponses nerveuses de la tension aux réponses proprioceptives est un outil d'enseignement efficace dans la détermination de la façon dont ces neurones sensoriels sont définies fonctionnellement et la façon dont l'anatomie est corrélée à la fonction. Trois techniques de colorationsont présentés permettant aux chercheurs et enseignants de choisir une méthode qui est idéal pour son laboratoire.
Introduction
La proprioception est la sensation de la position des membres et le mouvement qui permet le comportement moteur coordonnée. Propriocepteurs sont constitués de la position (statique) et le mouvement des récepteurs (kinesthésiques). Chez les insectes et les crustacés, les organes chordotonaux sont les structures qui fournissent ces informations à la CNS 1. Pas tous les organes chordotonaux couvrent un joint, mais ils peuvent toujours surveiller les mouvements des articulations en raison de leur attachement sur les apodèmes (tendon comme structures) qui couvrent la commune et se déplacent en association avec le muscle squelettique et joint d'articulation. Pattes de crabe ont six articulations, ayant chacun un ou deux organes chordotonaux 2. Typiquement, un organe chordotonal a 60-100 ou plusieurs neurones sensoriels intégrés au sein d'une bande élastique, les neurones qui signalent position commune statique, la direction et la vitesse de déplacement 3-6. L'entrée des organes chordotonaux à chaque commune et de la jambe est ensuite traitées de manière centralisée permettant des mouvements coordonnés par l'animal.
Les procédures démontré ci-dessous permettent l'analyse structurale et fonctionnelle des neurones qui innervent les deux types de récepteurs par rapport à leur emplacement sur un brin élastique et chordotonal apodeme. A titre d'illustration, on utilise la propodite-dactylopodite (PD) d'organe chordotonal, l'organe qui s'étend sur la plus segment distal de la patte de crabe 3.Bien que les études électrophysiologiques détaillées ont commencé dans les années 1930 et sont toujours en cours aujourd'hui, certains aspects sont devenus connus sur les liens segmentaires de propriocepteurs dans les différentes articulations et leurs rôles dans le contrôle coordonné de muscles10-16. Établir la relation structure-fonction entre les organes, les muscles et proprioceptives, le système nerveux en outre aider à définir ces rôles. Par exemple, l'étiquetage du soma et terminaisons distales des neurones de tension insérés dans le apodeme va révéler leur emplacement par rapport aux fibres musculaires 8,17-21.
Nous présentons trois techniques de coloration pour les jambes crustacés qui peuvent être utilisés dans la recherche ou des laboratoires universitaires. Coloration au bleu de méthylène donne un contraste adapté pour les muscles et les nerfs et est recommandé comme une technique simple pour les élèves à apprendre l'anatomie. Les laboratoires qui ont des configurations de microscopie de fluorescence peuvent accomplir coloration neuronale plus sélective en exposant brièvement le nerfs vers le colorant vital 4-di-2-ASP. La troisième alternative est CoCl 2 remblai, qui colore et résout les neurones, et ne nécessite pas l'imagerie de fluorescence. Bien qu'il soit le travail et de temps, ce processus de coloration donne un contraste élevé et une spécificité pour les nerfs qui sont remplis. Ensemble, ces techniques peuvent être utilisées pour comparer différents organes chordotonaux, non seulement au sein d'une branche ou entre membres, mais aussi parmi les autres espèces de crustacés et d'insectes 20-22. Crabes bleus (C. sapidus) utilisés dans les enregistrements physiologiques et pour la coloration anatomique sont disponibles tout autour de la frontière du Sud et du Sud-Est des États-Unis. Cette espèce sert un représentant des arrangements chordotonaux et tension nerveuses dans la plupart des crabes. Laboratoires sur la côte ouest préfèrent utiliser beaucoup plus grand crabe dormeur (Cancer magister) pour ces expériences.
Protocol
Une. Dissection et enregistrement de l'activité électrique du nerf Propodite-dactylopodite (PD)
- Tenez le crabe dans la carapace de derrière, et en évitant les griffes, pincez la partie proximale de la meropodite avec une pince. La jambe autotomize à empêcher l'animal de saigner à mort. Faites preuve de prudence lors de la manipulation de crabes bleus car ils sont assez agressif et très rapide.
