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Biology

Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/51058
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Os métodos para isolar e preparar amostras de testículos de Drosophila (ao vivo e fixo) para geração de imagens por contraste de fase e microscopia de fluorescência são descritos aqui.

Abstract

Drosophila melanogaster é um poderoso sistema modelo que tem sido amplamente utilizado para elucidar de uma variedade de processos biológicos. Por exemplo, estudos, tanto do sexo feminino e as linhas germinativas masculinas de Drosophila têm contribuído grandemente para a compreensão atual da meiose, bem como a biologia de células-tronco. Excelente protocolos estão disponíveis na literatura para o isolamento e imagiologia de ovários e testículos 3-12 Drosophila. Aqui, os métodos para a dissecação e preparação de testes de Drosophila para análise microscópica são descritos com uma demonstração em vídeo que o acompanha. Um protocolo para o isolamento de testículos do abdómen de adultos do sexo masculino e preparar as lâminas de tecido vivo, para análise por microscopia de contraste de fase, bem como o protocolo para a fixação e imunocoloração testículos para análise por microscopia de fluorescência são apresentados. Estas técnicas podem ser aplicadas na caracterização de mutantes de Drosophila que exibem defects na espermatogénese, assim como na visualização de localizações subcelulares de proteínas.

Introduction

Testículos de Drosophila são um sistema modelo ideal para o estudo de muitos processos biológicos incluindo a regulação das células estaminais, a meiose, e desenvolvimento do esperma 13-18. Os espermatócitos e os seus fusos meióticos são grandes e, portanto, conveniente para análise citológica e relaxado checkpoints do ciclo celular durante a espermatogênese facilitar o estudo de mutações em genes do ciclo celular. Diferentes tipos de células pode ser observada na progressão ordenada ao longo do comprimento dos testículos, e qualquer interrupção da espermatogénese pode conduzir a alterações neste arranjo global. Estas características combinadas com ferramentas genéticas Drosophila têm facilitado a análise mutacional da espermatogênese 21-23.

As fases de Drosophila espermatogénese foram bem definidos. As células da linha germinativa que se desenvolvem de forma síncrona nos cistos progredir sequencialmente através das fases de espermatogénese ao longo do comprimento do testículo. Durante both da mitose e meiose divisões das células germinais masculinas, citocinese ocorre de forma incompleta de modo a que as células filhas permanecem ligados por pontes citoplasmáticos conhecidos como canais de anel (Figura 1). A extremidade apical do testículo contém uma população de células estaminais da linha germinativa, que dá origem a células spermatogonial, que se submetem a quatro divisões mitóticas com citocinese incompletos para gerar cistos de 16 células de espermatócitos primários. Após a fase S pré-meiótica, espermatócitos primários entrar G2, um período prolongado de crescimento ~ 90 horas, durante o qual o volume celular aumenta ~ 25 vezes. Progressão através da meiose I e meiose II resulta na formação de quistos de 32 células de espermatócitos secundários e de cistos de 64 células de espermatídeos haplóides, respectivamente. As espermátides arredondadas, imaturos passam por extensos remodelamento celular para formar espermatozóides maduros. Células pós-meióticas, em especial os molhos de alongamento e espermatídeos maduros, ocupam a maior parte do volume do testículo.

Tele o transporte de sucesso de esperma funcional para moscas fêmeas requer a coordenação entre as diferentes partes do sistema reprodutor masculino, a qual é composta de várias estruturas emparelhados (os testículos, vesículas seminais e glândulas acessórias) e de uma única conduta ejaculatório (Figura 2). Os espermatozóides são produzidos dentro dos testículos e armazenado dentro das vesículas seminais até a cópula 24. As glândulas acessórias conter células secretoras de fluido seminal. O esperma migração das vesículas seminais são misturados com o fluido seminal dentro do ducto ejaculatório, a qual está ligada a ambas as vesículas seminais e glândulas acessórias. Esta mistura de esperma e fluido seminal é finalmente bombeado para fora do macho no interior da vagina da fêmea voar através do bulbo ejaculatório localizado na extremidade posterior do abdómen macho 25. As proteínas no fluido seminal, são essenciais para a armazenagem prolongada de esperma dentro de órgãos especializados conhecidos como Espermatecas na reptrato roductive de Drosophila fêmeas 26.

Excelentes métodos para o isolamento de testículos de Drosophila e a visualização de células em vários estádios da espermatogénese estão disponíveis na literatura científica 3-12. Nós aqui acrescentar a este corpo de conhecimento, apresentando exemplos desses protocolos com uma demonstração em vídeo que o acompanha. O protocolo para a preparação de amostras de testículos vivos para microscopia de fase de contraste baseia-se num método anteriormente descrito 27. O protocolo para a fixação de formaldeído e imunocoloração de testículos também se baseia em um método previamente descrito 28. As abordagens aqui descritos têm sido utilizados em vários estudos de Drosophila espermatogénese (por exemplo, para avaliar as funções da dineína, um motor de microtúbulos menos dirigida-fim, durante a espermatogénese de Drosophila).

Além dos protocolos básicos, são apresentadas sugestões para varying a dissecação, de modo a enriquecer a espermatogônias, espermatócitos, ou espermatozóides maduros. Diferentes métodos para o processamento dos testículos tais que cistos ou permanecem intactos ou são interrompidos quando necessário são descritos. Uma vantagem no uso de testículos de Drosophila como sistema modelo é que, em comparação com oócitos e embriões de Drosophila, os anticorpos e corantes podem facilmente penetrar nas células após a sua dispersão a partir dos testículos, e menos passos de lavagem são necessários, assim, os protocolos podem ser realizadas em um relativamente curto espaço de tempo.

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Protocol

1. Testes Dissection

  1. Anestesiar moscas em uma garrafa ou frasco, usando um fluxo de CO 2 e transferir para uma almofada de mosca.
  2. Ordenar opera sob um microscópio de dissecação com um pequeno pincel, e recolher um número apropriado (dependendo do ensaio) de Drosophila, os machos dos genótipos desejáveis. Jovens do sexo masculino (0-2 dias de idade) são ideais para examinar as células ao longo das etapas anteriores da espermatogênese (por exemplo, espermatogônias, espermatócitos e espermátides iniciais pós-meióticas), enquanto que os homens um pouco mais velhos (2-5 dias de idade) são ideais para examinar células nos estágios finais da espermatogénese (em particular, o esperma maduro).
  3. Use uma pinça para remover as asas de cada voar (para evitar que as moscas de flutuando no líquido durante a dissecção).
  4. Adicionar ~ 500 ml de solução salina tamponada com fosfato (130 mM de NaCl, 7 mM de Na 2 HPO 4, 3 mM de NaH 2 PO 4; PBS) numa gota de um prato de dissecação com revestimento de silicone emum fundo preto. Outras soluções aquosas têm sido usados ​​com sucesso para os testículos dissecção 3.
  5. Ponto de fórceps para o anterior da mosca, segure-o pelo tórax e mergulhá-lo na queda PBS. Durante a visualização através do microscópio de dissecação, use outro par de fórceps para agarrar e puxar a genitália externa (estrutura marrom escuro localizado na extremidade posterior do abdome ventral) posteriormente até que ele se separa do abdômen. Na maioria dos casos, os testículos, vesículas seminais e glândula acessória vai ser removido do abdómen, juntamente com os órgãos genitais externos e, se não, inserir um único par de fórceps para o abdómen e provocar os testículos.
  6. Testículos separadas de glândula acessória e genitais externos utilizando dois pares de pinças na gota de PBS (Figura 2). De tipo selvagem testículos são facilmente distinguidos dos tecidos brancos vizinhos por sua cor amarela. Vá imediatamente para a etapa 2.
  7. Para isolar os testículos dos machos pharate (i.. E fechada dentro da caixa de pupa), um passo adicional tem de ser realizada primeiramente que envolve a remoção da mosca do caso de pupa, este passo tem sido previamente descrita 31. Prossiga com dissecção como para os testículos adultos começando no passo 1.2.
  8. Para isolar os testículos dos machos larvais, realizar uma modificação de um protocolo para isolar ovários de larvas de Drosophila 32. Resumidamente, as larvas do sexo masculino pode ser distinguido a partir de larvas femininas pela presença de um par de estruturas grandes, claros, ovais (testículos larva) incorporados no terço posterior do corpo gordo. Para isolar os testículos larvais, parcialmente esfolar abrir a larva do sexo masculino para isolar os testículos e o corpo gordo circundante do abdómen, tal como descrito para o isolamento de ovários de larvas. Prosseguir imediatamente para a etapa 2 do protocolo aqui descrito, os testículos pode depois ser removido do corpo gordo pouco antes da montagem (passos 2.3 ou 3.14) como descrito para os ovários 32.

  1. Use uma pinça para colocar suavemente 2-3 pares de testículos em uma gota de 4-5 ml de PBS em uma praça lamínula de vidro. Note-se que a razão entre o número testículos ao volume PBS pode precisar de ser ajustado: muito líquido vai evitar que as células se espalhe corretamente quando esmagado, enquanto muito pouco líquido fará com que as células de estourar quando esmagado. Opcional: Use capa siliconizada desliza para minimizar a aderência de tecido para cobrir deslizamento no passo 3.2.
  2. Utilizar um par de pinças para rasgar cada testículo numa posição apropriada de modo a maximizar a presença de tipos de células da linha germinal desejados na preparação (notar que o conteúdo do testículo principalmente vai egresso da região rasgada na lâmina durante o esmagamento etapa.) Para enriquecer para espermatogônias e espermatócitos, rasgar abrir o testículo adjacente à sua ponta apical (nível 1, Figura 2B). Para enriquecer para espermatócitos e espermátides, rasgar abrir o testículo em um position ligeiramente basal ao nível 1 (nível 2, Figura 2B). Para enriquecimento em células da linha germinal mais maduros, rasgar a testículo mais perto de onde a curvatura começa (nível 3, Figura 2B).
  3. Delicadamente, coloque uma lâmina de vidro sobre a lamínula para esmagar os testículos; não aplique pressão manualmente, como o peso de só a lamínula é suficiente para obter uma amostra adequada esmagado. Tente evitar bolhas de interceptação. Opcional: Utilização de poli-L-lisina revestido lâminas de microscópio para promover a aderência do tecido a deslizar no passo 3.2.
  4. Use preparação imediatamente (de preferência dentro de 15 minutos de preparação) para observar células vivas por microscopia de contraste de fase, pois moscas transgênicas com expressão de proteínas fluorescentes marcados nos testículos, células vivas podem ser examinados por microscopia de fluorescência nesta etapa. Alternativamente, proceder com a fixação e coloração de anticorpos (Protocolo 3).
  5. Gentilmente pavio qualquer excesso de líquido sob a lamela usando uma limpeza wipe para permitir o achatamento de preparação até que as células germinais são claramente em foco.

