Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل الخلوي الحيوانات المنوية: الأعمال التحضيرية لايف والثابتة من Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/51058
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

وصفت وسائل لعزل وإعداد ذبابة الفاكهة الخصيتين عينات (العيش وثابتة) للتصوير من قبل على النقيض من المرحلة ومضان المجهري في هذه الوثيقة.

Abstract

ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو نظام نموذجي القوية التي استخدمت على نطاق واسع لتوضيح مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. على سبيل المثال، ساهمت الدراسات كل من الإناث والذكور خطوط الجرثومية من ذبابة الفاكهة إلى حد كبير في الفهم الحالي للالانقسام الاختزالي وكذلك بيولوجيا الخلايا الجذعية. تتوفر بروتوكولات ممتازة في الأدب لعزل والتصوير من المبيضين والخصيتين ذبابة الفاكهة 3-12. هنا، يتم وصف طرق للتشريح وإعداد الخصيتين ذبابة الفاكهة لتحليل مجهري مع مظاهرة الفيديو المرفقة. يتم عرض بروتوكول للعزل الخصيتين من البطن من الذكور البالغين وإعداد الشرائح من الأنسجة الحية لتحليلها من قبل على النقيض من المرحلة المجهري وكذلك بروتوكول لتحديد والمناعية الخصيتين لتحليلها من قبل مضان المجهري. هذه التقنيات يمكن تطبيقها في توصيف المسوخ ذبابة الفاكهة الذي يحمل دefects في الحيوانات المنوية وكذلك في تصور تعريب التحت خلوية من البروتينات.

Introduction

الخصيتين ذبابة الفاكهة هي نظام نموذج مثالي لدراسة العديد من العمليات البيولوجية بما في ذلك تنظيم الخلايا الجذعية، والانقسام الاختزالي، وتطوير الحيوانات المنوية 13-18. والخلايا المنوية ومغزل على الانتصافي كبيرة وبالتالي مريحة للتحليل الخلوي، واسترخاء نقاط التفتيش خلال دورة الخلية الحيوانات المنوية تيسير دراسة الطفرات في الجينات دورة الخلية. أنواع مختلفة من الخلايا يمكن ملاحظة التقدم في أمر على طول الخصيتين، وأي خلل في الحيوانات المنوية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في هذا الترتيب العام. هذه الميزات جنبا إلى جنب مع الأدوات الوراثية ذبابة الفاكهة قد سهلت تحليل طفرية من الحيوانات المنوية 21-23.

وقد تم تحديد مراحل تكوين الحيوانات المنوية ذبابة الفاكهة جيدا. خلايا سلالة الجرثومية التي تتطور بشكل متزامن داخل الخراجات بالتتابع تقدم من خلال مراحل تكوين الحيوانات المنوية على طول الخصية. خلال بوعشر والإنقسامية والانقسامات الانتصافي من الخلايا الجرثومية الذكور، يحدث الانقسام السيتوبلازمي مثل هذه غير كامل أن الخلايا الوليدة لا تزال متصلة بواسطة جسور حشوية المعروفة باسم قنوات حلقة (الشكل 1). غيض من قمية الخصية يحتوي على السكان من الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية التي تؤدي إلى خلايا النطفة، التي تخضع لأربعة أقسام الإنقسامية مع الانقسام السيتوبلازمي غير مكتملة لتوليد الخراجات 16 خلية من الخلايا المنوية الأولية. بعد المرحلة S السابق للانتصاف، الخلايا المنوية الأولية أدخل G2، وهي فترة طويلة من النمو الذي يزيد من حجم ~ ~ الخلوية 25 أضعاف خلال 90 ساعة. التقدم من خلال الانقسام الاختزالي الأول والانقسام الاختزالي الثاني النتائج في تشكيل الخراجات 32 خلية من الخلايا المنوية الثانوية والخراجات 64 خلية من طلائع منوية فرداني، على التوالي. غير ناضجة، طلائع منوية الجولة الخضوع لإعادة عرض الخلوية واسعة لتشكيل الحيوانات المنوية الناضجة. الخلايا بعد الانتصافي، ولا سيما حزم من التمطيط وطلائع منوية ناضجة، تحتل جزءا كبيرا من حجم الخصية.

Tوقال انه نقل ناجحة من الحيوانات المنوية وظيفية لالذباب الإناث يتطلب التنسيق بين أجزاء مختلفة من الجهاز التناسلي الذكري، والتي تتألف من العديد من الهياكل تقرن (الخصيتين والحويصلات المنوية والغدد ملحق) والقناة قذفي واحد (الشكل 2). ويتم إنتاج الحيوانات المنوية داخل الخصيتين وتخزينها داخل الحويصلات المنوية حتى الجماع 24. الغدد التبعي تحتوي على خلايا إفرازية التي تنتج السائل المنوي. الحيوانات المنوية المهاجرة من الحويصلات المنوية تختلط مع السائل المنوي داخل القناة قذفي، التي يتم توصيلها إلى كل من الحويصلات المنوية والغدد التبعي. هذا الخليط من الحيوانات المنوية والسائل المنوي ويتم ضخ في نهاية المطاف للخروج من الذكور في المهبل من الإناث تطير من خلال لمبة قذفي تقع في نهاية الخلفي من البطن الذكور 25. البروتينات داخل السائل المنوي ضرورية لتخزين لفترة طويلة من الحيوانات المنوية داخل الأجهزة المتخصصة المعروفة باسم spermathecae في مندوبالمسالك roductive الإناث ذبابة الفاكهة 26.