Figure 1. Première étape d'un crabe marche. La localisation anatomique des organes chordotonaux (régions hachurées) sont superposées sur ce schéma. La double tête de flèche indique où sectionner la jambe pour les expériences PD nerveuses. Cliquez ici pour agrandir l'image . - Faire une coupe entre le propodite et carpodite. Jeter le carpopodite et t il attachait meropodite (Figure 1).
- Couper une grande fenêtre dans la cuticule sur la (latéral) côté pigmentée de la propodite avec un scalpel avec une lame # 11 (figure 2 et 3). Remarque: Ne pas couper profondément.
- Enlever la couche de cuticule en faisant coulisser la lame de scalpel en dessous et parallèlement à la cuticule. Cela rompt les fibres musculaires attachés à la cuticule.
- En utilisant la même technique coupé une petite fenêtre sur le pigmentless (médiale) côté du propodite, mais laisser le condyle (le joint à rotule ou articulation entre les segments) attache intact.
Figure 2. Coupez le long de la ligne pointillée sur le propodite. Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Figure 3. Exposer le nerf de la fenêtre (les flèches décrivent le faisceau nerveux). Cliquez ici pour agrandir l'image . - Préparer un plat Sylgard bordée contenant une solution saline de crabe à la broche de la préparation vers le bas. Remarque: Voir le tableau 1 pour les espèces recettes salées spécifiques.
- Localiser l'organe de PD par sondage avec soin les aiguilles de verre poli au feu. Le brin élastique recouvrant le joint a un aspect argenté.
- Enlever les fibres musculaires qui obscurcissent votre vision de l'organe des deux côtés du tendon. Soyez très prudent pour ne pas blesser l'organe de PD ou son nerf.
- Une fois cette étape accomplie, remettez fermement la préparation dans le plat avec le côté de pigment (latéral) vers le haut (figure 4).
Figure 4. Exposed organe de PD et le nerf. Cliquez ici pour agrandir l'image .
- Suivez le nerf organe PD dans le propodite autant proximale que possible afin de libérer de longue durée de nerf (1,5 cm) à des fins d'enregistrement. Le mieux est alors le nerf de PD est encore attaché à la principale nerf de la jambe.
- Après la séparation du nerf PD du nerf principal de la jambe à l'aide d'aiguilles de verre, couper le nerf de PD proximale avec les iris ciseaux. Remarque: Ne pas étirer ou de tirer sur le nerf lors de la dissection.
- Déplacer le dactylopodite à une position étendue et entièrement fléchie. Prenez note sur l'endroit où les positions de flexion et d'extension extrêmes et un point pour une utilisation ultérieure à mi-chemin.
- Placez un fil de terre à l'intérieur du bain d'eau salée.
- Mettez le ematériel d'enregistrement lectrophysiology / logiciel. Remarque: Notre installation a été décrit précédemment 23.
- Placez le microscope de sorte qu'il est sur la platine du microscope. Une fois le plat de préparation est placé sur la scène, vous aurez besoin d'ajuster la position du faisceau d'éclairage de haute intensité pour mieux visualiser la préparation.
- Positionner le micromanipulateur afin que le montage d'électrode d'aspiration attaché aura accès facile au bain de sérum physiologique et de la préparation. L'électrode d'aspiration est réalisé sous la forme représentée sur une ligne vidéo 24.
- Pour détecter l'activité neuronale, tirer l'extrémité du nerf PD découpée dans l'électrode d'aspiration.
- Déplacez le dactyle tout au long de positions longues et fléchis pour plusieurs cycles à l'aide d'une sonde de verre ou cheville en bois.
- Suivant observer l'activité lorsque le dactyle est tombé dans les positions étendues, fléchis, et au milieu.
2. Enregistrement de l'activité électrique de la tensionNerf tout en surveillant de génération de forces
- Déterminer le côté latéral et médial de la jambe. Le côté médial a une texture douce qui peut être ressenti en pinçant doucement dans la région meropodite avec un ongle.
