Summary
方法分离和制备果蝇睾丸样品（住和固定的），用于成像由相衬和荧光显微术在本文中描述。
Abstract
果蝇的是，已被广泛用于澄清各种生物过程的一个强大的模型系统。例如，无论是女性和果蝇雄性生殖系的研究已经极大地促进了减数分裂目前了解以及干细胞生物学。优良协议可用文献中的果蝇卵巢和睾丸3-12的分离和成像。本文中，对于夹层及其制备果蝇睾丸进行显微分析方法，并附带视频演示说明。一种协议，用于从成年男性的腹部隔离睾丸和准备用相差显微镜分析，以及一个协议，用于固定和免疫睾丸通过荧光显微镜分析活组织的幻灯片介绍。这些技术可以在果蝇的突变体，表现出D的特征被应用EFECTS在精子发生，以及在蛋白质的亚细胞定位的可视化。
Introduction
果蝇睾丸是许多生物过程，包括干细胞的调节，减数分裂和精子发育13-18的研究的理想模型系统。在精母细胞和其减数分裂主轴都很大，进行细胞学分析，因此方便，而且精子发生过程轻松细胞周期检查点方便突变在细胞周期基因的研究。不同类型的细胞可以在有序进展可以观察到沿睾丸的长度，并在精子发生任何干扰可以导致改变这个布局。这些功能结合果蝇的遗传工具提供了便利21-23精子的突变分析。
果蝇精子发生的各个阶段都得到了很好的界定。生殖细胞是同步发展的囊肿内通过精子沿睾丸的长阶段的进展顺序。在博个有丝分裂和雄性生殖细胞的减数分裂，胞质分裂发生不完全的，使得子细胞仍然被称为环管（ 图1）的细胞质桥相连。睾丸的顶端尖包含生殖系干细胞的细胞群，使人们产生精原细胞，经过4有丝分裂不完全胞质分裂，以产生初级精母细胞的16 - 细胞包囊。经过减数分裂S期，初级精母细胞进入G2，中〜90小时期间，细胞体积增大〜25倍的长期增长期。进展通过减数分裂Ⅰ和减数分裂II结果在次级精母细胞和精子细胞单倍体64细胞囊肿，分别为32个细胞囊肿的形成。不成熟的，圆形精子细胞进行广泛的细胞重塑，形成成熟的精子。减数分裂后的细胞，尤其是拉伸和束成熟的精子细胞，占据大部分睾丸的体积。
Ŧ功能性精子雌蝇他成功的运输要求男性生殖系统，它是由几个配对结构（睾丸，精囊和附腺）和单射精管的（ 图2）的不同部分之间的协调。精子在睾丸内产生和精囊，直到交配24内存储。附件包含腺体产生精液分泌细胞。精子从精囊迁移混有射精管，它同时连接到精囊和附腺内精液。精子和精液的该混合物最终泵送出阳入阴穿过射精管灯泡位于的雄性腹部25的后端飞的阴道。精液中的蛋白质是内中的代表称为精囊特殊器官长时间贮存精子必需的果蝇雌性26 roductive道。
可在科学文献中3-12优良方法果蝇睾丸中分离并在细胞精子发生的不同阶段的可视化。这里，我们通过介绍这些协议的例子，并附带视频演示添加到这个知识体。的协议，用于制备活睾丸样品相衬显微镜是根据先前描述的方法27。该协议为甲醛固定和睾丸的免疫染色也基于先前描述的方法28。本文所描述的方法已被用于在果蝇精子发生的许多研究（例如，以评估动力蛋白的作用，一个负端定向微管运动，在果蝇的精子）。
除了基本的协议中，提供了varyin建议克解剖，以丰富的精原细胞，精母细胞，或成熟的精子。不同的方法，用于处理睾丸，使得囊肿要么保持不变，或者根据需要被描述被打乱。在使用果蝇睾丸作为模型系统的优点在于，相比于果蝇卵母细胞和胚胎中，抗体和染料可以很容易穿透细胞之后从睾丸其扩散，并需要较少的洗涤步骤，因此，协议可以在一个比较来进行很短的时间。
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Protocol
1。睾丸解剖
- 使用CO 2流麻醉苍蝇在瓶子或小瓶中，并转移到飞盘。
- 使用小画笔在解剖显微镜下排序苍蝇，并收集所需的基因型果蝇雄性适当数量（取决于实验）。年轻男性（0-2日龄），非常适合在整个精子发生的早期阶段（ 如精原细胞，精母细胞和早期减数分裂后的精子细胞）研究细胞，而年龄稍大的男性（2-5日龄）是理想的研究细胞在精子发生过程的最后阶段（尤其是成熟的精子）。
- 使用镊子从各飞取下翅膀（防止苍蝇剥离时漂浮在液体）。