تتوفر طرق ممتازة لعزل الخصيتين ذبابة الفاكهة والتصور من الخلايا في مراحل مختلفة من الحيوانات المنوية في الكتابات العلمية 3-12. نحن هنا لإضافة هذه الهيئة من المعرفة من خلال تقديم أمثلة من هذه البروتوكولات مع مظاهرة الفيديو المرفقة. ويستند بروتوكول لإعداد الخصيتين الحية عينات للمرحلة التباين المجهري على الطريقة الموصوفة سابقا 27. ويستند بروتوكول لتثبيت الفورمالديهايد والمناعية من الخصيتين أيضا على الطريقة الموصوفة سابقا 28. وقد استخدمت الأساليب الموصوفة هنا في العديد من الدراسات من ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية (على سبيل المثال، لتقييم أدوار داينين، أنيبيب المحركات الموجهة ناقص نهاية، خلال ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية).

بالإضافة إلى البروتوكولات الأساسية، وتقدم اقتراحات لvaryinز تشريح وذلك لإثراء للأمهات المني، الخلايا المنوية، أو الحيوانات المنوية الناضجة. طرق مختلفة لمعالجة الخصيتين بحيث الخراجات إما لا تزال سليمة أو تتعطل حسب الحاجة موصوفة. ميزة في استخدام الخصيتين ذبابة الفاكهة كنظام نموذج هو أنه، بالمقارنة مع البويضات والأجنة ذبابة الفاكهة، والأجسام المضادة والأصباغ يمكن بسهولة اختراق الخلايا التالية تشتتهم من الخصيتين، وأقل مطلوبة الخطوات الغسيل، وبالتالي، لا يمكن أن يؤديها البروتوكولات في نسبيا وقت قصير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تشريح الخصيتين

  1. تخدير الذباب في زجاجة أو قارورة باستخدام تيار من ثاني أكسيد الكربون 2 ونقل إلى لوحة الطاير.
  2. نوع الذباب تحت المجهر تشريح باستخدام الفرشاة الصغيرة، وجمع عدد مناسب (اعتمادا على التجربة) من الذكور ذبابة الفاكهة من المورثات المطلوب. الشباب الذكور (0-2 أيام من العمر) تعتبر مثالية لفحص الخلايا في جميع أنحاء المراحل السابقة من الحيوانات المنوية (مثل أمهات المني، الخلايا المنوية، وأوائل طلائع منوية بعد الانتصافي)، في حين أن الذكور الأكبر سنا قليلا (2-5 يوما) هي مثالية لدراسة الخلايا في المراحل النهائية من الحيوانات المنوية (على وجه الخصوص، تنضج الحيوانات المنوية).
  3. استخدام ملقط لإزالة الأجنحة من كل يطير (لمنع الذباب من عائمة في السائل خلال تشريح).
  4. إضافة ~ 500 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (130 ملي مول كلوريد الصوديوم، 7 ملم نا 2 هبو 4، 3 ملم ناه 2 ص 4؛ PBS) في قطرة إلى طبق تشريح المغلفة سيليكون علىخلفية سوداء. وقد استخدمت المحاليل المائية الأخرى بنجاح لتشريح الخصيتين 3.
  5. نقطة ملقط نحو الأمامي للذبابة، فهم من قبل الصدر، وتزج به في الانخفاض برنامج تلفزيوني. أثناء عرض من خلال مجهر تشريح، واستخدام زوج آخر من ملقط لفهم وسحب الأعضاء التناسلية الخارجية (هيكل البني الداكن تقع في نهاية الخلفي من البطن بطني) الخلف حتى يفصل من البطن. في معظم الحالات، سيتم إزالة الخصيتين والحويصلات المنوية، والغدة التبعي من البطن جنبا إلى جنب مع الأعضاء التناسلية الخارجية، وإذا لم يكن كذلك، اضافة الى وجود زوج واحد من ملقط في البطن وندف من الخصيتين.
  6. الخصيتين منفصلة من الغدة الإكسسوارات والأعضاء التناسلية الخارجية باستخدام اثنين من أزواج من ملقط في انخفاض PBS (الشكل 2). وتتميز البرية من نوع الخصيتين بسهولة من الأنسجة البيضاء المجاورة عن طريق لونها أصفر. الشروع فورا في الخطوة 2.
  7. لعزل الخصيتين من الذكور pharate (ط . البريد المغلقة داخل حالة العذراء)، يجب أولا أن يتم تنفيذ خطوة إضافية التي تنطوي على إزالة ذبابة من حالة العذراء، وقد تم هذه الخطوة هو موضح سابقا في مكان آخر 31. المضي قدما في تشريح أما الخصيتين الكبار تبدأ في الخطوة 1.2.
  8. لعزل الخصيتين من الذكور اليرقات، إجراء تعديل على بروتوكول للعزل المبايض اليرقات ذبابة الفاكهة 32. لفترة وجيزة، يرقات الذكور يمكن تمييزها عن يرقات الإناث من خلال وجود زوج من، واضحة، والهياكل بيضاوية كبيرة (الخصيتين اليرقات) جزءا لا يتجزأ في الثلث الخلفي من الدهون في الجسم. لعزل اليرقات الخصيتين، سلخ جزئيا فتح يرقة الذكور إلى عزل الخصيتين والدهون في الجسم المحيطة من البطن كما هو موضح لعزل اليرقات المبايض. الشروع فورا في الخطوة 2 من بروتوكول الموصوفة هنا، ويمكن في وقت لاحق يتم إزالة الخصيتين من الجسم الدهون فقط قبل تركيب (2.3 أو 3.14 خطوات) كما هو موضح في المبايض 32.