- Placez ce soft cuticule vers le haut dans le plat. Le nerf moteur de l'excitatrice qui innerve le muscle ouvreur innerve aussi le muscle civière dans le carpopodite.
- Afin de stimuler le muscle de l'ouvre le nerf moteur civière dans la région carpodite est isolé et stimulé avec une électrode d'aspiration. La partie proximale de la jambe est éliminé par sectionnant la meropodite avec des ciseaux.
- Retirer une partie de la cuticule de la région de carpe sur le côté intérieur (côté médial, figure 5A).
- Couper le apodeme du muscle de flexion et retirer délicatement le muscle à ne pas tirer sur le nerf principal de la jambe hors de la cavité de la jambe (figure 5B, C noter les flèches où Bender apodeme est séparé). Le nerf de la jambe principale et un soutien-gorgench au muscle civière peut alors être observé (figure 5D).
- Trouvez le nerf de branchement de la principale faisceau nerveux vers le muscle civière (figure 5E, à la flèche). Cela peut être coupé près du muscle et tiré dans une électrode d'aspiration pour stimuler (figures 5F et G, flèche représente la branche).
- Dégager une section du nerf qui se projette vers l'ouvre sans pincer le nerf. Sectionner le moteur civière / ouvreur nerf.
- Tirez le nerf moteur dans l'électrode d'aspiration et le stimuler.
- Pour exposer le muscle et le nerf ouvreur de tension retirer le muscle de fermeture et la région ventrale du propodite. Coupez le muscle de fermeture avec un scalpel avec une lame n ° 11 à la propodite (figure 6). Remarque: Ne pas couper profondément dans la région proximale, car il pourrait endommager le moteur ouvre nerf.
Figure 6. Couper la cuticule sur la moitié ventrale du propodite pour exposer le muscle de fermeture de sorte qu'il peut être retiré. Cliquez ici pour agrandir l'image . - Remplacez la solution saline avec une solution saline refroidie fraîche tout au long du processus de dissection de garder les neurones en vie. Pour de plus amples dissection, placez le plat de la préparation sous un microscope à dissection et utiliser un éclairage par fibre optique.
- Découpez soigneusement le tendon près de son attachement àle dactyle utilisant pointues ciseaux de taille moyenne.
- Soyez très prudent de ne pas perturber les branches vers le muscle ouvreur du nerf principal de la jambe qui doit être clairement visible.
- Retirer et jeter le muscle de fermeture et le tendon.
- Faire un trou dans le dactyle avec une épingle de dissection. Ce trou sera utilisé par la suite pour raccorder la tige de métal sur la tension (force) transducteur, mais il est nécessaire de le faire à ce stade de la procédure.
- Repérez la branche du nerf qui projette vers le muscle ouvreur et apodeme dans la région distale du muscle ouvreur. Sonder soigneusement le nerf avec l'outil de verre poli-le-feu.
- Observer le nerf de la tension qui résulte de l'extrémité distale de la apodeme et procède au faisceau du nerf moteur.
- Pour détecter l'activité neuronale, remplir une électrode d'aspiration avec une solution saline de crabe et dessiner la fin de l'ouvreur tension nerf coupé dans l'électrode. Assurez-vous que l'électrode d'aspiration est bien serrée sur le nerf.
- Examinez la NEURAl corrélat de tension passive sur le apodeme d'ouverture. Pendant l'enregistrement de l'activité électrique du nerf de la tension, tourner le dactyle rapidement dans une commune étendue (c.-à-étirement du muscle d'ouverture).
- Ensuite, essai le développement de la force active par rapport à la fréquence de stimulation.
- Attachez fermement un crochet métallique de sorte que la pointe de l'hameçon passe par un petit trou dans le dactyle.
- . Branchez l'autre extrémité du crochet de métal pour le capteur de force Remarque: Assurez-vous que le transducteur est à un angle de 90 ° à chaque fois pour que la tige est perpendiculaire à la sonde de détection maximale de la force générée.
- Tirer le crochet et le dactyle de sorte qu'il est à peu près un angle de 45 ° de l'articulation de l'ouvre.