- 加〜500毫升磷酸盐缓冲盐水（130 mM氯化钠，7毫米的Na 2 HPO 4，3mM的的NaH 2 PO 4; PBS）中的一个降低到了聚硅氧烷涂覆的解剖盘上一个黑色的背景。其它水溶液已被成功地用于睾丸切除3。
- 点钳朝飞前，抓住它的胸部，并沉浸在PBS的下降。同时通过解剖显微镜观看，请使用另一双钳抓住并拉动外生殖器（位于腹腹部的后端深褐色结构）向后，直到它从腹部分离。在大多数情况下，睾丸，精囊，和附腺将被从腹部随着外生殖器取出，若否，插入一对镊子进入腹部和梳理出睾丸。
- 睾丸分开使用两对PBS的下降钳（ 图2），附属性腺及外生殖器。野生型睾丸很容易从周围的白色组织中的黄颜色区分。立即进行第2步。
- 从pharate男性（ 我睾丸隔离。辰蛹壳括起来），一个额外的步骤必须先执行，涉及从蛹壳清除飞;这一步之前已在别处31描述。进行清扫作为成人睾丸开始在步骤1.2。
- 从幼虫男性睾丸分离，分离果蝇幼虫卵巢32执行协议的修改。简言之，男性幼虫可从女性的幼虫由一对嵌在脂肪体的后部第三大而明确，椭圆形结构（幼虫睾丸）存在区别。为了隔离幼虫睾丸，部分一气之下打开雄性幼虫从腹部所描述的幼虫卵巢的隔离，隔离和睾丸周围脂肪体。立即进行第2步本文所述的协议;睾丸以后可以从脂肪体安装（步骤2.3或3.14）所描述的卵巢32之前，为了去除。
- 使用镊子轻轻放置于4-5毫升的PBS在方形盖玻片下降2-3对睾丸。需要注意的是睾丸数目与PBS体积之比，可能需要进行调整：液体过多会防止细胞被挤压时扩频正确的，而过少的液体将导致细胞爆裂压扁时。可选：使用硅化盖玻片，尽量减少组织坚持以盖玻片在步骤3.2。
- 使用镊子撕开每个睾丸在适当的位置，以最大化所需的生殖系细胞类型在编写存在（请注意，睾丸会多出从撕开区域到幻灯片中的挤压过程中的内容步。）为丰富的精原细胞和精母细胞，拆毗邻其顶端尖（级别1， 图2B）的睾丸。以丰富的精母细胞和精子细胞，撕裂在POS打开睾丸银行足球比赛稍有基础，以1级（2级， 图2B）。为了丰富更成熟的生殖细胞，撕开睾丸接近那里的曲率开始（一级3， 图2B）。
- 轻轻地放在显微镜载玻片在盖玻片壁球睾丸，不要手动施加压力作为单独盖玻片的重量足以获得适当压扁的样品。尽量避免捕获气泡。可选：使用聚-L-赖氨酸包被的载玻片，以促进组织的粘附，以在步骤3.2滑动。
- 立即使用制剂（理想的范围内制备的15分钟）通过相差显微镜观察活细胞;为转基因果蝇与睾丸的荧光标记蛋白的表达，活细胞可以通过荧光显微术在这个步骤检查。另外，进行固定和抗体染色（协议3）。
- 轻轻地用清洁瓦特从盖玻片下灯芯任何多余的液体IPE以便编写的扁平化，直至生殖细胞显然是关注的焦点。
3。甲醛固定和抗体染色
- 急速冷冻每片含挤压睾丸（从协议2）使用一对金属钳简单浸在液氮中（直到液氮停止冒泡）的幻灯片。
- 使用刀片立即取出盖玻片。
- 使用金属钳到载玻片转移至充满了冰冷的95％乙醇中的预冷的载玻片架（分光级，无甲醇）。储存在-20℃下进行10分钟。
- 使用金属钳到载玻片转移到填充有4％多聚甲醛的PBS中加0.1％的Triton X-100的PBS（PBS-T）的载玻片架。储存在室温下为7分钟。
- 用金属钳，以幻灯片转移到充满PBS载玻片架。在PBS中5分钟，在室温下洗涤载玻片。重复1X。通过丢弃的解决方案在载玻片架（执行所有清洗
- 弃去PBS中并浸泡在PBS-T中的幻灯片30分钟，在室温下透化细胞膜。
- 在PBS中5分钟，在室温下洗涤载玻片。重复2倍。
- 阻断步（可选）：载玻片浸泡在PBS中加1％的BSA在室温下45分钟。
- 使用疏水屏障用笔画出周围压扁组织（肉眼很容易看到），以限制该抗体溶液（每步3.9和3.11加）滑了一圈。组织应保持湿润在任何时候都同时进行免疫染色。
- 加30〜40毫升的第一抗体（稀释于PBS-T中，1:400至1:50，这取决于抗体），以组织的圆内。如果进行拦截，稀释的一抗在PBS-T +1％BSA中。抗γ-微管蛋白抗体（在图4中的中心体的染色）以1:100稀释。孵育在潮湿，黑暗的室内（ 例如 ，封闭的塑料盒用湿纸巾）2小时，在室温或4℃过夜°C。
- 在PBS中5分钟，在室温下洗涤3次滑动。如果进行阻断，在PBS-T洗涤两次，一次在PBS（5分钟，在室温下每个）。
- 加30-40毫升的荧光团标记的二抗（稀释在PBS中1:400）到组织和孵育在黑暗中1-2小时，在室温下进行。
- 在PBS中5分钟，在室温下洗涤载玻片。重复2倍。
- 加30-40毫升的DAPI溶液（0.2 mg / ml的PBS）中的圆圈内的组织。
- 轻轻将盖玻片在组织，同时注意避免诱捕气泡。如果气泡应该出现，小心周围的盖玻片移动，而不会破坏壁球，直到气泡从盖玻片的两侧逃跑。
- 使用清洁擦拭从幻灯片的边缘吸干多余的DAPI。
- 用透明指甲油密封盖玻片的幻灯片。
- 使用这种制剂在未来的3-4小时内，荧光显微镜，查看免疫染色细胞。对于较长期存储的幻灯片（高达至少几个星期），可以使用甘油为基础的硬安装介质用DAPI和存储载玻片在-20˚C。
- 或者，固定样品在甲醇代替甲醛（取决于抗原）。通过3.2步完成整个协议后，浸泡挤压睾丸幻灯片甲醇10分钟，在-20°C和继续步骤3.5起。
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Representative Results
一个正常解剖对果蝇雄性生殖器官的一个例子示于图2A中 。从成年雄性苍蝇的腹部取出睾丸，通常通过一对精囊（蓝色， 图2A'）连接到射精管（褐色， 图2A'）和一对副腺的（绿色， 图2A'） 。从最所附体组织，射精管和副腺的分离睾丸应分离并弃去，使得只有一对睾丸和精囊腺留（ 图2B和2B'）。精囊也可以被删除，只留下一对睾丸，以进行进一步的处理。
选择睾丸切除的成年男性的年龄是一个重要的考虑因素。在年轻男性（羽化后0-2天），精囊小而几乎是空的，而睾丸是在其最大直径（ 如图2）。用年轻的男性获得比较大的数除以生殖细胞（无论是进行有丝分裂或减数分裂）和早期减数分裂后精子细胞。当老年男性（羽化后3-5天）被用于清扫（图片未显示），精囊更为突出，因为它们膨出与精子和睾丸比年轻男性窄。老年男性是优选的，如果目标是可视化的成熟精子。
由于发育事件的沿果蝇睾丸的长度的有序进展，生殖系细胞在精子发生过程的特定阶段可以基于在该解剖睾丸前被挤压撕裂的位置来富集。例如，撕开睾丸附近的顶端尖（级别1， 图2B'）产生细胞精子发生的早期阶段丰盈。 图3A显示了以这种方式获得的精原细胞（白色箭头），早期初级精母细胞（黄色箭头），和后期初级精母细胞（红色箭头）的有代表性的种群的相位对比图像。或者，撕开睾丸在一个稍微基底位置（级别2， 图2B'）得到主要精母细胞和精子。 图3B示出初级精母细胞（红色箭头），圆精子细胞（具有代表性的细胞群的相位对比图像绿色箭头），伸长以这种方式获得的精子细胞（橙色箭头），和成熟的精子束（蓝色箭头）。
睾丸相衬成像可用于在果蝇精子从是此过程中的关键基因突变产生的表征缺陷。圆形精子细胞有一个非常刻板的外观通过相差显微镜观察时。这些不成熟的精子都有一个单一的，PHASE光，圆核和单，三相暗，圆线粒体大致相同的尺寸（紫色箭头和箭，分别标示在图3C）的总和。变化在这些细胞器的相对数量或尺寸可导致异常的减数分裂（见讨论）。这样的缺陷，例如，示于图3D。从成年男性的四分五裂（ASUN）基因突变的圆形精子细胞含有一个大的线粒体聚集和多个小的原子核如在胞质分裂和染色体分离29的缺陷造成的。
荧光显微镜是另一种强大的方法来研究果蝇的精子。固定的细胞从压扁的睾丸样品的荧光图像的一个例子示于图4。睾丸是从转基因果蝇表达bTub56D基因融合在其C-TER的GFP-β1-微管蛋白（产品获得MINAL端到GFP和下育碧-p63E泛素基因启动子的控制，以标签的微管（绿色图4D，灰度从H.小田和Y秋山织田，JT Biohistory研究馆，大阪，日本）的礼物在图4A）。转基因的睾丸被使用小鼠抗体的抗γ-微管蛋白的免疫染色（二次抗体：抗小鼠Cy3标记）来标记的中心体（红色， 如图4D所示 ，灰度级图4C）和DAPI染色以标记的DNA（蓝色图4D中，灰度在图4B）。细胞在精子发生的不同阶段，可以很容易地识别通过检查微管，中心体和染色体（见图例）的安排。