ق ق = "jove_title"> 2. تحضير العينة وتصوير لايف

  1. استخدام زوج من ملقط لوضع بلطف 2-3 أزواج من الخصيتين في قطرة من 4-5 مل من برنامج تلفزيوني على غطاء زجاجي مربع الانزلاق. نلاحظ أن نسبة عدد الخصيتين للحجم PBS قد تحتاج إلى تعديل: سوف الكثير من السائل منع الخلايا من الانتشار بشكل صحيح عندما سحق، في حين أن السائل القليل جدا سوف يسبب الخلايا لتنفجر عندما ممرود. اختياري: استخدام الغطاء siliconized زلات لتقليل الالتزام من الأنسجة لتغطية الانزلاق في الخطوة 3.2.
  2. استخدام زوج من ملقط لتمزيق مفتوحة لكل الخصية في الموقف المناسب وذلك لتحقيق أقصى قدر من وجود أنواع الخلايا سلالة الجرثومية المطلوب في إعداد (لاحظ أن محتويات الخصية سوف معظمهم من الخروج من المنطقة التي مزقتها على الشريحة أثناء السحق الخطوة.) لإثراء لأمهات المني والخلايا المنوية، المسيل للدموع فتح الخصية المجاورة للطرف القمي في (مستوى 1، الشكل 2B). لإثراء لالمنوية وطلائع منوية، المسيل للدموع فتح الخصية في نقاط البيعition القاعدية قليلا إلى المستوى 1 (مستوى 2، الشكل 2B). لإثراء للخلايا سلالة الجرثومية أكثر نضجا، المسيل للدموع مفتوحة الخصية أقرب إلى حيث يبدأ انحناء (المستوى 3، الشكل 2B).
  3. وضع بلطف شريحة المجهر والزجاج على زلة غطاء لسحق الخصيتين، لا الضغط يدويا كما وزن الغطاء زلة وحده يكفي للحصول على عينة ممرود بشكل صحيح. في محاولة لتجنب احتباس فقاعات الهواء. اختياري: استخدام بولي-L-يسين المغلفة شرائح المجهر لتشجيع الانضمام من الأنسجة إلى الشريحة في الخطوة 3.2.
  4. استخدام إعداد فورا (مثالي في غضون 15 دقيقة من إعداد) لمراقبة الخلايا الحية من قبل على النقيض من المرحلة المجهري، على الذباب المعدلة وراثيا مع التعبير عن البروتينات الموسومة fluorescently في الخصيتين، والخلايا الحية يمكن دراستها بواسطة المجهر مضان في هذه الخطوة. بدلا من ذلك، المضي قدما في تثبيت وتلوين الأجسام المضادة (بروتوكول 3).
  5. الفتيل بلطف أي السائل الزائد من تحت ساترة باستخدام تنظيف ثبورصة البترول الدولية للسماح تسطيح من التحضير، حتى الخلايا الجرثومية بشكل واضح في التركيز.

3. الفورمالديهايد تثبيت وتلوين الأجسام المضادة

  1. المفاجئة تجميد كل شريحة تحتوي على الخصيتين ممرود (من البروتوكول 2) باستخدام زوج من ملقط معدني لتزج به لفترة وجيزة في النيتروجين السائل (حتى يتوقف النيتروجين السائل محتدما).
  2. إزالة الغطاء زلة فورا باستخدام شفرة حلاقة.
  3. استخدام ملقط معدني لنقل الشرائح إلى رف شريحة زجاجية prechilled مليئة الجليد الباردة الايثانول 95٪ (الصف الطيفي، خالية من الميثانول). تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  4. استخدام ملقط معدني لنقل الشرائح إلى رف شريحة زجاجية مملوءة 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 0.1٪ تريتون X-100 (PBS-T). تخزين في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق.
  5. استخدام ملقط معدني لنقل الشرائح إلى رف شريحة زجاجية مليئة برنامج تلفزيوني. تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر 1X. تنفيذ كافة يغسل عن طريق تجاهل الحل في رف شريحة زجاجية (
  6. تجاهل برنامج تلفزيوني وتزج الشرائح في برنامج تلفزيوني-T لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لpermeabilize أغشية الخلايا.
  7. تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تكرار 2X.
  8. عرقلة الخطوة (اختياري): تزج الشرائح في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 1٪ BSA لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. استخدام القلم حاجز مسعور لرسم دائرة على الشريحة في جميع أنحاء الأنسجة ممرود (مرئية بسهولة بالعين) من أجل حصر الحلول الضد (المضافة في الخطوات 3.9 و 3.11). يجب أن تبقى الأنسجة رطبة في جميع الأوقات أثناء أداء المناعية.
  10. إضافة 30-40 مل من الأجسام المضادة الأولية (المخفف في PBS-T، 1:400 إلى 1:50، اعتمادا على الضد) إلى الأنسجة داخل الدائرة. إذا تم تنفيذ حظر، تمييع الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني-T زائد 1٪ BSA. تم تخفيفه المضادة للأشعة غاما تويولين الضد (لتلطيخ centrosomes في الشكل 4) 1:100. احتضان في رطبة، غرفة مظلمة (على سبيل المثال. علبة بلاستيكية مغلقةمع المناشف مبللة ورقة) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  11. تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة 3X. إذا تم تنفيذ حظر، يغسل مرتين في برنامج تلفزيوني-T ومرة ​​واحدة في برنامج تلفزيوني (5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لكل منهما).
  12. إضافة 30-40 مل من fluorophore مترافق الضد الثانوية (1:400 المخفف في برنامج تلفزيوني) إلى الأنسجة واحتضان في الظلام لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  13. تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تكرار 2X.
  14. إضافة 30-40 مل من دابي الحل (0.2 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) إلى الأنسجة داخل الدائرة.
  15. وضع بلطف زلة غطاء زجاجي على الأنسجة، مع الحرص على تجنب احتباس فقاعات الهواء. إذا يجب أن تظهر فقاعات الهواء، تحرك بحذر حول انزلاق الغطاء دون تدمير الاسكواش حتى الفقاعات الهروب من جانبي انزلاق الغطاء.
  16. استخدام تنظيف مسح لطخة الزائدة دابي من حواف الشريحة.
  17. ختم زلة تغطية إلى الشريحة باستخدام طلاء الأظافر واضحة.
  18. استخدام هذا المستحضرداخل ساعة القادمة 3-4 لعرض الخلايا immunostained بواسطة المجهر الفلورسنت. للتخزين على المدى الطويل من الشرائح (تصل إلى عدة أسابيع على الأقل)، واستخدام وسائل الاعلام من الصعب القائم على جبل الجلسرين مع دابي، وتخزين الشرائح في -20 ˚ C.
  19. بدلا من ذلك، وتحديد العينات في الميثانول بدلا من الفورمالديهايد (اعتمادا على مستضد). بعد الانتهاء من البروتوكول بأكمله من خلال الخطوة 3.2، تزج الشرائح من الخصيتين ممرود في الميثانول لمدة 10 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، والمضي قدما في الخطوة 3.5 فصاعدا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد مثال على الزوج تشريح بشكل صحيح من ذبابة الفاكهة الذكور الأجهزة التناسلية في الشكل 2A. وترد الخصيتين إزالتها من البطن من الكبار ذبابة الذكور عادة إلى القناة قذفي (البني والشكل 2A ') وزوج من الغدد التبعي (الأخضر والشكل 2A') عن طريق زوج من الحويصلات المنوية (الأزرق والشكل 2A ') . لفصل الخصيتين من معظم الأنسجة الجسمية المصاحبة لها، القناة قذفي والغدد التبعي يجب أن تكون منفصلة وتجاهل مثل هذه الا ان الزوج الخصيتين والحويصلات المنوية تبقى (أرقام 2B 2B و'). يمكن أيضا إزالة الحويصلات المنوية، ولم يتبق سوى الزوج الخصيتين التي سيتم تجهيزها أخرى.

عمر الذكور البالغين المختارة لتشريح الخصيتين هو أحد الاعتبارات الهامة. في الشباب الذكور (بعد 0-2 أيام eclosion)، والحويصلات المنوية هي صغيرةوفارغة تقريبا، والخصيتين هي في القطر القصوى بهم (كما في الشكل 2). استخدام الذكور الأصغر سنا يضمن عددا كبيرا نسبيا من تقسيم خلايا سلالة الجرثومية (تمر إما الانقسام أو الانقسام الاختزالي) وأوائل طلائع منوية بعد الانتصافي. عندما تستخدم الذكور الأكبر سنا (بعد 3-5 أيام eclosion) للتشريح (الصورة لا تظهر)، والحويصلات المنوية هي أكثر وضوحا لأنها انتفاخ مع الحيوانات المنوية، والخصيتين هي أضيق مما كانت عليه في الذكور الأصغر سنا. كبار السن الذكور هي الأفضل إذا كان الهدف هو تصور الحيوانات المنوية الناضجة.