- Maintenant stimuler le nerf moteur à 100 Hz pour 250 ms et mesurer la force ainsi que la fréquence de tir du nerf de tension.
- Placer le joint dans une position complètement déployée de sorte que les fibres musculaires sont ouvreur flasque.
- Stimulate le nerf moteur à 100 Hz pour 250 ms et mesurer la force ainsi que la fréquence de tir du nerf de tension.
- Bend / flexion de l'articulation de sorte qu'elle soit entièrement fléchie (~ 90 °). Dans cette position, les fibres musculaires de l'ouvre-porte sont entièrement étirés. Il peut y avoir une certaine force mesurée par le transducteur du fait de cet étirement passif du muscle.
- Stimuler le nerf moteur à 100 Hz pour 250 ms et mesurer la force ainsi que la fréquence de tir du nerf de tension.
- Après la mesure de la force, de procéder à une série de fréquences différentes: 20, 40, 60, 80 et 100 Hz pendant 8 à 10 secondes dans chaque position de joint.
- Mesurer la réponse d'un relâchement de la tension rapide. Disposer la préparation de telle sorte que le crochet sur le transducteur de force peut être facilement poussée hors du trou dans le dactyle.
- Bend / flexion de l'articulation de sorte qu'elle soit entièrement fléchie (~ 90 °). Maintenant stimuler le nerf moteur à 100 Hz avec une stimulation continue de 5 sec.
- Après la première seconded ou moins, alors que la tension s'est accumulée sur le muscle d'ouverture, pousser la tige du trou dans le dactyle.
- Examiner l'enregistrement de nerf de tension avant et après la libération de la broche tenant le dactyle.
- Effets modulateurs de substances telles que la neuro-actifs octopamine, la sérotonine, et proctoline, ce qui modifie le signal de sortie des neurones de tension, peuvent être déterminés par l'addition de ces molécules à la presse de bain sur le muscle de l'ouvre-exposée et la répétition des expériences.
- Utiliser une pipette et goutte à goutte 1-2 ml au cours de la préparation.
3. Structures du système nerveux périphérique coloration de crustacés Jambes pied
- Technique de bleu de méthylène
- Diluer la solution mère de chlorure de méthylène bleu un de partie (0,25%) avec deux parties d'eau distillée.
- Ajouter ce mélange à cinq parties de solution saline tamponnée. Bien irriguer la zone d'intérêt.
- Disséquer une jambe selon le protocole à l'article 1. Incuber la préparation de la solution de bleu de méthylène à 12-13 ° C.
- Examiner la préparation toutes les 10-15 min avec le microscope à dissection en utilisant un éclairage de faible intensité pour suivre l'évolution de la coloration. Dans certains cas, la coloration sera terminé en une heure, dans d'autres, cela peut prendre du jour au lendemain.
- Technique 4-di-2-ASP
- Les colorants fluorescents peuvent être utilisés pour remblayer le neurone de PD ou teindre directement la préparation de la salle de bain. Toutefois, un microscope adapté aux capacités de voir le colorant fluorescent est nécessaire.
- Disséquer une jambe selon un protocole à l'article 1.
- Incuber la préparation à une concentration de 10 uM de solution de 4-Di-2-ASP et laisser la préparation dans le réfrigérateur pendant 15 min. Utilisez juste assez de solution pour couvrir la préparation.
- Photographier les préparatifs rapidement et éviter la surexposition à la lumière de mercure. Ce colorant fluorescent s'estompe assez rapidement.
- Exposer le nerf de PD selon le protocole de l'article 1 et le maintenir immergé dans une solution saline froide.
- Faire une gelée de pétrole et de tenir le CoCl 2. Si tout CoCl2 se déverse dans le bain d'eau salée toute la préparation va tacher noir, et la préparation doit être jeté.
- Glisser une petite incision d'une feuille de polystyrène, de faire une plate-forme de matière plastique, et la broche d'une manière telle qu'il ne sera pas flotter ou être immergé dans le bain de solution saline (figure 7).