FIGU再1。 原理在果蝇雄性生殖细胞分裂，每个干细胞分裂产生的经过四个回合有丝分裂与胞质不完全，产生初级精母细胞的16单元囊肿下颚细胞。每个初级精母细胞经历一个延长的生长阶段不完全胞质分裂发生在两次减数分裂，再次，以形成相互连接的次级精母细胞随后相互连接的圆形精子64细胞囊肿的32细胞囊肿之前。圆精子细胞的特征在于相轻核的存在和类似大小的相暗线粒体集合体（在Nebenkern）。圆形精子细胞经过伸长率和个性化，以形成成熟的精子。成熟精子头部可通过其针形细胞核进行识别。原子核以蓝色显示; Nebenkerne（线粒体聚集）的黑色;细胞质中棕褐色。/ 50981fig1highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
被选定为解剖图2。生殖果蝇的男性器官。年轻的成年男性（羽化后0-2天）。孤立的生殖器官光显微照片显示在A和B与相应的一个卡通'和B'。 （A，A'） 果蝇睾丸（红色）从一个成年男性苍蝇的腹部取出是通过精囊（蓝色）连接到射精管（棕色）。一对附腺（绿色）的也连接到射精管。 （B，B'）的睾丸应该从附腺b隔开安伏滑动的准备。在此之前挤压，撕开睾丸处第1级到精子发生的早期阶段富集细胞; 2级，获得减数分裂和减数分裂后的生殖系细胞的混合群体，并在第3级，以丰富的成熟精子。比例尺，250毫米。 点击这里查看大图。
果蝇睾丸图3。相位对比图像。（一 ）细胞在精子发生的早期阶段，包括精原细胞（白色箭头），早期初级精母细胞（黄色箭头），和晚期初级精母细胞（红色箭头）的丰度通常发布当睾丸 被撕裂处第1级（参见图URE 2B'）。两个或两个以上相互联系的细胞（细胞分裂不完全的结果）往往完全融合作为的挤压过程（黄色箭头标志的融合两个早期精母细胞）的神器。 （二）精母细胞（红色箭头标示后期初级精母细胞）和后减数分裂的细胞，包括圆形精子细胞（绿色箭头），长形精子细胞（橙色箭头标记的部分囊肿），和成熟的精子束（蓝色箭头）的组合，通常是（ 见图2B'）时，睾丸被撕裂处第2级释放。 （C，D）相衬挤压睾丸的成像，可用于容易地识别在丰富的和一成不变的圆形精子细胞的缺陷。野生型精子细胞有一个细胞核（相轻，标志着紫色箭头）连接到单个线粒体聚集（相暗;标记紫色箭头）大致相等大小的（C）。从asunf02815精子睾丸包含多个小核和一个大的线粒体总额胞质分裂失败和错误中染色体分离（D）的结果。比例尺为10毫米。 点击这里查看大图。
。 果蝇精巢图4荧光图像压扁睾丸的准备工作从男性表达GFP标记素β1-微管蛋白（绿色D，在灰度A）中分离固定和染色两种脱氧核糖核酸（DAPI，蓝色D，灰度乙 ）和中心体（γ-微管蛋白抗体，红色的D，灰度C语言）。分界spermato核细胞（白箭头）可旁边圆形精子细胞（白色箭头标志代表细胞）和成熟精子（黄色箭头）一束的大视场可以看出。比例尺为10毫米。 点击这里查看大图。
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Discussion
虽然野生型果蝇的睾丸可以很容易由于其黄色（相邻近的白色组织）鉴定， 白色突变果蝇的睾丸是白色的，因此可以偶尔与肠道混淆。大多数转基因株系，这是典型的在一个白色的背景，也有白色的睾丸，因为在P -元素发现的迷你白基因不提倡色素积聚在睾丸。当果蝇睾丸不能用颜色加以区分，其它易于识别的功能包括对12的螺旋纹和发生。请注意，一些工人发现它更容易使用解剖针，而不是镊子分离睾丸12。
该协议的一个关键步骤是挤压睾丸的准备。一个有用的方法是将鼠标悬停在滑动几毫米在含有睾丸，使得盖玻片的表面特在PBS中的盖玻片上nsion抬起包含对幻灯片中的组织盖玻片。这种方法往往会破坏囊肿摊开细胞在幻灯片上，使其成为理想的成像单个细胞。或者，为了保持用于成像的全部或部分包囊，PBS的体积放置在盖玻片可以增加（从4-5毫升至7-8毫升）中。
