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Neuroscience

Propriozeption und Spannungsrezeptoren in Crab Gliedmassen: Schülerlabor Übungen

doi: 10.3791/51050 Published: October 24, 2013

Summary

Physiologischen und anatomischen Techniken werden gezeigt, Funktion und Struktur für die gemeinsame Propriozeptoren und Muskelspannung Rezeptoren in Krebstier Fuß Gliedmaßen zu adressieren.

Abstract

Das primäre Ziel dieser Verfahren ist es, Lehre und Forschung zeigen, wie die Aktivität der lebenden primären sensorischen Neuronen für Propriozeption verantwortlich, da sie gemeinsame Erfassung Position und Bewegung und Muskelspannung aufzeichnen. Die elektrische Aktivität von Krebstier Propriozeptoren und Spannung Rezeptoren wird durch neurophysiologische Grundlagen Instrumentierung aufgezeichnet und ein Wandler wird verwendet, um gleichzeitig die Kraft, die durch Stimulation eines motorischen Nerven erzeugt wird. Außerdem zeigen wir, wie man die Neuronen für eine schnelle Beurteilung ihrer anatomischen Anordnung oder zur dauerhaften Fixierung färben. Die Färbung zeigt anatomische Organisation, die Vertreter der Chordotonalorgane in den meisten Krebstieren ist. Vergleichen der Spannung Nervenreaktionen auf die propriozeptive Antwort ist ein wirksames Werkzeug für die Lehre, wie diese sensorischen Neuronen funktional definiert und wie die Anatomie der Funktion korreliert. Drei Färbetechnikenpräsentiert so dass die Forscher und Dozenten, eine Methode, die sich ideal für ihre Labor ist zu wählen.

Introduction

Propriozeption ist die Empfindung von Gliedmaßen Position und Bewegung, die koordinierte Verhalten des Motors ermöglicht. Propriozeptoren aus Position (statisch) und Bewegung (kinästhetischen)-Rezeptoren. Bei Insekten und Krebstiere, Chordotonalorgane sind die Strukturen, die diese Informationen an das ZNS 1 vorzusehen. Nicht alle Chordotonalorgane spannen einen gemeinsamen, aber sie können immer noch Gelenkbewegungen aufgrund ihrer Befestigung auf den apodemes (Sehnen-Strukturen), die das Gelenk überspannen und sich in Verbindung mit der Skelettmuskulatur und Gelenkbewegung zu überwachen. Crab Beine haben sechs Gelenke, die jeweils mit einem oder zwei Chordotonalorgane 2. Typischerweise wird eine chordotonal Orgel hat 60 bis 100 oder mehr sensorischen Neuronen innerhalb eines elastischen Strang eingebettet ist, Neuronen, die statische gemeinsame Position, Richtung und Geschwindigkeit der Bewegung 06.03 signalisieren. Die Eingabe von Chordotonalorgane an jedem Gelenk-und Bein wird dann zentral verarbeitet so dass koordinierte Bewegungen durch das Tier.

Die unten demonstriert Verfahren ermöglichen strukturelle und funktionelle Analyse der Neuronen, die beide Arten von Rezeptoren relativ zu ihrer Lage auf einem chordotonal elastischen Strang und apodeme innervieren. Um zu veranschaulichen, verwenden wir die propodite-dactylopodite (PD) chordotonal Organ, das Organ, das den meisten distalen Segment der Krabbenbein 3 überspannt.Obwohl detaillierte elektrophysiologische Studien begann in den 1930er Jahren und werden noch heute aus durchgeführt wird, haben einige Aspekte werden über die Segmentverbindungen von Propriozeptoren in den verschiedenen Gelenken und ihre Rollen in der koordinierten Steuerung muscles10-16 bekannt. Festlegung der Struktur-Funktions-Beziehung zwischen den propriozeptiven Organe, Muskeln und das Nervensystem wird dazu beitragen, diese Rollen zu definieren. Zum Beispiel wird die Beschriftung der Somata und distalen Enden der Spannung in den Neuronen apodeme eingefügt ihrer Lage relativ zu Muskelfasern 8,17-21 offenbaren.

Wir präsentieren drei Färbetechniken für Krustentier Beine, die in der Forschung und akademischen Labors verwendet werden kann. Methylenblau-Färbung bietet geeigneten Kontrast für Muskeln und Nerven und wird als eine einfache Technik für Studenten, um Anatomie zu lernen empfohlen. Labs, die Fluoreszenzmikroskopie Setups können selektiver neuronaler Färbung durch kurzes Aussetzen des Nerven erreichens an den Vitalfarbstoff 4-Di-2-ASP. Die dritte Alternative ist CoCl 2 Hinterfüllung, die die Nervenzellen färbt und fixiert, und keine Fluoreszenz-Bildgebung erforderlich. Obwohl es Arbeit und Zeit intensiv, diese Färbung verleiht hohen Kontrast und Spezifität für die Nerven, die gefüllt sind. Zusammen können diese Techniken für den Vergleich verschiedener Chordotonalorgane nicht nur innerhalb einer Extremität oder zwischen den Gliedern, sondern auch bei anderen Krebstier-und Insektenarten 20-22, verwendet werden. Blaue Krabben (C. sapidus) in physiologischen und anatomischen Aufnahmen Färbung verwendet werden, sind in der ganzen Süd-und Südostgrenze der Vereinigten Staaten zur Verfügung stehen. Diese Art dient als Vertreter der chordotonal und Spannung Nerven Regelungen in den meisten Krebse gefunden. Laboratories an der Westküste wird es vorziehen, die viel größer Dungeness Crab (Cancer magister) für diese Experimente zu verwenden.

Protocol

1. Dissection und Recording elektrische Aktivität von der Propodite-dactylopodite (PD) Nerven

  1. Halten Sie die Krabben über den Panzer von hinten, und die Vermeidung der Klauen, kneifen die proximalen Teil des meropodite mit einer Pinzette. Das Bein wird autotomize, um das Tier aus Verbluten zu verhindern. Vorsicht beim Umgang mit Blaukrabben, wie sie eher aggressiv und sehr schnell sind.
    Figur 1
    Abbildung 1. Erste Fuß Bein einer Krabbe. Die anatomische Lage der Chordotonalorgane (schraffierte Bereiche) sind auf dieser schemalagert. Der Doppelpfeil zeigt an, wo Kopf, das Bein für die PD Nerven Experimente durchschneiden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
  2. Machen Sie einen Schnitt zwischen der propodite und carpodite. Entsorgen Sie die carpopodite und t er befestigt meropodite (Abbildung 1).
  3. Schneiden Sie ein großes Fenster in der Kutikula auf der pigmentierten (laterale) Seite des propodite mit einem Skalpell mit einer Klinge Nr. 11 (Abbildung 2 und 3). Hinweis: Schneiden Sie nicht tief.
  4. Entfernen Sie die Schuppenschicht, indem Sie den Skalpellklinge unterhalb und parallel zu der Nagelhaut. Diese trennt die auf die Nagelhaut angebracht Muskelfasern.
  5. Mit der gleichen Technik schneiden Sie ein kleines Fenster auf der pigment (mediale) Seite des propodite, aber lassen Sie den Gelenkkopf (die Gelenk oder ein Scharnier zwischen den Segmenten) Anlage intakt.
    Figur 2
    Abbildung 2. Entlang der gestrichelten Linie auf der propodite Cut. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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    Abbildung 3. Expose die Nerven in dem Fenster (die Pfeile beschreiben die Nervenbündel). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
  6. Bereiten Sie eine Sylgard gesäumten Schale mit Krabben Kochsalzlösung, um die Vorbereitung festzunageln. Hinweis: Siehe Tabelle 1 für artspezifische Salz Rezepte.
  7. Suchen Sie die PD-Orgel von sorgfältig Sondierung mit den feuerpolierte Glas Nadeln. Die elastische Strang überspannt den Joint hat ein silbernes Aussehen.
  8. Entfernen Muskelfasern, die Ihre Sicht der Orgel von beiden Seiten der Sehne zu verschleiern. Seien Sie sehr vorsichtig, nicht zu den PD Organ oder die Nerven zu verletzen.
  9. Sobald dies erreicht ist, fest bringen Sie die Zubereitung der Schale mit dem Pigment seitlich (lateral) nach oben (Fig. 4).
    Fig. 4 Abbildung 4. Exposed PD Organ-und Nerven. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
  10. Folgen Sie der PD Orgel Nerv im propodite so proximal wie möglich, um zu Aufzeichnungszwecken frei-up eine große Länge der Nerven (1,5 cm). Dies geschieht am besten, während die PD Nerven noch mit dem Hauptlauf Nerven angebracht.
  11. Nach dem Abtrennen der PD Nerven von der Hauptbeinnerv mit Hilfe von Glas-Nadeln, trennen PD Nerv proximal der Iris Schere. Hinweis: während der Präparation zu dehnen oder ziehen Sie nicht auf den Nerv.
  12. Bewegen Sie den dactylopodite zu einer erweiterten und voll gebeugten Position. Beachten Sie darüber, wo die extreme Beugung und Streckung Positionen und ein halber Punkt für die spätere Verwendung.
  13. Legen Sie ein Erdungsdraht in der Solebad.
  14. Einschalten des Electrophysiology Aufnahme Hardware / Software. Hinweis: Unsere Einrichtung hat bisher 23 beschrieben.
  15. Positionieren Sie das Mikroskop, so dass es mit Blick auf den Mikroskoptisch. Sobald die Vorbereitungs Gericht wird auf der Bühne platziert, müssen Sie die Position des hohen Intensität Beleuchtungsstrahl am besten visualisieren die Vorbereitung ein.
  16. Positionieren Sie den Mikromanipulator angebracht, so dass die Saug-Elektroden-Einheit wird einen einfachen Zugang zum Solebad und die Vorbereitung zu haben. Saugelektrode ist wie in einem Online-Video 24 gezeigt.
  17. Zum Nachweis neuronaler Aktivität, zeichnen Sie das Schnittende der PD Nerven in die Saug-Elektrode.
  18. Bewegen Sie den dactyl ganz ausgestreckten und gekrümmten Positionen für mehrere Zyklen mit Hilfe einer Glassonde oder Holzdübel.
  19. Nächste Aktivität zu beobachten, wenn die dactyl wird in den erweiterten, gebeugt und mittleren Positionen merken.

2. Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von der SpannungNerve Überwachung während Trupp

  1. Bestimmung der lateralen und medialen Seite des Beins. Die mediale Seite eine weiche Textur, die durch Kneifen sanft im meropodite Region mit einem Fingernagel spüren kann.
  2. Legen Sie diese weiche Nagelhaut nach oben in die Schüssel. Der Erreger, der die motorischen Nerven Opener Muskel innerviert innerviert auch die Trage Muskel im carpopodite.
  3. Um den Opener Muskel stimulieren die Trage in der motorischen Nerven carpodite Region wird isoliert und mit einer Saug-Elektrode stimuliert. Der proximale Teil des Beines durch Trennung des meropodite mit einer Schere entfernt.
  4. Entfernen eines Abschnitts der Oberhaut in die Handwurzel Bereich auf der Innenseite (medial, Fig. 5A).
  5. Schneiden Sie die apodeme der Biegemuskel und entfernen Sie den Muskel vorsichtig, um nicht die Hauptbeinnerv aus der Beinhöhle ziehen (5B, C beachten Sie die Pfeile, wo Bender apodeme wird getrennt). Der Hauptlauf Nerven und ein BHnch an der Streckmuskel kann dann beobachtet werden (Abbildung 5D).
  6. Finden Sie die Verzweigung von Nerven der Hauptnervenbündel an der Streckmuskel (5E, bei Pfeil). Dies kann in der Nähe des Muskel geschnitten und zog in eine Saug-Elektrode zu stimulieren (5F und G, Pfeil zeigt den Zweig).
  7. Necken ein Abschnitt der Nerv, der in Richtung der Öffner-Projekte ohne Einklemmen des Nervs. Durchschneiden die Bahre / Öffner motorischen Nerven.
  8. Ziehen Sie die motorischen Nerven in den Saug-Elektrode und stimulieren sie dann.
  9. Um den Opener Muskel-und Nerven Spannung aussetzen entfernen Sie das näher Muskel-und den Bauchbereich des propodite. Schneiden Sie das näher Muskel mit einem Skalpell mit einem # 11 Klinge in der propodite (Abbildung 6). Hinweis: Schneiden Sie nicht tief in der proximalen Region, denn es könnte der Opener motorischen Nerven schädigen.
    Figur 5 Abbildung 5. Dissection Schritte zum Freilegen der Motor Neuron für die Stimulierung der Opener Muskel. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
    Fig. 6
    6. Schneiden Sie die Nagelhaut auf der ventralen Hälfte des propodite, die näher Muskel so dass es entfernt werden kann, aus. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
  10. Tauschen Sie die Kochsalzlösung mit frisch gekühlten Salzlösung in der gesamten Dissektion Prozess, um die Nervenzellen am Leben zu halten. Für weitere Dissektion, legen Sie die Vorbereitung Gericht unter einem Binokular und mit Glasfaser-Beleuchtung.
  11. Die engere Sehne Schneiden Sie vorsichtig aus ihrer Befestigung andie dactyl mit spitz zulaufenden mittelgroßen Schere.
  12. Seien Sie sehr vorsichtig, nicht die Zweige der Opener Muskel aus dem Hauptlauf Nerv, der deutlich sichtbar sein sollte stören.
  13. Entfernen und Entsorgen der näher Muskeln und Sehnen.
  14. Machen Sie ein Loch in der dactyl mit einer Dissektion Pin. Dieses Loch wird später verwendet werden, um auf die Spannung (Kraft) Wandler den Metallstift Haken, aber es ist notwendig, um es in diesem Stadium des Verfahrens zu machen.
  15. Suchen Sie den Nervenzweig, die den Opener Muskel-und apodeme im distalen Bereich des Openers Muskel-Projekten. Sorgfältig untersuchen die Nerven mit dem feuerpolierte Glas Tool.
  16. Beachten Sie die Spannung Nerv, von dem distalen Ende des apodeme und fährt mit dem motorischen Nervenbündel entsteht.
  17. Zum Nachweis neuronaler Aktivität, füllen eine Saug-Elektrode mit Krabben Kochsalzlösung und ziehen Sie das abgeschnittene Ende des Openers Nervenspannung in der Elektrode. Sicherzustellen, dass die Saugelektrode enganliegend auf den Nerv.
  18. Untersuchen Sie für die NEURAl Korrelat der passiven Spannung auf dem Opener apodeme. Während der Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von Nerven der Spannung, drehen Sie den dactyl schnell in einen längeren gemeinsamen (dh Strecken der Opener Muskel).
  19. Nächstes Test aktive Kraft in Bezug auf die Entwicklung Stimulationsfrequenz.
  20. Stecken sie einen Metallhaken, so dass die Spitze des Hakens durch ein kleines Loch in der dactyl geht.
  21. . Schließen Sie das andere Ende des Metallhaken auf den Kraftaufnehmer Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der Wandler in einem 90 °-Winkel jedes Mal, so dass der Stift senkrecht an den Wandler für die maximale Erfassung der erzeugten Kraft.
  22. Ziehen Sie den Haken und dactyl, so dass es in einem 45 °-Winkel des Openers Gelenk ist.
  23. Jetzt regen die motorischen Nerven bei 100 Hz für 250 ms und messen die Kraft als auch die Schussfrequenz der Spannung Nerv.
  24. Legen das Gelenk in einer vollständig ausgefahrenen Position, so dass die Öffnungs Muskelfasern schlaff.
  25. Stimulate die motorischen Nerven bei 100 Hz für 250 ms und messen die Kraft als auch die Schussfrequenz der Spannung Nerv.
  26. Biege / das Gelenk beugen, so dass es vollständig gebeugt (~ 90 °). In dieser Position werden die Muskelfasern des Öffners vollständig gestreckt. Es kann einige Kraft, die durch den Wandler durch diese passive Dehnung des Muskels gemessen wird.
  27. Anregung der motorischen Nerven bei 100 Hz für 250 ms und messen die Kraft als auch die Schussfrequenz der Spannung Nerv.
  28. Nach der Messung eine Kraft, gehen in einer Reihe von verschiedenen Frequenzen: 20, 40, 60, 80 und 100 Hz für 8-10 s in jeder Gelenkstellung.
  29. Messen Sie die Reaktion mit einem schnellen Spannungslösung. Ordnen Sie die Vorbereitung, so dass der Haken an der Kraftaufnehmer leicht aus dem Loch in der dactyl geschoben werden.
  30. Biege / das Gelenk beugen, so dass es vollständig gebeugt (~ 90 °). Jetzt regen die motorischen Nerven bei 100 Hz mit einer kontinuierlichen Stimulation der 5 sek.
  31. Nach dem ersten SECONd oder weniger, als Zug hat sich auf dem Opener Muskel aufgebaut, schieben Sie den Stift aus dem Loch in der dactyl.
  32. Untersuchen Sie die Spannung Nerven Aufnahme vor und nach der Veröffentlichung der Stift, der den dactyl.
  33. Modulatorischen Effekte von neuroaktiven Substanzen, wie Octopamin, Serotonin und Proctolin, der den Ausgang der Spannungs Neuronen ändern können, indem diese Moleküle an der Bademittel über dem freigelegten Muskel Öffner und Wiederholung der Experimente bestimmt werden.
  34. Verwenden Sie eine Pipette und tropft 2.1 ml über die Vorbereitung.

3. Die Färbung peripheren Nervensystems Strukturen in Krusten Gehen Beine

  1. Methylenblau-Technik
    1. Verdünnen Sie einen Teil Methylenblau Chlorid-Stammlösung (0,25%) mit zwei Teilen destilliertem Wasser.
    2. Fügen Sie diese Mischung zu fünf Teile Kochsalzlösung. Den Bereich von Interesse gründlich zu bewässern.
    3. Präparieren Sie ein Bein nach dem Protokoll im Abschnitt 1. Inkubieren Sie die vorgebereitung in der Methylenblau-Lösung bei 12-13 ° C
    4. Untersuchen Sie die Vorbereitung alle 10-15 min mit dem Binokular mit geringer Intensität Beleuchtung, um den Fortschritt der Färbung zu folgen. In einigen Fällen Färbung wird in einer Stunde abgeschlossen werden, in anderen kann es über Nacht zu nehmen.
  2. 4-Di-2-ASP Technik
    1. Fluoreszierende Farbstoffe verwendet werden, um Back-füllen die PD Neuron oder direkt färben die Vorbereitung aus dem Bad. Doch ein geeignetes Mikroskop mit Fähigkeiten, um die Fluoreszenzfarbstoff sehen ist erforderlich.
    2. Präparieren Sie ein Bein nach einem Protokoll im Abschnitt 1.
    3. Inkubieren Sie die Zubereitung in einer Konzentration von 10 uM 4-Di-2-ASP-Lösung und lassen Sie die Zubereitung in den Kühlschrank für 15 min. Verwenden Sie gerade genug Lösung, um die Vorbereitung zu decken.
    4. Fotografieren Sie die Vorbereitungen schnell und über die Exposition der Quecksilber-Licht zu vermeiden. Diese fluoreszierenden Farbstoff verblasst relativ schnell.
  3. Cobalt Chlorid Technik
    1. Expose der PD Nerven nach dem Protokoll in Abschnitt 1 und halten Sie sie in kaltem Salzeingetaucht.
    2. Machen Sie eine Vaseline gut, um die CoCl 2 zu halten. Falls CoCl 2 schwappt in die Salz Bad die gesamte Vorbereitung wird schwarz färben und die Herstellung muss verworfen werden.
    3. Öffnen Sie mit einem kleinen Schnitt einer Polystyrolfolie, um ein Kunststoffplattform zu machen, und stecken Sie es in einer solchen Weise, dass es nicht weg schwimmen oder sich in der Kochsalzlösung eingetaucht (Abbildung 7).
      Fig. 7
      Abbildung 7. Polystyrol-Platte mit Pins, um im Platz in Schale zu halten. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
    4. Werfen Vaseline aus einer feinen Injektionsnadel auf einer Einwegspritze befestigt,dann eine Barriere (ein Kreis könnte gut funktionieren), die etwa 1 bis 1,5 mm hoch, außer einem flachen "V" am Mittelpunkt, wo der Nerv wird über, drapiert werden auf der Oberseite der Schlupf von Polystyrol sein sollten.
    5. Einen kleine Pfütze von Salz auf beiden Seiten der Barriere in der Nähe des "V". Die Pflege nicht zu dehnen oder zu kneifen die Nerven, heben Sie den Nerv vorsichtig aus der Schüssel und legen Sie sie in der Salz Pfütze in der Vaseline gut.
    6. Arbeiten Sie schnell, so dass der Abschnitt von Nerven trocknet nicht aus, vorsichtig auswerfen Vaseline auf die freiliegende Nerv zu decken. Jetzt testen die Barriere mit Kochsalzlösung und stellen Sie sicher, es ist nicht undicht.
    7. Blot entfernt Salz auf der Innenseite der Barriere und sehen, ob sie voll ist, wenn das Bad Salzlösung hoch ist, um die Wand des Vaseline, um sicherzustellen, dass die beiden Seiten voneinander (Fig. 8) isoliert.
      Fig. 8
      ng> Abbildung 8. Vaseline gut mit Kochsalzlösung und PD Nerven überspannt den auch. Der PD Nerven noch nicht geschnitten worden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
    8. Wick entfernt die Kochsalzlösung in die gut mit einem Stück Seidenpapier. Vermeiden Sie, dass das Papier wickeln die Nerven.