Feuille Figure 7. Polystyrène avec des épingles à tenir en place dans le plat. Cliquez ici pour agrandir l'image . - Éjecter la gelée de pétrole à partir d'une fine aiguille hypodermique fixée à une seringue jetable,puis faire une barrière (un cercle pourrait bien fonctionner), qui devrait être d'environ 1-1,5 mm de hauteur, sauf pour un "V" profond au milieu où le nerf sera drapé sur, au-dessus du bout de polystyrène.
- Faites une petite flaque d'eau salée de chaque côté de la barrière près de la "V". Prendre soin de ne pas étirer ou pincer le nerf, lever le nerf soin du plat et le placer dans la flaque d'eau salée dans la vaseline bien.
- Travaillez rapidement de sorte que la section de nerf ne se dessèche pas, soigneusement éjecter la gelée de pétrole pour couvrir le nerf exposé. Maintenant, testez la barrière avec une solution saline et assurez-vous qu'il ne fuit pas.
- Épongez loin saline à l'intérieur de la barrière et voir si elle se remplit lorsque la saline de bain est grande autour de la paroi de la gelée de pétrole pour être sûr que les deux parties sont isolées l'une de l'autre (figure 8).
- Évacuer la solution saline dans le puits à l'aide d'un morceau de papier de soie. Évitez de laisser le papier envelopper le courage.
- Faire une nouvelle flaque d'eau à l'aide de quelques petites gouttes d'eau distillée, puis couper l'extrémité des nerfs. Soyez très prudent de ne pas tirer sur le nerf à travers la barrière pendant la coupe. Le choc osmotique de l'eau distillée "ballon" des axones.
- Dans les 30 secondes ajouter une petite goutte de CoCl2 à l'eau, absorber cette solution, puis ajouter suffisamment CoCl 2 pour former une flaque d'eau au cours de cette section raccourcie de nerf (figure 9). Les préparatifs sont mieux conservés au réfrigérateur à 13 ° C pendant 12-24 h.
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Figure 9. L'PD nerf coupé est exposé à CoCl 2. Le nerf coupé gonfle en présence d'eau qui facilite et accélère le mouvement des molécules de colorant à travers les axones dans les corps cellulaires des neurones. Cliquez ici pour agrandir l'image . - Retirez les flaques d'humidification. Épongez loin la solution de cobalt en utilisant un tissu et laver les restes de cobalt avec plusieurs changements de solution saline.
- Transférer la préparation isolée à une petite boîte de Petri en verre contenant environ 10 ml de solution saline de crabe. Les neurones sont lavés et les étapes suivantes sont effectuées in situ. De bons outils métalliques ne doivent pas être utilisés pour gérer la préparation après cette étape (vous devez utiliser des outils spécifiques qui ne sont pas à utiliser à une date ultérieure pour la physiologie).
- Ajouter 1-2 gouttes de sulfure d'ammonium (NH4) 2 S à la solution saline. Boucher le (NH 4) 2 S flacon et remettez-les dans la hotte. Observer la réaction lors de la préparation sous un microscope à dissection
- Dans 1-2 min, les neurones de cobalt-remplie et leurs processus devraient commencer à apparaître car ils peuvent tacher noir.
- Après 5-10 minutes, remplacer la solution de développement avec une solution saline fraîche.
- Assurez-vous que la solution de développement, vous avez versé dans l'évier est suivi par l'eau du robinet pendant quelques minutes ou dans une bouteille de déchets avec un couvercle.
- Verser la solution saline et fixer la préparation de nerf pendant environ 15 min avec deux changements de solution fixateur de Bouin. Pour les plus grands tissus comme les muscles d'ouverture (pour colorer les neurones de tension), augmenter la durée de fixation à 30 min.
- Déshydrater dans une série de l'ordre croissant de concentration de l'éthanol à partir de 70% (soit 70%, 80%, 90%, 100%). Environ 10 min à chaque concentration est suffisante pourpetits tissus.
- Après environ 10 à 15 min dans deux changements d'éthanol à 100%, effacer le tissu par le remplacement de l'éthanol à 100% de salicylate de méthyle. La préparation va rester dans cette solution permanente pour la visualisation répétée. Avec le temps, les cellules remplies apparaîtront mieux parce que le tissu environnant deviendra plus clair. méthodes de densification peuvent être utilisés pour aider à prévenir la décoloration au fil du temps 25.
- Utilisez la même procédure pour remplir le nerf de tension avec CoCl 2. Cependant, changer la solution d'éthanol à plusieurs reprises dans chaque étape de déshydratation de l'éthanol et incuber la préparation à l'intérieur de l'alcool pendant environ 20 minutes pour chaque étape de déshydrater complètement les muscles et de leur permettre de bien dégager.
Representative Results
Lorsque l'organe est étiré par PD s'étendant complètement le joint, l'activité dans le nerf PD est robuste au cours du mouvement comme indiqué pour la première seconde de la figure 10. Certaine activité demeure alors qu'il est encore maintenu dans la position ouverte. Cette activité est dans les neurones sensibles à la position statique (deuxième moitié de l'enregistrement représenté sur la figure 10). Mouvement évoque une réponse pendant le déplacement et le tir est surtout présent lors de l'étirement du brin chordotonal (figure 11).
Une analyse plus poussée des pointes peut être facilement approchée par le tri des amplitudes relatives. C'est une approche de démontrer les différentes populations de neurones sensoriels étant recrutés pour des postes ou des types de mouvements 5. Amplitudes typiques vont de 0,25 à 1,5 mV, mais ces valeurs sont fonction de la résistance (par exemple l'étanchéité) du joint d'étanchéité de l'électrode d'aspiration. Fréquence des pics de til différentes gammes de taille peut également être représentée graphiquement pour l'analyse.
Forces produites par le muscle de l'ouvre par rapport à la fréquence de stimulation peuvent être comparés en superposant les traces tension-temps respectives au-dessus de l'autre (figures 13A et B). Ceci peut également être effectué pour chaque position de joint au niveau de chaque fréquence de la stimulation donnée. Activité du nerf de tension peut alors être corrélée avec la quantité de force par rapport générés à chaque fréquence de stimulation, et pour chaque position de joint. Comme dans le nerf de la PD, de diverses amplitudes de pointes sont vus en réponse à la contraction du muscle d'ouverture (Figure 13C).
Disposition anatomique des neurones dans la jambe de marche est clairement observée avec coloration au bleu de méthylène (figure 14). Notez le brin et la tension chordotonal neurone élastique qui est proche de la apodeme. Plusieurs corps cellulaires avec des diamètres différents d'uned emplacements spécifiques sont également visibles sur cette figure. Tout le cours du nerf de tension et civière nerf moteur sont présentées dans la figure 15. Neurones du nerf de PD sont présentés avec un contraste plus élevé en utilisant 4-di-2-ASP (Figure 16) et CoCl 2 (Figure 17) remblai techniques. À fort grossissement les terminaisons sensorielles peuvent être vus à l'intérieur des scolopales soutien (figures 16B) 21,22,26.
Figure 10. Déplacez et maintenez à 0 °. Les neurones dynamiques sont robustes en feu pendant le mouvement et les pointes de neurones sensibles statiques sont présents alors que le joint est maintenu ouvert. Cliquez ici pour agrandir l'image </ A>.
Figure 11. Rapide ouvert et la fermeture de flexion complète à la position étendue (90-0 °). Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 12. Pointes extracellulaires enregistrées depuis le nerf de PD. La commune est en pleine extension, puis rapidement déplacé vers un ½ position fléchie et tenait toujours. Remarquez l'activité pendant le mouvement et diminution de l'activité quand statique. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 13. Les forces qui sont développées par rapport à l'articulation entièrement fléchies et stimulés à différentes fréquences. (A) de tension à temps des traces provenant du transducteur de force sont représentés à chaque fréquence de stimulation. (B) Les traces du groupe A sont superposées dans des couleurs différentes pour faciliter la comparaison. (C) Tension-temps des traces de l'activité électrique enregistrée par le nerf de la tension lorsque le nerf moteur a été stimulée à 80 Hz. Notez le motif régulier des artefacts de stimulus par rapport à l'activité neuronale. En outre, notez les différentes amplitudes des réponses neuronales. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 14. Méthylène bleuissement de la préparation de la jambe de marche. Somas individuelles sont présentées avec leurs terminaisons sensorielles projeter dans le brin élastique. Près de la apodeme un neurone de la tension est affichée. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 15. Le nerf de la tension résultant de l'extrémité distale (flèches rouges) et de rejoindre le nerf moteur (flèche verte). Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 16. (A) Un remblai du nerf PD en Cancer magister avec 4 Di-2-ASP. (B) grossissement supérieur de terminaisons sensorielles. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 17. Les neurones qui ont été remplis avec CoCl2 et traitées (A). Contour tracé de la préparation colorée montré (B). Cliquez ici pour agrandir l'image .
