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Biology

Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/51058
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Los métodos para aislar y preparar muestras de Drosophila testículos (en directo y fijo) para obtener imágenes de contraste de fase y microscopía de fluorescencia se describen en este documento.

Abstract

Drosophila melanogaster es un sistema modelo de gran alcance que ha sido ampliamente utilizado para dilucidar una variedad de procesos biológicos. Por ejemplo, los estudios tanto de la mujer y las líneas germinales masculinas de Drosophila han contribuido en gran medida a la comprensión actual de la meiosis, así como la biología de células madre. Excelente protocolos están disponibles en la literatura para el aislamiento y formación de imágenes de los ovarios y los testículos 3-12 de Drosophila. En la presente memoria, los métodos para la disección y preparación de testículos de Drosophila para el análisis microscópico se describen con una demostración de vídeo adjunto. Un protocolo para el aislamiento de los testículos del abdomen de los hombres adultos y preparar diapositivas de tejido vivo para el análisis por microscopía de contraste de fase, así como un protocolo para la fijación y la inmunotinción testículos para el análisis por microscopía de fluorescencia se presentan. Estas técnicas se pueden aplicar en la caracterización de mutantes de Drosophila que exhiben defects en la espermatogénesis, así como en la visualización de localizaciones subcelulares de las proteínas.

Introduction

Testículos de Drosophila son un sistema modelo ideal para el estudio de muchos procesos biológicos, incluyendo la regulación de células madre, la meiosis, y el desarrollo del esperma 13-18. Los espermatocitos y sus husos meióticos son grandes y por lo tanto, conveniente para el análisis citológico, y los puntos de control del ciclo celular relajado durante la espermatogénesis facilitar el estudio de mutaciones en los genes del ciclo celular. Diferentes tipos de células se pueden observar en la progresión ordenada a lo largo de la longitud de los testículos, y cualquier interrupción de la espermatogénesis pueden conducir a cambios en esta disposición general. Estas características, combinadas con herramientas genéticas Drosophila han facilitado el análisis mutacional de la espermatogénesis 21-23.

Las etapas de la espermatogénesis de Drosophila han sido bien definido. Células de la línea germinal que se desarrollan de forma sincrónica dentro de quistes progresan secuencialmente a través de las etapas de la espermatogénesis a lo largo de la longitud de los testículos. Durante boª de la mitosis y divisiones meióticas de las células germinales masculinas, la citocinesis ocurre de forma incompleta de manera que las células hijas permanecen conectadas por puentes citoplásmicos conocidas como canales de anillo (Figura 1). La punta apical del testículo contiene una población de células madre de línea germinal que da lugar a células de espermatogonias, que se someten a cuatro divisiones mitóticas con la citocinesis incompleta para generar quistes 16 de células de espermatocitos primarios. Después de la fase S premeiotic, espermatocitos primarios entran G2, un período de crecimiento prolongado de ~ 90 horas durante el cual aumenta el volumen celular ~ 25 veces. La progresión a través de la meiosis I y la meiosis II resultados en la formación de quistes 32 de células de espermatocitos secundarios y quistes 64 de células de espermátides haploides, respectivamente. Las espermátidas redondas, inmaduros experimentan una amplia remodelación celular para formar espermatozoides maduros. Células post-meióticas, en particular, los haces de alargamiento y espermátidas maduras, ocupan gran parte del volumen de los testículos.

Tque el transporte de los espermatozoides éxito funcional a las moscas hembras requiere la coordinación entre las diferentes partes del sistema reproductor masculino, que se compone de varias estructuras apareadas (los testículos, las vesículas seminales y glándulas accesorias) y un único conducto eyaculador (Figura 2). Los espermatozoides se producen en los testículos y se almacenan en las vesículas seminales hasta la cópula 24. Las glándulas accesorias contienen células secretoras que producen el líquido seminal. El esperma de la migración de las vesículas seminales se mezclan con el líquido seminal dentro del conducto eyaculador, que está conectado tanto a las vesículas seminales y las glándulas accesorias. Esta mezcla de espermatozoides y fluido seminal se bombea en última instancia fuera del macho en la vagina de la hembra volar a través de la bombilla de la eyaculación situado en el extremo posterior del macho abdomen 25. Las proteínas en el líquido seminal son esenciales para el almacenamiento prolongado de espermatozoides dentro de los órganos especializados conocidos como espermatecas en el representantetracto roductiva de las hembras de Drosophila 26.

Excelente métodos para el aislamiento de los testículos de Drosophila y visualización de células en diversas etapas de la espermatogénesis están disponibles en la literatura científica 3-12. Estamos aquí añadimos a este conjunto de conocimientos mediante la presentación de ejemplos de estos protocolos con una demostración en video que lo acompaña. El protocolo para la preparación de los testículos en vivo muestras para microscopía de contraste de fase se basa en un método descrito previamente 27. El protocolo para la fijación de formaldehído y la inmunotinción de testículos también se basa en un método descrito previamente 28. Los enfoques descritos en el presente documento se han utilizado en muchos estudios de Drosophila espermatogénesis (por ejemplo, para evaluar las funciones de la dineína, un motor de microtúbulos menos de extremo-dirigido, durante la espermatogénesis de Drosophila).

Además de los protocolos básicos, se proporcionan sugerencias para varying la disección con el fin de enriquecer las espermatogonias, espermatocitos, o espermatozoide maduro. Diferentes métodos para el procesamiento de los testículos de tal manera que los quistes o bien permanecen intactas o se interrumpen, se describen, según sea necesario. Una ventaja en el uso de testículos de Drosophila como sistema modelo es que, en comparación con los ovocitos y embriones de Drosophila, anticuerpos y colorantes pueden penetrar fácilmente en las células después de su dispersión de los testículos, y se requieren menos etapas de lavado, por lo tanto, los protocolos se pueden realizar en un tiempo relativamente tiempo corto.

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Protocol

1. Testículos Disección

  1. Anestesie moscas en una botella o frasco con una corriente de CO 2 y la transferencia a una almohadilla de mosca.
  2. Ordenar moscas bajo un microscopio de disección usando un pequeño pincel, y recoger un número apropiado (dependiendo del experimento) de los machos de Drosophila de los genotipos deseados. Los hombres jóvenes (0-2 días de edad) son ideales para el examen de las células a través de las primeras etapas de la espermatogénesis (por ejemplo espermatogonias, espermatocitos y espermátidas tempranas post-meióticas), mientras que los machos ligeramente mayores (2-5 días de edad) son ideales para el examen de las células en las últimas etapas de la espermatogénesis (en particular, maduran los espermatozoides).
  3. Use unas pinzas para quitar las alas de cada vuelo (para evitar que las moscas que flotan en el líquido durante la disección).
  4. Añadir ~ 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (NaCl 130 mM, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4, PBS) en una gota a una disección plato cubierto con silicona porun fondo negro. Otras soluciones acuosas se han utilizado con éxito para la disección testículos 3.
  5. Punto fórceps hacia la parte anterior de la mosca, agarrarlo por el tórax, y sumergirlo en la gota de PBS. Mientras observa a través del microscopio de disección, utilice otro par de pinzas para agarrar y tirar de los genitales externos (estructura de color marrón oscuro situado en el extremo posterior del abdomen ventral) posteriormente hasta que se separe del abdomen. En la mayoría de los casos, los testículos, las vesículas seminales y las glándulas accesorias serán removidos del abdomen, junto con los órganos genitales externos, si fuera necesario, introduzca un solo par de pinzas en el abdomen y se burlan de los testículos.
  6. Separe los testículos y las glándulas accesorias genitales externos utilizando dos pares de pinzas en la caída de PBS (Figura 2). Testículos de tipo salvaje se distinguen fácilmente de los tejidos blancos vecinos por su color amarillo. Proceda inmediatamente al paso 2.
  7. Para aislar los testículos de los machos pharate (i.. E incluido dentro de la caja de pupa), un paso adicional primero se debe realizar que implica la eliminación de la marcha de la caja de pupa; este paso ha sido descrito previamente en otro lugar 31. Proceda con la disección como para los testículos adultos a partir del paso 1.2.
  8. Para aislar los testículos de los machos de larvas, lleve a cabo una modificación de un protocolo para el aislamiento de ovarios de larvas de Drosophila 32. Brevemente, las larvas macho se puede distinguir de larvas hembra por la presencia de un par de estructuras grandes, claras ovales (testículos de larvas) incrustados en el tercio posterior de la grasa corporal. Para aislar los testículos de larvas, desollar parcialmente abierta la larva macho para aislar los testículos y el cuerpo de grasa que rodea el abdomen como se describe para el aislamiento de ovarios de larvas. Proceder inmediatamente al paso 2 del protocolo descrito en el presente documento; los testículos más tarde pueden ser eliminados del cuerpo grasa justo antes de montar (pasos 2.3 o 3.14) como se describió para los ovarios 32.

