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최적화 된 음의 염색 : 전자 현미경으로 작은 비대칭 단백질 구조 검사를위한 높은 처리량 프로토콜

Published: August 15, 2014 doi: 10.3791/51087
Automatic Translation
1, 1, 1
1Lawrence Berkeley National Laboratory, The Molecular Foundry

Summary

더 많은 단백질의 절반 이상이 전자 현미경 영상과 3 차원 재구성 모두 도전하고 작은 단백질 (분자량 <200 kDa의)이다. 최적화 네거티브 염색 고 대비 및 비교적 높은 해상도 (~ 1 nm의) 다른 생리적 조건 하에서 작은 비대칭 또는 단백질 복합체의 이미지를 얻기 위해 견고하고 높은 처리량 프로토콜이다.

Abstract

200 kDa의 - 단백질의 구조 결정은 오히려 40 사이의 분자 질량을 가진 단백질에 도전하고있다. 천연 단백질의 절반 이상은 40 사이의 분자량이 점을 감안 - 200 kDa의 1,2, 나노 미터 분해능 능력으로 견고하고 높은 처리량 방법이 요구된다. 네거티브 염색법 (NS) 전자 현미경 (EM)는 자주 단백질 구조 및 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하는 연구 실험실에서 사용 된, 쉽게 신속 질적 접근법이다. 불행하게도, 기존의 NS 프로토콜은 종종 특히 일반적으로 연전 현상 유물을 제시 형성 지질 단백질로, 단백질의 구조 아티팩트를 생성합니다. 표준 극저온 전자 현미경 (극저온-EM)에서 지단백질의 이미지를 이용하여, NS 시료 준비 조건에서 주요 파라미터는 최근 스크리닝하고, 최적화 된 NS 프로토콜 (OpNS), 변성 종래 NS 프로토콜 3로보고. RO 등의 유물uleaux 별도로 크게 (1 나노 미터) 근처 비교적 고해상도과 함께 높은 콘트라스트와 작은 비대칭 단백질의 이미지를 제공 OpNS에 의해 제한 될 수있다. 이러한 고해상도와 높은 콘트라스트 이미지는 전자 단층 4,5의 방법에 의해, 예컨대 160 kDa의 항체와 같은 개별 단백질 (단일 객체없이 평균) 3D 재구성, 심지어 바람직하다. 또한, OpNS 작은 단백질의 수백 개의 샘플을 검사하기 위해 높은 처리량의 도구가 될 수 있습니다. 예를 들어, 53 kDa의 콜레 스테 릴 에스테르 전달 단백질의 이전에 발행기구 (CETP)의 시료 (6)의 수백 스크리닝 및 이미징을 포함했다. 고려 냉동-EM 드물게 성공적으로 이미지 단백질 미만 200 kDa의이 백을 통해 샘플 조건을 선별 관련된 모든 연구를 게시 아직, 그것은 OpNS에게 작은 단백질 연구를위한 높은 처리량 방법을 호출하는 공정이다. 희망이 여기에 제시된 OpNS 프로토콜은 E의 한계를 극복 할 수있는 유용한 도구가 될 수 있습니다M은 작은 단백질 구조, 역 동성 및 메커니즘에 EM 연구를 가속화하고.

Introduction

단백질 기능을 이해하는 것은 단백질 구조에 대한 지식이 필요합니다. 200 kDa의 - 구조 결정은 누구의 분자 질량 (40) 내에있는 단백질에 도전하고있다. X 선 결정학은 단백질 결정화에 의해 제한된다; 극저온 전자 현미경 (극저온-EM)은 분자 질량이 작은 양 화상 취득 작은 단백질의 3 차원 (3D) 재구성에 어려움을 갖는다 핵 자기 공명 (NMR) 분광법은 40 kDa의보다 적은 분자 질량에 한정 200 kDa의보다. 특히, 50 % 이상의 단백질이 (40)의 범위 내에 분자 질량 - 현재의 방법은이 크기의 단백질 연구에 도전 될 때, 200 kDa의 1,2, 새로운 방법이 필요하다.

대부분의 투과형 전자 현미경 (있는 TEM)을 원자 해상도, 즉,보다 나은 3 해결 가능하지만, 생물학적 시료에서 심지어 나노 미터 분해능에 가까운 구조를 달성하는 것은 오히려 challen이며카 7. 방사선 손상, 낮은 대비는 구조적 편차뿐만 아니라 탈수 같은 아티팩트들은 모든 고해상도 TEM 촬상을 방해 3,8.

다양한 TEM 방식 중 냉동-EM은 근처의 생리적 조건 9-12에서 매우 대칭 큰 거대 분자의 원자 해상도 구조를 달성하기 위해 고급 및 첨단 방법입니다. 극저온-EM 시료는 이후 이러한 액체 질소 나 헬륨 등의 온도 13 극저온에서 결상된다 유리체 얼음에서 고분자 매립 검액 냉동 플래쉬를 제조한다. 그 샘플이 어떤 이슈를 제시하지 않고 구조 8-12 거의 네이티브에 알아내는-EM은 유리하다. 추가 장치를 설치 또는 냉동-EM 기능에 대한 표준 TEM 장비를 업그레이드 구입하는 데 필요한 I) : 곳을 알아내는-EM는 단점을 가지고있다. 장치는 다음과 같습니다 방지 contaminator, 냉동 홀더, 저용량 모드 소프트웨어 및 저용량 센시을TIVE CCD 카메라, 이러한 장치의 가격은 TEM 기기 자체의 가격보다 훨씬 낮은 있지만; ⅱ) 극저온-EM 동작 NS 동작보다 더 긴 시간을 필요로한다. 크라이 EM 표본을 검사하는 것은 종종 NS보다 TEM 악기를 표본을 준비하고 운영하는 더 긴 시간을 필요로 냉동-EM은 다음과 같은 추가의 어려움, 해결이 필요하게되기 (위해) 때문에 : 액체 질소 온도 동작, 샘플 충전, 영상 드리프트, 온도 구배, 저용량을 모델 조작, 샘플 방사 민감도 및 투여 한계. 몇 극저온-EM 영상 확실히 평형 온도 구배로 제조기구와 함께 극저온-EM 전문가가 1 시간 이하로 얻어 질 수 있지만, 이러한 추가 단계는, NS 데이터 취득에 비해 유용한 데이터를 획득하는 속도가 느려지 며; ⅲ) 사용자는 촬상의 Proc, 극저온-EM 그리드, 저용량 동작, 선량 측정 동결, 액체 질소 운반 충전 취급 표류 지식 추가적인 훈련을 필요싱; 다른 TEM 세션 동안 같은 극저온 시료에 대한 반복 이미징 IV) 부족. 곳을 알아내는-EM 표본 쉽게 TEM 장비 /에서 시료 로딩 및 언 로딩하는 동안 얼음 오염에 의해 손상 될 수 있습니다. 이 손상은 샘플 절연되기 어려운 경우 특히 문제이다 / 14 정제; v)의 작은 단백질 (<200 kDa의 분자량)이 도전하고 때문에 낮은 콘트라스트 이미지를 만들 수 있습니다; ⅵ) 극저온-EM 영상의 낮은 콘트라스트 및 높은 잡음은 특히 구조적 유연 단백질 단백질 방위, 배좌 및 분류, 결정의 전체적인 정확성이 감소하므로, 화상들 간의 교차 상관 값을 감소시키고 자연스럽게 용액 변동 4,5.

음의 염색 (NS)는 모든 기관이, 어떤 종류의 EM으로 단백질 구조를 검사 활용할 수 있습니다 상대적으로 "고대"역사적 방법입니다. 브레너와 혼 먼저 개념 (을)를 개발F 바이러스 (15)를 조사하기위한 반 세기 전에 부정적인 염색. NS 충전 중금속 소금 시편을 코팅을 통해 수행됩니다. 이 개념은 처음에 광학 현미경 및 네거티브 이미지 (16)를 볼 때 높은 이미지 콘트라스트를 허용 시편 주위 어두움을 제공 염색 용액에 박테리아를 매립 실시로부터 오는. 중금속 이온은 단백질 17-20 덜 조밀 원자에 비해 전자를 분산시키는 능력을 더 가지고 있고, 코팅 중금속 오염 향상된 콘트라스트와 높은 투여 량의 제한을 허용하기 때문이다. NS 표본 쉽게 입자 방향 결정 및 냉동-EM의 이미지보다 3 차원 복원에 대한 높은 콘트라스트 이미지 팔을 제공 할 수 있습니다.

전통 NS 불행하게도, 평탄화 및 8,21,22 스태킹 등 일반 집계 분자 해리로 얼룩 - 단백질 상호 작용에 의해 유발 된 아티팩트를 생성 할 수 있습니다. 지질 관련 보호 자전거 용이러한 지질 단백질 16,23-30와 같은 기능, 스택 및 연전 현상에 함께 (그림 1) 31 ~ 36 포장 입자의 일반적인 이슈가 발생합니다. 그러한 비 변성 폴리 아크릴 아미드 구배 겔 전기 영동과 같은 많은 지단백질 연구, 극저온-EM 모두 보이기 지단백질 입자가 단 입자 대신 자연적으로 적층 질량 분석법 39,41, 및 소각 X-선 회절 데이터 (42), 13,29,37-40 공부 함께 21,29,30,35,42-45 연전 현상을 형성한다. 기존의 NS에 의해 연전의 관찰 가능한 표준 NS 프로토콜 솔루션 13,29,30,46-49 및 감도의 구조적 유연성이 아포 지방 단백 (APO) 및 인지질로 구성 지질 단백질 사이의 역동적 인 상호 작용에 의해 발생합니다. 이 이슈를 식별하기 위해, 아포 E4 (apoE4) 팔미 토일 - oleoylphosphatidylcholine (POPC) 고밀도 지질 단백질 (HDL) 샘플은 시험 샘플 및 cryo-으로 사용했다일련의 조건 하에서 제조 NS 시험편 스크리닝 이슈없는 표준 29 대 EM 이미지. NS 및 극저온-EM으로부터 얻은 입자 크기와 형태를 비교함으로써, 염색 시약과 염 농도의 특정 유형은 공지 연전 현상을 일으키는 현상이 주요 파라미터 인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 최적화 된 네거티브 염색법 (OpNS) 프로토콜이보고되었다.

OpNS으로 apoE4 HDL의 잘 알려진 연전 현상 현상은 OpNS (그림 2A)에 의해 제거되었다. 통계 분석은 극저온-EM으로부터 그 비교 OpNS 수율보기 크기 및 형상에 매우 유사한 이미지 (5 % 미만의 편차를) 입증하지만 콘트라스트는 제거되었다. OpNS의 검증은 거의 모든 클래스 나 apoA-I 7.8 nm의 (그림 2B), 8.4 nm의 포함 지단백 샘플 6,29,30,50,51의 서브 클래스의 연전 현상 유물의 제거를 검사하여 수행 하였다 (그림 2C) 9.6 나노 Discoidal은 HDL (rHDL) (그림 2D), 9.3 nm의 구형 rHDL (그림 2E), 인간 혈장 HDL (그림 2 층), 지질 무료 apoA-I (그림 2G), 혈장 HDL (그림 2H), 저밀도 지단백 (LDL을 재구성 ) (그림 2I), 중간 밀도 지단백 (IDL) (그림 2J), 초 저밀도 지단백 (VLDL) (그림 2K) 및 POPC 리포좀 (그림 2L) 30. (도 4A 및 B) 4,5,29을 6,29 및 매우 유연한 160 kDa의 IgG 항체 - 추가 검증은 작고 비대칭 단백질을 묘화 53 kDa의 콜레 스테 릴 에스테르 전달 단백질 (CETP) (C도 3a)를 포함하여 수행되었다 , 52, 및이 구조적으로 잘 알려진 단백질 GroEL 및 프로 테아 좀 (도 2M과 N). C에서 추가 검증을 요구하십시오olleagues, 우리는이 OpNS 방법에 어떤 블라인드 테스트 열려 있습니다.

OpNS 높은 처리량 프로토콜이 또한 CETP는 지질 단백질의 4 클래스 재결합 HDL 상호 작용을 포함하는 일련의 조건 하에서 다양한 단백질 (에 결합 된 이러한 CETP 작은 단백질 샘플 수백, 검사를 통해 단백질의 메커니즘을 연구하는 데 사용 된 바와 같이, 혈장 HDL, LDL과 VLDL과 / 3 분, 20 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 24 시간, 48 시간 및 72 시간을 포함하여 9 배양 시간에서 2 항체, H300 및 N13,없이, 를 포함하여 4, 3 희석액, 즉, 0.1 ㎎ / ㎖, 0.01 ㎎ / ㎖ 및 0.001 ㎎ / ㎖, 및 추가 제어 샘플 : 4 미만의 몰 비율, 즉, 1 : 0.5, 1 : 1 : 1, 2, 1 다른 사람에 의해 위의 실험) 6,29의 트리플 테스트 혼자 CETP 혼자 단독으로 LDL과 VLDL. OpNS CETP의 이미지는 상당히 좋은 세부 구조와 높은 콘트라스트 이미지를 제공; 우리를 허용하면 성공적으로 53 kDa의 SMA의 3D 밀도지도를 재구성하는LL 단백질 CETP (그림 3D - F) 단일 입자 재건에 의해. 우리가 중간 해상도 하나의 (~ 1.5 nm의) (하나의 개체, 아니 평균)의 IgG 항체 차원 구조를 달성 할 수 - 또한, 고 대비 OpNS 이미지는 우리에게 개별 단백질 (C도 4a)에서 충분한 신호를 제공 5 - 개별 입자의 전자 단층 촬영 (IPET) 방법 (J 그림 4E)를 통해. IPET 재건 전략, 방법론, 단계별 프로세스 및 구조 변화 분석의 상세한 설명은 이전에 4를보고되었다. 유튜브 오에 업로드하여 원시 이미지와 중간 결과, 3D 밀도지도 및 구조 도킹 포함 IPET 항체 재건 절차에 대한 영화는 대중도 사용할 수있었습니다. 다른 개별 항체 입자의 3 차원 복원의 비교 단백질 역학과 C를 공개 할 수화학 반응 4,5 동안 onformational 변경됩니다.

kDa의 1,2 (200),이 작은 단백질을 이미징 성공 OpNS 방법 작고 비대칭 구조 결정기구 발견 향해 종래 EM 경계를 밀어 유용한 도구임을 입증 - 단백질의 50 % 이상이 40에서부터 분자 질량 것을 고려 . 따라서, 상세한 프로토콜은 아래와 같이 제공된다.

Protocol

1 %에서 신선한 음의 염색 용액의 1 준비 (w / v)의

  1. 어두운 방이나 상자에 탈 이온수 100 ㎖에 들어있는 유리 병에 1 mg의 우라 닐 편대 (UF) 분말을 넣어.
  2. 어두운 방 / 상자에 RT에서 솔루션 O / N 저어. 솔루션을 타격에서 빛을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 솔루션 병을 감싸.
  3. 완만 내지 0.2 μM (구멍 크기) 필터를 5 ㎖ 주사기에 장착 용액 필터. 여과 액은 여러 알루미늄 호일 덮여 팔콘 튜브에 수집 하였다. 필터 주사기는 빛의 노출을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 포장해야합니다.
  4. 1 ML의 주사기에 장착 된 0.02 μm의 (기공 크기) 필터를 통해 솔루션을 다시 필터링합니다. 여과 된 용액을 2 ㎖의 바이알에 채취 및 분취 하였다. 주사기 및 바이 얼을 사용하기 전에, 알루미늄 호일로 커버된다.
  5. 즉시 액체 질소 충전 용기에 유리 병을 잠수 긴 처리 집게를 사용 나누어지는 바이알 동결이후 용액을 여과 하였다.
  6. 저장 및 미래의 사용을 위해 -80 ° C 냉동고에 얼어 붙은 병을 전송합니다.

음 염색 워크 스테이션 및 창업 보육 워크 스테이션의 2 준비

  1. RT에서 설정된 수욕 UF 1 % 용액의 바이알을 해동. 알루미늄 호일이 빛에 노출을 방지하기 위해 유리 병을 감싸 남아 있는지 확인합니다.
  2. 그것이 완전히 1 ㎖의 주사기가 0.02 μm의 필터로 장착 래핑 알루미늄 호일을 이용하여 해동 후에있어 용액 필터. 유리 병을 랩 된 새​​로운 알루미늄 호일로 필터링 솔루션을 수집 및 사용을 기다리는 모자 덮여 얼음 상자 안에 얼음에 배치.
  3. 빈 단백질 결정화 판의 표면에 ~ 8 인치 길이의 파라 필름 시트를 밀어 손가락 솔루션 판을 확인합니다. 그것은 ~ 5mm의 직경을 갖는 원형 플레이트의 행을 생성합니다. 얼음 내부 평면화 얼음의 표면에 파라 필름 판이 포함되어 각 행 대신에 6 판 만들기어 뚜껑, 염색 워크 스테이션 등.
  4. 피펫 ~ 35 ㎕의 각 행의 왼쪽 세 판의 각 부분에 물을 탈, 피펫 ~ 35 ㎕의 각 행에서 오른쪽으로 세 판에게 UF 솔루션을 여과. 단백질을 염색하기 전에 빛에 노출되는 것을 방지하는 데 뚜껑 염색 워크 스테이션을 포함한다.
  5. 얼음 빈 상자 반쯤 채워 EM 그리드 배양 스테이션을 준비하고, 지원하는베이스에 장착 할 수있는 걸이 옆에 부착. 핀셋 '팁 근처의 얼음 표면되는 행거의 샘플 핀셋을 놓습니다. 절반은 상자 입술 높이에 의해 족집게 '팁을 포함한다. 배양 스테이션을 만들기 위해 이상적인 얼음 상자가 빈 피펫 팁 컨테이너를 사용하고 있습니다.

3 OpNS 운영

  1. 얇은 탄소막이 10 초 동안 300 메쉬 구리 EM 그리드를 도포 글로우 방전.
  2. 핀셋 그리드를 들고 얼음 위에 45 ° 기울기와 1 인치에서 그리드를 유지하여 행거에 핀셋 후크배양 역 내부 표면.
  3. ~의 최종 단백질 농도 0.01가 ~ 0.005 ㎎ / ㎖를 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (admin으로)와 단백질 샘플을 희석. 대여 ~ 4 μL 즉시 EM 그리드의 탄소 측 희석 한 후 시료를 희석. (단백질 DPBS에 민감한 경우 DPBS 다른 버퍼로 변경 될 수 있음)
  4. 배양 역 내부 ~ 1 분 동안 EM 그리드에 샘플을 품어.
  5. 신속하게 필터 종이 그리드 가장자리를 터치를 통해 초과 솔루션을 제거합니다.
  6. 초과 솔루션은 EM 그리드 제거 된 직후 파라 필름 시트 꼭대기 순수한 물 표면의 첫 번째 드롭 (~ 35 μL)에 신속하게 그리드를 터치합니다. 그리고 여과지로 즉시 물기를 제거합니다.
  7. 파라 필름에 남아있는 두 개의 물방울에 EM 그리드를 세척하여 또 다른 2 번 단계를 반복 3.6 (3.6 단계로 샘플이 물에 매우 민감 경우 3.7는 건너 뛸 수 있습니다).
  8. EM의 GRI 플로트즉시 EM 그리드 물기 UF 후 용액의 오른쪽 첫 번째 방울의 표면에서 제거 하였다 ㄹ. 그리고 10 초 동안 배양한다. UF 용액의 표면에 격자를 떠 전에 3 초 이내에 물 세척 절차를 완료해야합니다. 세탁 시간이 짧을수록 품질이 될 것입니다.
  9. 3 번 - ~ 2 거름 종이에 팁을 관통하여 핀셋를 청소합니다.
  10. 필터 종이 그리드 가장자리 접촉을 통해 그리드에 여분의 용액을 제거하고 UF의 두 번째 드롭에 그리드를 떠.
  11. 둘째 방울에 단계 3.10 이상 계속합니다.
  12. UF 용액의 세번째 액적에 격자 플로트와 ~ 1 분간 염색 역을 커버.
  13. 옵션 단계 : 3.6에 설명 된대로 물 위에 그리드를 빨리 씻는다. 이 추가 단계는로드 무료 금 입자 또는 얼룩 배경 위에 포함 된 샘플을 도움이 될 것입니다.
  14. 토륨 필터 용지를 터치하여 여분의 용액을 제거(탄소 측 반대) 전자 전체 그리드 뒷면. 바로 여과지에 흡수 용액을 관찰 한 후 RT에서 질소 가스 기류 하에서 완만 그리드를 건조.
  15. 배양 접시 안에 필터 종이에 그리드를 배치하고 RT에서 적어도 30 분 동안 건조 모자와 부분적으로 덮으세요. 일부 샘플의 경우, 시간 동안 베이킹 40 ° C의 배양기에서 그리드를 배치합니다.
  16. 검사 미래 EM을위한 EM 그리드 상자에 그리드를 저장합니다.

검사 4 EM

  1. 제대로 그리드에있는 작은 단백질의 EM 시험 전에 TEM을 맞 춥니 다.
    1. TEM은 적절하게 정렬되어 있는지 여부를 확인하기 위해, 비정질 탄소막의 전력 스펙트럼이다 높은 가시 링 톤의 해상도를 확인. TEM은 다양한 사용자들에 의해 공유되기 때문에, TEM 종종 제대로 정렬되지 않았다.
    2. 조심스럽게 정렬 공조을 조정 시험편의 탄소막 영역 파워 스펙트럼을 확인기계의 N. 높은 볼 톤 링은 대상 해상도보다 더 낫다.
      NOTE : 120 kV의 높은 장력 하에서 작동 LaB6 제 필라멘트 TEM의 적절한 정렬의 예로서, 20 개 이상의 링 톤이 가시화 될 수있는, 대응하는 해상도는 5.0 (A)보다 더 좋을 수있다. 이 톤 링은 1.6 μm의 ~의 디 포커스와 20.4 전자 / A2 (그림 5)의 용량에 따라 몇 군데 비정질 탄소 필름의 푸리에 전송에 의해 달성되었다.
      NOTE : 고해상도 톤 링의 관측이 필요한 상태가 아니라 적절한 정렬을위한 충분 조건이다. 실제로 높은 해상도의 이미지를 달성하기 위해 많은 다른 파라미터는 샘플 품질, 방사선 손상, 충전 및 드리프트뿐만 아니라 조명 선량률로, 또한 중요하다.
  2. 이상적으로 스테인드 지역에있는 작은 단백질을 영상화에 가까운 슈어 초점으로 다시 디 포커스를 전환합니다.
  3. IMAG에 "흐린"지역 검색전자. 이상적으로 염색 면적은 일반적으로 얼룩의 두께는 일반적으로 균일하게 탄소 코팅 된 그리드 (도 6)에 배포하지 않기 때문에 그리드 "흐림"영역과 같은 두꺼운 얼룩 영역의 가장자리 근처에 위치한다. 일반적으로 낮은 배율 (<100 배) 먼저 이미징 확대하기 전에이 흐린 영역을 찾는 데 도움이 될 것이 었습니다.

Representative Results

OpNS의 구현은 다음과 같은 다양한 지질 단백질 종의 구조 및 형태 학적 검사를 포함 : 초기 재조합 HDL (rHDL), 구형 재조합 HDL, 혈장 HDL, LDL, IDL과 VLDL (그림 2) (30); 같은 53 kDa의 CETP (성공적으로 EM을 통해 몇 군데 작은 단백질 중) (그림 3) 6 160kDa의 IgG 항체뿐만 아니라 작은 단백질 (가장 역동적 인 이종 단백질의 하나) (그림 4) 4,5,29,52 도 28 kDa의 지질 무료 아포 리포 단백질 A-1 (그림 2L)와 GroEL와 프로 테아 좀 (그림 2 M 및 N).

높은 처리량 방법으로 OpNS의 다른 예로는 53 kDa의 단백질로서 CETP 메커니즘을 폭로위한 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하고있다. investiga 도입부에서 설명한 바와 같이, 방법은 CETP 지단백질의 다른 서브 클래스와 상호 작용이었다테드는 우리가 아는 바와 같이 400 개 이상의 EM 표본 (6) 검사를 통해 검사에게 거의 백 다른 조건을 포함 크라이 EM 연구의 그런 경우가 없었다.

OpNS 작은 비대칭 단백질의 3 차원 구조를 공부하고, 심지어 3D 구조 (평균)없이 하나의 개별 단백질을 형성 달성하기 위해 확장 EM 경계를 확장 할 수 있습니다. 예를 들어, IgG 항체가 중간 해상도의 3D 재구성이 달성 될 도전하는 매우 유연한 구조, 160 kDa의 분자이다. OpNS 방법은 경사 각도 (도 4E 및 H)의 일련의 이미지를 개별의 IgG 항체를 사용 하였다. 4,5 - 개별 입자 전자 단층 촬영 (IPET) (J도 4E)에 의해 단일 단백질의 성공적인 재구성 허용 OpNS부터 합리적으로 높은 해상도와 높은 콘트라스트 이미지 단백질. IPET 3 차원 복원에 (도 4F 및 G)에서 3D 밀도를 달성하기 위해 연속적으로 반복 재구성 통해 그들의 계산 된 전역 중앙에 정렬 된 4. 같은 방식으로, 단일 항체 - 펩타이드 복합체는 재구성하고, 펩티드 (해상도 ~ 16.6 Å도 4I 및 J)을 4,5 발견 된 하나의 항체를 입자의 내부 도메인 구조적 변화를 유도. 다른 개개의 입자의 3 차원 복원을 비교, 구조 분석은 화학 반응 4,5,29,53,54의 중간 단계 "- 사진을 찍고"심지어 우리가 단백질의 열역학적 변화를 공개 할 수 있도록하고있다.

요약하면, 40 kDa의 사이 분자량을 가진 단백질 - 200 kDa의 표준 EM 구조 시험 및 복원에 대한 도전입니다. 고려 그 50 % 이상단백질 (40)에 이르기까지의 분자 질량이 중 - kDa의 1,2 (200), 우리는 작은 비대칭 구조 결정에도 역학적 연구 향해 종래 EM 경계를 밀어 견고하고 높은 처리량 도구로서 OpNS 방법을보고한다.

그림 1
기존의 부정적인 염색 (NS) EM에 의한 지질 단백질의 1 Rouleau 유물 그림. (패널 아래) 전자 (패널 위) 현미경 선택된 입자는 표준 혼합 절차에 따라 인 텅스텐 산 (PTA)와 NS 후 연전 현상 다양한 지단백질을 보여줍니다. ApoE4와 (A) 재구성 HDL (rHDL), (B) apoA-I 함유 9.6 내지 discoidal rHDL, (C) 플라즈마 LDL, (D) 비 POPC 아포지 단백질 - 함유 리포좀을 함유으로 ApoB. 바 : 50 nm의. 윈도우의 크기 : A와 C, 20 Nm; B, 30 내지. 지질 연구 저널 처음에이 작품 (29, 30)를 발표했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림이
. (OpNS) EM 전자 현미경 사진이 OpNS에 의해 연전 현상 이슈없이 다양한 지질 단백질 및 리포좀을 보여 최적화 된 음의 염색에 의한 그림 2 단백질 구조 (A) rHDL을 apoE4 함유,. (B) 7.8 nm의 rHDL (C) 8.4 nm의 rHDL ( D) 9.6 nm의 rHDL (E) 9.3 nm의 구형 rHDL (F) 인간 혈장 α-HDL (G) 플라즈마 HDL (H) 인간 혈장 LDL (I) 인간의 플라즈마 IDL (J) 인간 혈장 VLDL; (L) 지질 무료 apoA-I. 추가적인 검증 (M) GroEL 및 (N) 테아 샘플을 사용하여 수행 하였다. 현미경 (위 패널)과 (아래 패널) 선택된 입자. 바 : 50 nm의. 윈도우의 크기 : A - D, 20 nm의; E 및 F, 25 나노 미터; G이 20 nm; H, 25 nm의; I, 50 nm의; J와 K, 100 nm의; L, 80 nm의., 지질 무료 apoA-I, GroEL와 프로 테아를 제외하고,이 연구는 원래 지질 연구 (29, 30)의 저널에 발표되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 CETP의 3 OpNS의 전자 현미경 사진. (A) CETP (점선 원)과 개요 현미경 바나나 모양의 입자. (B) Windowe원시 입자를 선택 거라고. (C) 세 가지 단일 원시 CETP 입자의 이미지를 명확하게 다른 작고, 가볍고 좁은 팁 (왼쪽 패널)을 포함하여 더 크고, 더 무겁고 더 큰 구상 팁을 보여주는 평면도를 덜 전체 곡률과 유사한 터미널 영역을 표시 (중간 CETP (오른쪽 패널)의 장축 아래 패널) 및 엔드 뷰 (D)의 결정 구조 (PDB 배치도 :. 이러한 것의 CETP 입자 이미지에 2OBD)가 될 수 배향을 도시 모두 구조적 형상 및 도메인 크기가 잘 일치 거의 직접 심지어 컴퓨터 ((C)로 패널에 대응)에 의해 지원없이 정의. (E)이 무작위로 배향 된 입자의 유사성 (상호 - 상관 계산)를 계산하는 프리 2D 클래스 평균보기 (순이 론적 프로세스 참조를 갖는 입자 서로 높은 유사성 그룹화 정렬 후 배경 잡음을 감소 및 평균 입자 이미지 콘을 강화 하였다콘트라스트. 기준 무료 2D 수준의 평균은되는, 더 어떤 인간 만든 초기 모델은이 클래스의 평균에 참여했다, EMAN 패키지 refine2D.py 소프트웨어에 의해 계산되지 않습니다. 레퍼런스 클래스 평균)은 단일 입자 재구성으로부터 3D 재구성을 검증 독립된 방법으로 사용될 수있다. (F) 선택된 기준 프리 2D 클래스 평균이 다른 비교하여 큰 말단부를 나타낸다. (G)에 겹쳐 결정 구조 (PDB : 오버레이 이미지는 구조의 모양과 도메인의 크기 (낮은 패널) 모두 결정 구조 및 참조가없는 클래스의 평균 사이의 완벽에 가까운 경기를 기준 무료 평균과 2OBD) 비교 표시 (F)에서 CETP의 3D 밀도지도. 13 Å의 해상도는 OpNS 및 단일 입자 재구성 방법 (상단 패널)와 결정 구조 (낮은 패널)하여이 단일 입자 재건에 고정 래치의 몸으로 이미지화 8,879 입자로부터 재구성했다. DET이미지 전처리, 초기 모델, 정제 절차, 각도 분포와 푸리에 쉘의 상관 관계 (FSC)을 포함하는 단일 입자 재건 ailed 정보는 방법 섹션에서 출판 된 원본 종이의 지원 정보 (H) 단일 입자 재건의 최종 비교 ( 패널) 및 추가 PDB에 맞는 비교 (하단 패널) 상기 6. 바 : A, 50 nm의; B - D, 10 nm의; F, 3 nm의. 이러한 수치 중 일부는 이전에 자연 화학 생물학 (6)에 발표되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 OpNS 이미지와 인간 IgG 한 항체 입자의 재구성. (A) 이상인간의 IgG1 항체 OpNS 이미지보기. 백색 원에 도시 된 입자는 분명하게 3 서브 도메인으로 입자를 표시. (B) 수동 터치 어떤없이 (원료 입자 가장자리 주변 소음을 줄임으로써 오 개별 비 접합 항체 입자 (C) 대응하는 잡음 저감 이미지 고해상도로 이미지를 엄선 쉽게 시각화 할 수있는 입자 내부의 밀도). (D)와 유사 EM 이미지로보기 지향 한의 IgG1 항체의 결정 구조 (PDB 항목 1IGT). 해당 이미지의 비교 EM 이미지와 도메인의 위치와 모양을 포함하는 결정 구조 사이 많은 일반적인 기능을 보여줍니다. (E) 단일 인스턴스의 IgG1 항체에서 순이 론적 차원 복원하는 단계 - 투 - 단계 절차 (아무 평균 한 개별 개체) 개별 입자의 전자 단층 촬영 (IPET) 메소드를 사용하여. (F) SI의 최종 3 차원 복원14.1의 해상도 ngle 항체 입자는 세 도넛 형상의 영역이 "Y"형상으로 형성 하였다. (G) 영역의 밀도가 각각 매핑 대응 수동 도메인 중 루프의 반복 각각에 도메인의 결정 구조 도킹. (H) IPET에 의해 하나의 IgG-펩타이드 복합체 (아무 평균 한 개별 개체)의 3 차원 복원하는 단계 - 투 - 단계 절차. (I)의 IgG 펩타이드 복합체의 최종 3 차원 복원이 16.6 Å의 해상도로 표시된 세 개의 막대를 보여 주었다 "Y"형상으로 형성하는 성형 영역 (J) 각각으로, 각각의 IgG 항체 도메인의 결정 구조 (PDB 항목 : 1IGT)을 도킹. 각 봉 형상 밀도로는 저조한 내부 도메인 구조적 변화를 시사 도메인 결정 구조와 일치했다 펩타이드 접합 후. 자세한 절차는 해상도 분석 및 통계는 원래 논문에서 설명되었다 4 년에 출판과 과학은 5를보고합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
비정질 탄소 필름의 그림 5 파워 스펙트럼은 자이스 천칭 자리 120 LaB6 제 TEM에 의해 1.6 μm의 디 포커스에서 몇 군데. 고해상도 이미징은 EM 적절한 정렬 및 고해상도 능력을 가지고 있음을 보여주는 충분한 증거가 필요합니다. 그리드에 가까운 탄소 영역의 파워 스펙트럼의 분석은 이전 데이터 수집에 빔 간섭 상태를 점검하기위한 효율적인 방법이다. 비결정질 탄소 영역의 화상의 푸리에 전송 (C를 계기 관련 콘트라스트 전달 함수를 보여 TF는) 그래서 톤 링을했다. 적절한 정렬 및 일관성을 볼 수 톤 링의 수와 상대적으로 높은 디 포커스 조건에서 볼 수 톤 반지의 최고 해상도로 반영 될 수있다. / 2 - 랩 6 필라멘트 구비 TEM의 근처 적절한 정렬 조건의 예로서, 20 톤 링 (~ 5 Å)은 카본 막으로 생성 될 수있다 ~ 이상은 20.4 전자 선량하여 1.6 μm의 디 포커스에 묘화된다. 저가형 TEM에서 달성 톤 링은 적절한 정렬 조건 하에서 작동 전계 발광 총 (FEG) 향상된 TEM으로 하이 엔드 TEM에서 것과 동일한있다. 처음 과학에 발표 된이 작품은 다섯보고합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6highres.jpg "폭 ="500 "/>
도 OpNS 촬상 용 "이상적인"영역 6 실시 예 현미경 사진. 세 단백질 시료 (A) GroEL (B) 프로 테아 좀 (C)는 구면 HDL, 이미징을위한 이상적인 OpNS을 입증하는 예로서 사용되었다. 기미가 불균일 시험편에 분포되기 때문에, 시료의 낮은 배율은 보통 "흐림"(가장 왼쪽 패널) 나타난다. 이미징을위한 이상적인 지역은 일반적으로 이러한 "구름"의 경계에 있습니다. 의 예 단계별 줌인 한 "흐림"얼룩 영역 (좌측 중간 패널) 입자의 고해상도와 높은 콘트라스트 이미지 (중간 오른쪽 패널)로 제시 고배율 이미지를 보여준다. 입자의 선정 된 이미지는 단백질의 구조 세부 사항 (오른쪽 패널)를 보여줍니다. 바 :. 30 나노 대형을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 R 버전.

그림 7
도 7 OpNS 절차의 개략도. (A) EM 그리드 인큐베이션 스테이션, 글로우 방전 그리드에 시료 용액을 배양하는 단순한 역. 광에 얼룩 노출을 최소화하면서, 얼음 침대 위에서 수세 방울 및 얼룩 방울을 유지하기위한 (B) 염색 워크 스테이션. (C) 염색 절차의 개요 설명 : 블로 팅 방향, 3X, 수세, 3X UF 얼룩 노출 얼룩 방울이 반전 샘플 그리드 염색 배양 및 최종 배면 샘플에 의해 건조에 앞서 샘플 염색 용액의 얇은 층을 위해 블로 팅 질소 공기. 일의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림입니다.

그림 8
그림 8 높은 - 53kDa 작은 단백질 CETP의 해상도 이미지 수정 OpNS 방법, 냉동 양성 - 염색 (크라이 PS)에서 밝혀 다섯 높은 해상도와 원형 (대비 반전으로) CETP 입자의 부드러운 마스크로 이미지를 선택합니다. 입자 형상은 쉽게 시각화 (하지만 입자 내의 밀도를 수정하지 않고 원료 입자 이미지 '에지 주변 수동 소음 저감) 원료 입자를 마스크. 모든 원자와 리본 결정 구조 비교 EM 이미지에 각 입자의 유사한 방향으로 정렬 된 원료 입자를 마스크합니다. 모든 결정 구조에 특징이 원시 데이터로부터 확인할 수있는 반면 원시 이미지 영역의 고해상도 사항, 결정 구조와 소정의 유사성을 표시. Remarka BLY, 이러한 원시 이미지는 모두 터미널에서 유사성 수동 소음 감소 이미지 (삼각형)에서 볼 근처의 작은 원형 구멍을 갖는 단부 보여; 또한, 입자와 이미지 내의 C-말단 영역에서 스트랜드 결정 구조를 보완 β-시트 (화살표) 최종적 CETP C-말단 영역에 돌출 루프 결정 구조 (다이아몬드)에 유사하다. (A) 다섯 선택 (역방향 대비) CETP 입자의 높은 해상도와 원형 부드러운 마스크로 이미지. (B) 10A에 로우 패스 필터링. (C) 20A로 필터링 높은 낮은 패스. (D) 수동 소음 감소 이미지를 마스크 된. (E) 리본 구조에 의해 결정 구조의 비교. 모든 원자의 표현으로 (F) 결정 구조의 비교. 바 :가 5nm. 이 작품의 일부는 자연 화학 생물학 6 년에 출판되었다.여윈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9
그림 9 염분을 다른 아래 기존의 NS 프로토콜 (PTA 얼룩)에 의해 rouleau 형성을 보여주는 리포좀의 전자 현미경 사진. (A) 높은 염도 (~ 0.5 MNaCl). (B) 정기 염분 (~ 0.25 M의 NaCl). (C) 저 염분 (~ 0.1 M의 NaCl). (D) 순수한 물. 현미경 사진 (패널 위) 및 표시 (패널 아래)을 선택 창 입자. 바 : 100 nm의. 윈도우의 크기 : 80 nm의. 지질 연구 저널 원래이 작품 30을 발표했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

기존의 NS 기술에 비해 OpNS은 연전 현상 유물 (그림 1, 9), 신뢰성과 합리적인 고해상도 (~ 1 ㎚) 작은 단백질의 구조 정보를 제공한다 (그림 2)을 방지 할 수 있습니다. 극저온-EM에 비해 OpNS은 높은 처리량을 제공하는 방법 및 단백질 및 단백질 - 단백질 상호 작용 (6)의 다양한 검사 할 수있다. 그러나 OpNS은 여전히​​ 단점이있다. 기존의 NS에 비해 OpNS이 수반 : 시편 준비 내가) 더 복잡한 단계; ⅱ) 방사성 물질, UF를 사용함; ⅲ) 때문에 때문에 빛 감도의 UF 얼룩의 짧은 효능에 신선한 얼룩을 유지; ⅳ) 강수량은 UF 솔루션은 -80 ° C에 저장하고 사용하기 전에 해동이 필요합니다 미연에 방지; V) 그리고 마지막으로 모든 UF는 유해 폐기물로 처리해야합니다. 곳을 알아내는-EM에 비해 OpNS은 상대적으로 낮은 해상도의 이미지 및 아직 발견하지 이슈에 대한 보장을 제공한다미래에.

지단백질 연전에 NS 동작 절차 효과

드롭에 의해 드롭 (16) 및 세정 절차 29, 55를 혼합 : 시험 16,29-36,55 위해 단백질을 제조 NS 프로토콜은 방법 (50)의 세 개의 주요 그룹으로 분류 할 수있다. ⅰ) 혼합 프로토콜은 특정 비율로 얼룩과 단백질 시료의 예비 혼합을 필요로하고, 최종적 EM 시험 55 공기 건조 전에 여과지로 과잉 용액을 제거 그리드에 도포 탄소막 상에 혼합 용액을 도포. ⅱ) 드롭 의해 드롭 프로토콜이어서 얼룩의 강하 (~ 4 μL)의인가 전에 과량의 시료 용액을 제거 ~ 1 분 동안 탄소시키는 윗몸 코팅 EM 그리드에 직접 (~ 4 μL) 샘플 방울을 도포 포함 격자의 동일 측에 용액. 인큐베이션 ~ 1 분 후에 제거 exces깨끗한 종이 필터와 접촉을 통해의 얼룩, 마지막으로 공기 건조 16,56-58에 제출. ⅲ) 세척 프로토콜 (도 7)을 오른쪽 여과지 3,29,30 의해 과잉 용액 매번 제거한 후, 탈 이온수로 3 회 세척, 1 분 동안 탄소 코팅 EM 그리드에 샘플 용액 도포를 필요. OpNS 프로토콜이 세척 과정에서 수정되었습니다.

NS 얼룩의 종류와 지질 단백질 연전에 효과

NS에 의한 중금속 오염에 강한 전자 산란은 단백질 17-20,59에서 대비를 제공합니다. NS 샘플은 별도로 더 방사선 량 고통과 선명한 음 콘트라스트 8,9,60 의해 단백질의 기능을 향상시킬 수있다. 중금속의 얼룩으로 분류 될 수있다 : 인 텅스텐 산 (PTA) (16)를 포함하여, 음이온 성, 메틸 텅스텐 (14) 및 규소 텅스텐 산 (61); 양이온예 우라 닐 아세테이트 (UA) 62, UF 3,29,30, 그리고 우라 닐 질산염 (UN) 63 IC. 가장 일반적으로 사용되는 음이온 NS 얼룩의 하나가 PTA 33,64-67이다. 7.5 - PTA는 일반적으로 pH를 7.0의 주위에 사용되는 헤테로폴리산이다. PTA는 긍정적 염색 3,16,68 사용할 수 있습니다. PTA의 음전하 모두 지단백질 및 리포좀 표면에 적극적 POPC 같이 머리기를 충전 불포화 지질과 정전 기적 상호 작용을 중재 할 수있다. PTA도 정기적으로 버퍼 염분 29, 30 (그림 1)에서 이러한 상호 작용 (29, 30)을 통해 연전 현상 형성의 원인이 될 수 있습니다. 같은 UA, UF 및 UN 등의 우라 닐 얼룩, 특히 자주 생물 표본 62,69,70의 다양한 NS에 사용되는 양이온 중금속 얼룩 및 UA에 대한 대안 선택이다. 실험은 UF는 POPC 불포화 지방 산의 지질을 포함하는 지질 단백질의 더 연전 현상이 발생 찾을 수 없습니다. 그러나, UF는 여전히 roule을 야기 할 수 있음이러한 dimyristoyl 포스파티딜콜린 (DMPC) 및 헥사-1-2-옥타 데카 노일-SN-글리세로 -3 - 포스 포 콜린 (PSPC) 등의 포화 지방산 지질을 함유 지단백질에 AUX 형성. 이러한 상호 작용의 상세한 메커니즘은 알 수 없습니다. UA / UF / UN 낮은 pH 값에서 모든 작업은 3.5-4.6까지 할 수 있습니다. 이러한 낮은 pH 값은 pH가 14,71에 민감한 특정 생체 고분자에 적합하지 않을 수 있습니다. 흥미롭게도, UA / UF 알 수없는 메커니즘 (72)을 통해 몇 밀리 초 내에 단백질 구조를 해결할 수 있습니다. PTA는 달리, UA / UF는 산보다 소금에 더 유사합니다.

(: 0.3 nm의, UN : ~ 0.5 nm의 UF) 3,74를 UF 보도되는, UF 및 UN 얼룩 UA보다 작은 입자 크기를 가지고 UA 73보다 더 나은 결과를 제공 할 수 있습니다. UF는 따라 네거티브 얼룩 시약으로서 사용한 경우 흥미로운 예, 작은 단백질 (53 kDa의 CETP)의 이차 구조와 같은 세부 사항은 직접 원료 현미경에서 시각화 될 수있다이전 크라이 포지티브 염색 (크라이 PS) 방법 (그림 8) 6 보도했다. 극저온 PS에서, 스테인드 샘플은 보조 건물 붕괴의 원인이 될 수 있습니다 OpNS 프로토콜에 냉동-EM 샘플 준비 절차 대신 건조 절차에 따라 냉동 플래시이었다. 극저온 PS 작은 단백질 (75)의 높은 콘트라스트 및 고해상도 영상화하는 방법이다. 크라이-PS 이미지를보고 크라이 NS 프로토콜 22에서에 비해 명암을 반전하지만, 기존의 냉동-EM 이미지와는 일관된 이미지 대비를했기 때문에, 따라서는 크라이 PS 방법 지명되었다. 크라이 PS 이미지 염색 시약은 포름산을 우라 닐, 염색 단지 외면 구조를 시각화 할 수 있다는 종래에 도전 볼, 분자 표면을 관통 것을 보여준다. 우라 닐 포름산은 분자 표면을 침투하는 방법의 메커니즘은 알 수 없습니다. 하나의 가능성은 우라 닐 양이온 가능한 단백질 카르복실기에 결합하며, 따라서 인 것을유리체 얼음을 둘러싼시켜 포지티브 얼룩으로서 작용 단백질과 우라 닐 기의 염색보다 낮은 농도이다. 크라이 PS 방법은 X-선 결정학 76-78에서 위상 문제를 해결하는 일반적인 방법이었다 다중 동형 여분 (MIR) 방법과 유사하다. MIR에서, 크리스탈 샘플은 네이티브 형태 동형 양식을 얻기 위해 우라늄을 포함하는 무거운 원자 솔루션에 흠뻑있다. 무거운 원자의 첨가는 때때로 결정 생성 또는 단위 셀 치수에 영향을 미칠 수 있지만, 결정 구조 결정 76-78의 추가 정보를 제공하지 않는다. UF의 소립 수혜함으로써 크라이 PS 특히 거의 모든 단백질 용액에서 자연적 동적 이종임을 고려할 때, 단백질 구조 연구에 중요한 하나의 단백질의 높은 콘트라스트 및 높은 해상도 이미지를 제공 할 수있다. 이 극저온 PS 방법의 검증을 위해, 우리는 EM 필드에서 어떤 블라인드 테스트를 위해 엽니 다. 지단백질의 연전 염 농도에 영향

전통적인 PTA 네거티브 염색 시약을 사용하여, 관찰 연전은 가능성 대신 단백질 상호 작용의 지질 상호 작용에 관한 것이다. 상당한 염분 (0.5 M의 NaCl), 적당한 염분 (0.25 M 염화나트륨), 비교적 약한 염분 (0.1M의 NaCl), 순수 (도 9)에 따라 제조 POPC 리포좀 소포의 샘플을 이미징, 전자 현미경은 연전이었다 보여 소금 농도 (- D도 9a) 상관 관계. UF 부정적인 염색 시약을 사용하여, 연전 현상을 신속하게 염색이 필요한을 직전 염 농도를 감소시키기 위해 세척 과정을 시사 POPC 리포솜 소포 샘플 30 (도 2L)에서 관찰되지 않지만 하였다 관련 POPC에 연전 현상을 방지하지 독립적 충분한 공정 샘플.

TEM 영상 작은 단백질은 거의 슈어 초점 조건이 필요합니다.

높은 해상도에서 작은 단백질의 성공적인 TEM 영상은 두 가지 중요한 조건, 적절한 빔 정렬과 가까운 슈어 초점 인수 조건이 필요합니다. ⅰ) 적절한 빔 정렬은 상대적으로 높은 디 포커스에 따라 취득한 탄소막 화상의 푸리에 전송에 보이는 톤 링 (전력 스펙트럼)의 숫자를 통해 판단 할 수있다. 빔의 더 나은 정렬 조건은 더 톤 링은 가시화 될 수 있고, 근처 슈어 포커스 하에서 측정 .. ⅱ) 획득 된 이미지는 또 다른 중요한 조건이다. 생물학적 샘플 이미지 콘트라스트를 향상시킬 수있는 79 - (2 μM 더욱 1) 생물학적 표본을 이미징하는 전통적인 표준 전략은 일반적으로 높은 디 포커스를 이용한다. 이 전략은 종종 하드 물질의 원자 해상도 구조를 이미징을위한 일반적인 전략에서 다른 중요근처 슈어 초점 (~ 50 nm의 디 포커스)를 사용합니다. , 디 포커스가 높은 생체 시료 대비를 강화할 수 있지만, 고해상도 신호가 부분적으로 제거 될 것이다. 그 결과, 고해상도의 신호는 더 높은 공모 디 포커스 촬상 조건에서 낮은 것이다. 이유는 TEM 이미지 샘플 구조의 컨볼 루션과 인스트루먼트 CTF 인 점이다. CTF는 곡선 빈번 높은 주파수에서 진폭 제로 교차되는 발진 주파수에 대하여 진동 곡선이다. 때마다 CTF는 제로에 걸쳐이 특정 주파수에서의 샘플 구조 신호 (영 번 모든 수가 0이됩니다) 제거 될 때. 이 주파수 신호는 제거하는 CTF 보정 알고리즘 (대신 원래 구조 신호 중 어느 난수 일 수 제로로 나눈 제로)에 의해 회수 될 수 없다. 높은 디 포커스 촬상 하에서 CTF 훨씬 더 공격적 따라서 CTF가 결과적으로 더 자주 진폭 0으로 진동한다 교차특정 주파수에서 더 많은 수의 신호 구조가 제거된다. 제거된다 이상의 신호는 덜 공모는 이미지가 있습니다. 특히, 이미지의 공모 복구 또는 CTF 보정에 의해 보정 할 수 없습니다. 그러나, 다른 defocuses 따라 취득한 완료되지 않은 이미지는 짝수 원자 해상도 9-12 달성 할 수있는 평균 방법을 통해 샘플 구조 수득 완료 구조적 신호에 서로의 간격을 채우기 위해 사용될 수있다.

평균화 방법은 고도로 대칭 단백질과 구조적으로 관련된 단백질의 강성 구조를 달성하기위한 강력한 방법이다. 그러나, 여전히, 특히 항체와 같은 구조 역학 HDL에 유연 단백질에 대해 작고 비대칭 단백질 구조 연구에 도전 남아있다. 평균화는 단백질 입자 구조 및 형태이지만 디가 동일하다는 가정에 기초fferent 방향에, 그러나 많은 단백질 용액에 열역학적 변동을 겪는 것으로 알려져있다. 이전에 단백질의 열역학적 변동 변동을 몰라도 평균 방법을 적용함으로써, 평균 구조는 종종 도메인 10,80 또는 냉동-EM의 복원에 해상도 81 로컬 변화를 누락의 원인이 될 수 있습니다.

단일 단백질의 작은 단백질의 3D 재구성을 달성하는데 성공 같은 53 kDa의 CETP 및 3D 구조, 예컨대 160 kDa의의 IgG1 항체, 적절한 정렬 조건 하에서 가까운 슈어 포커스 촬상 조건을 사용하여 혜택. 이미지 콘트라스트는 거의 슈어 포커스 이미지 낮은 보이지만, 반대로 쉽게 간단히 백그라운드에서의 고주파 노이즈를 줄이기 위해 저역 통과 필터를 적용함으로써 향상 될 수있다. 우리는 믿는다 가까운 슈어는 이미지 최대 구조 신호를 전달 초점 및 입자의 배향의 정확도를 높이고 effi을 향상시킬단일 입자의 3 차원 복원 및 개별 입자 전자 단층 촬영 재건에 ciency.

Acknowledgments

우리는 편집 및 주석 및 박사 박사 미키 양 감사합니다. 도움 레이 장 및 보 펭. 이 작품은 과학의 사무실, 미국 에너지 부서의 기본 에너지 과학 사무소 (NO. DE-AC02-05CH11231 계약), 국립 심장, 폐, 그리고 국립 보건원 (NIH)의 혈액 연구소 (에 의해 지원되었다 없음 . R01HL115153)와 국립 보건원의 일반 의료 과학 국립 연구소 (NO. R01GM104427).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stain: Uranyl Formate The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc. 02545-AA http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml
Syringe: 1 ml NORM-JECT VWR 89174-491 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491
Syringe filter: 0.2 μm  VWR 28145-487 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487
Syringe filter: 0.02 μm filter (Anotop 10) Whatman 6809-1002 http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline SIGMA-Aldrich D8537 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&region=US
Parafilm: 4 in. x 125 ft. VWR 470152-246 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A
Carbon film coated TEM grid: 300 mesh Pacific Grid-Tech Cu-300CN http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon
Carbon film coated TEM grid: 200 mesh EMS (Electro Microscopy Sciences) CF200-Cu http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx
Tweezer: Dumont Tweezer L5 EMS (Electro Microscopy Sciences) 72882-D http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5
Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System EMD Millipore Milli-Q Advantage A10 http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117
Filter Paper: Grade 1 circles Whatman 1001-090 http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx
Aluminum Foil Any type
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10µL Pipettors VWR 89174-520 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520
Name Company Catalog Number Comments
Glow Discharge Unit Ted Pella 91000 http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40µL Pipettors VWR 89174-524 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524
Filter Tips: VWR Signature 200 µL Pipet Tips VWR 37001-528 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528
Pipet Pipetman F161201 and F167300 http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx

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References

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Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (90), e51087, doi:10.3791/51087 (2014).

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