| Saline | g / L |
| NaCl | 27.29 |
| KCl | 0,81 |
| MgSO 4 7H 2 O • | 4.81 |
| CaCl 2 • 2H 2 O | 1,85 |
| Na 2 SO 4 • 10H 2 O | 0,97 |
| 1.982 | |
| Acide HEPES | 0,476 |
| HEPES sel | 2.08 |
| Ajuster le pH à 8,1 avec NaOH ou HCl |
Tableau 1. Recettes pour saline de crabe.
Discussion
Le but de cette série d'expériences est une) pour enseigner et exposer les principes fondamentaux d'enregistrements extracellulaires d'un organe proprioceptive identifiable et le nerf de tension et 2) de souligner l'importance de la cartographie anatomique par rapport à la fonction physiologique des systèmes sensoriels particuliers. Cette approche expérimentale et les modèles animaux utilisés sont peu coûteux et relativement facile à réaliser dans les laboratoires d'enseignement de neurophysiologie.
Les neurones des organes chordotonaux sont de deux types fonctionnels spécifiques, ceux qui répondent au mouvement et à ceux qui ont répondu à des positions statiques. Enregistrements de cellules individuelles à partir d'une variété d'organes chordotonaux, quel que soit le joint est examiné, ont montré que cela soit le cas 3,5. En effet, les organes chordotonaux associés aux articulations des antennes de homards révèlent les deux mêmes types sensoriels et l'anatomie de base 27. En plus de l'existence de deux types de neurones (mouvement et positisur), les neurones ont la même disposition anatomique sur leurs fils élastiques respectifs. Le grand soma située proximale sur le brin tendance à appartenir à des neurones sensibles de mouvement dynamique. Les neurones qui signalent des positions statiques ont petit soma et sont situés distale. Ces cellules sont activité tonique. La commune de PD ne contient qu'un seul organe chordotonal alors qu'il ya deux organes chordotonaux à la carpe-propodus (CP) et merus-carpe (MC) joints.
La dissection d'exposer structures proprioceptives dans crabes bleus (C. sapidus) pour l'enregistrement électrophysiologique nécessite une stratégie qui permet aux mouvements articulaires aient lieu dans les positions naturelles pendant l'enregistrement de neurones sensoriels. Le nerf de tension pour le muscle ouvreur à la jambe de la marche est un très beau nerf composé de plusieurs neurones. Sauf soin est pris, le nerf de la tension ainsi que le nerf moteur innervant le muscle à stimuler, peuvent être endommagés au cours de cette dissection. Pourenregistrements optimales des électrodes d'aspiration doivent être adaptées à la taille du nerf. Les enregistrements sont facilement accessibles dans un laboratoire de l'élève à l'aide d'un 30-40X microscope de dissection et micromanipulateurs bas de gamme.
Futures expériences qu'il serait intéressant de poursuivre avec les organes chordotonaux communes seraient à examiner les profils structurels et physiologiques pendant la régénération de la jambe dans différentes espèces à différents stades du cycle de vie comme une suite à une première étude qui a utilisé Cancer magister 19,26 . Questions restent à résoudre sont: 1) ne la distribution et de l'organisation des neurones artificielles dépendent de l'âge de l'animal lors de la régénération d'un membre, 2) sont les projections axonales à la CNS (ventrale cordon nerveux) dans une branche de régénération fonctionnelle ou faut-il prendre le temps et l'utilisation conjointe d'établir des connexions fonctionnelles, et 3) ce qui se passe aux axones sectionnés proximale au plan de autotomie lorsque le membre est autotomized? 28
Crustacés conformes aux conditions environnementales et leur température environnante, mais il est difficile de savoir comment ils maintiennent la coordination au sein d'un circuit neuronal neurones modifient leur activité en réponse aux changements de température. Un faible taux de changement pourrait permettre à l'animal un certain temps d'acclimatation alors un changement rapide peut not29, 30. Les changements physiologiques de pH ou osmolarité en raison du métabolisme, le comportement 31, ou l'impact environnemental peuvent présenter des défis semblables à des circuits neuronaux impliqués dans la proprioception. Ces préparations de crustacés sont idéales pour faire face à ces types de problèmes parce que leur fonction est bien caractérisé au niveau d'une seule cellule.
Dans ce protocole, nous avons démontré l'importance physiologique de neurones de traction en force générée par le muscle ouvreur de surveillance. Ces récepteurs de tension peuvent être attribués à leur emplacement dans la apodeme en utilisant des procédures de coloration. Cesneurones, comme chez les mammifères, détectent vigueur à différents niveaux et de recruter des neurones supplémentaires comme la force augmente. La fréquence de l'activité est liée à la fréquence de stimulation du neurone moteur jusqu'à ce que la saturation est atteinte en réception. L'utilisation d'un protocole de libération rapide avec l'articulation de dactyle fléchies, l'activité de la tension disparaît rapidement mais revient ensuite sur regagner tension dans une commune en pleine extension. Il s'agit d'un mode opératoire expérimental classique pour illustrer la force mesurée par les récepteurs de tension. Diverses neuromodulateurs peuvent être appliquées à la préparation de voir comment elle affecte le développement de la force et de la réponse neuronale. L'un des aspects importants est la manière dont les réponses neurales sont traitées et intégrées dans le système nerveux central et leur incidence sur l'activité des neurones moteurs. Les techniques que nous avons indiquées permettent de commencer à répondre à plus d'informations sur la tension (sensoriel) nerf moteur fonction de circuit de neurone, c'est à dire le signal dans une jambe intacte au ganglion et retourau muscle.
Les procédures de coloration démontré sont la clé de la compréhension de la physiologie des neurones sensoriels qui innervent les organes proprioceptifs. Disposition anatomique des neurones basés sur la fonction et la taille de la soma sont similaires dans les différents organes chordotonaux dans les pattes de crabe. On ne sait pas si des dispositions neuronales similaires sont également présents dans d'autres espèces ou d'insectes crustacés. La combinaison des enregistrements physiologiques de cellules individuelles et la cartographie de la situation permet relations fonctionnelles de la structure directe. La préservation à long terme de la disposition anatomique avec CoCl2 coloration et la fixation permet de faire des mesures de façon répétitive et évaluer l'agencement structurel.
Proprioception et la réception de tension des muscles squelettiques sont les modalités sensorielles qui permettent des comportements coordonnés et les réponses à l'environnement externe et interne pour animaux articulés dans une variété de configuration du muscle squelettiques. L'organe récepteur musculaire dans l'abdomen de l'écrevisse est une autre préparation bien documenté (voir le projet Ecrevisse; http://www.crawdad.cornell.edu/ ) à des fins d'enseignement de la proprioception avec seulement deux neurones par abdominale hémi-secteur 23 . Être capable d'enregistrer à partir de neurones simples à faisceaux de nerfs sensoriels fournit plus de détails que l'aide à comprendre les principes de base de la réception sensorielle. Ces préparations crustacés relativement simples permettent d'aborder les aspects fondamentaux de la proprioception et la surveillance de la tension, avec la possibilité de déterminer les circuits neuronaux qui permettent l'intégration centrale d'entrées proprioceptives et autres sensoriels 9-12, 32, 33.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants pour les contributions artistiques de Hyewon Cooper.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| HEPES base | Sigma | ||
| D-Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
| CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
| Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Materials | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | Any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Electrical leads | Any company | ||
| Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | Any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | Any company | ||
| Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |
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