Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Cecal ligatur og Punktering-induceret sepsis som en model til at studere Autophagy i mus

Published: February 9, 2014 doi: 10.3791/51066
Automatic Translation
1,3, 1, 2, 2, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Renal Division, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3First Department of Critical Care Medicine and Pulmonary Services, University of Athens Medical School, Evangelismos Hospital, Athens, Greece

Summary

Eksperimentel sepsis kan induceres i mus ved hjælp af den cecal ligatur og punktering (CLP) metode. Nuværende protokoller for at vurdere autofagi in vivo i forbindelse med CLP-induceret sepsis præsenteres her: En protokol til måling autofagi anvendelse af (GFP)-LC3 mus og en protokol til måling af autophagosome dannelse ved elektronmikroskopi.

Abstract

Eksperimentel sepsis kan induceres i mus ved anvendelse cecal ligatur og punktering (CLP)-metoden, som forårsager polymikrobielle sepsis. Her er en protokol, forudsat at fremkalde sepsis af varierende sværhedsgrad i mus ved hjælp af CLP teknik. Autophagy er en grundlæggende væv reaktion på stress og patogeninvasion. To nuværende protokoller for at vurdere autofagi in vivo i forbindelse med eksperimentelle sepsis også præsenteret her. (I) Transgene mus, som udtrykker grønt fluorescensprotein (GFP)-LC3 fusionsprotein underkastes CLP. Lokaliseret forbedring af GFP signal (puncta), som analyseret enten ved immunohistokemiske eller konfokale assays kan anvendes til at påvise øget autophagosome dannelse og dermed ændret aktivering af autofagi vej. (II) Udvidet autophagic vacuole (autophagosome) dannelse pr vævsareal (som en markør for autofagi stimulation) kan kvantificeres ved hjælp af elektronmikroskopi. Studiet af autophagic reaktioner sepsis er en kritisk component at forstå de mekanismer, som væv reagerer på infektion. Forskningsresultater på dette område kan i sidste ende bidrage til at forstå patogenesen af ​​sepsis, som repræsenterer et stort problem i intensivbehandling medicin.

Introduction

Sepsis, systemisk inflammatorisk respons på infektion, er en førende dødsårsag i kritisk-syge patienter 1. Intra-abdominale infektioner, der ofte fører til polymikrobiale sepsis, tegner sig for 20% af sepsistilfælde, som har en betydelig dødelighed på op til 60% 2. Sepsis-associeret dødelighed primært skyldes multi-organsvigt med fiasko efterfølgende orgel 3,4. Yderligere undersøgelse af patogene mekanisme af denne sygdom er et presserende behov for at fremme udviklingen af ​​nye og mere effektive behandlingsformer.

Cecal ligatur og punktering (CLP)-metoden er en almindeligt anvendt procedure for modellering sepsis in vivo. Som coecum er fuld af bakterier, dets punktur resulterer i polymikrobielle peritonitis, translokation af bakterier i blodet (bakteriæmi), septisk shock, multi-organsvigt og i sidste ende død 5. Det er generelt accepteret, at CLP afspejler den kliniskevirkeligheden mere præcist end tidligere teknikker, såsom injektion af endotoxin eller endda oprensede bakterier i gnavere Således CLP betragtes som den gyldne standard (omend ikke uden begrænsninger) 6 for den eksperimentelle induktion og dermed undersøgelse af patogenesen af sepsis. I denne monografi beskriver vi protokoller, designet til at vurdere, om patogene mekanismer sepsis omfatter autofagi.

Autophagy, en evolutionært bevaret cellulær proces, letter omsætningen af beskadigede proteiner og organeller, såsom mitokondrier og spiller en vigtig rolle ved udskillelsen af intracellulære patogener, herunder bakterier 7,8. Under autophagy, er cytosoliske proteiner eller organeller afsondret i dobbelt membran-bundne vesikler kaldet autophagosomes, som efterfølgende leveres til lysosomerne for nedbrydningen 9. En række proteiner er blevet identificeret som mammale homologer af autophagy-relaterede gener (ATG),oprindeligt identificeret i gær, der regulerer processen autofagi. Omdannelsen af mikrotubuli-associeret protein-1 let kæde 3B (LC3B) (homolog af Atg8) fra LC3B-I (fri form) til LC3B-II (phosphatidylethanolamin-konjugeret form) er et stort skridt i autophagosome formation 9. Autophagic dysfunktion er forbundet med aldring og menneskelige sygdomme, herunder kræft og neurodegenerative sygdomme 10. Desuden autofagi påvirker medfødte og adaptive immunitet, såsom antigen-præsentation, lymfocyt udvikling og cytokinsekretion af immunceller 8. Det synes således rimeligt, at autofagi også kan spille en rolle i systemisk inflammatorisk respons på infektion (dvs. i sepsis).

Til dato er blevet beskrevet flere metoder til at vurdere den rolle autophagy i vævsskade in vivo. Disse omfatter anvendelse af grønne fluorescensprotein (GFP)-LC3 udtrykkende mus og kvantificering af autophagosomes i væv ved elektronmikroskopi (disse to metoder er beskrevet i denne monografi). Yderligere metoder omfatter kvantificering af autophagic protein udtryk i vævshomogenater, og analysen af autophagic flux (som beskrevet andetsteds) 11-13. Målet med denne gennemgang er at give nuværende protokoller til vurdering autofagi in vivo i forbindelse med eksperimentel sepsis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Den Institutional Animal Care og brug Udvalg på Brigham and Women 's Hospital / Harvard Medical School-området godkendt følgende procedurer.

1.. Cecal ligatur og Puncture

Brug mus af den samme baggrund (C57BI / 6), mand, 8-10 uger gamle. Hunmus er mere modstandsdygtige end mænd mod sepsis-induceret dødelighed. Mus ældre end 8 uger producerer mindre variable resultater end yngre mus i form af overlevelse efter CLP. Ca. N = 10 mus pr sammenlignet gruppe bør anvendes til overlevelse analyse. N = 3-5 mus er passende for autophagy assays.

  1. Brug sterile små kirurgiske instrumenter (nemlig skalpel, saks og stumpe anatomiske pincet), der skal være egnet til gnaver kirurgi.
  2. Forbered anæstesi blanding: Til 7,95 ml PBS tilsættes 150 ul Xylazin (AnaSed injektion 100 mg / ml) og 700 ul Ketamin (Ketaset   CIII, 100 mg / ml).
  3. For at sikre aseptiske forhold under proceduren, bære handsker, ansigtsmaske og kirurgisk kjole.
  4. Dyr vejes. Bedøver dem ved at indsprøjte intraperitonealt (ip) en blanding nævnt i trin 3 i en dosis på pi (10x kropsvægt i g). For eksempel, for en mus vejer 22 g, indgives 10x22 = 220 ul af anæstesiblandinger. Således er de endelige doser af xylazin og ketamin er 17 og 80 mg / kg legemsvægt, henholdsvis. Sørg for, at anæstesi er tilstrækkelig, ingen bøjning af ekstremitet bør produceres efter tå knivspids Bemærk:. Brug oftalmologiske salve på øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
  5. Placer dyr på en ren arbejdsflade på ryggen. Haler og bagpoterne er orienteret mod investigator. Desinficere bugen ved hjælp af alkohol (70% EtOH opløsning) Bemærk:. Kirurgisk område bør helt barberet, for at undgå forurening af såret ved kontakt medpels. Også optimalt en cirkulerende varmt vand pad bør anvendes til at opretholde normotermi af bedøvede mus under operationen.
  6. Ved hjælp af en skalpel, lave en lille langsgående hudincision parallel og ca 1 cm tilbage at midterlinjen. Må ikke trænge endnu i bughulen. Brug en lille saks til at udvide det oprindelige snit.
  7. Identificer mavemuskler og dissekere dem at få adgang ind i bughulen.
  8. Ved at bruge stumpe anatomiske pincet, identificere coecum og flytte den ud af bughulen. Vær forsigtig med ikke at beskadige mesenteriale blodkar (dette kan føre til dødbringende blødning).
  9. Ligere 60% af coecum at opnå en mid-grade sepsis. Ligering lig med eller mere end 75% af coecum generelt resulterer i høj kvalitet sepsis, mens ligering lig med eller mindre end 25% af coecum resulterer i lav kvalitet sepsis. Vær omhyggelig med ikke at ligere ileocecal ventil (dette kunne blokere tarm kontinuitet).
  10. Ved hjælp af en21 G nål perforere coecum af en gennem-og via punktur (to huller) tæt på ligering. Retningen af ​​perforeringen skal ske fra mesenteriske til anti-mesenteriske side af coecum. Vær forsigtig med ikke at punktere mesenteriale blodkar.
  11. Fjern nålen. Forsigtigt presse ligeret coecum at bekræfte passage gennem de to huller, og kun en lille mængde af afføring skal ekstruderes gennem dem.
  12. Flyt ligerede og punkteret coecum i bughulen.
    Bemærk: For sham mus, springe trin 1,10-1,12.
  13. Brug silke kirurgiske suturer 6-0 med skærende nål til at lukke abdominal muskulatur. Brug silke kirurgiske suturer 6-0 med skærende nål til at lukke abdominal hud.
  14. Injicer 1 ml forvarmet (37 ° C) normalt saltvand ip til at erstatte varme og hydrering tabt under proceduren. Placer mus under en varmelampe indtil deres genoplivning Bemærk:. Optimalt et sikrere anordning opvarmning (sulm som cirkulerende varmt vand pad) kan anvendes i stedet for en varmelampe.
  15. Postoperativt injicere buprenorphin (0,05 mg / kg legemsvægt sc.) For at opnå analgesi Bemærk:. Et dyr må ikke efterlades uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Et dyr, der har gennemgået en kirurgisk behandling bør ikke sendes tilbage til virksomheden af ​​andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
  16. Placer dyr tilbage i deres bure med ubegrænset adgang til mad og vand. Mus vil blive aflives, når de bliver døende (indikeret ved kliniske tegn som manglende bevæge sig, når rørt eller cyanose). Tjek mus hver 4 timer for at undgå at have dem dør før eutanasi.

2. Tissue Høst og fiksering

  1. Forbered en 4% paraformaldehyd (PFA) løsning: Til 889 ml PBS tilsættes 111 ml 37% PFA.
  2. Sacrifice mus ved hjælp af enten CO 2-induceret narkose eller ketamin / xylazin solution i en høj dosis.
  3. Immobilisere musene på en ren arbejdsflade. Spray den abdominale og thorax hud med 70% EtOH løsning til at desinficere det.
  4. Brug en skalpel og en lille saks til at fjerne den abdominale og thorakale hud samt huden omfatter trakeal område.
  5. Reveal luftrøret ved at fjerne dens omgivende væv (muskler og bindevæv).
  6. Placer en sutur (uden at skære nål) omkring luftrøret. Den skal ikke strammes endnu.
  7. Brug en lille perifer venekateter (20 G) til 'intubationstid' luftrøret. Vær forsigtig under kateteret for at undgå trakeal tåre. Bemærk, at den største diameter af luftrøret er lige under ringbrusk.
  8. Spænd suturen omkring luftrøret / kateteret. Fjern kanylen efterlader kun plastikkanylen af ​​kateteret ind i luftrøret. Needle fungerede kun som en guide-wire til indsættelse plastikkanylen.
  9. Efter at have sikret plastikkanylen i luftrøret, klippe the mavemuskulaturen åbne maven og afsløre mellemgulvet.
  10. Ved hjælp af en nål, punktere membranen til at producere pneumothorax (dvs. indføring af luft i pleurahulen). Lunger bør derefter sammen.
  11. Ved hjælp af en lille saks, fjerne mellemgulvet, skære langs brystbenet (sternotomien), fjern brystkassen og afslører hjertet og lungerne.
  12. Gennem plastikkanylen indsat i luftrøret fastsætte lungerne med formaldehyd opløsning under 30 cm H2O tryk.
  13. Fjern lungerne og placere dem i 4% PFA i 24 timer og efterfølgende i 70% EtOH opløsning, indtil forarbejdningen.
  14. Identificere og fjerne hjerte, lever og nyrer. På samme måde, skal du placere dem i 4% PFA i 24 timer og efterfølgende i 70% EtOH løsning, indtil forarbejdningen.

3. GFP Mus og visning af GFP Slides

  1. Udfør CLP og simuleret operation på GFP-LC3 mus som beskrevet i trin 1, og postoperativ procedures som beskrevet i trin 2 i protokollen.
  2. Integrer væv (nemlig lunger, hjerte, lever og nyrer) i paraffin og skær dem i serielle 5 um snit.
  3. Når den er klar til GFP-farvning, inkuberes ved 60 ° C i 30-60 min, indtil paraffin smelter og væv synes gennemsigtig.
  4. Afparaffiner med standard gradueret serie af xylen eller xylen erstatninger, 5 min xylen 1, xylen 2 og xylen 3 derefter 3 min inkubationer i gradueret serie af EtOH: 100%, 95%, 75%, og derefter skylles i destilleret vand.
    Bemærk: Når Afparaffinering undgå væv udtørring, hvilket øger prøve baggrund.
  5. Udfør antigengenfinding hjælp citronsyre-buffer (10 mM natriumcitrat syre, 0,05% Tween 20, pH 6,0) ved mikrobølgebehandling i 10-20 min. Vær omhyggelig med at udskifte buffer jævne mellemrum for at undgå væv udtørring.
  6. Opløsningen afkøles i 20 minutter på bænken til at fuldføre antigen hentning.
  7. Vask 2-3x med PBS. Fjern overskydende buffer og transfer glider fra rack til vandret position på et dias boks eller andet fugtigt kammer for at forhindre udtørring.
  8. Blok 45-60 minutter ved stuetemperatur med 10% normal donkey serum (også 5% bovint serumalbumin eller fortrinsvis serum fra dyret, hvor det sekundære antistof blev genereret) i PBS.
  9. Inkuber prøver i primær GFP antistof ved 1:100 fortynding i PBS natten over ved 4 ° C i befugtet kammer. Forsigtigt på små stykker af Parafilm vævet med antistof for at fremme ensartet kontakt med vævet og forhindre fordampning.
    Bemærk: Resterende trin udføres ved stuetemperatur.
  10. Vask 5x med PBS for at fjerne overskydende primære antistof. Inkuber med sekundært antistof 1:500-1:1,000 i PBS i 1 til 2 timer ved stuetemperatur.
  11. Vask 5x med PBS for at fjerne overskydende sekundært antistof. Hvis det ønskes, kontrastfarve dias på dette trin.
  12. Hvis du bruger fluorescerende sekundært antistof, inkuberes 0,1% Sudan Black i 70% EtOH feller 15-20 min for at reducere autofluorescens. Tør overskydende Sudan Black fra omkring væv og vask 5x med PBS i løbet af 20 min.
  13. Monter prøve med dækglas og gemme horisontalt, indtil montering løsning har sat.

4.. Alternativ Protokol: Direkte påvisning af GFP-LC3

  1. Kanyle og puste lungerne med et ~ 500 ml 50/50 v / v oktober PBS.
  2. Integrere i oktober ved at sætte en lille mængde OCT i bunden af ​​en kryoformen.
  3. Læg forsigtigt dissekeret lunge kompleks i formen.
  4. Langsomt fryse methylbutane nedkølet tøris.
  5. Tilføj flere OLT indtil vævet er helt dækket og frosset fast. Hold på tøris og opbevares ved -80 ° C.
  6. Ved hjælp af en cryomicrotome, skåret 5-10 um tykke snit beskytter sektionerne fra lys. Store sektioner og resterende væv ved -80 ° C.
  7. At forberede dias til billedbehandling, fjerne afsnittet fra fryseren og straks anvende en dråbe PBS for at forhindre udtørring.
  8. Fix i 30 min med 4% PFA. Vask med PBS.
  9. Anvend DAPI / Hoescht i 10 min. Vask 3 gange med PBS.
  10. Monter prøve med dækglas og gemme horisontalt, indtil montering løsning har sat.
  11. Billedet ved hjælp epifluorescens eller konfokal mikroskop. Opbevar prøverne ved 4 ° C i op til en måned.

5.. Forberedelse væv for Electron Microscopy

  1. Skær væv i ca 1 mm terninger for fastsættelse.
  2. Lave vævet i 2% formaldehyd, 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumcacodylat-buffer, pH 7,4.
  3. Vask med 0,1 M natriumcacodylat-buffer for 1-2 timer.
    Bemærk: Fast væv kan opbevares i 0,1 M natriumcacodylat ved + 4 ° C.
  4. Skrive fix i 1% osmiumtetroxid i 0,2 M natriumcacodylat-buffer i 1 time.
  5. Skyl i 0,2 M natriumcacodylat-buffer i 10 min 3x.
  6. Dehydrer i 70% EtOH, 20 min 2x. Dehydrer i 90% EtOH, 10 min 2x. Dehydrer i 100% EtOH20 min 2x.
  7. Inkuberes med propylenoxid (epoxypropan) i 10 min 2x.
  8. Inkuber med propylenoxid / epoxyharpiks-blanding (50:50) i 1 time. Epoxyharpiks blanding er: 24 g Agar 100 harpiks, 13 g dodecenylravsyreanhydrid, 13 g methylnadic anhydrid og 1 ml N-Benzyldimethylamin. Bland grundigt i et engangsbægerglas hjælp af en træspatel.
  9. Inkuberes med Epoxy harpiks natten over i reducerede hætteglas (dette tillader enhver resterende propylenoxid at fordampe).
  10. Integrer i mærkede kapsler med frisklavet harpiks. Polymerisere ved 60 ° C i 48 timer.
  11. Foto vævssnit ved hjælp af en transmissions elektron mikroskop ved 80 eller 60 kV på elektronmikroskop film. Udskrive billederne på fotografisk papir eller gemme så digitale medier.
  12. Analyser autophagosome dannelse i intakte celler, der indeholder kernen. Lavt strømforbrug felter (e. Gram. 2.000-4.000 X) kan bruges til at identificere celler med kerne. Typisk 6,800-10,000 X billederne bruges til ther autophagosome kvantificeres. Tæl autophagosomes per arealenhed fra 15-30 felter for passende statistisk repræsentation. Autophagosomes har dobbelt membran struktur, hvor sene autophogosomes lignede fyldte vakuoler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bakteriæmi er til stede i mus så tidligt som 6 timer, efter CLP-induceret sepsis 14. Kliniske tegn på sepsis (herunder kuldegysninger, takypnø og nedsat motorisk aktivitet) vises cirka 12 timer efter indgrebet. Mus udsat for CLP begynder at dø på omkring 18 timer efter induktion af bughindebetændelse. Jo mere alvorlig er den sepsis mere øget er dødeligheden 15. I detaljer, high-grade sepsis forårsager 100% mortalitet inden for 2-3 dage, mens mid-grade sepsis resulterer i omkring 60% dødelighed ved 7 dage efter CLP (ud over denne frist, ingen dødsfald er forventet) (Figur 1). Derimod bør dødelighed sham mus være nul

Figur 1
Figur 1. Overlevelseskurver efter CLP af forskellig sværhedsgrad hos mus. C57BL / 6 mus blev udsat for sham operation eller CLP-induceret sepsis af forskellig sværhedsgrad ved at justere ligering holde konstant antal perforeringer til coecum (dvs. 1 'gennem-og-through-punktur (to huller) med en 21 G kanyle ). Ligering af 60% af coecum resulterer i en mid-grade sepsis, hvilket fører til omkring 60% dødelighed ved 7 dage efter CLP. Ligering af ≥ 75% af coecum resultater i høj kvalitet sepsis og senere i 100% dødelighed inden for 2-3 dage efter CLP mens ligering af ≤ 25% af coecum fører i lav kvalitet sepsis og dermed i næsten energineutrale dødelighed. Typiske overlevelse resultater er vist.

Ved anvendelsen af ​​de autophagy undersøgelser, valgte vi at gennemføre en CLP model af mid-grade sepsis. Low-grade sepsis kan være utilstrækkelig til at fremkalde autophagy, mens high-grade sepsis kan føre til tidlig dødelighed af mus (før induktion af autophagy).

ve_content "> For analyse autofagi har vi anvendt transgene mus, der udtrykker GFP-LC3 fusionsprotein underkastes de førnævnte sepsis protokoller. For behandlingsprocedurer, der resulterer i stimulering af autophagy vej, forventes det, at der vil være lokaliseret forøgelse af GFP signal ( puncta), som analyseret enten ved immunhistokemiske eller konfokal assays, indikerer forbedret autophagosome dannelse 16.

Figur 2
Figur 2. GFP billeddannelse in vivo og in vitro. (A, B) Et repræsentativt eksempel af GFP billeddannelse i museorganer (fx nyre) opnået fra GFP-LC3B mus. Billedet viser GFP-LC3 puncta i glomeruli nyrevæv opnået fra ubehandlede mus. Skalapanelerne = 10 mm. ( C, D) Yderligere data tilvejebringes for at illustrere in vitro GFP-LC3 billeddannelse. Primære mesangiale celler blev isoleret fra GFP-LC3 transgene mus ved hjælp af en protokol til celleisolering fra genetisk modificerede mus som beskrevet tidligere. 17 Cellerne blev inkuberet i fravær (C) eller nærvær (D) TGF-β1 (2 ng / ml) i 24 timer som tidligere beskrevet 18. Behandling med TGF-β1 forøgede overflod af autophagosomes (grøn puncta). Klik her for at se større billede.

Dette kan yderligere testet af klassisk ultrastrukturel analyse ved hjælp af elektronmikroskopi, som skitseret i protokollen. Det forventes, at vævssnit opnået fra septiske mus eller andre væv beskadigelsesmodeller ville vise forbedret autophagic vacuole (autophagosome) dannelse pr vævsareal.

e_content "fo: keep-together.within-side =" altid "> Figur 3
Figur 3.. Elektronmikroskopi af autophagosome formation. Et repræsentativt mikrograf af tidlig og sen-fase autophagosome dannelse i lungevæv taget fra C57BI / 6 mus udsat til midten-grade CLP (60% ligatur, 21 G, 2 huller). Εarly fase autophagosomes have en dobbelt-membran struktur (pil), mens sene autophagosomes ligne en fyldt vakuole (pilespids). M betegner mitokondrier. Scale bar = 1 um. En repræsentativ kontrol billede vises af lungevæv fra C57BI / 6 mus udsættes for simuleret operation. Klik her for at se større billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den største fordel ved CLP er, at det giver forskerne at undersøge sepsis forskellige sværhedsgrader (dvs. fra lav-til midt-og high-grade). Sværhedsgraden af induceret sepsis påvirkes af længden af coecum ligeret (som den vigtigste faktor), størrelsen af nålen, brugt til punktur og antallet af huller udført 15. Desuden kan musen stamme og køn indflydelse på sværhedsgraden af sepsis, flere stammer er mere modtagelige end andre, og mænd er generelt mere modtagelige end hunnerne 19,20. De ovennævnte faktorer tilsammen bestemme CLP-induceret dødelighed.

Baseret på vores erfaring, at der er en forskel mellem efterforskere med hensyn til opnået CLP-induceret dødelighed. . Eksempelvis Rittirsch m.fl. anvendt 50% ligatur, 21 G, 1 'gennem-og-through' punktering (to huller) for at opnå en dødelighed 15 60%, en efterforsker i vores forskningsgruppe behoved til at bruge en lidt mere alvorlig model (60% ligatur, 21 G, 1 'gennem-og-through' punktering) for at opnå den samme dødelighed, der henviser til en anden efterforsker i vores forskergruppe brugt en mere alvorlig model (nær 100% ligatur , 19 G, 1 'gennem-og-through-punktur) for at opnå en meget lavere dødelighed (kun 25%). Med ovennævnte overvejelser i tankerne, kunne man argumentere for, at karakterisering af sværhedsgraden af CLP (dvs. lav-, midt-eller high-grade sepsis) bør ske med tilbagevirkende kraft (dvs. ved at kigge på den resulterende dødelighed) snarere end fremadrettet (dvs. ved at anvende visse betingelser for eksempel 50% ligatur). Når en operatør opnår en dødelighed på omkring 60%, så det er mid-grade sepsis, uanset hvilke betingelser (såsom længden af ​​coecum ligeret og antallet af huller udført) gennemføres. Således forekommer det rimeligt, at operatøren prøve forskellige betingelser for at identificere dem, der gælder 60% af musene dø. Derefter operatørenskal gennemføre nøjagtig de samme betingelser i begge grupper, der sammenlignes.

Ved at gennemføre nøjagtig de samme betingelser (f.eks længden af coecum ligeret, størrelsen af nålen, brugt til punktering, antallet af huller udføres, musestamme og køn), forventes det, at ensartede og reproducerbare resultater vil blive produceret 15. Men selv efter udførelsen af ​​CLP på en standardiseret måde (under hensyntagen til de ovennævnte determinanter), kan variation forekomme. Det er blevet anerkendt af eksperter, at »selv når gives identiske fornærmelser til identisk alderen grupper af dyr - også fra samme kuld - en variabel individuel effekt kan ses« 6.. Således i forsøg på at reducere variation, synes det rimeligt, at operatøren udfører CLP i begge sammenlignede grupper på samme dag.

Analysen af ​​autophagy, en dynamisk cellulær proces, er kompleks. De protokoller, der er skitseret i denne monograph danne grundlag for estimering autofagi aktivering in vivo, baseret på biokemisk eller morfologisk analyse af autophagosome dannelse. I princippet kan de protokoller, der er fastsat i dette kapitel, kan anvendes til analysen af ​​autophagy i ethvert organ væv i mus udsat for CLP eller alternative modeller af sepsis. Mens leveren generelt er accepteret at repræsentere et primært mål for CLP Denne procedure kan også forårsage skade på lunge eller nyre væv, som er værdig til yderligere undersøgelse. Effekten af CLP om autophagy af hepatocytter har været relativt godt undersøgt i forhold til dets virkninger på autophagy af nyre-eller lunge, og nogle relevante beviser er for nylig blevet offentliggjort 21,22.

Det skal bemærkes, at disse er statiske foranstaltninger af autophagy, øgede autophagosome tal også kan afspejle autophagy dysfunktion gennem blokering af lysosomale funktion og ende forarbejdning. I denne forbindelse bør disse analyser suppleres med biokemigiske assays for autophagic substrat omsætning (f.eks   flux), som for nyligt beskrevet og tilpasset til in vivo analyser 11. Disse analyser kan også suppleres med standard vestlige immunoblotanalyse for ekspressionen af vigtige autophagy proteiner i væv som for nylig beskrevet 12,13. Derfor anbefales det, at en kombination af disse tests skal gennemføres for at opnå en nøjagtig vurdering af status for autophagy i skadede væv 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser at erklære

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud P01 HL108801, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904 til AMK Choi. S. Ryter fået støtte løn fra Lovelace Respiratory Research Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GFP-LC3 Transgenic Mice Riken (Japan) RBRC00806 GFP-LC3#53
Xylazine Henry-Schein 568-0606 Xylazine HCl Injection Vet
Ketamine Henry-Schein 995-2949 Ketaset Inj 100 mg/ml
EtOH Fisher A405-20 Histology Grade
EtOH Fisher A407-1 For Sterilizatiion
silk surgical sutures 6-0 Owens & Minor 2300-0078OG, 017624
buprenorphine-HCl Henry-Schein 614-5157 Buprenex Ampules
paraformaldehyde (37%) solution JT Baker S898-09
xylenes Fisher X3P-1GAL
anti-GFP monoclonal antibody Life Technologies G10362
Hoescht Sigma 944403
DAPI Invitrogen D1306
OCT VWR scientific 25608-930
Sudan Black Santa Cruz sc-203760
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate Electron microscopy Sciences 15960
propylene oxide Sigma 240397
Agar 100 resin Agar scientific R1045
dodecenylsuccinic anhydride Sigma 46346
methylnadic anhydride Sigma 45359
N-benzyldimethylamine Sigma 185582

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
  2. Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
  3. Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A. Sepsis: A new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 112, 235-243 (1997).
  4. Rivers, E., et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med.. Med, shock.N. .E. ngl.J. . 345, 1368-1377 (2001).
  5. Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24 (Suppl 1), 19-23 (2005).
  6. Raven, K. Rodent models of sepsis found shockingly lacking. Nat. Med. 18, 998 (2012).
  7. Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
  8. Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10, 461-470 (2009).
  9. Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
  10. Choi, A. M., Ryter, S. W., Levine, B. Autophagy in human health and disease. N. Engl. J. Med. 368, 651-662 (2013).
  11. Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7, 629-642 (2011).
  12. Chen, Z. H., et al. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLos One. 3, 3313 (2008).
  13. Kim, H. P., Chen, Z. H., Choi, A. M., Ryter, S. W. Analyzing autophagy in clinical tissues of lung and vascular diseases. Meth. Enzymol. 453, 197-216 (2009).
  14. Flierl, M. A., et al. Adverse functions of IL-17A in experimental sepsis. FASEB J. 22, 2198-2205 (2008).
  15. Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat. Protoc. 4, 31-36 (2009).
  16. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140, 313-326 (2010).
  17. Wang, L., Ma, R., Flavell, R. A., Choi, M. E. Requirement of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3) for activation of p38α and p38δ MAPK isoforms by TGF-β1 in murine mesangial cells. J. Biol. Chem. 277, 47257-47262 (2002).
  18. Ding, Y., Kim, J. K., Kim, S. I., Na, H. J., Jun, S. Y., Lee, S. J., Choi, M. E. TGF-{beta}1 protects against mesangial cell apoptosis via induction of autophagy. J Biol Chem. 285, 37909-37919 (2010).
  19. Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94, 331-335 (1983).
  20. Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J. Surg. Res. 102, 45-49 (2002).
  21. Carchman, E. H., Rao, J., Loughran, P. A., Rosengart, M. R., Zuckerbraun, B. S. Heme oxygenase-1-mediated autophagy protects against hepatocyte cell death and hepatic injury from infection/sepsis in mice. Hepatology. 53, 2053-2062 (2011).
  22. Lo, S., et al. Lc3 over-expression improves survival and attenuates lung injury through increasing autophagosomal clearance in septic mice. Ann. Surg. 257, 352-363 (2013).

Tags

Infektion autophagosome Autophagy cecal ligatur og punktering mus sepsis
Cecal ligatur og Punktering-induceret sepsis som en model til at studere Autophagy i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding,… More

Siempos, I. I., Lam, H. C., Ding, Y., Choi, M. E., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice. J. Vis. Exp. (84), e51066, doi:10.3791/51066 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter