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Biology

Cytologique Analyse de la spermatogenèse: Préparatifs en direct et fixes de doi: 10.3791/51058 Published: January 20, 2014

Summary

Méthodes pour isoler et préparer Drosophila testicules échantillons (vivre et fixe) pour l'imagerie par contraste de phase et microscopie de fluorescence sont décrits ici.

Abstract

Drosophila melanogaster est un système de modèle puissant qui a été largement utilisé pour élucider une variété de processus biologiques. Par exemple, des études à la fois la femme et lignées germinales mâles de Drosophila ont grandement contribué à la compréhension actuelle de la méiose ainsi que la biologie des cellules souches. Excellentes protocoles sont disponibles dans la littérature pour l'isolement et l'imagerie de ovaires et les testicules 12.03 Drosophila. Ici, les méthodes pour la dissection et la préparation des testicules chez la drosophile pour l'analyse microscopique sont décrits avec une vidéo de démonstration d'accompagnement. Un protocole pour isoler les testicules de l'abdomen des mâles adultes et préparer des lames de tissu vivant pour une analyse par microscopie à contraste de phase ainsi que d'un protocole pour la fixation et la coloration immunologique testicules pour l'analyse par microscopie de fluorescence sont représentés. Ces techniques peuvent être appliquées à la caractérisation de mutants de drosophile qui présentent defects de la spermatogenèse, ainsi que dans la visualisation des localisations intracellulaires de protéines.

Introduction

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Testicules chez la drosophile sont un système modèle idéal pour l'étude de nombreux processus biologiques, y compris la régulation des cellules souches, la méiose, et le développement des spermatozoïdes 13-18. Les spermatocytes et leurs fuseaux méiotiques sont grandes et donc pratique pour l'analyse cytologique, et les points de contrôle du cycle cellulaire détendu pendant la spermatogenèse faciliter l'étude des mutations dans les gènes du cycle cellulaire. Différents types de cellules peuvent être observées dans la progression ordonnée le long de la longueur des testicules, et toute perturbation de la spermatogenèse peuvent conduire à des changements dans cet agencement global. Ces fonctionnalités, combinées à des outils génétiques chez la drosophile ont facilité l'analyse mutationnelle de la spermatogenèse 21-23.

Les étapes de la spermatogenèse chez la drosophile ont été bien définis. des cellules de la lignée germinale qui se développent de manière synchrone à l'intérieur des kystes progresser séquentiellement à travers les étapes de la spermatogenèse le long de la longueur du testicule. Pendant boe la mitose et la méiose divisions des cellules germinales mâles, la cytokinèse se produit de manière incomplète de telle sorte que les cellules filles restent reliés par des ponts cytoplasmiques dits canaux périphériques (Figure 1). L'extrémité apicale du testicule contient une population de cellules souches de lignée germinale qui donne lieu à des spermatogonies, qui subissent quatre divisions mitotiques avec la cytokinèse incomplète pour générer des kystes de 16 cellules de spermatocytes primaires. Après la phase S préméiotique, spermatocytes primaires entrent G2, une période de croissance prolongée de ~ 90 heures au cours de laquelle le volume cellulaire augmente ~ 25 fois. La progression à travers la méiose et de la méiose II I conduit à la formation de kystes de 32 cellules de spermatocytes secondaires et les kystes 64 cellulaires des spermatides haploïdes, respectivement. Les immatures, des spermatides rondes subissent un remodelage cellulaire pour former des spermatozoïdes matures. Cellules post-méiotiques, en particulier des faisceaux de s'allongeant et spermatides matures, occupent une grande partie du volume du testicule.

Til transports succès des spermatozoïdes fonctionnels à mouches femelles nécessite une coordination entre les différentes parties du système reproducteur masculin, qui est composé de plusieurs structures paires (les testicules, les vésicules séminales et des glandes accessoires) et un seul canal éjaculateur (Figure 2). Les spermatozoïdes sont produits dans les testicules et stockée dans les vésicules séminales jusqu'à l'accouplement 24. Les glandes accessoires contiennent des cellules sécrétoires qui produisent le liquide séminal. Le sperme migrer des vésicules séminales sont mélangés avec le liquide séminal dans le conduit éjaculatoire, qui est reliée à la fois les vésicules séminales et les glandes accessoires. Ce mélange de sperme et du liquide séminal est finalement pompé hors du mâle dans le vagin de la femelle voler à travers l'ampoule de la éjaculatoire situé à l'extrémité postérieure de l'abdomen mâle 25. Protéines dans le liquide séminal sont essentiels pour un stockage prolongé des spermatozoïdes dans les organes spécialisés appelés spermathèque de la répétitionvoies roductive de Drosophila femmes 26.

D'excellentes méthodes pour l'isolement de testicules de Drosophila et la visualisation de cellules à différents stades de la spermatogenèse sont disponibles dans la littérature scientifique 3-12. Nous ajoutons ici à cet ensemble de connaissances en présentant des exemples de ces protocoles avec une vidéo de démonstration d'accompagnement. Le protocole de préparation des échantillons de testicules vivants pour la microscopie à contraste de phase est basé sur un procédé 27 décrit précédemment. Le protocole pour la fixation de formaldehyde et immunomarquage des testicules est également basée sur un procédé 28 décrit précédemment. Les approches décrites ici ont été utilisées dans de nombreuses études de la spermatogenèse chez la drosophile (par exemple, pour évaluer le rôle de la dynéine, un moteur de microtubule-minus extrémité dirigée, pendant la spermatogenèse chez la drosophile).

En plus des protocoles de base, des suggestions sont prévus pour varying la dissection afin d'enrichir de spermatogonies, spermatocytes, ou des spermatozoïdes matures. Différentes méthodes de traitement des testicules tels que les kystes soit restent intacts ou sont perturbés au besoin sont décrits. Un avantage à utiliser des testicules de Drosophila en tant que système modèle est que, par rapport à des ovocytes et des embryons de Drosophila, des anticorps et des colorants peuvent facilement pénétrer dans les cellules après leur dispersion à partir des testicules, et moins d'étapes de lavage sont nécessaires, ainsi, les protocoles peuvent être effectuées en un temps relativement peu de temps.

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Protocol

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Une. Dissection des testicules

  1. Anesthésier les mouches dans une bouteille ou flacon à l'aide d'un flux de CO 2 et de les transférer à un pad à la mouche.
  2. Trier les mouches sous un microscope à dissection à l'aide d'un petit pinceau, et collecter un nombre approprié (en fonction de l'expérience) des mâles de Drosophila des génotypes souhaités. Les jeunes mâles (0-2 jours) sont idéales pour examiner les cellules à travers les premières étapes de la spermatogenèse (par exemple de spermatogonies, spermatocytes et spermatides début d'après-méiotiques), tandis que les mâles un peu plus âgés (2-5 jours) sont idéales pour examiner les cellules dans les dernières étapes de la spermatogenèse (en particulier, la maturité des spermatozoïdes).
  3. Utilisez une pince pour enlever les ailes de chaque vol (pour empêcher les mouches de flotter dans le liquide lors de la dissection).
  4. Ajouter ~ 500 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate (130 mM de NaCl, 7 mM de Na 2 HPO 4, 3 mM de NaH 2 PO 4; PBS) dans une goutte d'une dissection plat revêtu de silicone surun fond noir. Autres solutions aqueuses ont été utilisés avec succès pour testicules dissection 3.
  5. Point de forceps vers la partie antérieure de la mouche, le saisir par le thorax, et la plonger dans la chute du PBS. Lors de la visualisation au microscope de dissection, utiliser une autre paire de pinces pour saisir et tirer des organes génitaux externes (structure brun foncé situé à l'extrémité postérieure de l'abdomen ventral) en arrière jusqu'à ce qu'il se détache de l'abdomen. Dans la plupart des cas, les testicules, les vésicules séminales, et la glande accessoire seront retirés de l'abdomen avec les organes génitaux externes, sinon, insérer une seule paire de pince dans l'abdomen et démêler les testicules.
  6. Séparez les testicules glande accessoire et organes génitaux externes en utilisant deux paires de pinces dans les menus déroulants PBS (figure 2). Testicules de type sauvage sont faciles à distinguer des tissus blancs voisins par leur couleur jaune. Procéder immédiatement à l'étape 2.
  7. Pour isoler les testicules des mâles de pharate (i.. E enfermé dans la coque de nymphose), une étape supplémentaire doit être effectué d'abord qui consiste à retirer la volée de la coque de nymphose; cette étape a déjà été décrit ailleurs 31. Procéder à la dissection que pour les testicules adultes commençant à l'étape 1.2.
  8. Pour isoler les testicules des mâles larvaires, effectuer une modification d'un protocole pour isoler ovaires larves de Drosophila 32. Brièvement, les larves mâle peut être distingué de larves femelle par la présence d'une paire de grandes structures, ovales clairs (testicules larvaires) noyées dans le tiers postérieur du corps de la graisse. Pour isoler les testicules larvaires, écorcher partiellement ouvrir la larve mâle d'isoler les testicules et la graisse du corps entourant de l'abdomen comme décrit pour l'isolement des ovaires larvaires. Procéder immédiatement à l'étape 2 du protocole décrit ci-après, les testicules peuvent ensuite être retirés du corps de graisse juste avant le montage (étapes 2.3 ou 3.14) comme décrit pour les 32 ovaires.

  1. Utilisez une paire de pinces pour placer doucement 2-3 paires de testicules dans une goutte de 4-5 ml de PBS sur une place couvercle en verre glissement. Notez que le rapport du nombre des testicules au volume PBS peut être nécessaire d'ajuster: trop de liquide empêche les cellules de se propager correctement lorsque écrasé, alors que trop peu de liquide entraînera éclater leurs cellules quand écrasé. Facultatif: Utilisez le couvercle silicone glisse à minimiser l'adhérence de tissu pour couvrir glissement dans l'étape 3.2.
  2. Utilisez une paire de pinces à déchirer chaque testicule à une position appropriée de façon à maximiser la présence des types de cellules de la lignée germinale souhaités dans la préparation (à noter que le contenu du testicule sera la plupart du temps de sortie de la région déchirée sur la lame pendant l'écrasement étape.) pour enrichir les spermatogonies et spermatocytes, déchirer le testicule adjacent à son extrémité apicale (niveau 1, figure 2B). Pour enrichir les spermatocytes et spermatides, déchirer les testicules à une position légèrement base au niveau 1 (niveau 2, figure 2B). Pour enrichir les cellules de la lignée germinale plus matures, déchirer les testicules plus près de l'endroit où la courbure commence (niveau 3, figure 2B).
  3. Placez délicatement une lame de microscope en verre sur la lamelle à écraser les testicules, ne pas appliquer de pression manuellement le poids de la lamelle seul est suffisant pour obtenir un échantillon bien écrasé. Essayez d'éviter les bulles d'air. Facultatif: enduit utilisation poly-L-lysine lames de microscope pour promouvoir l'adhésion du tissu à glisser dans l'étape 3.2.
  4. Utiliser la préparation immédiatement (de préférence dans les 15 minutes suivant la préparation) pour observer les cellules vivantes par microscopie à contraste de phase, par des mouches transgéniques avec expression des protéines marquées par fluorescence dans les testicules, les cellules vivantes peuvent être examinés par microscopie de fluorescence à cette étape. Sinon, procéder à la fixation et coloration d'anticorps (protocole 3).
  5. Mèche doucement tout excès de liquide sous la lamelle en utilisant un nettoyage wipe pour permettre l'aplatissement de la préparation jusqu'à ce que les cellules germinales sont nettement au point.

3. Formaldéhyde fixation et coloration des anticorps

  1. Aligner geler chaque diapositive contenant les testicules écrasés (du protocole n ° 2) en utilisant une paire de pinces métalliques à plonger brièvement dans de l'azote liquide (azote liquide jusqu'à ce que le bouillonnement cesse).
  2. Retirer la lamelle immédiatement d'utiliser une lame de rasoir.
  3. Utilisez des pinces métalliques pour transférer des diapositives dans une grille coulissante en verre préalablement refroidi rempli de glace-froid à 95% d'éthanol (grade spectrophotométrie, sans méthanol). Conserver à -20 ° C pendant 10 min.
  4. Utiliser des pinces en métal de transférer les lames d'un porte-lame de verre rempli de formaldehyde à 4% dans du PBS plus 0,1% de Triton X-100 (PBS-T). Stocker à température ambiante pendant 7 min.
  5. Utilisez des pinces métalliques pour transférer des diapositives dans une grille coulissante en verre rempli de PBS. Laver les lames dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Répétez 1x. Effectuer tous les lavages en rejetant la solution dans la grille coulissante en verre (
  6. Rejeter le PBS et plongez-lames dans du PBS-T pendant 30 min à température ambiante pour perméabiliser les membranes cellulaires.
  7. Laver les lames dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Répétez 2x.
  8. L'étape (optionnelle) de blocage: Immerger les lames dans du PBS + 1% de BSA pendant 45 minutes à température ambiante.
  9. Utilisez un stylo de barrière hydrophobe pour dessiner un cercle sur la lame autour du tissu écrasé (facilement visible à l'oeil nu), afin de limiter les solutions d'anticorps (ajoutés dans les étapes 3.9 et 3.11). Le tissu doit être maintenue humide en tout temps pendant l'exécution immunologique.
  10. Ajouter 30 à 40 ml d'anticorps primaire (dilué dans du PBS-T, 1:400 à 01:50, en fonction de l'anticorps) de tissu à l'intérieur du cercle. Si le blocage a été effectué, diluer l'anticorps primaire dans du PBS-T plus 1% de BSA. L'anticorps anti-gamma-tubuline (pour la coloration des centrosomes dans la figure 4) a été dilué 1:100. Incuber dans un sol humide, chambre noire (boîte en plastique par exemple. Ferméavec des serviettes humides de papier) pendant 2 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
  11. Laver les lames dans du PBS pendant 5 min à manger 3x de température. Si le blocage a été effectué, laver deux fois dans du PBS-T et une fois dans du PBS (5 min à température ambiante chacun).
  12. Ajouter 30 à 40 ml d'un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore (dilué à 1:400 dans du PBS) pour le tissu et incuber dans l'obscurité pendant 1-2 h à température ambiante.
  13. Laver les lames dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Répétez 2x.
  14. Ajouter 30 à 40 ml de solution de DAPI (0,2 mg / ml dans du PBS) pour le tissu à l'intérieur du cercle.
  15. Placez délicatement une lamelle de verre sur le tissu, en prenant soin d'éviter la formation de bulles. Si des bulles d'air doivent apparaître, déplacer soigneusement autour de la lamelle sans détruire la courge jusqu'à ce que les bulles s'échapper par les côtés de la lamelle.
  16. Utilisez un chiffon de nettoyage pour effacer l'excès de DAPI des bords de la diapositive.
  17. Sceller la lamelle sur la lame à l'aide de vernis à ongles transparent.
  18. Utilisez cette préparationdans le 3-4 heures suivantes pour afficher les cellules immunocolorées par microscopie à fluorescence. Pour le stockage à long terme de diapositives (au moins jusqu'à plusieurs semaines), utiliser un support de montage disque à base de glycérol avec DAPI, et conserver les lames à -20 ˚ C.
  19. En variante, fixer les échantillons dans du methanol à la place du formaldehyde (en fonction de l'antigène). Après avoir terminé l'ensemble du protocole à l'étape 3.2, plongez les lames de testicules écrasées dans du méthanol pendant 10 min à -20 ° C et passez à l'étape 3.5 en avant.

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Representative Results

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Un exemple d'une paire convenablement disséqué des organes reproducteurs mâles de Drosophila est représenté sur la figure 2A. Testicules retirés de l'abdomen de la mouche mâle adulte sont généralement attachés à la conduite de l'éjaculation (brun, figure 2A ') et une paire de glandes accessoires (vert, figure 2A') via une paire de vésicules séminales (bleu, figure 2A ') . Pour séparer les testicules de la majeure partie du tissu somatique d'accompagnement, le conduit éjaculatoire et les glandes accessoires doit être détaché et mis au rebut de manière que seule la paire de testicules et vésicules séminales restent (figures 2B et 2B '). Les vésicules séminales peuvent également être retirés, ne laissant que la paire des testicules à traiter davantage.

L'âge des mâles adultes sélectionnés pour testicules dissection est une considération importante. Chez les jeunes hommes (0-2 jours après l'éclosion), les vésicules séminales sont petiteset à peu près vide, et les testicules sont à leur diamètre maximal (comme sur la figure 2). Utilisation de jeunes hommes assure un nombre relativement important de division cellules germinales (qui subissent la mitose ou de la méiose) et au début des spermatides post-méiotiques. Quand les hommes plus âgés (3-5 jours après l'éclosion) sont utilisés pour la dissection (image non représenté), les vésicules séminales sont plus importants parce qu'ils sont bourrées de sperme, et les testicules sont plus étroites que chez les jeunes hommes. Hommes plus âgés sont préférables si l'objectif est de visualiser des spermatozoïdes matures.

En raison de la progression ordonnée d'événements de développement le long de la longueur des testicules de Drosophila, des cellules de lignée germinale à des stades spécifiques de la spermatogenèse peuvent être enrichis en fonction de la position à laquelle a disséqué les testicules sont arrachés avant l'écrasement. Par exemple, déchirer les testicules près de son extrémité apicale (niveau 1, Figure 2B ') donne une abondance de cellules dans les premiers stades de la spermatogenèse. Figure 3Une montre une image en contraste de phase d'une population représentative de spermatogonies (flèche blanche), les spermatocytes primaires début (flèche jaune), et spermatocytes primaires tardifs (flèche rouge) obtenue de cette manière. Sinon, déchirant les testicules à une position légèrement plus basale (niveau 2, Figure 2B ') donne principalement des spermatocytes et spermatides. Figure 3B montre une image en contraste de phase d'une population de cellules représentant des spermatocytes primaires (flèche rouge), les spermatides rondes ( flèche verte), allongeant spermatides (flèche orange), et des faisceaux de spermatozoïdes matures (flèche bleue) obtenues de cette manière.

L'imagerie à contraste de phase des testicules peut être utilisé pour caractériser des défauts dans la spermatogenèse chez la drosophile résultant de mutations dans des gènes qui sont critiques pour ce processus. Les spermatides rondes ont un aspect très stéréotypée, observé à travers un microscope à contraste de phase. Chacun de ces spermatides immatures a un seul, les PVVIHe-light, noyau rond et un seul, phase sombre, agrégat ronde mitochondrial d'environ la même taille (marquée par une flèche pourpre et flèche, respectivement, à la figure 3C). Variation du nombre relatif ou tailles de ces organites peut entraîner des divisions méiotiques aberrantes (voir la discussion). Un exemple d'un tel défaut est représenté sur la figure 3D. spermatides rondes de mâles adultes avec mutation de la sépare (asun) gène contiennent un seul grand ensemble mitochondrial et plusieurs petits noyaux en raison de défauts de cytocinèse et la ségrégation des chromosomes 29.

La microscopie à fluorescence est une autre approche puissante pour étudier la drosophile spermatogenèse. Un exemple d'une image de fluorescence de cellules fixées provenant d'un échantillon des testicules écrasés est représenté sur la figure 4. Testicules ont été obtenus à partir de mouches transgéniques exprimant la GFP-beta1-tubuline (produit de gène bTub56D fusionnée à son extrémité C-terborne fin à la GFP et sous le contrôle du promoteur du gène de l'ubiquitine Ubi-P63F; don de H. Oda et Y. Akiyama-Oda, JT biohistoire recherche Hall, Osaka, Japon) afin de marquer les microtubules (vert sur ​​la figure 4D, en niveaux de gris la figure 4A). Les testicules transgéniques ont été immunocolorées en utilisant un anticorps de souris dirigé contre la gamma-tubuline (anticorps secondaire: anti-souris Cy3) pour marquer centrosomes (rouges dans la figure 4D, les niveaux de gris sur la figure 4C) et DAPI teinté pour marquer l'ADN (en bleu sur la figure 4D, les niveaux de gris sur la figure 4B). Cellules à différents stades de la spermatogenèse peuvent être facilement identifiés en examinant la disposition des microtubules, centrosomes et des chromosomes (voir légende).

Figure 1
Figu re 1. Schéma de divisions cellulaires germinales mâles de Drosophila. Chaque division de cellules souches produit une cellule goniaque qui subit quatre séries de divisions mitotiques avec cytokinèse incomplète pour produire un kyste de 16 cellules de spermatocytes primaires. Chaque spermatocytes primaires est soumis à une phase de croissance prolongée avant de subir les deux divisions méiotiques, de nouveau avec la cytokinèse incomplète, pour former un kyste de 32 cellules de spermatocytes secondaires interconnectées suivies d'un kyste 64 cellule de spermatides ronds interconnectés. spermatides rondes sont caractérisées par la présence d'un noyau de phase de lumière et un ensemble mitochondrial phase sombre (le Nebenkern) de tailles similaires. Les spermatides rondes subissent un allongement et l'individualisation pour former le sperme mûr. Les têtes des spermatozoïdes matures peuvent être identifiés par les leurs noyaux en forme d'aiguille. Noyaux apparaissent en bleu; Nebenkerne (les agrégats mitochondriaux) en noir; cytoplasme en tan./ 50981fig1highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Figure 2. Organes de reproduction des mâles de Drosophila. Mâles adultes jeunes (0-2 jours après l'éclosion) ont été sélectionnés pour la dissection. Microscope optique des organes reproducteurs isolés sont présentés dans A et B avec des dessins animés en A correspondant 'et B'. (A, A ') de Drosophila testicules (rouge) ont été retirés de l'abdomen d'une mouche adulte de sexe masculin sont reliés au conduit éjaculatoire (brun) via les vésicules séminales (en bleu). Une paire de glandes accessoires (vert) est également attaché à la conduite de l'éjaculation. (B, B ') Les testicules doivent être séparés des glandes accessoires bvant glisser préparation. Avant écraser, déchirer les testicules au niveau 1 pour enrichir des cellules à des stades précoces de la spermatogenèse; au niveau 2 pour obtenir une population mixte de la méiose et les cellules germinales post-méiotiques et au niveau 3 pour enrichir les spermatozoïdes matures. La barre d'échelle, 250 mm. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3
Figure 3. Des images de testicules de Drosophila contraste de phase. (A) Une abondance de cellules aux premiers stades de la spermatogenèse, y compris les spermatogonies (flèche blanche), les spermatocytes primaires début (flèche jaune), et spermatocytes primaires tardifs (flèche rouge) sont généralement libéré lorsque le testicule est déchiré au niveau 1 (voir la figureure 2B '). Deux ou plus interconnectés cellules (une conséquence de la cytokinèse incomplète) fusionnent souvent complètement comme un artefact de la procédure d'écrasement (flèche jaune marque la fusion de deux premiers spermatocytes). (B) Une combinaison de spermatocytes (flèche rouge marque la fin de spermatocytes primaires) et les cellules post-méiotiques, y compris des spermatides rondes (flèche verte), les spermatides en élongation (flèche orange marque kyste partielle), et des faisceaux de spermatozoïdes matures (flèche bleue), sont généralement libérée lorsque le testicule est déchiré au niveau 2 (voir la figure 2B). (C, D) à contraste de phase imagerie des testicules écrasés peut être utilisé pour identifier rapidement les défauts dans les rondes spermatides abondantes et stéréotypées. Spermatides de type sauvage ont un noyau (phase lumière; marqué par une flèche violette) attaché à un seul agrégat mitochondrial (phase sombre; marqué par la flèche violette) de taille à peu près égale (C). Spermatides de asunf02815testicules contiennent de multiples petits noyaux et une grande agrégat mitochondrial en raison de la cytocinèse et erreurs échoué dans la ségrégation des chromosomes (D). La barre d'échelle, 10 mm. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 4
.. Figure 4 image fluorescente des testicules chez la drosophile Préparations des testicules écrasés isolées des mâles exprimant la GFP-étiquetée beta1-tubuline (vert en D, en niveaux de gris en A) ont été fixées et colorées à la fois pour l'ADN (DAPI; bleue D, en niveaux de gris en B) et centrosomes (anticorps gamma-tubuline; rouges en D, en niveaux de gris en C). Un spermato divisantcyte (tête de flèche blanche) peut être vu à côté d'un grand champ de spermatides rondes (flèche blanche marque un cellules représentatifs) et un faisceau de spermatozoïdes matures (flèche jaune). La barre d'échelle, 10 mm. Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Discussion

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Bien que les testicules des mouches de type sauvage peuvent être facilement identifiés en raison de leur couleur jaune (en revanche, les tissus blancs des voisins), les testicules des mouches mutantes blancs sont blancs et donc peuvent parfois être confondus avec l'intestin. La plupart des souches transgéniques, qui sont généralement dans un fond blanc, ont également testicules blancs parce que le gène de mini-blanc trouvé dans les P-éléments ne favorise pas l'accumulation de pigment dans les testicules. Lorsque les testicules drosophile ne peuvent être distingués par la couleur, d'autres caractéristiques facilement identifiables comprennent leur motif en spirale et l'apparition en paires 12. Notez que certains travailleurs trouvent plus facile d'utiliser des aiguilles de dissection au lieu de pince à isoler les testicules 12.

Une étape cruciale de ce protocole est la préparation des testicules écrasés. Il peut être utile pour planer la lame de quelques millimètres sur la lamelle contenant les testicules de telle sorte que la surface de tension du PBS sur la lamelle soulève la lamelle contenant le tissu vers la diapositive. Cette méthode tend à perturber kystes et d'étaler les cellules sur la lame, le rendant idéal pour l'imagerie des cellules individuelles. Sinon, pour maintenir kystes entières ou partielles pour l'imagerie, le volume de PBS placé sur la lamelle peut être augmenté (4-5 ml à 7-8 ml).

Si un mutant Drosophila d'intérêt particulier ne survit pas à l'âge adulte, alors testicules larvaires ou des pupes peuvent également être utilisées pour étudier la spermatogenèse. Dans la section de protocole, des références sont fournies pour l'isolement des mâles et des ovaires pharate larvaires; une modification de ce dernier protocole peut être utilisé pour isoler des testicules larvaires. Les étapes pour déchirer, écraser, et coloration testicules larvaires ou des pupes sont essentiellement identique à celle décrite ici pour les testicules adultes. Même si la ligne de mouche à étudier peut atteindre l'âge adulte, l'isolement des testicules larvaires ou des pupes peut être préférable si le gut est d'obtenir des cellules dès les premiers stades de la spermatogenèse. Comme décrit dans la section des résultats représentatifs, les cellules dans les stades précoces ou tardifs de la spermatogenèse peuvent être enrichis comme souhaité en faisant varier le niveau auquel le testicule est déchirée avant l'écrasement.

Microscopie à contraste de phase offre une approche relativement simple pour étudier la drosophile spermatogenèse. Un avantage de la microscopie à contraste de phase sur immunologique et microscopie à fluorescence est que moins de temps est nécessaire pour préparer les échantillons. Toutes les grandes étapes de la spermatogenèse peut être facilement identifiée en utilisant cette technique 24. En effet, plusieurs groupes ont utilisé en contraste de phase de l'analyse microscopique des testicules comme un écran primaire pour caractériser les phénotypes de Drosophila stérilité mâle lignées mutantes 21-23. Au cours de la méiose divisions, les mitochondries et les chromosomes sont également divisées à des cellules filles. Une caractéristique unique de la spermatogenèse chez Drosophila et d'autres insectes implique la formation d'un agrégat mitochondrial (le Nebenkern) dans les spermatides ronds 24. spermatides rondes contiennent un Nebenkern de phase sombre et un noyau de phase-lumière de taille à peu près égale dans un rapport de 1:1 (Figure 3). Le diamètre du noyau reflète la teneur en ADN des spermatides ronds, de sorte que des erreurs dans la ségrégation des chromosomes pendant la méiose peut conduire à la variabilité de la taille nucléaire 33. Perturbation de la cytokinèse méiotique résultats suivants chromosome de ségrégation dans les spermatides rondes multinucléées dans lequel le fusible Nebenkerne en un seul agrégat 34. Par conséquent, toute variation de la proportion de 1:1 ou de la taille ou la forme du Nebenkern et le noyau dans les spermatides rondes peut être facilement détecté par microscopie à contraste de phase des testicules en direct et est souvent de diagnostic de défauts de la méiose. Fusion de deux ou plusieurs cellules interconnectées à l'intérieur d'un kyste commun se produit fréquemment comme un artefact de la procédure d'écrasement (figure 3A, Tête de flèche jaune), le rapport de 1:01 à noyaux Nebenkerne, cependant, est toujours maintenue.

Immunomarquage de préparations fixes de testicules drosophile peut être effectué à l'étape des cellules de la spermatogenèse subissant ainsi que pour évaluer les modèles d'expression et localisations intracellulaires de protéines d'intérêt. Un système raffiné de classification des stades de la drosophile spermatogenèse en fonction de la morphologie cellulaire, l'organisation de la chromatine, et les arrangements des microtubules des cellules des testicules immunocolorées pour la tubuline et de l'ADN-souillé a été décrite 19. Drosophila spermatocytes primaires sont relativement grandes cellules, et les broches de la méiose le peut être observé clairement en utilisant cette approche. Coimmunostaining pour centrosomes (par exemple, en utilisant des anticorps contre les gamma-tubuline) peut être effectuée pour obtenir une vue plus précise de la structure de fuseau méiotique. Le formaldéhyde est un fixateur approprié quand immunomarquage testicules avec un large éventail de antibods (par exemple, anti-lamine et la chaîne lourde anti-dynéine). La morphologie des microtubules et des centrosomes, cependant, est mieux préservé avec du methanol, d'où le methanol est généralement utilisé comme fixateur lors de la réalisation de la coloration immunologique avec des anticorps contre l'alpha-tubuline et de la gamma-tubuline.

Si des anticorps contre une protéine d'intérêt ne sont pas disponibles, les lignes de Drosophila transgéniques exprimant une version fluorescente marqué (par exemple. MCherry ou GFP) de la protéine peuvent être générés comme une approche alternative. La localisation subcellulaire de la protéine peut ensuite être déterminée en utilisant un microscope pour visualiser la fluorescence de la GFP dans des préparations vivantes ou fixées de tissu, en alternative, des anticorps anti-GFP peut être utilisé pour détecter la protéine de fusion dans des échantillons fixes. Sur la figure 4, les microtubules dans une préparation fixée testicules ont été visualisés par l'intermédiaire de la fluorescence intrinsèque de la GFP-étiqueté beta1-tubuline (exprimé à partir d'un transgène sous le contrôle d'un globallié exprimé promoteur de l'ubiquitine). En variante, les mouches transgéniques dans lesquelles l'expression est sous le contrôle d'un promoteur spécifique d'un tissu, par exemple, le promoteur du gène de la bêta-2-tubuline ont été utilisées pour l'expression spécifique des testicules-35. En variante, l'expression d'une protéine d'intérêt peut être limité à des cellules spécifiques de la lignée germinale mâle en utilisant le système UAS-Gal4 36. Nanos-Gal4 peut être utilisé pour induire l'expression d'une protéine sous le contrôle d'un promoteur UAS sein spermatogonies, tout en bam-Gal4 peut être utilisé pour induire son expression dans les spermatocytes 37. Effet de choc d'une protéine d'intérêt peut également être induite dans les testicules, en exprimant un produit d'assemblage d'ARNi en épingle à cheveux sous le contrôle d'un promoteur UAS en conjonction avec ces pilotes Gal4 37.

Le développement de méthodes d'analyse en direct l'image des cellules de testicules de drosophile a élargi la gamme de questions qui peuvent êtreadressée en utilisant ce système. Les événements de la cytokinèse méiotique peuvent être visualisées par microscopie à contraste de phase des spermatocytes cultivées dans des caillots de fibrine à l'intérieur d'une chambre de perfusion afin de prolonger la durée de vie des cellules 35. Time-lapse microscopie confocale de spermatocytes Drosophila exprimant des protéines par fluorescence taggés a également été une approche puissante (par exemple, pour étudier l'assemblage du fuseau méiotique) 38. L'utilisation de la microscopie confocale pour l'imagerie en direct d'un stade plus précoce, les division des cellules souches germinales des testicules chez la drosophile, a conduit à une meilleure compréhension de la régulation des cellules souches. Outre les contraste de phase et immunofluorescence approches de microscopie présentées ici, la microscopie électronique à transmission a également été largement utilisée pour étudier la spermatogenèse chez la drosophile 31.

En plus de l'imagerie, les testicules de Drosophila peuvent être utilisés comme une source de matériau pour analysi biochimiques. Pour les expériences de immunoblot, les testicules de mouches disséquées peuvent être homogénéisées dans 6x tampon d'échantillon (5 ml / testicules paire), bouillis, et directement chargés sur un gel SDS-PAGE (~ 4 testicules paires / voie). Par exemple, cette approche a été utilisée pour évaluer les niveaux de composants dynéine Dynactin dans les testicules de plusieurs mutants de drosophile. des extraits de testicules peuvent en variante être préparés par homogénéisation de tissu dans un tampon de lyse non dénaturante, si il est important de maintenir l'intégrité de la protéine. Par exemple, Drosophila testicules extraits ont été utilisés dans des expériences de co-immunoprécipitation de démontrer la présence de complexes protéiques stables dans ce tissu de 41 à 43.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Michael Anderson pour établir dans le laboratoire Lee ces méthodes reconnues pour l'étude de la spermatogenèse des conseils d'experts de Karen Hales. H. Oda et Y. Akiyama-Oda généreusement fourni le γ-tubuline-GFP mouche stock. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH R01 à LAL (GM074044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

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Cytologique Analyse de la spermatogenèse: Préparatifs en direct et fixes de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testicules
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Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).More

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

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