  1. Use un par de pinzas para colocar suavemente 2-3 pares de testículos en una gota de 4-5 ml de PBS en una cubierta de vidrio cuadrado deslizamiento. Tenga en cuenta que puede necesitar la relación del número testículos al volumen de PBS para ajustar: el exceso de líquido evitar que las células se propaguen correctamente cuando aplastado, mientras que demasiado poco líquido hará que las células revienten cuando aplastada. Opcional: Uso cubierta siliconada desliza para minimizar la adherencia de tejido para cubrir deslizamiento en el paso 3.2.
  2. Use un par de pinzas para rasgar cada testículo en una posición apropiada para maximizar la presencia de los tipos de células de la línea germinal deseadas en la preparación (tenga en cuenta que los contenidos de los testículos en su mayoría será la salida de la región desgarrada sobre el portaobjetos durante el aplastamiento paso.) Para enriquecer espermatogonias y espermatocitos, rasgar el testículo adyacente a su extremo apical (nivel 1, la Figura 2B). Para enriquecer espermatocitos y espermátidas, desgarro abrir los testículos a un position ligeramente basal al nivel 1 (nivel 2, la Figura 2B). Para enriquecer las células germinales más maduras, rasgar los testículos más cerca de donde comienza la curvatura (nivel 3, Figura 2B).
  3. Con suavidad, coloque un portaobjetos de vidrio sobre la hoja de la cubierta para aplastar los testículos; no presione manualmente como el peso de la hoja de la cubierta es suficiente para obtener una muestra adecuada aplastada. Trate de evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Opcional: Uso revestido de poli-L-lisina portaobjetos para promover la adhesión de tejido se deslice en el paso 3.2.
  4. Utilice la preparación inmediata (idealmente dentro de 15 minutos de preparación) para observar células vivas por microscopía de contraste de fase, porque las moscas transgénicas con expresión de las proteínas marcadas con fluorescencia en los testículos, las células vivas pueden ser examinadas por microscopía de fluorescencia en este paso. Por otra parte, proceder a la fijación y la tinción de anticuerpos (Protocolo n º 3).
  5. Absorber suavemente el exceso de líquido bajo el cubreobjetos usando una limpieza wipe para permitir que el aplanamiento de la preparación hasta que las células germinales son claramente enfocado.

3. Formaldehído La fijación y la tinción de anticuerpos

  1. Snap congelar cada diapositiva que contiene los testículos aplastados (del Protocolo 2) usando un par de pinzas de metal para sumergirlo brevemente en nitrógeno líquido (nitrógeno líquido hasta que se detiene el burbujeo).
  2. Retire la hoja de la cubierta inmediatamente usando una cuchilla de afeitar.
  3. Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas en una parrilla corrediza de vidrio preenfriado lleno de etanol al 95% enfriado con hielo (grado espectrofotométrico, exento de metanol). Almacenar a -20 ° C durante 10 min.
  4. Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas a un estante de portaobjetos de vidrio lleno con 4% de formaldehído en PBS más 0,1% de Triton X-100 (PBS-T). Guarde a temperatura ambiente durante 7 min.
  5. Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas en una parrilla corrediza de vidrio lleno de PBS. Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 1x. Realice todos los lavados descartando la solución en la parrilla corrediza de vidrio (
  6. Desechar el PBS y sumergir los portaobjetos en PBS-T durante 30 min a temperatura ambiente para permeabilizar las membranas celulares.
  7. Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 2x.
  8. El bloqueo de paso (opcional): Sumergir los portaobjetos en PBS más 1% de BSA durante 45 min a temperatura ambiente.
  9. Use una barrera hidrofóbica lápiz para dibujar un círculo en la diapositiva alrededor del tejido aplastado (fácilmente visible a simple vista) con el fin de limitar las soluciones de anticuerpos (agregado en los pasos 3,9 y 3,11). El tejido debe mantenerse húmedo en todo momento durante la realización de la inmunotinción.
  10. Añadir 30-40 ml de anticuerpo primario (diluido en PBS-T, 1:400 a 1:50, dependiendo de anticuerpo) en el tejido dentro del círculo. Si se ha realizado el bloqueo, diluir anticuerpo primario en PBS-T más 1% de BSA. El anticuerpo anti-gamma-tubulina (para la tinción de los centrosomas en la Figura 4) se diluyó 1:100. Incubar en una cámara oscura húmeda (por ejemplo. Caja de plástico cerradacon toallas húmedas de papel) durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
  11. Lavar los portaobjetos con PBS durante 5 min a temperatura de habitación 3x. Si se realizó el bloqueo, lavar dos veces en PBS-T y una vez en PBS (5 min a temperatura ambiente, cada una).
  12. Añadir 30-40 ml de anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo (diluido 1:400 en PBS) a los tejidos y se incuba en la oscuridad durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
  13. Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 2x.
  14. Añadir 30-40 ml de solución de DAPI (0,2 mg / ml en PBS) para el tejido dentro del círculo.
  15. Con suavidad, coloque una hoja de cubierta de vidrio sobre el tejido, teniendo cuidado de evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Si deben aparecer burbujas de aire, mueva con cuidado alrededor de la hoja de la cubierta sin destruir la calabaza hasta que las burbujas se escapan de los lados de la hoja de la cubierta.
  16. Utilice una toallita de limpieza para borrar el exceso de DAPI de los bordes de la diapositiva.
  17. Sellar el cubreobjetos a la diapositiva utilizando el esmalte de uñas transparente.
  18. Utilice esta preparacióndentro de los próximos 3 a 4 horas para ver las células immunostained por microscopía fluorescente. Para el almacenamiento a largo plazo de las diapositivas (hasta por lo menos varias semanas), utilice un medio difícil montar a base de glicerol con DAPI, y almacenar a -20 ˚ diapositivas C.
  19. Alternativamente, fijar muestras en metanol en lugar de formaldehído (dependiendo del antígeno). Después de completar todo el protocolo hasta el paso 3.2, sumerja las diapositivas de los testículos aplastados en metanol durante 10 minutos a -20 º C y continúe con el paso 3.5 en adelante.

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Representative Results

Un ejemplo de un par adecuadamente diseccionado de los órganos reproductores masculinos de Drosophila se muestra en la Figura 2A. Testículos retirados desde el abdomen de la mosca macho adulto están típicamente unidos al conducto eyaculador (marrón, Figura 2A ') y un par de glándulas accesorias (verde, Figura 2A') a través de un par de vesículas seminales (azul, Figura 2A ') . Para separar los testículos de la mayor parte del tejido somático de acompañamiento, el conducto eyaculador y las glándulas accesorias debe ser separado y desechado de tal manera que sólo el par testículos y las vesículas seminales se mantienen (Figuras 2B y 2B '). Las vesículas seminales también se puede quitar, dejando sólo el par de testículos para ser procesada posteriormente.

La edad de los machos adultos seleccionados para la disección testículos es una consideración importante. En los varones jóvenes (0-2 días después de la eclosión), las vesículas seminales son pequeñasy casi vacío, y los testículos están en su diámetro máximo (como en la Figura 2). El uso de machos jóvenes asegura un número relativamente grande de células que se dividen de la línea germinal (o bien se someten a la mitosis o la meiosis) y principios de espermátidas post-meióticas. Cuando se utilizan los machos de mayor edad (3-5 días después de la eclosión) para la disección (imagen no se muestra), las vesículas seminales son más prominentes, ya que están repletos de esperma, y ​​los testículos son más estrechas que en los hombres más jóvenes. Los machos adultos son preferibles si el objetivo es visualizar los espermatozoides maduros.

Debido a la progresión ordenada de eventos de desarrollo a lo largo de la longitud de los testículos de Drosophila, células de la línea germinal en etapas específicas de la espermatogénesis se pueden enriquecer en base a la posición en la que diseccionan los testículos se rompen antes de aplastar. Por ejemplo, desgarrando los testículos cerca de la punta apical (nivel 1, la Figura 2B ') se obtiene una gran cantidad de células en las primeras etapas de la espermatogénesis. Figura 3A muestra una imagen de contraste de fase de una población representativa de espermatogonias (flecha blanca), espermatocitos primarios tempranos (flecha amarilla), y espermatocitos primarios tardíos (flecha roja) obtenido de esta manera. Alternativamente, desgarrando los testículos en una posición ligeramente más basal (nivel 2, la Figura 2B ') produce principalmente espermatocitos y espermátidas. Figura 3B muestra una imagen de contraste de fase de una población celular representante de espermatocitos primarios (flecha roja), espermátidas redondas ( flecha verde), alargándose espermátidas (flecha naranja), y los paquetes de esperma maduro (flecha azul) obtenidos de esta manera.

De formación de imágenes de contraste de fases de los testículos puede ser utilizado para caracterizar los defectos en la espermatogénesis de Drosophila que resulta de mutaciones en los genes que son esenciales para este proceso. Las espermátidas redondas tienen un aspecto muy estereotipada cuando se ve a través de un microscopio de contraste de fase. Cada uno de estos espermátides inmaduras tiene un solo, los PHAe-luz, núcleo redondo y una sola, la fase oscura, agregada mitocondrial ronda de aproximadamente el mismo tamaño (marcado por la punta de flecha de color púrpura y la flecha, respectivamente, en la Figura 3C). La variación en el número relativo o tamaños de estos orgánulos puede ser resultado de las divisiones meióticas aberrantes (véase el debate). Un ejemplo de un defecto de este tipo se muestra en la Figura 3D. Espermátidas redondas de hombres adultos con mutación de la separe (Asun) gen contienen un único agregado grande mitocondrial y múltiples núcleos pequeños como resultado de defectos en la citocinesis y la segregación de cromosomas 29.

La microscopia de fluorescencia es otro poderoso enfoque para el estudio de la Drosophila espermatogénesis. Un ejemplo de una imagen fluorescente de células fijadas de una muestra testículos aplastados se muestra en la Figura 4. Testículos se obtuvieron de moscas transgénicas que expresan GFP-beta1-tubulina (producto de gen bTub56D fusionado en su extremo C-terminal fin a las buenas prácticas agrarias y bajo el control del promotor del gen de la ubiquitina Ubi-p63E; regalo de H. Oda y Y. Akiyama-Oda, JT Biohistory Investigación Hall, Osaka, Japón) con el fin de etiquetar los microtúbulos (en verde en la figura 4D, en escala de grises en la Figura 4A). Los testículos transgénicos fueron immunostained utilizando un anticuerpo de ratón contra la gamma-tubulina (anticuerpo secundario anti-ratón Cy3) para marcar los centrosomas (rojo en la figura 4D, en escala de grises en la Figura 4C) y DAPI-manchado para marcar el ADN (azul en la figura 4D, en escala de grises en la Figura 4B). Las células en diferentes etapas de la espermatogénesis se pueden identificar fácilmente mediante el examen de la disposición de los microtúbulos, centrosomas, y cromosomas (véase la leyenda).

Figura 1
Figu re 1. Esquema de divisiones celulares de la línea germinal en los machos de Drosophila. Cada división de células madre produce una célula gonial que se somete a cuatro rondas de divisiones mitóticas con citocinesis incompleto para producir un quiste de 16 células de espermatocitos primarios. Cada espermatocito primario se somete a una fase de crecimiento prolongado antes de someterse a las dos divisiones meióticas, de nuevo con la citocinesis incompleta, para formar un quiste 32 de células de espermatocitos secundarios interconectados seguido de un quiste 64 de células de espermátidas redondas interconectadas. Espermátidas redondas se caracterizan por la presencia de un núcleo de fase ligera y un agregado mitocondrial-fase oscura (la Nebenkern) de tamaños similares. Las espermátidas redondas son sometidos elongación e individualización para formar el esperma maduro. Cabezas de espermatozoides maduros pueden ser identificados por los sus núcleos en forma de aguja. Los núcleos se muestran en azul; Nebenkerne (agregados mitocondriales) en negro; citoplasma de bronceado./ 50981fig1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2
Figura 2. Los órganos reproductores de machos de Drosophila. Machos adultos jóvenes (0-2 días después de la eclosión) fueron seleccionados para la disección. Micrografías de luz de los órganos reproductivos aislados se muestran en A y B con caricaturas en un correspondiente 'y B'. (A, A ') testículos de Drosophila (rojo) que se retiró del abdomen de una mosca macho adulto están conectados al conducto eyaculador (marrón) a través de las vesículas seminales (azul). Un par de glándulas accesorias (verde) también se une al conducto eyaculatorio. (B, B ') Los testículos deben estar separados de las glándulas accesorias bntes deslice preparación. Antes de aplastamiento, rasgar los testículos en el nivel 1 para enriquecer a las células en las primeras etapas de la espermatogénesis, en el nivel 2 para obtener una población mixta de células germinales meióticas y post-meióticas, y en el nivel 3 para enriquecer en espermatozoides maduros. La barra de escala, 250 mm. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3
Figura 3. Imágenes de contraste de fase de testes de Drosophila. (A) Una gran cantidad de células en las primeras etapas de la espermatogénesis, incluyendo las espermatogonias (flecha blanca), espermatocitos primarios tempranos (flecha amarilla), y espermatocitos primarios tardíos (flecha roja) se liberan normalmente cuando los testículos se debate en el nivel 1 (ver Fig.ure 2B '). Dos o más interconectadas las células (una consecuencia de la citocinesis incompleta) a menudo se fusionan por completo como un artefacto del procedimiento de aplastamiento (punta de flecha amarilla marca la fusión de dos primeros espermatocitos). (B) Una combinación de espermatocitos (flecha roja marca tardía espermatocito primaria) y de las células después de la meiosis, incluyendo espermátidas redondas (flecha verde), alargándose espermátidas (flecha naranja marca quiste parcial), y los paquetes de esperma maduro (flecha azul), son típicamente liberado cuando los testículos se debate en el nivel 2 (ver Figura 2B '). (C, D) de formación de imágenes de contraste de fases de los testículos aplastados se puede utilizar para identificar fácilmente los defectos en las espermátidas redondas abundantes y estereotipadas. Espermátidas de tipo salvaje tienen un núcleo (fase-luz; marcado por la punta de flecha de color púrpura) unido a un solo agregado mitocondrial (fase oscura, marcada por la flecha morada) de aproximadamente el mismo tamaño (C). Espermátidas de asunf02815testículos contienen múltiples núcleos pequeños y una acumulación de grandes mitocondrial como resultado de la citocinesis y errores fallado en la segregación cromosómica (D). La barra de escala, 10 mm. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4
.. Figura 4 imagen fluorescente de testículos Drosophila preparaciones de testículos aplastados aisladas de los machos que expresan GFP-etiquetados beta1-tubulina (verde en D, escala de grises en A) se fijaron y tiñeron tanto ADN (DAPI; azul en D, escala de grises en B) y los centrosomas (anticuerpo gamma-tubulina; rojos en D, escala de grises en C). A espermato dividiendocyte (punta de flecha blanca) se puede ver al lado de un gran campo de espermátidas redondas (flecha blanca marca una células representativas) y un paquete de esperma maduro (flecha amarilla). La barra de escala, 10 mm. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Discussion

Aunque los testículos de los de tipo salvaje moscas pueden ser fácilmente identificados por su color amarillo (a diferencia de los tejidos blancos vecinos), los testículos de las moscas mutantes blancos son de color blanco y por lo tanto a veces se puede confundir con el intestino. Mayoría de las cepas transgénicas, que son típicamente en un fondo blanco, también tienen testículos blancos porque el gen de mini-blanco que se encuentra en P-elementos no promueve la acumulación de pigmento en los testículos. Cuando testículos de Drosophila no se pueden distinguir por el color, otras características fácilmente reconocibles incluyen su patrón de espiral y la ocurrencia en pares 12. Tenga en cuenta que algunos trabajadores les resulta más fácil de usar agujas de disección en lugar de fórceps para aislar los testículos 12.

Un paso crítico de este protocolo es la preparación de los testículos aplastados. Un enfoque útil es para asomar la diapositiva de unos pocos milímetros sobre la hoja de cubierta que contiene los testículos de tal manera que la superficie del tension del PBS en la hoja de la cubierta se levanta la hoja de cubierta que contiene el tejido hacia el tobogán. Este método tiende a interrumpir los quistes y se extienden las células en la diapositiva, lo que es ideal para obtener imágenes de células individuales. Por otra parte, para mantener los quistes enteras o parciales para imágenes, el volumen de PBS coloca en la hoja de la cubierta se puede aumentar (4-5 ml a 8.7 ml).

Si un mutante Drosophila de interés particular no sobrevive a la edad adulta, a continuación, los testículos de larvas o pupas pueden alternativamente ser utilizados para estudiar la espermatogénesis. En la sección de protocolo, se proporcionan referencias para el aislamiento de los machos pharate y los ovarios de las larvas; una modificación de este último protocolo se puede utilizar para aislar los testículos de larvas. Los pasos para lagrimeo, aplastamiento, y la tinción de testículos de larvas o pupas son esencialmente idéntica a la descrita en el presente documento para los testículos adultos. Incluso si la línea de la mosca que estudiar puede alcanzar la edad adulta, el aislamiento de los testículos de larvas o pupas puede ser preferible si el goal es obtener células en las primeras etapas de la espermatogénesis. Como se describe en la sección de resultados representativos, las células en etapas tempranas o tardías de la espermatogénesis se pueden enriquecer según se desee variando el nivel en el que los testículos se rompe antes de aplastar.

Microscopía de contraste de fases ofrece un enfoque relativamente simple para estudiar Drosophila espermatogénesis. Una de las ventajas de la microscopía de contraste de fase sobre la inmunotinción y microscopía de fluorescencia es que se requiere menos tiempo para preparar las muestras. Todas las principales etapas de la espermatogénesis se pueden identificar fácilmente utilizando esta técnica 24. De hecho, varios grupos han utilizado de contraste de fase de análisis microscópico de testículos como pantalla principal para la caracterización de los fenotipos de Drosophila con esterilidad masculina líneas mutantes 21-23. Durante divisiones meióticas, las mitocondrias y los cromosomas están igualmente divididas a las células hijas. Una característica única de la espermatogénesis en DrosophilA y otros insectos implica la formación de un agregado mitocondrial (la Nebenkern) en espermátidas redondas 24. Espermátidas redondas contienen una Nebenkern fase oscura y un núcleo-luz piloto de aproximadamente el mismo tamaño en una proporción 1:1 (Figura 3). El diámetro del núcleo refleja el contenido de ADN de las espermátidas redondas, por lo que los errores en la segregación cromosómica durante la meiosis puede conducir a variabilidad en el tamaño nuclear 33. La interrupción de la citocinesis meiótica siguientes resultados segregación cromosómica en espermátidas redondas multinucleadas en el que el fusible Nebenkerne en un solo agregado 34. Por lo tanto, cualquier variación en la proporción de 1:1 o en el tamaño o forma de la Nebenkern y núcleo en espermátidas redondas se puede detectar fácilmente por microscopía de contraste de fase de los testículos en vivo y es a menudo de diagnóstico de los defectos en la meiosis. La fusión de dos o más células interconectadas dentro de un quiste común se produce con frecuencia como un artefacto del procedimiento de aplastamiento (Figura 3A, Punta de flecha amarilla); la proporción de 1:1 de núcleos a Nebenkerne, sin embargo, todavía se mantiene.

La inmunotinción de preparaciones fijos de testículos de Drosophila se puede realizar a la etapa células sometidas a la espermatogénesis, así como para evaluar los patrones de expresión y localizaciones subcelulares de las proteínas de interés. Un esquema de refinado para la clasificación de las etapas de la espermatogénesis de Drosophila basados ​​en la morfología celular, la organización de la cromatina, y los arreglos de microtúbulos de células de los testículos inmunoteñidas para la tubulina y ADN-manchado ha sido descrita 19. Drosophila espermatocitos primarios son células relativamente grandes, y los husos meióticos puede se observa claramente el uso de este enfoque. Coimmunostaining para centrosomas (por ejemplo, usando anticuerpos contra la gamma-tubulina) se puede realizar para obtener una visión más precisa de la estructura del huso meiótico. El formaldehído es un fijador adecuado cuando inmunotinción testículos con una amplia gama de AntibodIES (por ejemplo, anti-lamina y cadena pesada anti-dineína). La morfología de los microtúbulos y los centrosomas, sin embargo, es mejor conservado con metanol; por lo tanto, el metanol se utiliza típicamente como el fijador al realizar la inmunotinción con anticuerpos contra alfa-tubulina y gamma-tubulina.

Si los anticuerpos contra una proteína de interés no están disponibles, líneas transgénicas de Drosophila que expresan una versión marcado con fluorescencia (por ejemplo. MCherry o GFP) de la proteína se pueden generar como un enfoque alternativo. La localización subcelular de la proteína se puede determinar mediante el uso de un microscopio para ver la fluorescencia de GFP en las preparaciones vivas o fijas de tejido; Alternativamente, los anticuerpos anti-GFP se pueden utilizar para detectar la proteína de fusión en muestras fijadas. En la Figura 4, los microtúbulos en una preparación testículos fijo se visualizaron a través de la fluorescencia intrínseca de GFP-etiquetados beta1-tubulina (expresada a partir de un transgén bajo el control de un pegotealiado expresó promotor de la ubiquitina). Alternativamente, las moscas transgénicas en las que la expresión está bajo el control de un promotor específico de tejido, por ejemplo, el promotor del gen de la beta 2 tubulina se han utilizado para testículos-específicas expresión 35. Alternativamente, la expresión de una proteína de interés puede ser restringida a las células de la línea germinal masculinos específicos utilizando el sistema UAS-Gal4 36. Nanos-Gal4 se puede utilizar para inducir la expresión de una proteína bajo el control de un promotor UAS dentro de las células de espermatogonias, mientras BAM-Gal4 se puede utilizar para inducir su expresión dentro de espermatocitos 37. Desmontables de una proteína de interés también puede ser inducida en los testículos mediante la expresión de un constructo de horquilla RNAi bajo el control de un promotor UAS en conjunción con estos controladores Gal4 37.

El desarrollo de métodos de análisis en vivo-la imagen de las células de los testículos de Drosophila se ha ampliado la gama de preguntas que pueden serabordado utilizando este sistema. Los acontecimientos de la citocinesis meiótica se pueden visualizar por microscopía de contraste de fase de espermatocitos cultivadas en coágulos de fibrina dentro de una cámara de perfusión con el fin de prolongar la vida de las células 35. Time-lapse microscopía confocal de espermatocitos de Drosophila que expresan proteínas etiquetadas con fluorescencia también ha sido un enfoque de gran alcance (por ejemplo, para estudiar ensamblaje del huso meiótico) 38. El uso de la microscopía confocal de imágenes en vivo de una etapa anterior, las células madre de línea germinal que se dividen en los testículos de Drosophila, ha llevado a una mayor comprensión de la regulación de células madre. Además de los enfoques de microscopía de contraste de fase y de inmunofluorescencia se presentan en el presente documento, microscopía electrónica de transmisión también se ha utilizado ampliamente para estudiar la espermatogénesis 31 de Drosophila.

Además de formación de imágenes, los testículos de Drosophila se pueden utilizar como una fuente de material para analysi bioquímicas. Para los experimentos de inmunotransferencia, los testículos de moscas disecadas se pueden homogeneizar en tampón de muestra 6x (5 ml / testículos par), hervidos, y directamente cargaron en un gel de SDS-PAGE (~ 4 testículos pares / carril). Por ejemplo, este método se ha utilizado para evaluar los niveles de componentes dineína dynactin en los testículos de varios mutantes de Drosophila. Testículos extractos se pueden preparar alternativamente por homogeneización de los tejidos en tampón de lisis no desnaturalizante si es importante para mantener la integridad de la proteína. Por ejemplo, Drosophila testículos extractos se han utilizado en experimentos coimmunoprecipitation para demostrar la presencia de complejos de proteínas estables en este tejido 41-43.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Michael Anderson para establecer en el laboratorio Lee estos métodos aceptados para el estudio de la espermatogénesis con asesoramiento de expertos de Karen Hales. H. Oda y Y. Akiyama-AOD ofrecida generosamente la γ-tubulina-GFP de stock volar. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH R01 a LAL (GM074044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

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Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

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