如果感兴趣的特定突变的果蝇不会活到成年，然后幼虫或蛹的睾丸也可以被用于研究精子发生。在协议部分中，提供了用于pharate男性和幼虫的卵巢中分离的引用，后者协议的修改，可以用于分离幼虫睾丸。的步骤撕裂，挤压，和染色幼虫或蛹睾丸基本上是相同的，这里所描述的用于成年睾丸。即使飞线进行研究可以达到成年期，幼虫或蛹睾丸隔离可能是可取的，如果对GOAL是在精子发生的早期阶段获得的细胞。正如代表性的结果部分所述，细胞精子发生早期或晚期可富集随意通过改变其睾丸先于挤压撕裂的水平。
相差显微镜提供了研究果蝇精子发生是比较简单的办法。过免疫染色和荧光显微镜相衬显微镜的一个优点在于更少的时间是必需的，以制备样品。所有精子发生的主要阶段可以容易地确定使用这种技术24。事实上，一些团队曾使用睾丸相衬显微分析表征的果蝇雄性不育突变品系21-23的表型的主屏幕。在减数分裂，线粒体和染色体平衡分配到子细胞中。精子在Drosophil的一个独特功能一个和其他昆虫涉及圆形精子细胞24形成线粒体聚集（在Nebenkern）的。圆形精子包含一个相位暗Nebenkern和大致相等大小的以1:1的比例相轻核（ 图3）。原子核的直径反映了圆形精子细胞的DNA含量，所以在减数分裂过程中染色体分离错误可能会导致变异核的大小33。减数分裂的胞质以下染色体分离结果在多核圆形精子细胞破坏，其中Nebenkerne融合成一个单一的总和34。因此，在1:1的比率，或在圆精子细胞的大小或Nebenkern的形状和细胞核的任何变化可以很容易地通过活睾丸相差显微镜检测并往往是诊断的减数分裂缺陷。内的一个共同囊肿两个或多个互连的细胞融合经常发生的的挤压过程的人为现象（ 图3A黄色箭头），而1:1的比例原子核Nebenkerne的，但是，仍然保持着。
果蝇睾丸固定制剂的免疫染色可以执行阶段细胞进行精子以及评估的表达模式和利益蛋白质的亚细胞定位。一种改进的方案为果蝇精子发生的基于蜂窝的形态，染色质组织，免疫染色的微管蛋白和DNA染色的睾丸细胞的微管的安排上的阶段划分已经描述19。 果蝇初级精母细胞是相对大的细胞，并在减数分裂主轴可以使用这种方法可以清楚地观察到。 Coimmunostaining为中心体（例如，使用抗γ-微管蛋白）可以被执行，以获得纺锤体结构的更精确的图。甲醛是一种合适的固定剂具有广泛antibod的免疫染色睾丸时IES（例如，抗核纤层蛋白和抗动力蛋白重链）。微管和中心体的形态，但是，更好用甲醇保存，因此，甲醇执行与抗α-微管蛋白和γ-微管蛋白的免疫染色时，通常用作固定剂。
如果抗体对感兴趣的蛋白是不可用的，转基因果蝇系表达荧光标记（ 例如 。的mCherry或GFP）版本的蛋白质也可以作为一种替代方法。可替代地，抗GFP抗体可以用于检测该融合蛋白固定的样品中，所述蛋白质的亚细胞定位可以再通过显微镜可以看到的GFP荧光在组织中的活的或固定的准备来确定。在图4中，在一个固定的睾丸制备的微管通过GFP标记β1的微管蛋白的内源荧光（从转基因下的一个通配符的控制下表达被可视化盟友泛素表达的启动子）。或者，转基因果蝇中的表达是组织特异性启动子的控制之下，例如，对β2-微管蛋白基因的启动子已用于睾丸特异性表达35。或者，感兴趣的蛋白的表达可以通过使用UAS-Gal4的系统36被限制在特定的雄性生殖系细胞。 毫微秒 -Gal4的可用于诱导精原细胞内的UAS启动子的控制下的蛋白质的表达，而BAM-Gal4的可用于内精母细胞37诱导其表达。目的蛋白质的敲低也可通过表达与这些Gal4的驱动程序37结合一UAS启动子的控制下的RNAi发夹构建体诱导的睾丸。
对果蝇睾丸细胞的实时图像分析方法的发展，扩大了问题，可以将范围针对使用这个系统。减数分裂细胞分裂的事件可以由精母细胞在灌注腔内部的纤维蛋白凝块在为了延长电池35的寿命培养的相衬显微镜观察。 果蝇精母细胞表达荧光标记蛋白的时间推移共聚焦显微镜也得到了强大的方法（例如，学习减数分裂纺锤体组装）38。对于较早阶段的实时成像的使用共焦显微镜， 果蝇睾丸除以生殖系干细胞，导致了干细胞调节中增加的了解。除了 本文中所呈现的相衬和免疫荧光显微镜的方法，透射电子显微镜也被广泛用于研究果蝇精子31。
除了 成像， 果蝇睾丸可以用作材料的生化产品分析源秒。用于免疫印迹实验，解剖苍蝇睾丸可以匀浆在6X上样缓冲液（5毫升/睾丸对），煮，并直接上样到SDS-PAGE凝胶（〜4睾丸对/泳道）。例如，这种方法已被用来评估动力蛋白-dynactin组件中的一些突变体果 蝇睾丸的水平。睾丸提取物也可以通过均质的组织在非变性裂解液，如果它保持蛋白质的完整性是非常重要的准备。例如， 果蝇睾丸提取物已被用于在免疫共沉淀实验，以证明稳定的蛋白复合体在这个组织41-43的存在。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
作者要感谢迈克尔·安德森建立在李某实验室研究与精子从卡伦海尔斯专家建议这些接受的方法。 H.小田和Y秋山织田慷慨提供的γ-微管蛋白GFP飞股票。这项工作是由美国国立卫生研究院的R01授予LAL（GM074044）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish |
| PAP pen | Fisher Scientific | NC9888126 | Ted Pella #22309 |
| Clear nail protector | Wet n Wild | 7780235001 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-003 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 16% Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D-9542 | 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C |
| NaCl | Research Products International Corp. | S23020 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Kimwipes delicate task wipers | Fisher Scientific | S47299 | |
| BSA | Research Products International Corp. | A30075 | Molecular biology grade |
| Glass Coplin staining jar, screw cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 | |
| Single frosted microscope slides | Corning | 2948-75X25 | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Polysciences, Inc. | 22247-1 | Optional (to replace untreated microscope slides ) |
| Square cover glass | Corning | 2865-22 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Kimax Petri dish | Fisher Scientific | S31473 | Kimble #23060 10015 EMD |
| Forceps | Dumont | 52100-51S | Pattern 5 INOX |
| Stemi 2000-CS stereoscope | Carl Zeiss | ||
| Eclipse 80i | Nikon | ||
| Plan-Fluor 40X objective | Nikon | ||
| Axiophot | Carl Zeiss | ||
| Plan-Neofluar Ph2 40X objective | Carl Zeiss |
References
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