    9. Stellen Sie eine neue Pfütze mit ein paar kleinen Tropfen von destilliertem Wasser, und dann schneiden Sie den Nervenende. Seien Sie sehr vorsichtig, nicht den Nerv durch die Barriere zu ziehen, wenn er den Cut. Der osmotische Schock des destillierten Wassers wird "Ballon" die Axone.
    10. Innerhalb von 30 Sekunden fügen Sie einen kleinen Tropfen CoCl 2 zum Wasser, genießen Sie diese Lösung, und fügen Sie genug CoCl 2, um eine Pfütze in diesem Abschnitt der Nerven verkürzt (Abbildung 9) bilden. Die Vorbereitungen sind am besten bei 13 ° C gekühlt gehalten für 12-24 Std.
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      Abbildung 9. Die Schnitt PD Nerven an CoCl 2 ausgesetzt. Der Schnitt Nerv schwillt in der Gegenwart von Wasser, das durch die Axone in den Neuronenzellkörpern erleichtert und beschleunigt die Bewegung der Farbstoffmoleküle. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
    11. Entfernen Sie die Befeuchtung Pfützen. Tupfen Sie sich die Kobaltlösung mit einem Gewebe und waschen die Überreste von Kobalt mit mehreren Änderungen der Kochsalzlösung.
    12. Übertragen der isolierten Präparation auf eine Glaspetrischale mit ca. 10 ml Kochsalzlösung Krabben. Die Neuronen werden gewaschen und die folgenden Schritte werden in situ durchgeführt. Gute Metallwerkzeuge sind nicht zu verwenden, um die Vorbereitung nach diesem Schritt (Sie sollten spezifische Tools, die nicht zu einem späteren Zeitpunkt für Physiologie verwendet werden, zu verwenden) zu behandeln.
    13. Fügen Sie 1-2 Tropfen Ammoniumsulfid (NH4) 2 S zu der Salzlösung. Verschließen Sie die (NH 4) 2 S-Flasche verschließen und wieder in die Kapuze. Beobachten der Reaktion bei der Herstellung unter einem Präpariermikroskop
    14. Innerhalb von 1-2 min sollte Kobalt gefüllten Neuronen und ihre Prozesse beginnen zu erscheinen, weil sie schwarz zu färben.
    15. Nach 5-10 min, ersetzen Sie die Entwicklungslösung mit frischem Salzlösung.
    16. Stellen Sie sicher, dass die Entwicklung Lösung, die Sie in die Spüle Abfluss gegossen haben, wird von fließendem Leitungswasser für ein paar Minuten oder in einem Abfallbehälter mit einem Deckel gefolgt.
    17. Gießen Sie das Kochsalzlösung und befestigen Sie den Nerven Vorbereitung für ca. 15 min mit zwei Änderungen von Bouin-Lösung Fixiermittel. Für größere Geweben wie der Opener Muskel (um Spannung Neuronen Fleck), erhöhen Sie die Dauer der Fixierung bis 30 min.
    18. Dehydratisierung in einer Reihe von aufsteigenden Reihenfolge beginnend Ethanolkonzentration auf 70% (dh 70%, 80%, 90%, 100%). Etwa 10 min bei jeder Konzentration ist ausreichend fürkleine Gewebe.
    19. Nach ca. 10-15 min in zwei Änderungen von 100% Ethanol, deaktivieren Sie das Gewebe durch den Austausch mit Ethanol 100% Methylsalicylat. Die Vorbereitung wird in dieser Lösung permanent wiederholte Betrachtung bleiben. Mit der Zeit werden die gefüllten Zellen werden deutlicher, da das umgebende Gewebe wird klarer. Intensivierung Methoden können verwendet werden, um im Laufe der Zeit verblassen 25 zu verhindern.
    20. Verwenden Sie den gleichen Prozess, um die Spannung Nerven mit CoCl 2 zu füllen. Allerdings ändern Ethanol-Lösung mehrfach in jeder Ethanol Entwässerungsschritt und Inkubation der Vorbereitung innerhalb Alkohol für ca. 20 Minuten für jeden Schritt gründlich zu dehydrieren die Muskeln und es ihnen ermöglichen, auch zu löschen.

Representative Results

Wenn die PD Organ wird durch die gemeinsame, die sich voll gestreckt, ist Aktivität in der PD Nerven während der Bewegung wie bei der ersten Sekunde in Abbildung 10 dargestellt robust. Einige Aktivität bleibt, während es noch in der geöffneten Position gehalten wird. Diese Tätigkeit ist von den statischen positionsempfindlichen Neuronen (zweite Hälfte des in Abbildung 10 dargestellt Aufnahme). Bewegung ruft eine Reaktion während der Verschiebung, und die Brenn ist vor allem während der Streckung der chordotonal Strang (Abbildung 11) vorhanden ist.

Eine weitere Analyse der Spitzen können leicht durch Sortieren der relativen Amplituden fahren werden. Dies ist ein Ansatz, um verschiedene Populationen von sensorischen Neuronen, die für Positionen oder Arten von Bewegungen 5 rekrutiert demonstrieren. Typische Amplituden reichen von 0,25 bis 1,5 mV, aber diese Werte sind abhängig von dem Widerstand (dh Dichtigkeit) der Saugelektrode Dichtung. Häufigkeit der Spitzen in ter verschiedene Größenbereiche können auch zur Analyse grafisch dargestellt werden.

Kräfte, die durch den Öffner Muskel bezüglich der Stimulationsfrequenz erzeugt wird, kann durch Überlagerung der jeweiligen Spannung-Zeit-Spuren auf der jeweils anderen (13A und B) verglichen werden. Dies kann auch für jedes gemeinsame Position zu jedem gegebenen Stimulationsfrequenz durchgeführt werden. Aktivität des Nerven Spannung kann dann mit dem Betrag der relativen Kraft an jedem Stimulationsfrequenz erzeugt korreliert werden, und für jede gemeinsame Position. Wie in der PD Nerven werden eine Vielzahl von Spitzenamplituden entsprechend der Kontraktion des Muskels Öffner (Fig. 13C) gesehen.

Anatomische Anordnung der Neuronen in der Laufbein ist eindeutig mit Methylenblaufärbung (Fig. 14) beobachtet. Beachten Sie die elastischen chordotonal Strang und Spannung Neuron, das in der Nähe des apodeme ist. Mehrere Zellkörper mit unterschiedlichen Durchmessern eind bestimmten Orten sind auch in dieser Figur sichtbar. Der gesamte Verlauf der Spannung und Nerven Trage motorischen Nerven sind in Abbildung 15 dargestellt. Einzelne Neuronen des Nerven PD mit höheren Kontrast mit 4-Di-2-ASP (Abbildung 16) und CoCl 2 (Abbildung 17) Hinterfüllung Techniken gezeigt. Bei hoher Vergrößerung die sensorischen Endungen kann innerhalb der unterstütz scolopales (16B) 21,22,26 gesehen werden.

10
Abbildung 10. Bewegen und halten bei 0 °. Die dynamischen Neuronen sind robust in Brand während der Bewegung und Spitzen von elektrostatisch empfindlichen Neuronen vorhanden sind, während die Verbindung offen gehalten. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht </ A>.

11
Abbildung 11. Schneller und Schließen von offenen voll ausgebaut (90-0 °) Position gebogen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

12
Abbildung 12. Extrazelluläre Spikes von der PD Nerven aufgezeichnet. Das Gelenk ist voll ausgefahren und dann schnell bewegt, um einen ½ Beugestellung und dann ruhig halten. Beachten Sie die Aktivität während der Bewegung und verminderte Aktivität, wenn statisch. Klicken Sie hier, um größere ima ansehenge.

13
Abbildung 13. Die relativen Kräfte, die mit der gemeinsamen Entwicklung sind komplett gebogen und an den verschiedenen Frequenzen stimuliert. (A) Spannung-Zeitspuren aus dem Kraftaufnehmer sind mit jedem Stimulationsfrequenz gezeigt. (B) Die Spuren in Feld A sind in verschiedenen Farben für Leichtigkeit im Vergleich überlagert. (C) Spannung-Zeitverläufe der elektrischen Aktivität von Nerven der Spannung aufgezeichnet, wenn die motorischen Nerven wurde bei 80 Hz stimuliert. Beachten Sie die regelmäßigen Muster der Reizartefakten im Vergleich zu der neuronalen Aktivität. Beachten Sie auch, die verschiedenen Amplituden der neuronalen Antworten. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .


Abbildung 14. Methylenblau-Färbung des Laufbein Vorbereitung. Individuelle Somen sind mit ihren sensorischen Endungen in den elastischen Strang vorstehenden gezeigt. In der Nähe des apodeme eine Spannung Neuron gezeigt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

15
Abbildung 15. Nerven Die Spannung, die sich aus distalen Ende (rote Pfeile) und Verbinden der motorischen Nerven (grüner Pfeil). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .


Abbildung 16. (A) Ein Back-Füllung des PD Nerven in Cancer magister mit 4-Di-2-ASP. (B) Höhere Vergrößerung von sensorischen Endungen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

17
Abbildung 17. Neuronen, die mit CoCl 2 befüllt und verarbeitet wurden (A). Traced Umriss der Vorbereitung gezeigt gefärbt (B). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Dextrose (D-Glucose)
Salzig g / L
NaCl 27.29
KCl 0,81
MgSO 4 • 7H 2 O 4,81
CaCl 2 • 2H 2 O 1,85
Na 2 SO 4 • 10H 2 O 0,97
1.982
HEPES Säure 0.476
HEPES Salz 2,08
Auf pH 8,1 mit NaOH oder HCl

Tabelle 1. Krabben Rezepte für Kochsalzlösung.

Discussion

Der Zweck dieser Versuchsreihe 1) von einer identifizierbaren propriozeptiven Nervenspannorgan und lehren und zeigen die Grundprinzipien der extrazellulären Aufzeichnungen und 2) die Bedeutung von anatomischen Karten für die physiologische Funktion von bestimmten sensorischen Systeme streichen. Dieser experimentelle Ansatz und die Tiermodelle verwendet werden, sind preiswert und relativ einfach in der Neurophysiologie Lehrlabors durchzuführen.

Die Neuronen Chordotonalorgane sind von zwei spezifischen Funktionstypen, die, die auf Bewegungen und die Reaktion auf statische Positionen. Einzelzellaufnahmen aus einer Vielfalt von Chordotonalorgane, egal welche gemeinsamen untersucht wird, haben gezeigt, dass dies der Fall 3,5 sein. Tatsächlich Chordotonalorgane mit den Antennenverbindungen von Hummer verbunden zeigen die gleichen zwei Sinnestypen und grundlegende Anatomie 27. Zusätzlich zu, dass es zwei Neuronentypen (Bewegung und position), die Neuronen die gleiche anatomische Anordnung an ihren jeweiligen elastischen Fäden. Die große Somata proximal am Strang befindet eher auf die dynamische Bewegung sensiblen Neuronen gehören. Neuronen, die statischen Positionen signalisiert haben kleine Zellkörper und distal entfernt. Diese Zellen sind tonisch aktiv. Der PD-Joint enthält nur einen einzigen chordotonal Orgel, während es zwei Chordotonalorgane in der Handwurzel-propodus (CP) und merus-Handwurzel (MC) Gelenke.

Die Präparation auf propriozeptiven Strukturen in Blaukrabben (C. sapidus) für elektrophysiologische Aufnahme aussetzen erfordert eine Strategie, die Gelenkbewegungen statt in den Natur Positionen zu nehmen, während der Aufnahme von sensorischen Neuronen ermöglicht. Die Spannung, Nerven für den Opener Muskel im Bein Walking ist eine sehr feine Nerven aus mehreren Neuronen. Sofern darauf geachtet wird, die Spannung Nerven sowie der motorischen Nerven innervieren die Muskeln stimuliert werden, können in dieser Präparation beschädigt werden. Füroptimale Aufnahmen Saugelektroden müssen auf die Größe des Nervs angepasst werden. Aufnahmen sind in einem Schülerlabor mit einer 30-40-facher Vergrößerung Binokular-und Low-End-Mikromanipulatoren leicht zugänglich.

Zukünftige Experimente, das wäre interessant, mit den gemeinsamen Chordotonalorgane verfolgen wäre, die strukturellen und physiologischen Beinprofile während der Regeneration bei verschiedenen Spezies in verschiedenen Phasen des Lebenszyklus zu untersuchen, wie eine Folgemaßnahme zu einer ersten Studie, die Cancer magister 19,26 verwendet . Fragen noch zu richten sind: 1) hat die Verteilung und Organisation von Nervenzellen regeneriert hängen vom Alter des Tieres beim Regenerieren ein Glied, 2) sind die axonalen Projektionen des ZNS (Bauchmark) in einem Regenerations Gliedmaßen Funktions oder tut es nehmen Sie sich Zeit und die gemeinsame Nutzung zu funktionellen Verbindungen herzustellen, und 3), was passiert mit den abgetrennten Axone proximal der Autotomie Ebene, wenn das Glied autotomized? 28

Krebstiere entsprechen den Umweltbedingungen und ihrer Umgebungstemperatur, aber es ist unklar, wie sie Koordination zu erhalten in einem neuronalen Schaltkreis, wie Nervenzellen ändern ihre Aktivität in Reaktion auf Temperaturänderungen. Eine langsame Geschwindigkeit der Änderung könnte dem Tier einige Zeit zur Akklimatisierung zu ermöglichen, während eine schnelle Änderung kann not29, 30. Physiologische Veränderungen im pH-Wert oder Osmolarität durch Stoffwechsel, Verhalten 31 oder Auswirkungen auf die Umwelt können ähnliche Herausforderungen zu neuronalen Schaltkreise in Propriozeption beteiligt zu präsentieren. Diese Krustentierpräparate sind ideal für die Lösung dieser Art von Problemen, weil ihre Funktion auch bei einer Einzelzellebene aus.

In diesem Protokoll haben wir die physiologische Bedeutung der Spannung Neuronen bei der Überwachung der Kraft, die von dem Opener Muskel erzeugt demonstriert. Diese Spannung Rezeptoren können, um ihre Position innerhalb der apodeme mithilfe Färbeverfahren zurückverfolgt werden. DieseNeuronen, wie in Säugetieren, erkennen Kraft auf verschiedenen Ebenen und zu rekrutieren zusätzliche Neuronen wie die Kraft steigt. Die Frequenz der Aktivität hängt mit der Anregungsfrequenz des Motors Neuron bis zur Sättigung in Empfang erreicht wird. Mit einem Schnellverschluss-Protokoll mit dem gebogenen dactylus Gelenk, schnell verschwindet Spannung Aktivität, sondern kehrt auf die Wiedererlangung Spannung in einer vollständig ausge Joint dann. Dies ist ein klassisches experimentelles Verfahren, um die Kraft auf Zug-Rezeptoren gemessen illustrieren. Verschiedene Neuromodulatoren können sich auf die Herstellung angewendet werden, um zu sehen, wie sie die Entwicklung der Kraft und der neuronalen Reaktion bewirkt. Einer der wichtigsten Aspekte ist, wie die neuronalen Antworten werden verarbeitet und im Zentralnervensystem und ihr Einfluss auf die Aktivität von Motoneuronen integriert. Die Techniken, die wir gezeigt haben, erlauben es, zu starten, um mehr Informationen über die Spannung (sensorischen) Nerven Motor Neuron Schaltungsfunktion, dh das Signal in einem intakten Bein zum Ganglion und Rücken Adresseauf den Muskel.

Die Färbung Verfahren nachgewiesen sind der Schlüssel zum Verständnis der Physiologie der Sinnesnervenzellen, die propriozeptiven Organe innervieren. Anatomische Anordnung der Neuronen basierend auf der Funktion und der Größe des Soma sind ähnlich in den verschiedenen Chordotonalorgane innerhalb der Krabben Beine. Es ist nicht bekannt, ob ähnliche neuronale Arrangements sind auch in anderen Schalentierarten und Insekten gefunden. Die Kombination von physiologischen Aufnahmen von Einzelzellen und Kartierung der Lage ermöglicht direkten Strukturfunktionsbeziehungen. Die langfristige Erhaltung der anatomischen Anordnung mit CoCl 2-Färbung und Fixierung ermöglicht es, wiederholt zu Maßnahmen und Bewertung der strukturellen Anordnung.

Propriozeption und Spannung Empfang der Skelettmuskeln sind Sinnesmodalitäten, die koordinierte Verhaltensweisen und Reaktionen auf externe und interne Umfeld für Gelenktiere in einer Vielzahl von Skelettmuskel-Konfiguration zu aktivierens. Der Muskel-Rezeptor-Orgel in der Bauch der Krebse ist eine weitere gut dokumentierte Vorbereitung (siehe Crawdad Projekt; http://www.crawdad.cornell.edu/ ) für Lehrzwecke der Propriozeption mit nur zwei Neuronen pro Bauch Hemi-Segment 23 . Die Möglichkeit, von einzelnen Nervenzellen auf sensorische Nervenbündel aufnehmen weitere Einzelheiten, dass die Hilfe für das Verständnis der grundlegenden Prinzipien der sensorischen Rezeption. Diese relativ einfache Krustentierpräparate erlauben es, grundlegende Aspekte der Propriozeption und Spannungsüberwachung anzugehen, mit dem Potenzial, die neuronalen Schaltkreise, die zentrale Integration von propriozeptiven und andere sensorische Eingänge 9-12, 32, 33 ermöglichen zu bestimmen.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich für die künstlerischen Beiträge der Hyewon Cooper.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard Dow Corning 182 silicone kit
NaCl Sigma-Aldrich S7653
KCl Sigma-Aldrich P9333
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
HEPES acid Sigma 3375 Free acid, crystalline
HEPES base Sigma
D-Glucose Sigma G7021
MgSO4•7H2O Sigma M2643
Na2SO4•10H2O Sigma 246980
Bouin’s solution fixative Sigma HT10-1-32 Caution: Hazardous material (Special shipping cost required)
CoCl2 Sigma Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations.
Methylene blue chloride Matheson Co., Inc Basic Blue 9, C.I. 52015
4-Di-2-ASP Molecular Probes 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide
Bleach Sigma-Aldrich To chloride silver wire
NaOH Sigma-Aldrich 221465 To adjust pH
HCl Sigma-Aldrich H1758 To adjust pH
Materials
Dissecting tools World Precision Instruments assortment
Intracellular electrode probe
Faraday cage
Insect Pins Fine Science Tools, Inc 26001-60
Dissecting microscope (100X)
Fiber optic lamp
Small adjustable mirror To direct light beam toward the preparation.
Glass electrodes Sigma-Aldrich CLS7095B5X Box of 200, suction electrodes
Micromanipulator World Precision Instruments MD4-M3-R Can fix for base or on a metal rod
Raised preparation stand
Silver wire (10/1,000 inch) A-M Systems 782500
Computer Any company
AC/DC differential amplifier A-M Systems Model 3000
PowerLab 26T AD Instruments 27T
Force transducer AD Instruments 0-50g MLTF050/ST
Head stage AD Instruments Comes with AC/DC amplifier
LabChart7 AD Instruments
Electrical leads Any company
Glass tools Make yourself For manipulating nerves
Cable and connectors Any company
Pipettes with bulbs Fisher Scientific 13-711-7 Box of 500
Beakers Any company
Wax or modeling clay Any company or local stores
Stimulator Grass Instruments SD9 or S88
Plastic tip for suction electrode Local hardware store (Watt’s brand) ¼ inch OD x 0.170 inch ID Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size

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References

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Propriozeption und Spannungsrezeptoren in Crab Gliedmassen: Schülerlabor Übungen
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Majeed, Z. R., Titlow, J., Hartman, H. B., Cooper, R. Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (80), e51050, doi:10.3791/51050 (2013).More

Majeed, Z. R., Titlow, J., Hartman, H. B., Cooper, R. Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (80), e51050, doi:10.3791/51050 (2013).

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