3. Formaldeído Fixação e Coloração Anticorpo

  1. Encaixar congelar cada slide contendo testículos esmagados (das Protocolo 2) usando um par de pinças de metal para mergulhá-lo brevemente em nitrogênio líquido (até nitrogênio líquido pára borbulhando).
  2. Retire a tampa de deslizamento imediatamente usando uma lâmina de barbear.
  3. Use pinças metálicas para transferir lâminas para uma grade deslizante de vidro previamente arrefecido com gelo-etanol frio a 95% (grau de espectrofotometria, livre de metanol). Armazenar a -20 ° C durante 10 min.
  4. Use pinças metálicas para transferir lâminas para uma grade deslizante de vidro cheio com 4% de formaldeído em PBS mais 0,1% de Triton X-100 (PBS-T). Armazenar à temperatura ambiente durante 7 min.
  5. Use pinças de metal para transferir slides para um porta-lâminas de vidro cheio de PBS. Lavar as lâminas com PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente. Repetir 1x. Executar todas as lavagens de solução descartando no rack lâmina de vidro (
  6. Descartar o PBS e mergulhar as lâminas em PBS-T, durante 30 minutos à temperatura ambiente, para permeabilizar as membranas das células.
  7. Lavar as lâminas com PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente. Repetir 2x.
  8. Bloqueio passo (opcional): mergulhar as lâminas em PBS mais 1% de BSA durante 45 min à temperatura ambiente.
  9. Use uma caneta barreira hidrofóbica para desenhar um círculo no slide em torno de tecido amassado (facilmente visível a olho nu), a fim de limitar as soluções de anticorpos (adicionados em passos 3,9 e 3,11). O tecido deve ser mantido úmido em todos os momentos durante a execução de imunomarcação.
  10. Adicionar 30-40 mL de anticorpo primário (diluído em PBS-T, 1:400 a 1:50, dependendo do anticorpo) para o tecido no interior do círculo. Se o bloqueio foi realizado, diluir o anticorpo primário em PBS-T + 1% de BSA. Anticorpo anti-gama-tubulina (por coloração de centrossomas na Figura 4) foi diluída de 1:100. Incubar em uma câmara escura úmida (caixa de plástico, por exemplo. Fechadocom toalhas de papel húmidas) durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
  11. Lavar as lâminas em PBS por 5 min a sala de 3x de temperatura. Se o bloqueio foi realizado, lavar duas vezes em PBS-T, e uma vez em PBS (5 min a temperatura ambiente, cada um).
  12. Adicionar 30-40 mL de anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (diluído 1:400 em PBS) para o tecido e incubar no escuro durante 1-2 horas à temperatura ambiente.
  13. Lavar as lâminas com PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente. Repetir 2x.
  14. Adicionar 30-40 mL de solução DAPI (0,2 mg / ml em PBS) para o tecido no interior do círculo.
  15. Delicadamente, coloque uma lamínula de vidro sobre o tecido, tomando cuidado para evitar bolhas de interceptação. Se bolhas de ar devem aparecer, cuidadosamente mover ao redor da lamínula sem destruir a abóbora até que as bolhas escapar dos lados da lamínula.
  16. Use uma limpeza limpar para apagar o excesso de DAPI a partir das bordas do slide.
  17. Selar a lamela para o slide usando claro unha polonês.
  18. Use esta preparaçãono próximo 3-4 hr para ver células imunomarcadas por microscopia fluorescente. Para o armazenamento de longo prazo de lâminas (até, pelo menos, várias semanas), use uma mídia difícil montar à base de glicerol com DAPI, e armazenar a -20 ˚ lâminas C.
  19. Em alternativa, fixar as amostras em metanol em vez de formaldeído (dependendo do antigénio). Depois de completar todo o protocolo até a etapa 3.2, mergulhe as lâminas de testículos esmagados em metanol por 10 min a -20 ° C e prossiga com o passo 3.5 em diante.

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Representative Results

Um exemplo de um par adequadamente dissecados dos órgãos reprodutores masculinos de Drosophila é mostrado na Figura 2A. Testículos do abdómen da mosca adulta masculina está normalmente ligado ao ducto ejaculatório (castanho, Figura 2A ') e um par de glândulas acessórias (verde, Figura 2A'), através de um par de vesículas seminais (azul, Figura 2A ') . Para separar os testículos da maioria do tecido somático que o acompanha, o ducto ejaculatório e as glândulas acessórias deve ser retirado e descartado de modo a que apenas o par de testículos e das vesículas seminais permanecem (Figuras 2B e 2B '). As vesículas seminais também pode ser removido, deixando apenas o par de testículos de ser processado.

A idade dos homens adultos selecionados para testes dissecção é uma consideração importante. Em jovens do sexo masculino (0-2 dias após a eclosão), as vesículas seminais são pequenose quase vazia, e os testículos são no seu diâmetro máximo (como na Figura 2). Usando homens mais jovens garante um número relativamente grande de células germinativas (dividindo submetidos ou mitose ou meiose) e espermátides iniciais pós-meióticas. Quando os machos mais velhos (3-5 dias após a eclosão) são utilizados para dissecção (imagem não mostrado), as vesículas seminais são mais importantes, porque eles são cheias de esperma, e os testículos são mais estreitos do que em homens mais jovens. Homens mais velhos são preferíveis se o objetivo é visualizar espermatozóides maduros.

Devido à progressão ordenada de eventos do desenvolvimento ao longo do comprimento dos testículos de Drosophila, células da linha germinativa em fases específicas da espermatogénese pode ser enriquecido com base na posição em que os testículos dissecados são rasgadas antes esmagamento. Por exemplo, rasgando o testículo perto de sua ponta apical (nível 1, Figura 2B ') produz uma grande quantidade de células nos estágios iniciais da espermatogênese. Figura 3A mostra uma imagem de contraste de fase de uma população representativa de espermatogónios (seta branca), espermatócitos primários precoce (seta amarela), e espermatócitos primários final (seta vermelha) obtido desta forma. Alternativamente, rasgando os testículos em uma posição um pouco mais basal (nível 2, Figura 2B ') produz principalmente espermatócitos e espermátides. Figura 3B mostra uma imagem de contraste de fase de uma população representativa de células de espermatócitos primários (seta vermelha), espermátides arredondadas ( seta verde), alongando espermátides (seta laranja), e feixes de espermatozóides maduros (seta azul) obtidos desta forma.

Imagem de contraste de fase de testes pode ser utilizado para caracterizar os defeitos na espermatogénese Drosophila resultante de mutações em genes que são fundamentais para este processo. As espermátides redondas têm uma aparência muito estereotipada, quando vistos através de um microscópio de contraste de fase. Cada uma dessas espermátides imaturos tem um único, PHAse-luz, núcleo redondo e uma única fase de escuro, agregado mitocondrial rodada de aproximadamente o mesmo tamanho (marcado pela ponta da seta roxa e flecha, respectivamente, na Figura 3C). Variação dos números relativos ou tamanhos de essas organelas podem resultar de divisões meióticas aberrantes (ver discussão). Um exemplo de um tipo de defeito é mostrado na Figura 3D. Espermátides redondas de homens adultos com mutação do gene em pedaços (asun) conter uma única grande agregado mitocondrial e vários pequenos núcleos, como resultado de defeitos de citocinese e segregação de cromossomos 29.

A microscopia de fluorescência é uma outra abordagem poderosa para o estudo de Drosophila espermatogénese. Um exemplo de uma imagem de fluorescência de células fixadas a partir de uma amostra de testículos esmagados é mostrado na Figura 4. Os testes foram obtidos a partir de moscas transgénicas expressando GFP-beta 1-tubulina (produto do gene bTub56D fundida na sua extremidade C-tulominal de ponta a GFP e sob o controle do promotor do gene da ubiquitina Ubi-p63E; dom de H. Oda e Y. Akiyama-Oda, JT bio-história Research Hall, Osaka, Japão), a fim de rotular os microtúbulos (verde na Figura 4D, em tons de cinza na Figura 4A). Os testículos transgênicos histoquímica usando um anticorpo de rato contra a gama-tubulina (anticorpo secundário: anti-rato Cy3) para marcar centrossomas (vermelho na Figura 4D, em tons de cinza na Figura 4C) e DAPI-manchado para marcar DNA (azul na Figura 4D, em tons de cinza na Figura 4B). As células em diferentes estádios da espermatogénese podem ser prontamente identificados através da análise do arranjo dos microtúbulos, centrossomas e cromossomas (ver legenda).

Figura 1
Figu re 1. Esquema de divisões celulares germinativas em Drosophila machos. Cada divisão de células-tronco produz uma célula goníaco que sofre quatro rodadas de divisões mitóticas com citocinese incompleta para produzir um cisto de 16 células de espermatócitos primários. Cada espermatócitos primários passa por uma fase de crescimento prolongada antes de sofrer as duas divisões meióticas, novamente com citocinese incompleta, de modo a formar um quisto 32 células de espermatócitos secundários interligados seguido de um quisto de 64 células de espermatídeos redondas interligadas. Espermátides arredondadas são caracterizados pela presença de um núcleo fase de luz e um agregado mitocondrial fase de escuro (o Nebenkern) de tamanhos semelhantes. As espermátides arredondadas sofrer alongamento e individualização para formar o esperma maduro. Cabeças de esperma maduros podem ser identificados pelos seus núcleos em forma de agulha. Núcleos são mostrados em azul; Nebenkerne (agregados mitocondriais) em preto; citoplasma no bronzeado./ 50981fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 2
Figura 2. Órgãos reprodutivos de machos de Drosophila. Homens adultos jovens (0-2 dias após a eclosão) foram selecionados para dissecção. Micrografias de Luz de órgãos reprodutivos isolados são mostrados em A e B com desenhos animados em um correspondente 'e B'. (A, A ') dos testículos de Drosophila (vermelhas) foram retirados a partir do abdómen de uma mosca adulta masculina está ligada à conduta de ejaculatório (castanho) através das vesículas seminais (azuis). Um par de glândulas acessórias (verde) também é ligado ao ducto ejaculatório. (B, B ') Os testículos deve ser separada das glândulas acessórias bntes de deslizar preparação. Antes de esmagamento, rasgar os testículos no nível 1 para o enriquecimento de células em fases iniciais da espermatogênese; no nível 2 para obter uma população mista de células germinativas e meiose pós-meióticas, e no nível 3 para enriquecer espermatozóides maduros. Barra de escala, a 250 mm. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 3
Figura 3. Imagens de contraste de fase de testes de Drosophila. (A) Uma abundância de células em estágios iniciais da espermatogênese, incluindo espermatogônias (seta branca), espermatócitos primários iniciais (seta amarela), e espermatócitos primários final (seta vermelha) normalmente são liberados quando o testículo é rasgado no nível 1 (ver Fig.ure 2B '). Duas ou mais células interligadas (uma conseqüência da citocinese incompleta) muitas vezes se fundem completamente como um artefato do processo de esmagamento (seta amarela marca uma fusão de dois espermatócitos primeiros). (B) A combinação de espermatócitos (seta vermelha marca espermatócito primário tardio) e células pós-meióticas, incluindo espermátides arredondadas (seta verde), espermátides alongamento (seta laranja marca cisto parcial), e feixes de espermatozóides maduros (seta azul), são tipicamente liberada quando o testículo é rasgado ao nível 2 (ver Figura 2B). (C, D) de imagem de contraste de fase de testículos achatadas pode ser usado para identificar facilmente os defeitos dos espermatídeos redondas abundantes e estereotipados. Do tipo selvagem espermátides têm um núcleo (fase-light; marcado pela ponta de seta roxa) ligado a um único agregado mitocondrial (fase de escuro, marcado pela seta roxa) de tamanho aproximadamente igual (C). Espermátides de asunf02815testículos conter vários núcleos pequenos e um grande agregado mitocondrial como resultado da citocinese falhou e erros na segregação cromossômica (D). Barra de escala, de 10 mm. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 4
.. Figura 4 imagem fluorescente de testículos de Drosophila Preparações de testículos esmagados isoladas de homens expressando GFP-tagged beta1-tubulina (verde em D, em tons de cinza em A) foram fixados e corados para ambos DNA (DAPI; azul em D, em tons de cinza em B) e centrossomas (anticorpos gama-tubulina; vermelhas em D, em tons de cinza em C.) A spermato dividindocyte (seta branca) pode ser visto ao lado de um grande campo de espermátides arredondadas (seta branca marca um células representativas) e um pacote de espermatozóides maduros (seta amarela). Barra de escala, de 10 mm. Clique aqui para ver imagem ampliada.

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Discussion

Embora os testículos de moscas do tipo selvagem pode ser facilmente identificado, devido à sua cor amarela (em contraste, os tecidos brancos vizinhos), os testículos de moscas mutantes brancos são brancos e, assim, eventualmente, pode ser confundido com o intestino. Mais estirpes transgénicas, que são tipicamente num fundo branco, também têm testículos branco porque o mini-gene de branco encontrada em P-elementos não promove a acumulação de pigmentos nos testículos. Quando os testículos de Drosophila não podem ser distinguidos por cores, outras características facilmente reconhecíveis incluem o seu padrão de espiral e ocorrência em pares 12. Note-se que alguns trabalhadores encontrá-lo mais fácil de usar agulhas de dissecação em vez de fórceps para isolar os testículos 12.

Uma etapa fundamental deste protocolo é a preparação dos testículos esmagados. Uma abordagem útil é a pairar o slide alguns milímetros sobre a lamínula contendo os testículos de tal forma que o te superfíciension da PBS sobre a lamínula levanta a lamela contendo o tecido para o slide. Este método tende a perturbar cistos e espalhar-se as células na lâmina, tornando-o ideal para imagens de células individuais. Alternativamente, para manter os cistos inteiros ou parciais para imagiologia, o volume de PBS colocado na tampa de deslizamento pode ser aumentada (4-5 ml para 7-8 ml).

Se um mutante especial Drosophila de interesse não sobreviver até a idade adulta, em seguida, testes de larvas ou pupas pode, alternativamente, ser usado para estudar a espermatogênese. Na secção de protocolo, as referências são fornecidas para o isolamento de machos pharate e ovários larvais; uma modificação do último processo pode ser utilizado para isolar os testículos larvares. Os passos para rasgar, esmagar, e manchando testículos larvas ou pupas são essencialmente idênticos aos que aqui descrito para os testículos de adulto. Mesmo que a linha da mosca a ser estudado pode atingir a idade adulta, o isolamento de testículos de larvas ou pupas pode ser preferível se o goal é a obtenção de células nos estágios iniciais da espermatogênese. Tal como descrito na secção de resultados representativos, as células em estádios precoces ou tardias da espermatogénese pode ser enriquecido como desejado por variação do nível em que o testículo é rasgado antes da esmagamento.

Microscopia de contraste de fase oferece uma abordagem relativamente simples para o estudo de Drosophila espermatogênese. Uma vantagem de microscopia de contraste de fase durante a imunocoloração e microscopia de fluorescência é que menos tempo é necessário para preparar as amostras. Todas as grandes fases de espermatogénese pode ser prontamente identificado utilizando esta técnica 24. De fato, diversos grupos têm usado de contraste de fase de análise microscópica dos testículos como uma tela principal para a caracterização dos fenótipos de linhagens mutantes de Drosophila macho-estéreis 21-23. Durante divisões meióticas, as mitocôndrias e os cromossomos são igualmente dividido para as células filhas. Uma característica única da espermatogênese em Drosophilum e outros insetos envolve a formação de um agregado mitocondrial (a Nebenkern) em espermátides arredondadas 24. Espermatídeos adesivo conter um Nebenkern fase de escuro e um núcleo de fase leve de tamanho aproximadamente igual em uma proporção de 1:1 (Figura 3). O diâmetro do núcleo reflecte o teor de ADN dos espermatídeos redondas, assim erros na segregação dos cromossomas durante a meiose pode conduzir a variabilidade no tamanho do núcleo 33. Rompimento de citocinese meiótica após resultados de segregação cromossômica em espermátides arredondadas multinucleadas em que o fusível Nebenkerne em um único agregado 34. Assim, qualquer variação na proporção de 1:1, ou no tamanho ou forma do Nebenkern e núcleo no espermatídeos redondas pode ser facilmente detectada por microscopia de contraste de fase de testículos vivos e é muitas vezes de diagnóstico de defeitos na meiose. Fusão de duas ou mais células interligadas dentro de um cisto comum ocorre freqüentemente como um artefato do processo de esmagamento (Figura 3A, Seta amarela), com uma razão de 1:1 de núcleos para Nebenkerne, no entanto, é ainda mantida.

Imunocoloração de preparações fixas de testículos de Drosophila pode ser realizada para estágio células passando a espermatogênese, bem como para avaliar os padrões de expressão e localizações subcelulares de proteínas de interesse. Um esquema refinado para classificar os estágios da espermatogênese Drosophila com base na morfologia celular, organização da cromatina, e arranjos de microtúbulos de células dos testículos imunomarcadas para tubulina e manchado de DNA tem sido descrita 19. Drosophila espermatócitos primários são células relativamente grandes, e os fusos meióticos pode ser observado claramente utilizando esta abordagem. Coimmunostaining para centrossomas (por exemplo, utilizando anticorpos contra a gama-tubulina) pode ser realizado para obter uma visão mais precisa da estrutura do fuso da meiose. O formaldeído é um fixador adequado quando imunocoloração testículos com uma vasta gama de Antibods (por exemplo, anti-lamina e cadeia pesada anti-dineína). A morfologia dos microtúbulos e centrossomas, no entanto, é melhor preservada com metanol, daí, o metanol é utilizado tipicamente como um fixador ao realizar a imunocoloração com anticorpos contra a alfa-tubulina e gama-tubulina.

Se os anticorpos contra a proteína de interesse está disponível, as linhas de Drosophila transgénicas que expressam uma versão fluorescente marcado (p. ex. MCherry ou GFP) da proteína pode ser gerado como uma abordagem alternativa. A localização subcelular da proteína pode então ser determinada usando um microscópio de fluorescência para visualizar a GFP em preparações vivas ou fixas de tecidos, em alternativa, os anticorpos anti-GFP pode ser utilizado para detectar a proteína de fusão em amostras fixadas. Na Figura 4, os microtúbulos, em uma preparação de testículos fixo foram visualizados através da fluorescência intrínseca da GFP beta1-tubulina (expresso a partir de um transgene sob o controlo de um globaliado expressa ubiquitina promotor). Alternativamente, moscas transgénicas em que a expressão está sob o controlo de um promotor específico de tecido, por exemplo, o promotor do gene da beta-2-tubulina foram usadas para testes específicos de expressão-35. Alternativamente, a expressão de uma proteína de interesse pode ser restrita às células da linha germinativa do sexo masculino específicos usando o sistema de UAS-Gal4 36. Nanos-Gal4 pode ser utilizado para induzir a expressão de uma proteína sob o controlo de um promotor UAS dentro de células spermatogonial, enquanto bam-Gal4 pode ser utilizado para induzir a expressão dentro de espermatócitos 37. Knockdown de uma proteína de interesse também pode ser induzida nos testículos, expressando uma construção hairpin RNAi sob o controle de um promotor UAS em conjunto com estes controladores Gal4 37.

O desenvolvimento de métodos para análise de imagens ao vivo de células dos testículos de Drosophila ampliou a gama de questões que podem serendereçado usando este sistema. Os eventos de citocinese meiótica pode ser visualizada por microscopia de contraste de fase de espermatócitos cultivadas nos coágulos de fibrina dentro de uma câmara de perfusão, a fim de prolongar a vida das células 35. Microscopia confocal Time-lapse de espermatócitos de Drosophila que expressam proteínas fluorescente etiquetado também tem sido uma abordagem poderosa (por exemplo, para estudar a montagem fuso meiótico) 38. A utilização de microscopia confocal de imagens em tempo real de uma etapa anterior, os divisores de células germinativas dos testículos de Drosophila, tem conduzido a uma maior compreensão da regulação de células estaminais. Para além dos de contraste de fase e microscopia de imunofluorescência as abordagens aqui apresentadas, a microscopia electrónica de transmissão também tem sido amplamente utilizado para estudar a Drosophila espermatogénese 31.

Em adição às imagens, testículos de Drosophila podem ser utilizados como uma fonte de material para analysi bioquímicas. Para as experiências de imunotransferência, testículos dissecados de moscas podem ser homogeneizadas em tampão de amostra de 6x (5 ml / testículos par), fervida, e directamente carregada num gel de SDS-PAGE (~ 4 testículos pares / pista). Por exemplo, esta abordagem tem sido utilizada para avaliar os níveis de componentes dineína-dinactina nos testículos de vários mutantes de Drosophila. Extractos de testículo pode, alternativamente, ser preparados por homogeneização do tecido em tampão de lise, se não desnaturante é importante para manter a integridade da proteína. Por exemplo, a Drosophila testículos extractos têm sido utilizados em experiências coimmunoprecipitation para demonstrar a presença de complexos de proteínas estáveis ​​neste tecido 41-43.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Michael Anderson para a criação em laboratório Lee estes métodos aceitos para estudar espermatogênese com aconselhamento especializado de Karen Hales. H. Oda e Y. Akiyama-Oda generosamente forneceu a γ-tubulina-GFP voar estoque. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NIH R01 para LAL (GM074044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

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Protocolo Básico Edição 83, Dissecção testículos espermatogênese a meiose as células germinativas microscopia de contraste de fase imunofluorescência
Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes
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Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

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