نظرا لتطور الأحداث أمر التنموية على طول الخصيتين ذبابة الفاكهة، وخلايا سلالة الجرثومية في مراحل معينة من الحيوانات المنوية يمكن إثراء استنادا إلى الموضع الذي تشريح تتمزق الخصيتين قبل سحق. على سبيل المثال، وتمزيق مفتوحة الخصية بالقرب من غيض القمي في (مستوى 1، الشكل 2B ') تعطي وفرة من الخلايا في المراحل الأولى من تكوين الحيوانات المنوية. الشكل 3ويظهر صورة المرحلة على النقيض من السكان ممثل أمهات المني (السهم الأبيض)، الخلايا المنوية الأولية في وقت مبكر (السهم الأصفر)، والخلايا المنوية الأولية في وقت متأخر (السهم الأحمر) التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة. بدلا من ذلك، وتمزيق مفتوحة الخصية في موقف أكثر قليلا القاعدية (مستوى 2، الشكل 2B ') ينتج في المقام الأول المنوية وطلائع منوية. الشكل 3B يظهر صورة المرحلة على النقيض من السكان الخلية ممثل الخلايا المنوية الأولية (السهم الأحمر)، طلائع منوية الجولة ( السهم الأخضر)، التمطيط طلائع منوية (السهم البرتقالي)، وحزم الحيوانات المنوية الناضجة (السهم الأزرق) التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة.

التصوير المرحلة على النقيض من الخصيتين يمكن استخدامها لوصف عيوب في ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية الناتجة عن طفرات في الجينات التي تعتبر بالغة الأهمية لهذه العملية. وطلائع منوية جولة لها مظهر النمطية جدا عندما ينظر من خلال المجهر مرحلة التباين. كل من هذه طلائع منوية غير ناضجة لديها واحد، phasالإلكترونية الخفيفة، نواة جولة واحدة، مرحلة مظلمة والركام الميتوكوندريا جولة تقريبا نفس حجم (تميزت السهم الأرجواني والسهم، على التوالي، في الشكل 3C). التباين في أعداد أو أحجام النسبية لهذه العضيات يمكن أن تنجم عن الانقسامات الانتصافي الشاذة (انظر المناقشة). ويرد مثال على مثل هذا عيب في الشكل 3D. طلائع منوية جولة من الذكور البالغين مع الطفرة من اربا (asun) تحتوي على الجينات الكلي الميتوكوندريا واحدة كبيرة وصغيرة متعددة النوى نتيجة لعيوب في الانقسام السيتوبلازمي والعزل الصبغي 29.

مضان المجهري هو طريقة فعالة أخرى لدراسة ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية. ويرد مثال لصورة الفلورسنت من الخلايا الثابتة من عينة الخصيتين ممرود في الشكل 4. تم الحصول على الخصيتين من الذباب المعدلة وراثيا معربا عن GFP-beta1-تويولين (نتاج bTub56D الجينات تنصهر في دورته C-ثالثامينال ينتهي إلى GFP وتحت سيطرة يو بي آي-p63E المروج اليوبيكويتين الجينات؛ هدية من H. أودا وY. أكياما-أودا، JT Biohistory قاعة البحوث، أوساكا، اليابان) من أجل تسمية الأنابيب الدقيقة (الأخضر في الشكل 4D، الرمادي في الشكل 4A). و immunostained الخصيتين المعدلة وراثيا باستخدام الأجسام المضادة ضد الماوس غاما تويولين (الأجسام المضادة الثانوية: مكافحة فأر CY3) بمناسبة centrosomes (الأحمر في الشكل 4D، الرمادي في الشكل 4C) ودابي الملطخة بمناسبة الحمض النووي (الأزرق في الشكل 4D، الرمادي في الشكل 4B). الخلايا في مراحل مختلفة من الحيوانات المنوية يمكن تحديدها بسهولة من خلال دراسة ترتيب الأنابيب الدقيقة، centrosomes، والكروموسومات (انظر أسطورة).

الشكل 1
فيقو إعادة 1. تخطيطي من الانقسامات الخلوية سلالة الجرثومية في الذكور ذبابة الفاكهة. تنتج كل انقسام الخلايا الجذعية خلية الركينى أن يخضع لأربع جولات من الانقسامات الإنقسامية مع الانقسام السيتوبلازمي غير مكتملة لإنتاج الكيس 16 خلية من الخلايا المنوية الأولية. كل منوية الأولية يخضع لمرحلة النمو لفترة طويلة قبل خضوعه الشطرين الانتصافي، ومرة ​​أخرى مع الانقسام السيتوبلازمي غير مكتملة، لتشكيل الكيس 32 خلية من الخلايا المنوية الثانوية المترابطة تليها الكيس 64 خلية من طلائع منوية الجولة مترابطة. وتتميز الجولة طلائع منوية من وجود نواة مرحلة خفيفة والكلي الميتوكوندريا مرحلة مظلمة (جنيبة النواة) من أحجام مماثلة. وطلائع منوية الجولة الخضوع استطالة والفردية لتشكيل الحيوانات المنوية الناضجة. ويمكن تحديد رؤساء الحيوانات المنوية الناضجة من نواة على شكل إبرة بهم. وتظهر نوى في الزرقاء؛ Nebenkerne (المجاميع الميتوكوندريا) باللون الأسود؛ السيتوبلازم في تان./ 50981fig1highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
وقد تم اختيار الرقم 2. الأجهزة الإنجابية للذكور ذبابة الفاكهة. الذكور البالغين الشباب (بعد 0-2 أيام eclosion) للتشريح. وتظهر الميكروسكوب ضوء الأعضاء التناسلية المعزولة في A و B مع الرسوم في المقابلة 'وباء'. (A، A ') ترتبط الخصيتين ذبابة الفاكهة (الأحمر) إزالتها من البطن من ذبابة الكبار الذكور إلى القناة قذفي (البني) عبر الحويصلات المنوية (الازرق). ويرد زوج من الغدد التبعي (الأخضر) أيضا إلى القناة قذفي. (B، B ') يجب فصل الخصيتين من الغدد ملحق بefore إعداد الشريحة. قبل سحق، المسيل للدموع مفتوحة الخصيتين في المستوى 1 إلى إثراء للخلايا في المراحل الأولى من تكوين الحيوانات المنوية؛ على مستوى 2 للحصول على السكان مختلطة من الانتصافي وخلايا سلالة الجرثومية بعد الانتصافي، وعلى المستوى 3 إلى إثراء للحيوانات المنوية الناضجة. شريط النطاق، 250 مم. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
الرقم 3. الصور المرحلة على النقيض من الخصيتين ذبابة الفاكهة. (A) يتم الافراج وفرة من الخلايا في المراحل الأولى من تكوين الحيوانات المنوية، بما في ذلك أمهات المني (السهم الأبيض)، الخلايا المنوية الأولية في وقت مبكر (السهم الأصفر)، والخلايا المنوية الأولية في وقت متأخر (السهم الأحمر) عادة عندما تمزق الخصية في المستوى 1 (انظر الشكللدى عودتهم 2B). اثنين أو أكثر ترابطا الخلايا (نتيجة الانقسام السيتوبلازمي غير مكتملة) غالبا ما تندمج تماما باعتباره قطعة أثرية من الإجراء السحق (رأس السهم الأصفر يمثل مزيجا من اثنين من الخلايا المنوية المبكرة). (ب) مزيج من الخلايا المنوية (السهم الأحمر يمثل منوية أولية في وقت متأخر) والخلايا بعد الانتصافي، بما في ذلك جولة طلائع منوية (السهم الأخضر)، طلائع منوية التمطيط (السهم البرتقالي يمثل الكيس جزئي)، وحزم الحيوانات المنوية الناضجة (السهم الأزرق)، وعادة ما تكون صدر عندما تمزق الخصية عند مستوى 2 (انظر الشكل 2B). (C، D) التصوير المرحلة على النقيض من الخصيتين ممرود يمكن استخدامها لتحديد بسهولة العيوب في الجولة طلائع منوية وفيرة والنمطية. من النوع البري طلائع منوية يكون نواة واحدة (مرحلة الضوء؛ تميزت السهم الأرجواني) تعلق على مجموع واحد الميتوكوندريا (مرحلة الظلام؛ تميزت السهم الأرجواني) متساوية في الحجم تقريبا (C). طلائع منوية من asunf02815الخصيتين تحتوي على نواة صغيرة متعددة واحدة الكلي الميتوكوندريا كبيرة نتيجة الانقسام السيتوبلازمي والأخطاء فشلت في العزل الصبغي (D). شريط النطاق، 10 مم. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 4
. الرقم 4 صورة نيون من الخصيتين ذبابة الفاكهة التحضيرات من الخصيتين ممرود معزولة عن الذكور معربا عن GFP الموسومة beta1-تويولين (الخضراء في D، الرمادي في A) كانت ثابتة وملطخة لكل من الحمض النووي (دابي؛ زرقاء في D، B في الرمادي) وcentrosomes (جاما تويولين الضد؛ الحمراء في D، C في الرمادي). والنطفة تقسيمcyte (رأس السهم الأبيض) يمكن أن ينظر إليه بجانب حقل كبير من طلائع منوية الجولة (السهم الأبيض يمثل الخلايا ممثل) ومجموعة من الحيوانات المنوية الناضجة (السهم الأصفر). شريط النطاق، 10 مم. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من أن الخصيتين من نوع البرية الذباب يمكن تحديدها بسهولة بسبب اللون الأصفر بهم (على النقيض من الأنسجة البيضاء المجاورة)، الخصيتين متحولة من الذباب الأبيض هم من البيض، وبالتالي يمكن أحيانا أن الخلط بينه وبين القناة الهضمية. سلالات معظم المعدلة وراثيا، التي عادة ما تكون في خلفية بيضاء، وأيضا الخصيتين الأبيض لأن الجينات صغيرة بيضاء وجدت في P-عناصر لا يشجع تراكم الصباغ في الخصيتين. عندما الخصيتين ذبابة الفاكهة لا يمكن تمييزها من خلال اللون، وتشمل غيرها من الميزات يمكن التعرف عليها بسهولة ولبي وقوع 12 في أزواج. نلاحظ أن بعض العمال تجد أنه من الأسهل لاستخدام الإبر تشريح بدلا من ملقط لعزل الخصيتين 12.

خطوة حاسمة من هذا البروتوكول هو إعداد الخصيتين ممرود. واحد هو نهج مفيد لتحوم الشريحة بضعة ملليمترات على مدى انزلاق الغطاء الذي يحتوي على الخصيتين من هذا القبيل أن الشركة المصرية للاتصالات سطحnsion من برنامج تلفزيوني على زلة تغطية يرفع الغطاء زلة تحتوي على الأنسجة نحو الشريحة. هذا الأسلوب يميل إلى تعطيل الخراجات وانتشرت الخلايا على الشريحة، مما يجعلها مثالية لتصوير الخلايا الفردية. بدلا من ذلك، للحفاظ على الخراجات كامل أو جزئي للتصوير، وحجم من برنامج تلفزيوني وضعت على زلة غطاء يمكن زيادة (4-5 إلى 7-8 مل مل).

إذا متحولة ذبابة الفاكهة معينة من الفائدة لا البقاء على قيد الحياة حتى سن البلوغ، ثم الخصيتين اليرقات أو يمكن بدلا من العذراء أن تستخدم لدراسة الحيوانات المنوية. في قسم البروتوكول، يتم توفير المراجع لعزل الذكور والمبايض pharate اليرقات؛ تعديل البروتوكول الأخير يمكن استخدامها لعزل الخصيتين اليرقات. الخطوات للتمزيق، سحق، وتلطيخ الخصيتين اليرقات أو العذراء هي أساسا مطابقة لتلك التي وصفها هنا لالخصيتين الكبار. حتى لو كان خط الطيران لدراستها يمكن أن تصل إلى مرحلة البلوغ، والعزلة من الخصيتين اليرقات أو العذراء قد يكون من الأفضل إذا كان زOAL هو الحصول على الخلايا في المراحل الأولى من تكوين الحيوانات المنوية. كما هو موضح في قسم نتائج ممثل، والخلايا في المراحل الأولى أو في وقت متأخر من الحيوانات المنوية يمكن إثراء حسب رغبة متفاوتة المستوى الذي تمزق الخصية قبل سحق.

يقدم على النقيض من المرحلة المجهري مقاربة بسيطة نسبيا لدراسة ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية. ميزة واحدة من المجهري على النقيض من المرحلة أكثر المناعية والمجهر الفلورسنت هو أن أقل وقت مطلوب لإعداد العينات. كل مرحلة من المراحل الرئيسية من الحيوانات المنوية يمكن تحديدها بسهولة باستخدام هذه التقنية 24. في الواقع، وقد استخدمت عدة مجموعات المرحلة على النقيض من التحليل المجهري للخصية كشاشة الأولية لوصف الظواهر من ذبابة الفاكهة الذكور العقيمة خطوط متحولة 21-23. خلال الانقسامات الانتصافي، يتم تقسيم الميتوكوندريا والكروموسومات بالتساوي على الخلايا الوليدة. ومن المزايا الفريدة لتكون المني في Drosophilلوالحشرات الأخرى ينطوي على تشكيل الكلي الميتوكوندريا (وجنيبة النواة) في طلائع منوية الجولة 24. طلائع منوية الجولة جنيبة النواة تحتوي على مرحلة مظلمة ونواة للتخلص ضوء حجم متساوية تقريبا في نسبة 1:1 (الشكل 3). قطر نواة تعكس محتوى الحمض النووي للطلائع منوية الجولة، لذلك أخطاء في العزل الصبغي أثناء الانقسام الاختزالي يمكن أن يؤدي إلى التباين في حجم النووية 33. تعطل الانقسام السيتوبلازمي الانتصافي التالية النتائج العزل الصبغي في الجولة طلائع منوية متعددة النوى التي فتيل Nebenkerne إلى واحد الكلي 34. وبالتالي، فإن أي اختلاف في نسبة 1:1 أو في حجم أو شكل جنيبة النواة والنواة في الجولة طلائع منوية يمكن الكشف عنها بسهولة بواسطة المجهر المرحلة على النقيض من الخصيتين الحية وغالبا ما يكون التشخيص من عيوب في الانقسام الاختزالي. اندماج خليتين أو أكثر ترابطا داخل الكيس مشتركة يحدث في كثير من الأحيان باعتباره قطعة أثرية من الإجراء السحق (الشكل 3A، رأس السهم الأصفر)، ونسبة 1:1 من نواة لNebenkerne، ومع ذلك، لا تزال تحتفظ.

المناعية الاستعدادات الثابتة من الخصيتين ذبابة الفاكهة يمكن أن يؤديها لتنظيم الخلايا التي تمر الحيوانات المنوية وكذلك لتقييم أنماط التعبير وتعريب التحت خلوية من البروتينات في المصالح. وقد وصفت مخطط المكرر لتصنيف مراحل ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية على أساس مورفولوجيا الخلوية، وتنظيم الكروماتين، والترتيبات أنيبيب خلايا الخصيتين immunostained لتويولين وملطخة الحمض النووي 19. ذبابة الفاكهة الخلايا المنوية الأولية هي خلايا كبيرة نسبيا، ويمكن مغزل الانتصافي أن يلاحظ بشكل واضح استخدام هذا النهج. Coimmunostaining لcentrosomes (على سبيل المثال، باستخدام أجسام مضادة ضد تويولين غاما) لا يمكن أن يؤديها للحصول على عرض أكثر دقة للهيكل المغزل الانتصافي. الفورمالديهايد هو مثبت مناسبة عندما المناعية الخصيتين مع مجموعة واسعة من antibodالمنشأ (على سبيل المثال، ومكافحة امين والسلسلة الثقيلة المضادة للداينين). مورفولوجية الأنابيب الدقيقة وcentrosomes، ومع ذلك، هو أفضل مع الحفاظ على الميثانول، وبالتالي، وعادة ما تستخدم الميثانول كما تثبيتي عند تنفيذ المناعية مع الأجسام المضادة ضد تويولين ألفا وغاما-تويولين.

إذا أجسام مضادة ضد بروتين من الفائدة غير متوفرة، يمكن أن تتولد خطوط ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا التي تعبر عن (على سبيل المثال. mCherry أو GFP) نسخة الموسومة fluorescently من البروتين كنهج بديل. توطين التحت خلوية من البروتين ثم يمكن قياسها عن طريق استخدام المجهر لعرض مضان GFP في الأعمال التحضيرية حية أو ثابت من الأنسجة، بدلا من ذلك، والأجسام المضادة لمكافحة GFP يمكن استخدامها للكشف عن البروتين الانصهار في عينات ثابتة. في الشكل 4، وتصور الأنابيب الدقيقة في إعداد الخصيتين الثابتة عبر مضان لا يتجزأ من GFP الموسومة beta1-تويولين (معبرا من التحوير تحت سيطرة غلوبأعرب حليف اليوبيكويتين المروج). بدلا من ذلك، الذباب المعدلة وراثيا في التعبير التي هي تحت سيطرة المروج الأنسجة محددة، على سبيل المثال، استخدمت المروج من الجينات beta2 تويولين لالخصيتين محددة التعبير 35. بدلا من ذلك، والتعبير عن بروتين من الفائدة يمكن أن يقتصر على خلايا معينة سلالة الجرثومية الذكور باستخدام نظام UAS-GAL4 36. نانو-GAL4 يمكن استخدامها للحث على التعبير عن بروتين تحت سيطرة المروج UAS داخل الخلايا النطفة، بينما بام-GAL4 يمكن استخدامها للحث على التعبير في غضون 37 المنوية. ويمكن أيضا ضربة قاضية من البروتين من الفائدة أن يتسبب في الخصيتين قبل إبداء دبوس بناء رني تحت سيطرة المروج UAS بالتزامن مع هؤلاء السائقين GAL4 37.

تطوير أساليب لتحليل الحية صورة ذبابة الفاكهة الخصيتين خلايا وسعت مجموعة من الأسئلة التي يمكن أن تكونتعالج باستخدام هذا النظام. أحداث الانقسام السيتوبلازمي الانتصافي يمكن تصور بواسطة المجهر المرحلة على النقيض من الخلايا المنوية تربيتها في جلطات الليفين داخل غرفة نضح من أجل إطالة عمر الخلايا 35. كان الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر من الخلايا المنوية ذبابة الفاكهة معربا عن بروتينات الموسومة fluorescently أيضا نهجا قوية (على سبيل المثال، لدراسة الجمعية المغزل الانتصافي) 38. استخدام الفحص المجهري متحد البؤر للتصوير حي لمرحلة سابقة، وتقسيم الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية الخصيتين ذبابة الفاكهة، أدى إلى زيادة فهم تنظيم الخلايا الجذعية. بالإضافة إلى مرحلة التباين والنهج المناعي المجهري الواردة في هذه الوثيقة، كما تم استخدام المجهر الإلكتروني انتقال على نطاق واسع لدراسة ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية 31.

بالإضافة إلى التصوير، والخصيتين ذبابة الفاكهة يمكن استخدامها كمصدر للمادة للتحليل سياسي البيوكيميائيةق. للتجارب immunoblotting، الخصيتين ذبابة تشريح يمكن المتجانس في 6X عينة العازلة (5 مل / الزوج الخصيتين)، مسلوق، وتحميلها مباشرة على هلام SDS-PAGE (~ 4 الخصيتين زوجا / حارة). على سبيل المثال، تم استخدام هذا النهج لتقييم مستويات مكونات داينين-dynactin في الخصيتين العديد من المسوخ ذبابة الفاكهة. مقتطفات الخصيتين يمكن بدلا من ذلك من قبل المجانسة الأنسجة العازلة تحلل في nondenaturing إذا كان من المهم للحفاظ على سلامة البروتين أعدت. على سبيل المثال، ذبابة الفاكهة الخصيتين وقد استخدمت في التجارب مقتطفات coimmunoprecipitation لإثبات وجود مجمعات البروتين مستقرة في هذا النسيج 41-43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر مايكل اندرسون لإقامة في المختبر لي هذه الطرق المقبولة لدراسة الحيوانات المنوية مع مشورة الخبراء من كارين هيلز. H. أودا وY. أكياما-أودا قدمت بسخاء γ-تويولين-GFP تطير الأوراق المالية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 منحة لLAL (GM074044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
  3. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
  4. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
  5. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
  6. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
  7. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
  8. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
  9. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
  10. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
  11. Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
  12. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
  13. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  14. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  15. Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
  16. Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
  17. McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
  18. Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
  19. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
  20. Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
  21. Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
  22. Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
  23. Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
  24. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
  25. Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
  26. Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
  27. Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
  28. Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
  29. Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
  30. Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
  31. Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
  32. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
  33. Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
  34. Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
  35. Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
  36. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  37. White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
  38. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
  39. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
  40. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  41. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
  42. Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
  43. Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).

Tags

بروتوكول الأساسية، العدد 83،
تحليل الخلوي الحيوانات المنوية: الأعمال التحضيرية لايف والثابتة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخصية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee,… More

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter