Summary
Fysiologiska och anatomiska tekniker visat att ta itu med funktion och struktur för gemensamma proprioceptorer och muskelspänningar receptorer i kräftdjur walking lemmar.
Abstract
Det främsta syftet med dessa förfaranden är att visa för undervisnings-och forskningsändamål hur du spelar in aktiviteten av levande primära sensoriska nervceller som ansvarar för proprioception som de upptäcka gemensam position och rörelse, och muskelspänningar. Elektrisk aktivitet från kräftdjurs proprioceptorer och drag receptorer registreras av grundläggande neurofysiologisk instrumentering, och en omvandlare används för att samtidigt mäta kraften som genereras genom att stimulera en motorisk nerv. Dessutom visar vi hur man kan färga nervceller för en snabb bedömning av deras anatomiska arrangemang eller för permanent fixering. Färgning avslöjar anatomiska organisation som är representativ för chordotonal organ i de flesta kräftdjur. Jämföra spänning nerv svar på de proprioceptiva svaren är ett effektivt hjälpmedel i undervisningen i att bestämma hur dessa sensoriska neuroner definieras funktionellt och hur anatomin är korrelerad till funktionen. Tre färgningsteknikerpresenteras låta forskare och lärare att välja en metod som är idealisk för deras laboratorium.
Introduction
Proprioception är känslan av lem position och rörelse som möjliggör samordnad motoriskt beteende. Proprioceptorer består av läge (statisk) och rörelse (kinestetiska) receptorer. I insekter och kräftdjur, chordotonal organ är de strukturer som tillhandahåller denna information till CNS 1. Inte alla chordotonal organ spänner över ett gemensamt, men de kan ändå följa gemensamma rörelser på grund av deras fastsättning på apodemes (senan som strukturer), som spänner över gemensamma och rör i anslutning till skelettmuskulaturen och gemensam artikulation. Krabba benen har sex leder, var och en har en eller två chordotonal organ 2. Vanligtvis en chordotonal organ har 60-100 eller flera sensoriska neuroner inbäddade i en elastisk tråd, nervceller som signalerar statiska gemensam position, riktning och hastighet på rörelsen 3-6. Ingången från chordotonal organ i varje led och ben är då centralt bearbetas möjliggör koordinerade rörelser av djuret.
De förfaranden som visat nedan möjliggör strukturell och funktionell analys av de nervceller som innerverar båda typerna av receptorer i förhållande till deras plats på en chordotonal elastisk tråd och apodeme. För att illustrera, använder vi propodite-dactylopodite (PD) chordotonal orgel, det organ som sträcker sig över den mest distala segmentet av krabba benet 3.Även om detaljerade elektrofysiologiska studier började på 1930-talet och fortfarande pågår i dag, har vissa aspekter blivit känt om segment anslutningar proprioceptorer i de olika lederna och deras roller i samordnad kontroll av muscles10-16. Upprätta struktur-funktion relationen mellan de proprioceptiva organ, muskler och nervsystem kommer att ytterligare hjälpa till att definiera dessa roller. Till exempel kommer att märka somata och distala ändelser av spänn neuroner införda i apodeme avslöja deras placering i förhållande till muskelfibrerna 8,17-21.
Vi presenterar tre färgningsteknik för kräftdjurs ben som kan användas i forskning eller akademiska laboratorier. Metylenblått färgning ger lämplig kontrast för muskler och nerver och rekommenderas som en enkel teknik för studenter att lära sig anatomi. Labs som har fluorescens mikroskopi uppställningar kan åstadkomma mer selektiv neuronal färgning genom att kort utsätta nervens till det vitala färgämnet 4-di-2-ASP. Det tredje alternativet är CoCl 2 återfyllning, som fläckar och fixar nervceller, och kräver inte fluorescens avbildning. Även om det är arbets-och tidskrävande, ger denna färgningsprocess med hög kontrast och specificitet för nerverna som är fyllda. Tillsammans dessa tekniker kan användas för att jämföra olika chordotonal organ, inte bara inom en lem eller mellan benen, men även bland annat kräftdjur och insektsarter 20-22. Blå krabbor (C. sapidus) som används i fysiologiska inspelningar och för anatomisk färgning är lätt tillgängliga över hela södra och sydöstra gränsen till USA. Arten fungerar som en representant för de chordotonal och spänningsnerv arrangemang finns i de flesta krabbor. Laboratorier på västkusten kommer att föredra att använda den mycket större Dungeness krabba (Cancer magister) för dessa experiment.
Protocol
1. Dissection och inspelning Elektrisk aktivitet från Propodite-dactylopodite (PD) Nerve
- Håll krabba över ryggskölden bakifrån, och undvika klorna, nypa den proximala delen av meropodite med pincett. Benet kommer autotomize att hindra djuret från att förblöda. Var försiktig vid hantering av blå krabbor som de är ganska aggressiva och mycket snabb.
Figur 1. Första walking benet av en krabba. Den anatomiska lokaliseringen av chordotonal organ (streckade områden) är överlagrade på denna schematiska. Den dubbla pilspets visar var för tvärsnitt av benet för PD nervexperiment. Klicka här för att visa en större bild . - Gör ett snitt mellan propodite och carpodite. Kassera carpopodite och t Han bifogade meropodite (Figur 1).
- Skär ett stort fönster i nagelbanden på pigmente sidan av propodite med en skalpell med en # 11 blad (figur 2 och 3) Note (lateral):. Skär inte djupt.
- Ta bort nagelbanden lagret genom att skjuta skalpell blad nedanför och parallellt med nagelbanden. Detta bryter muskelfibrer knutna till nagelbanden.
- Med samma teknik som skär ett mindre fönster på pigmentless (medial) sida av propodite, men lämna kondylen (uttaget gemensamt eller gångjärn mellan segmenten) fastsättning intakt.
Figur 2. Klipp längs den streckade linjen på propodite. Klicka här för att visa en större bild .
n "src =" / files/ftp_upload/51050/51050fig3.jpg "width =" 500px "/>
Figur 3. Exponera nerven i fönstret (pilarna beskriva nervknippen). Klicka här för att visa en större bild . - Förbered en Sylgard-fodrade skål med krabba saltlösning till stift beredningen ner. OBS: Se Tabell 1 för arter specifika salt recept.
- Leta reda på PD orgel genom att försiktigt sondera med de brand polerad glasnålar. Den elastiska strängen som spänner över fogen har en silver utseende.
- Avlägsna muskelfibrer som skymmer vyn av organet från båda sidor av senan. Var mycket noga med att inte skada PD organ eller dess nerv.
- När detta har gjorts, fast sätta tillbaka förberedelse till skålen med pigmentet sidan (lateral) uppåt (Figur 4).
Figur 4. Utsatt PD orgel och nerv. Klicka här för att visa en större bild .
- Följ PD organ nerv i propodite så långt proximalt som möjligt i syfte att frigöra en lång längd av nerv (1,5 cm) för inspelningsändamål. Detta görs bäst medan PD nerven sitter fortfarande den viktigaste benet nerv.
- Efter att separera PD nerven från huvud benet nerven med hjälp av glas nålar, kapa PD nerv proximalt med iris sax Obs. Dra inte eller dra på nerven under dissektionen.
- Flytta dactylopodite till ett utsträckt och fullt böjt läge. Notera om var de extrema böjning och sträckning positioner och ett halvvägs för senare användning.
- Placera en jordledning inne i saltbadet.
- Slå på electrophysiology inspelning hårdvara / mjukvara Obs:. Vår inställning har beskrivits tidigare 23.
- Placera mikroskopet så att det är över mikroskop scenen. När prep skålen placeras på scenen, måste du justera positionen av den höga intensiteten belysningen stråle för att bäst visualisera beredningen.
- Placera mikromanipulator så den bifogade sug elektrodenheten kommer att ha enkel tillgång till saltbadet och förberedelse. Den sug elektroden är konstruerad enligt en online video 24.
- För att upptäcka neural aktivitet, dra den avskurna ändan av PD nerv i sug elektroden.
- Flytta dactyl hela utsträckta och böjda positioner för flera cykler med hjälp av en glassond eller träpinne.
- Nästa observera aktiviteten när dactyl är låst i den förlängda, böjda, och mitten av positioner.
2. Inspelning Elektrisk aktivitet från TensionNerve medan Monitoring styrke
- Bestäm den laterala och mediala sidan av benet. Den mediala sidan har en mjuk konsistens som kan kännas genom att nypa försiktigt i meropodite region med en fingernagel.
- Placera detta mjuka nagelband uppåt i skålen. Avgivningsanordningens motor nerv som innerverar öppnaren muskeln innerverar också båren muskeln i carpopodite.
- För att stimulera öppnaren muskeln båren motorisk nerv i carpodite regionen isoleras och stimuleras med en sug elektrod. Den proximala delen av benet avlägsnades genom transecting meropodite med sax.
- Ta bort en del av nagelband i framknä regionen på insidan (mediala sidan, Figur 5A).
- Skär apodeme av bender muskler och ta bort muskeln försiktigt så att inte dra de viktigaste benet nerv ur benet hålrum (Figur 5B, C notera pilarna var till Bender apodeme separeras). Den viktigaste benet nerv och en bhnch till båren muskeln kan sedan observeras (Figur 5D).
- Hitta nerven avgrening från huvudnervknippen till båren muskeln (Figur 5E, vid pilen). Kan detta kapas nära muskeln, och dras in i en sug elektrod för att stimulera (figur 5F och G, pilen visar grenen).
- Reta ut en sektion av den nerv som skjuter ut mot öppnaren utan att klämma nerven. Transekt båren / öppnaren motor nerv.
- Dra motor nerv i sug elektroden och sedan stimulera den.
- För att exponera öppnaren muskeln och spänning nerv bort närmare muskler och den ventrala regionen av propodite. Skär av närmare muskeln med en skalpell med en # 11 blad i propodite (Figur 6) Anmärkning:. Kapa inte djupt i den proximala regionen, eftersom det kan skada öppnaren motornerven.
Figur 6. Skär nagelbanden på den ventrala hälft propodite att exponera närmare muskeln så att den kan tas bort. Klicka här för att visa en större bild . - Byt ut saltlösning med färsk kyld koksaltlösning under hela dissekering processen för att hålla nervceller vid liv. För ytterligare dissektion, placera preparatet skålen under ett dissekera mikroskop och använda fiberoptisk belysning.
- Skär försiktigt den närmare senan från sitt engagemang förden dactyl med spetsiga medelstora sax.
- Var mycket noga med att inte störa grenarna till öppnaren muskeln från huvud benet nerv som ska vara klart synliga.
- Ta bort och kasta närmare muskler och senor.
- Gör ett hål i den dactyl med en dissektion pin. Detta hål kommer att användas senare för att haka fast metallstiften på spänning (kraft) omvandlare, men det är nödvändigt för att göra det på detta stadium av förfarandet.
- Lokalisera nerven gren som projicerar till öppnaren muskeln och apodeme i den distala regionen av öppnaren muskeln. Försiktigt sondera nerven med elden-polerat glas verktyg.
- Beakta spännings nerv som uppkommer från den distala änden av apodeme och fortsätter till motornervknippen.
- För att upptäcka neural aktivitet, fyller ett sug elektrod med krabba saltlösning och dra den avskurna ändan av öppnaren spänningsnerven i elektroden. Se till att sug elektroden sitter tätt på nerven.
- Undersök för Neural korrelat för passiv spänning på öppnaren apodeme. Under inspelning elektrisk aktivitet från spänningsnerven, rotera dactyl snabbt in i en utökad gemensam (dvs. sträcker öppnaren muskeln).
- Därefter prov aktiv kraft utveckling i relation till stimulering frekvens.
- Sätt fast en metallkrok, så att spetsen av kroken går genom ett litet hål i dactyl.
- . Fäst den andra änden av metallkroken till kraftgivare OBS: Se till att givaren är i 90 ° vinkel varje gång så att tappen är vinkelrät mot givaren för maximal detektion av den kraft som genereras.
- Drag kroken och dactyl så att den är vid omkring en 45 ° vinkel av öppnaren fogen.
- Nu stimulera motorisk nerv vid 100 Hz i 250 ms och mäta kraften liksom avfyrningsfrekvensen för den spänning nerv.
- Placera skarven till ett helt utsträckt läge så att öppnaren muskelfibrer är slapp.
- Stimulate motornerven vid 100 Hz i 250 ms och mäta kraften liksom avfyrningsfrekvensen för den spänning nerv.
- Böj / flex skarven så att den är helt böjd (~ 90 °). I detta läge är muskelfibrer av öppnaren är fullt utsträckt. Det kan finnas en viss kraft som mäts av givaren på grund av denna passiva sträcka av muskeln.
- Att stimulera motorisk nerv vid 100 Hz för 250 ms och mäta kraften liksom avfyrningsfrekvensen för den spänning nerv.
- Efter mätning en kraft, vidare i en rad olika frekvenser: 20, 40, 60, 80 och 100 Hz i 8-10 sekunder på varje gemensamt ställningstagande.
- Mät svaret med en snabb spänningsutlösning. Arrange beredningen så att haken på kraftomvandlaren lätt kan skjutas ut ur hålet i dactyl.
- Böj / flex skarven så att den är helt böjd (~ 90 °). Nu stimulera motorisk nerv vid 100 Hz med en kontinuerlig stimulering av 5 sek.
- Efter den första sekundärad eller mindre, eftersom spänningar har byggts upp på öppnaren muskeln, skjut stiftet ur hålet i dactyl.
- Undersök spänningsnerven inspelning före och efter frisläppandet av stiftet håller dactyl.
- Modulerande effekter av neuroaktiva substanser såsom oktopamin, serotonin och proctolin, som förändrar utgången från spänn neuroner, kan bestämmas genom tillsats av dessa molekyler till badet media över den exponerade öppnaren muskeln och upprepa experimenten.
- Använd en pipett och droppa 1-2 ml under beredningen.
3. Färgning Perifera nervsystemet Structures i Crustacean Walking Legs
- Metylenblått teknik
- Späd ut en del metylenblått klorid-stamlösning (0,25%) med två delar destillerat vatten.
- Lägg denna blandning till fem delar av saltlösning. Grundligt vattna området av intresse.
- Dissekera ett ben enligt protokollet i avsnitt 1. Inkubera preparation i metylenblåttlösning vid 12-13 ° C.
- Undersök beredningen var 10-15 min med dissekera mikroskop med hjälp av låg intensitet belysning för att följa utvecklingen av färgningen. I vissa fall färgning kommer att slutföras i en timme, i andra kan det ta över en natt.
- 4-di-2-ASP teknik
- Fluorescerande färgämnen kan användas för att backa-fylla PD-neuron eller direkt fläcka beredningen från badet. Men en lämplig mikroskop med förmåga att visa den fluorescerande fläcken krävs.
- Dissekera ett ben enligt ett protokoll i avsnitt 1.
- Inkubera preparatet i en 10 pM koncentration av 4-Di-2-ASP-lösning och lämna beredningen i kylskåp i 15 min. Använd bara tillräckligt lösning för att täcka beredningen.
- Fotografera förberedelserna snabbt och undvika överexponering för kvicksilverlampor. Denna fluorescerande färg försvinner relativt snabbt.
- Exponera PD nerv enligt protokollet i avsnitt 1 och hålla den nedsänkt i kall saltlösning.
- Gör ett vaselin bra att hålla CoCl 2. Om någon CoCl 2 spiller in i saltbadet hela beredningen färgar svart, och beredningen ska kasseras.
- Slip ett litet snitt i en polystyren plåt, för att göra en plast-plattform, och fästa den på ett sådant sätt att det inte kommer att flyta bort eller doppas i saltbadet (Figur 7).
Figur 7. Polystyren ark med stift för att hålla på plats i skålen. Klicka här för att visa en större bild . - Mata vaselin från en fin injektionsnål fäst vid en engångsspruta,sedan göra ett hinder (en cirkel kan fungera bra), som bör vara ca 1 till 1,5 mm höga med undantag av ett grunt "V" vid mittpunkten där nerven kommer att draperas över, ovanpå glid av polystyren.
- Gör en liten pöl av saltlösning på endera sidan av barriären nära den "V". Till att inte sträcka ut eller nypa nerven, lyft nerven försiktigt från skålen och placera den i salt pöl i vaselin bra.
- Arbeta snabbt så att den del av nerven inte torkar ut, försiktigt mata vaselin för att täcka den utsatta nerven. Nu testar barriären med koksaltlösning och se till att det inte läcker.
- Blot bort saltlösning på insidan av barriären och se om det fyller upp när badet saltlösning är hög runt muren vaselin för att vara säkra på att de två sidorna är isolerade från varandra (figur 8).
- Transportera bort saltlösning i brunnen med hjälp av en bit papper. Undvik att låta pappers avsluta nerven.
- Gör en ny pöl med hjälp av några små droppar av destillerat vatten, och sedan klippa nervänden. Var mycket noga med att inte dra nerven genom barriären när du gör snittet. Den osmotiska chock för destillerat vatten kommer att "ballong" axoner.
- Inom 30 sekunder lägga en liten droppe av CoCl2 till vattnet, njuta denna lösning, och sedan lägga tillräckligt CoCl 2 för att bilda en pöl över denna förkortade delen av nerven (Figur 9). Förberedelserna är bäst förvaras kylda vid 13 ° C i 12-24 timmar.
tp_upload/51050/51050fig9.jpg "width =" 500px "/>
Figur 9. Snittet PD nerv utsätts för CoCl 2. Snittet nerv sväller upp i närvaro av vatten som underlättar och påskyndar förflyttning av färgämnesmolekyler genom axoner i de neuron cell organ. Klicka här för att visa en större bild . - Ta bort det fukt pölar. Blot bort koboltlösningen med användning av en vävnad och tvätta bort resterna av kobolt med flera byten av saltlösning.
- Överför den isolerade beredningen till en liten glaspetriskål innehållande omkring 10 ml av krabba saltlösning. Neuronerna tvättas och de följande stegen utförs in situ. Bra metallverktyg är inte att användas för att hantera beredningen efter detta steg (du bör använda vissa verktyg som inte ska användas vid ett senare tillfälle för fysiologi).
- Lägg 1-2 droppar av ammoniumsulfid (NH4) 2 S i saltlösning. Cap (NH 4) 2 S flaskan ordentligt och sätt tillbaka in i huvan. Observera reaktionen vid framställning under ett dissektionsmikroskop
- Inom 1-2 minuter, bör kobolt fyllda nervceller och deras processer börja visas eftersom de kommer att färga svart.
- Efter 5-10 minuter, byt utvecklingen lösningen med färsk saltlösning.
- Se till att utvecklingen lösning du har hällt i diskhon avloppet följs av rinnande vatten i några minuter eller i en avfallsflaska med lock.
- Häll ut saltlösning och fixa nerv förberedelse för ca 15 min med två byten av Bouins lösning fixativ. För större vävnader som öppnaren muskeln (för att färga spänn neuroner), öka varaktigheten av fixering till 30 min.
- Torka i en serie av stigande ordning av etanolkoncentration som börjar vid 70% (dvs. 70%, 80%, 90%, 100%). Om 10 minuter vid varje koncentration är tillräcklig försmå vävnader.
- Efter ca 10 till 15 minuter i två byten av 100% etanol, rensa vävnad genom att ersätta etanol med 100% metylsalicylat. Beredningen kommer att bo i denna lösning permanent för upprepad visning. Med tiden de fyllda cellerna kommer att bli mera uppenbara, eftersom den omgivande vävnaden kommer att bli tydligare. Intensifiering metoder kan användas för att hjälpa till att förhindra fädning över tid 25.
- Använd samma förfarande för att fylla spänning nerv med CoCl 2. Emellertid ändrar etanoUösning flera gånger i varje etanol dehydratiseringssteg och inkubera preparatet inne alkohol under ca 20 min för varje steg för att grundligt torka ut musklerna och tillåta dem att rensa väl.
Representative Results
När PD orgel sträcks genom att fullt utvidga det gemensamma, är aktiviteten i PD nerv robust under rörelsen som visas för den första sekunden i Figur 10. Viss verksamhet återstår när det hålls kvar i öppet läge. Denna aktivitet är från de statiska positionskänsliga nervceller (andra hälften av inspelningen som visas i figur 10). Rörelsen frammanar ett svar under förflyttning, och bränningen är mestadels närvarande under sträckningen av chordotonal strängen (figur 11).
Ytterligare analys av spikar lätt kan närma sig genom att sortera de relativa amplituderna. Detta är en metod för att påvisa olika populationer av sensoriska neuroner rekryteras för positioner eller typer av rörelser 5. Typiska amplituderna variera från 0,25 till 1,5 mV, men dessa värden är beroende av motståndet (dvs tätheten) av sug elektroden tätning. Frekvens av spikar i than olika storleksintervall kan även grafiskt för analys.
Krafter genereras av öppnaren muskeln i förhållande till stimuleringsfrekvens kan jämföras genom att överlagra de respektive spänning-tid-spår ovanpå varandra (figurerna 13A och B). Detta kan även utföras för varje gemensam position vid varje given stimuleringsfrekvens. Aktivitet av linspänningen nerv kan därefter korreleras med mängden relativ kraft genereras vid varje stimuleringsfrekvens, och för varje gemensam position. Liksom i PD-nerven, är en mängd olika spik amplituder ses som svar på sammandragning av öppnaren muskeln (Figur 13C).
Anatomical arrangemanget av neuroner i gångbenet är tydligt observerats med metylenblått färgning (figur 14). Notera den elastiska chordotonal strängen och spänning neuron som ligger nära apodeme. Flera somata med olika diametrar end specifika platser är också synliga i denna figur. Hela loppet av spänningsnerven och bår motor nerv visas i Figur 15. Enskilda neuroner i PD nerv visas med högre kontrast använder 4-Di-2-ASP (fig 16) och CoCl2 (Figur 17) fyllningen tekniker. Vid hög förstoring kan ses de sensoriska ändelser insidan av de stödjande scolopales (fig. 16B) 21,22,26.
Figur 10. Flytta och håll vid 0 °. De dynamiska nervceller är robust i bränning under rörelsen och spikar från statiska känsliga nervceller finns medan fogen hålls öppen. Klicka här för att visa en större bild </ A>.
Figur 11. Snabb öppna och stänga från helt böjt till utfällt läge (90-0 °). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 12. Extracellulär spikar inspelade från PD-nerven. Fogen är helt utdragen och sedan snabbt flyttas till en ½ böjt läge och sedan höll stilla. Lägg märke till verksamheten under rörelsen och minskad aktivitet vid statisk. Klicka här för att visa en större imaGE.
Figur 13. De relativa krafter som utvecklas med den gemensamma helt böjd och stimuleras på olika frekvenser. (A) Spänning-time spår från kraftgivare visas med varje stimuleringsfrekvens. (B) De spår i panel A är överlagrade i olika färger för att underlätta i jämförelse. (C) Spänning-tid spår av elektrisk aktivitet som registrerats från spänningsnerven när motorn nerven stimulerades vid 80 Hz. Notera den regelbundet mönster av stimulans artefakter såsom jämfört med den neurala aktiviteten. Observera också de olika amplituderna hos de neurala svar. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 14. Metylenblått fläck på gång benet beredningen. Individuella SOMAS visas med deras sensoriska ändelser som skjuter in i den elastiska strängen. Nära apodeme en spänning neuron visas. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 15. Spänningen nerv uppstår distala änden (röda pilar) och gå med i motornerven (grön pil). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 16. (A) Ett återfyllningen av PD nerv i Cancer magister med 4-Di-2-ASP. (B) Högre förstoring av sensoriska ändelser. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 17. Neuroner som är fyllda med CoCl 2 och bearbetas (A). Spåras konturerna av det färgade preparatet visas (B). Klicka här för att visa en större bild .
| Saltlösning | g / L |
| NaCl | 27,29 |
| KCl | 0,81 |
| MgSO 4 • 7H 2 O | 4,81 |
| CaCl2 • 2 H2O | 1,85 |
| Na 2 SO 4 • 10H 2 O | 0,97 |
| 1,982 | |
| HEPES-syra | 0,476 |
| HEPES-salt | 2,08 |
| Justera till pH 8,1 med NaOH eller HCl |
Tabell 1. Recept för krabba saltlösning.
Discussion
Syftet med denna uppsättning av experiment är 1) att lära och ställa ut de grundläggande principerna för extracellulära inspelningar från en identifierbar proprioceptiva organ och spänningsnerven och 2) för att betona vikten av anatomisk kartläggning i samband med fysiologiska funktionen av vissa sensoriska system. Denna experimentella metod och djurmodeller används är billiga och relativt lätta att genomföra i neurofysiologi undervisningslaboratorier.
De nervceller i chordotonal organ är av två specifika funktionella typer, de som reagerar på rörelse och de som svarar på statiska positioner. Encelliga inspelningar från en variation av chordotonal organ, oavsett vilken gemensam undersöks, har visat detta vara fallet 3,5. Faktum chordotonal tillhörande organen de antennal lederna hummer avslöjar samma två sensoriska typer och grundläggande anatomi 27. Förutom att det finns två neurontyper (rörelse-och positipå), nervceller har samma anatomiska arrangemang på sina respektive elastiska strängar. Den stora somata belägen proximalt på strängen brukar tillhöra de dynamiska rörelsekänsliga nervceller. Nervceller som signalerar statiska positioner har små somata och ligger distalt. Dessa celler är tonically active. PD gemensamt innehåller endast en enda chordotonal orgel medan det finns två chordotonal organ i carpus-propodus (CP) och Merus-carpus (MC) leder.
Den dissektion att exponera proprioceptiva strukturer i blå krabbor (C. sapidus) för elektrofysiologiska inspelning kräver en strategi som gör att gemensamma rörelser att äga rum i de naturliga positioner medan du spelar in från sensoriska neuroner. Spänningen nerv för öppnaren muskeln i gångbenet är en mycket fin nerv består av flera neuroner. Såvida man är försiktig, spänningen nerven samt motor nerv innerverar muskeln som skall stimuleras, kan skadas under denna dissektion. Föroptimala inspelningar sug elektroder måste anpassas till storleken på nerven. Inspelningar är lätt tillgängliga i en studentlaboratorium med hjälp av en 30-40X förstoring dissekera mikroskop och low-end micromanipulators.
Framtida experiment som skulle vara intressant att fortsätta med de gemensamma chordotonal organ skulle vara att undersöka de strukturella och fysiologiska profiler under benet förnyelse i olika arter i olika skeden i livscykeln som en uppföljning till en inledande studie som använde Cancer magister 19,26 . Frågor som återstår att lösas är 1) gör distribution och organisation av regenererade nervceller beror på åldern på djuret när regenerera en lem, 2) är de axonal prognoser till CNS (ventrala nerv sladd) i en regenererande lem funktionell eller gör det tar tid och gemensam användning för att inrätta funktionella anslutningar, och 3) vad som händer med de avhuggna axoner proximalt om autotomy planet när lem är autotomized? 28
Kräftdjur uppfyller miljöförhållanden och den omgivande temperaturen, men det är oklart hur de upprätthåller samordningen inom en neural krets som nervceller förändrar sin verksamhet till följd av temperaturförändringar. En långsam förändringshastighet kan tillåta djuret lite tid för acklimatisering under det att en snabb förändring kan not29, 30. Fysiologiska förändringar i pH eller osmolaritet på grund av ämnesomsättning, beteende 31, eller miljöpåverkan kan medföra liknande utmaningar till nervbanor som är involverade i proprioception. Dessa kräftdjur förberedelser är idealiska för att hantera dessa typer av problem, eftersom deras funktion är väl beskriven i en enda cell nivå.
I detta protokoll har vi visat den fysiologiska betydelsen av spännings neuroner vid övervakning kraft som genereras av öppnaren muskeln. Dessa spänningsreceptorer kan spåras till sin plats inom apodeme med färgningsförfaranden. Dessanervceller, som hos däggdjur, detektera kraft på olika nivåer och rekrytera ytterligare neuroner som kraften ökar. Frekvensen i aktivitet är relaterad till stimuleringen frekvensen hos motor neuron tills mättnad i sändningen har skett. Med hjälp av en snabbkoppling protokoll med böjd dactylus gemensamma, försvinner spänningen aktivitet snabbt men återvänder sedan när återfå spänning i en helt utsträckt gemensamt. Detta är ett klassiskt experimentella förfarandet för att illustrera den kraft som mäts av spänn receptorer. Olika neuromodulators kan användas till att förbereda för att se hur det påverkar utvecklingen av våld och neuronal svar. En av de viktigaste aspekterna är hur de neurala svaren behandlas och integreras i det centrala nervsystemet och deras inverkan på aktiviteten av motoriska nervceller. De tekniker som vi har visat tillåter en att börja ta itu med mer information om spänning (sensoriska) nerv-motorneuron krets funktion, dvs signal i en intakt ben till ganglion och tillbakatill muskeln.
De färgningsförfaranden visade är nyckeln till att förstå fysiologi sensoriska nervceller som innerverar proprioceptiva organ. Anatomiska arrangemang av nervceller som bygger på funktion och storleken på soma är liknande i de olika chordotonal organen inom krabba benen. Det är inte känt om liknande neuronala arrangemang finns också i andra skaldjursarter och insekter. Kombinera fysiologiska inspelningar från enstaka celler och kartlägga läget möjliggör direkt struktur funktionssamband. Den långsiktigt bevarande av den anatomiska arrangemanget med CoCl2 färgning och fixering gör att man upprepade gånger göra åtgärder och bedöma den strukturella arrangemang.
Proprioception och spänning mottagning av skelettmuskulaturen är sensoriska modaliteter som möjliggör samordnade beteenden och reaktioner på yttre och inre miljö för ledade djur i en mängd olika skelettmuskulaturen konfigurationer. Muskeln receptorn organ i buken av kräftor är en annan väldokumenterad preparat (se Crawdad Project, http://www.crawdad.cornell.edu/ ) för undervisningsändamål av proprioception med bara två neuroner per buken hemi-segmentet 23 . Att kunna spela in från enskilda nervceller till sensoriska nervbuntar ger ytterligare information som stöd i att förstå de grundläggande principerna för sensorisk mottagning. Dessa relativt enkla kräftdjur förberedelser tillåter en att ta itu med grundläggande aspekter av proprioception och spänningsövervakning, med potential att fastställa de nervbanor som möjliggör central integration av proprioceptiva och andra sensoriska ingångar 9-12, 32, 33.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för de konstnärliga bidrag Hyewon Cooper.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| HEPES base | Sigma | ||
| D-Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
| CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
| Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Materials | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | Any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Electrical leads | Any company | ||
| Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | Any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | Any company | ||
| Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |
References
- Whitear, M. Chordotonal organs in Crustacea. Nature. 187, 522-523 (1038).
- Alexandrowicz, J. S. The comparative anatomy of leg propriocetors in some decapod Crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 52 (3), 605-634 (1972).
- Hartman, H. B., Boettiger, E. G. The functional organization of the propys-dactylus organ in Cancer irroratus Say. Comp. Biochem. Physiol. 22, 651-663 (1967).
- Cooper, R. L., Hartman, H. B. Responses of the bender apodeme tension receptors in the Dungeness crab, Cancer magister. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 109 (2), 479-486 (1994).
- Cooper, R. L. Mapping proprioceptive neurons on chordotonal organs in the crab, Cancer magister. Crustaceana. 81 (4), 447-475 (2008).
- Burke, W. An organ for proprioception and vibration sense in Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 31, 127-138 (1953).
- Hill, A. V. First and Last Experiments in Muscle Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, U.K. (1970).
- Stuart, D. G., Mosher, C. C., Gerlach, R. L., Reinking, R. M. Mechanical arrangement and transducing properties of Golgi tendon organs. Exp. Brain Res. 14 (3), 274-292 (1972).
- Macmillan, D. L., Dando, M. R. Tension receptors on the apodemes of muscles in the walking legs of the crab, Cancer magister. Mar. Behav. Physiol. 1 (1-4), 185-208 (1972).
- Bévengut, M., Simmers, A. J., Clarac, F. Central neuronal projections and neuromuscular organization of the basal region of the shore crab leg. J. Comp. Neurol. 221 (2), 185-198 (1983).
- El Manira, A., Cattaert, D., Clarac, F. Monosynaptic connections mediate resistance reflex in crayfish (Procambarus clarkii) legs. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 337-349 (1991).
- Le Bon-Jego, M., Cattaert, D. Inhibitory component of the resistance reflex in the locomotor network of the crayfish. J. Neurophysiol. 88 (5), 2575-2588 (2002).
- Ray, D. L., Clarac, F., Cattaert, D. Functional analysis of the sensory motor pathway of resistance reflex in crayfish. I. Multisensory coding and motor neuron monosynaptic responses. J. Neurophysiol. 78 (6), 3133-3143 (1997).
- Wiersma, C. A. G. Vergleichende Untersuchungenüber das periphere Nerve-muskelsystem von Crustaceen (Comparative studies on the peripheral nerve-muscle system of crustaceans). J. Comp. Physiol. 19, 349-385 (1933).
- Wiersma, C. A. G. Movement receptors in decapod crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 38 (01), 01-143 (1959).
- Hartman, H. B. Tension receptors on the closer muscle apodeme in the walking legs of the blue crab Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 157 (3), 355-362 (1985).
- Holsinger, R. The effect of regional phenotypic differences of Procambarus clarkii opener muscle on sarcomere length, fiber diameter, and force development MSc thesis [dissertation]. , University of Kentucky. (2013).
- Parsons, D. W. The morphology and ultrastructure of tension receptors in the walking legs of the crab, Carcinus maenas. Cell Tissue Res. 211 (1), 139-149 (1980).
- Parsons, D. W. Responses and central interactions of tension receptors in the leg muscle of Carcinus. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 72 (2), 391-399 (1982).
- Tryba, A. K., Hartman, H. B. Dynamic responses of series force receptors innervating the opener muscle apodeme in the blue crab, Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 180 (3), 215-221 (1997).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. I. The chordotonal organs in the legs of the shore crab, Carcinus meanas. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 245 (725), 291-325 (1962).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. II. The thoracico-coxal organs in Carcinus, Pagurus and Astacus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 248 (752), 437-456 (1965).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322 (2011).
- Delaney, K., Gelperin, A. Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limaxmaximus; I. Anatomy and criteria for re-identification. J. Comp. Physiol. A. 166, 297-310 (1990).
- Hartman, H. B., Cooper, R. L. Regeneration and molting effects on a proprioceptor organ in the Dungeness crab, Cancer magister. J. Neurobiol. 25 (5), 461-471 (1994).
- Hartman, H. B., Austin, W. D. Proprioceptor organs in the antennae of Decapoda Crustacea. J. Comp. Physiol. 81 (2), 187-202 (1972).
- Cooper, R. L. Development of sensory processes during limb regeneration in adult crayfish. J. Exp. Biol. 201 (Pt 11), 1745-1752 (1998).
- Chung, Y. -S., Cooper, R. M., Graff, J., Cooper, R. L. The acute and chronic effect of low temperature on survival, heart rate and neural function in crayfish (Procambarus clarkii) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) species. Open J. Mol. Int. Physiol. 2 (3), 75-86 (2012).
- Blundon, J. A. Effects of temperature and thermal history on neuromuscular properties of two crustacean species. J. Comp. Physiol. B. 158 (6), 689-696 (1989).
- Cooper, R. M., Schapker, H., Adami, H., Cooper, R. L. Heart and ventilatory measures in crayfish during copulation. Open J. Mol. Int. Physiol. 1 (3), 36-42 (2011).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The mechanistic action of carbon dioxide on a neural circuit and NMJ communication. Journal of Experimental Zoology. , (2013).
- Bierbower, S. M., Shuranova, Z. P., Viele, K., Cooper, R. L. Sensory systems and environmental change on behavior during social interactions. Brain Behav. 3 (1), 4-13 (2013).
