Summary
أنشأنا فلوري التهجين الموضع البروتوكول في للكشف عن فيروس الحمض النووي الجينوم المستمرة داخل أقسام الأنسجة من النماذج الحيوانية. هذا البروتوكول يتيح دراسة عملية العدوى عن طريق codetection من الجينوم الفيروسي، والمنتجات RNA لها، والبروتينات الفيروسية أو الخلوية داخل الخلايا واحد.
Abstract
codetection خلية واحدة من الجين والمنتجات RNA والبروتينات الخلوية التنظيمية أمر بالغ الأهمية لدراسة الجينات تنظيم التعبير. هذا هو التحدي في مجال علم الفيروسات، وبصفة خاصة عن الفيروسات الحمض النووي المستمر-النووية التي تنطوي على تكرار نماذج حيوانية لدراستهم. نوع فيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1) يحدد عدوى مدى الحياة كامنة في الخلايا العصبية الطرفية. يقدم الفيروس كامنا كما الخزان، من الذي ينشط ويؤدي الى حلقة جديدة العقبولية. يبقى بيولوجيا الخلية من HSV-1 كمون غير مفهومة، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود طرق للكشف عن HSV-1 الجينوم في الموقع في النماذج الحيوانية. نحن تصف الحمض النووي الفلورسنت الموقع التهجين (FISH) في نهج كشف بكفاءة-نسخة منخفضة الجينوم الفيروسي داخل أقسام الأنسجة العصبية من النماذج الحيوانية المصابة. وتعتمد الطريقة على القائم الحرارة مستضد إماطة اللثام، وتحقيقات الحمض النووي المسمى مباشرة الصنع، أو تحقيقات متاحة تجاريا. وضعنا الفول الثلاثينهج نينغ، والجمع بين الحمض النووي RNA-FISH مع FISH والمناعي، وذلك باستخدام البيروكسيديز مقرها إشارة التضخيم لاستيعاب كل متطلبات تلطيخ. وتحسن كبير هو القدرة على الحصول، في غضون 10 ميكرومتر أقسام الأنسجة، وإشارات منخفضة الخلفية التي يمكن تصويرها بدقة عالية بواسطة المجهر متحد البؤر واسعة المجال epifluorescence التقليدية. بالإضافة إلى ذلك، عملت تلطيخ ثلاثية مع مجموعة واسعة من الأجسام المضادة الموجهة ضد البروتينات الخلوية والفيروسية. بروتوكول كاملة يأخذ 2.5 أيام لاستيعاب الأجسام المضادة والاختراق التحقيق داخل الأنسجة.
Introduction
نوع فيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1) هو فيروس موجه للعصب الإنسان الثابتة، وإقامة العدوى الكامنة على المدى الطويل في الخلايا العصبية في العقد الثلاثي التوائم (TG) في الجهاز العصبي المحيطي، والتي كانت تعيد تجديد دوري لتكرار وانتشار. الجينوم HSV-1 هو 150 كيلو بايت dsDNA وإضفاء الطابع المحلي في نواة الخلايا العصبية المضيفة حيث لا يزال البلازميدات chromatinized multicopy كما، والتي لا الاندماج في الجينوم الخلية المضيفة 1،2. خلال الكمون، وقمعها بشدة برنامج جيني HSV-1 دورة تنسخي، ويقتصر التعبير الجيني للنسخة المرتبطة الكمون (LAT) موضع، من إنشاء الكمون لبدء تنشيط 3. LAT تنتج 8.5 كيلو بايت طويلة غير المكودة RNA معالجتها في كبرى 2 كيلو بايت الوهق مستقرة، والعديد من ميرنا 4-7. وهكذا يتميز HSV-1 كمون من خلال وجود الحمض النووي الفيروسي الجيني، LAT الحمض النووي الريبي، وعدم وجود كشف البروتينات دورة تنسخي.
ontent "> النماذج الحيوانية، في الغالب الماوس والأرنب، هي نماذج تجريبية تلخص العديد من الميزات من الكمون في الإنسان. واحدة من المصالح الرئيسية لتلك النماذج هو أنها تسمح بدراسة الجوانب الفسيولوجية للHSV-1 كمون في المضيفين مناعيا. على مدى العقود الماضية ، العديد من الأدوات التجريبية، مثل الفيروسات والفئران المعدلة وراثيا، وقد وضعت لدراسة علم وظائف الأعضاء، وعلم الوراثة، وعلم الأحياء الخلوية من HSV-1 كمون، من الأنسجة الحيوانية. وحتى الآن، تم الكشف عن الحمض النووي الجيني الفيروسي وكميا بواسطة لطخة الجنوبية و QPCR من فصلها TGS. ومع ذلك، لا يوجد حاليا أي وسيلة متاحة للكشف عن HSV-1 الجينوم بواسطة التهجين في الموقع على أقسام الأنسجة 8، وبالتالي يتم تقييم الكمون بشكل روتيني على المقاطع النسيجية من خلال الكشف عن الحمض النووي الريبي RNA LAT بواسطة التهجين في الموقع بدلا من الفيروسية كشف الجينوم. لأنه قد كان من المستحيل أن تميز الخلايا المصابة على أساس وجود الجينوم الفيروسي، ثيوقد ق الحد التقنية والعيب الرئيسي لتحليل جوانب كثيرة من التفاعلات المضيفة للفيروسات، مثل العلاقة بين الجينوم الفيروسي والخلوية والفيروسية التعبير الجيني أو بوساطة الخلية المضيفة استجابة مناعية 9،10.الأهم من ذلك، عدم التجانس الخلية الى خلية من العدوى الكامنة لا تزال غير مستكشفة نسبيا، ولقد ثبت أن تكون سمة رئيسية من الكمون في الفئران في الخلايا العصبية والحسية العقدة الإنسان زرعها في الفئران SCID 11-17. عادة، فقد تبين من خلال QPCR أن الجينوم عدد النسخ HSV-1 في الخلية يختلف من 5 إلى عدة مئات. على الرغم من أن LAT يبدو كمنظم رئيسي من الكمون وتنشيط، أشارت البيانات QPCR على الخلايا العصبية معزولة في الموقع وPCR أنه ليس هناك سوى مجموعة فرعية من الخلايا العصبية المصابة خفية، منخفضة تصل إلى 30٪، ويعرب عن موضع LAT 11،12،18-21. كيف الخلية المضيفة والبيئة الخلوية داخل الأنسجة تأثير على إنشاء الكمون الفيروسات ويبقى التعبير الجيني الفيروسي غير واضحة. نحن هنا وصف الفلورسنت قوة التهجين الموضع (FISH) طريقة للكشف الفعال للنسخ منخفضة HSV-1 الحمض النووي الجيني داخل أقسام الأنسجة العصبية في الحيوانات. وقد تم تصميم هذه الطريقة واستخدامها من قبلنا للوصول إلى عالية الدقة التصوير المجهري ما هو ضروري لدراسة تفاعل الجينوم الفيروسي مع الخلية المضيفة المكونات داخل النووية 22. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف طريقة تلوين متعددة للكشف في وقت واحد من الحمض النووي الفيروسي RNA والبروتينات مع، التي هي أداة فريدة لوصف التفاعلات الفيروسات المضيف التي تنظم التعبير الجيني الفيروسي. ويمكن أيضا أن تطبق طريقة لمجموعة واسعة من التحليلات التي تتطلب الكشف عن HSV-1 الجينوم الكامنة، مثل قياس الخلايا العصبية المصابة في عدد كبير من الأقسام. والخطوة الرئيسية هي تطبيق المستضد العلاج استرجاع لجعل الحمض النووي الفيروسي للوصول إلى التهجين. وبالتالي، قد يكون هذا البروتوكول أيضا فعالة لكشفمن الفيروسات dsDNA وغيرها، والتي هي حاليا لا يمكن كشفها بواسطة النهج الحمض النووي FISH التقليدية داخل الأنسجة الحيوانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد استخدم هذا الأسلوب في دراسة نشرت سابقا 22. لخلفية عامة ووصف التلاعب التقليدية على ISH، وإذا FISH، نقترح الأدبيات المتوفرة التالية 23.
1. عدوى الحيوان
جميع الإجراءات التي تنطوي على حيوانات التجارب يتفق مع القضايا الأخلاقية من جمعية للبحوث في مجال طب العيون والرؤية (ARVO) بيان لاستخدام الحيوانات في البحوث، وتمت الموافقة من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية من الاستعراض الدوري الشامل-3296-CNRS، وفقا الجماعة الأوروبية توجيه المجلس 86/609/EEC. جميع الحيوانات تلقى الوصول غير المحدود إلى الغذاء والماء.
طريقة العدوى الفأر مع HSV-1 هو موضح أدناه استخدمت في الدراسات التي نشرت سابقا 24-26.
- إعداد الحلول التالية لإعداد قبل انطلاق:
الحل HSV-1 الأسهم فيروس
التخدير الحل - KetaminE-100 ملغ / كغ وزيلازين-10 ملغ / كغ - يستغرق 1 ميكرولتر من الفيروس (10 PFU 6) في محقنة مكروية 5 ميكرولتر الزجاج متصلة بجهاز مضخة محقنة مكروية تقديم 0.1 ميكرولتر / ثانية ملاحظة: Resuspend والأسهم الفيروس في الفينول الحمراء الخالية المتوسطة لرؤية الحد بين النفط أحمر عرض في شعري والحل لتجنب الفيروسات وحقن الهواء في موقع الحقن الفيروس.
- وضع الماوس تخدير (الكيتامين-100 ملغ / كغ وزيلازين-10 ملغ / كلغ) على ظهرها مكشوفة.
- موقف رئيس الماوس تخدير تحت مجهر ستيريو المجهر وادخال الإبرة في الطبقة تحت الظهارة من الشفة العليا اليسرى على الحدود الجلدي المخاطي. حقن الفيروس في حل خطوتين (مرتين 0.5 ميكرولتر) بسرعة 0.5 ميكرولتر في 5 ثانية ملاحظة: احترام وقفة 10 ثانية بين اثنين من الحقن 0.5 ميكرولتر، لتمكين التعليق الفيروسية لاستيعاب في موقع الحقن.
- ضع الماوس فيوC حاضنة 37 درجة حتى الإيقاظ.
- ترك الماوس في مرافق حيوان لاسترداد للمرة المطلوبة ملاحظة: في نموذج الفأر، HSV-1 يؤدي الى العدوى الأولية، ودعا العدوى الحادة، التي تستمر أقل من 10 يوما في موقع التلقيح والأنسجة العصبية في غضون عدة بما في ذلك TGS، متفوقة العقد عنق الرحم (SCG)، والعقد الجذرية الظهرية (DRG) اعتمادا على موقع التلقيح. علامات العدوى الأولية تختفي تدريجيا، ويعتبر الكمون ثابتة تماما عن 28-30 يوما بعد الإصابة (نقطة في البوصة) فصاعدا. الأنسجة العصبية يمكن أن تحصد عادة من 4 نقطة في البوصة للدراسات عن العدوى الحادة، ومن 28 نقطة في البوصة للدراسات الكمون.
2. الماوس الإرواء الإصلاح
- إعداد الحلول التالية قبل البدء: 50ML من العازلة المالحة الفسيولوجية
60 مل من برنامج تلفزيوني 1X
150 مل من الطازجة بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني 1X
60 مل من السكروز 20٪ في برنامج تلفزيوني 1X. <ر /> - إعداد أنابيب نضح: ربط الإبرة إلى الشعيرات الدموية، وهذا مرتبط إلى مضخة تحوي.
- تخدير الماوس كما هو موضح أعلاه (1.2 SREP) ووضع على ظهرها على صينية التشريح، التي توليها أربع أرجل مع دبابيس.
- باستخدام مقص قطع الجلد من البطن يصل إلى الحلق *. المسيل للدموع بعيدا طبقة رقيقة الأنسجة التي تغطي الأجهزة. فتح القفص الصدري عن طريق خفض الأضلاع على جانب واحد من القص. إزالة الجلد عن طريق تمزيق. الابتعاد عن بعضها البعض اليمين واليسار أجزاء من القفص الصدري لكشف القلب ملاحظة: انتبه على عدم شق الشجاعة والرئتين والأوعية الكبيرة (الشرايين السباتية والأوردة الوداجي)، الأمر الذي سيجعل يروي-التثبيت مستحيلا.
- ادخال الإبرة في البطين الأيسر *. شق الأذين الأيمن مع مقص. المضي قدما في استنزاف عن طريق حقن 20 مل من المياه المالحة الفسيولوجية في الأوعية الدموية عن طريق القلب. السماح للتدفق الدم في الدرج. لاالشركة المصرية للاتصالات: خلال هذا الإجراء، وإيلاء الاهتمام على عدم ثقب من خلال الجانب الآخر من القلب.
- يروي مع 150 مل من PFA 4٪ في برنامج تلفزيوني 1X خلال 15 دقيقة * (تنبيه: PFA هي سامة، والتعامل معها تحت غطاء الدخان). يروي 60 مل من السكروز 20٪ في برنامج تلفزيوني 1X خلال 6 دقائق. في تلك المرحلة الماوس جاهز للحصاد TG ملاحظة: تعيين مضخة إلى 10 مل / دقيقة. ونضح جيدة الملاحظ عندما يتصلب ذيل الماوس لأعلى، وترفع ثم تسقط مرة أخرى.
3. TG حصاد
- إعداد الحل التالية قبل البدء:
20٪ سكروز في برنامج تلفزيوني 1X - قطع الرأس على مستوى الرقبة. قطع غيض من الأنف فقط وراء القواطع من أجل الكشف عن تجويف الأنف. شق الحنك في اثنين مع مقص والابتعاد كل جانب من الحنك ملاحظة: إن TGS يظهر فقط تحت الحنك، واثنين من الجماهير البيضاء ومستطيل من 2-3 ملم في الطول تقع على اليمين والجانب الأيسر وتوصيلها الى العصب مثلث التوائم.
- قطع فروع العصب مثلث التوائم على كل جانب من TGS للافراج عن TGS من جذع الدماغ. إزالة TGS مع كماشة الجراحية والاحتفاظ بها في 20٪ محلول معقم لمدة 24 ساعة السكروز ملاحظة: استخدام اثنين من المستلمين مختلفة لليسار واليمين TGS، لتجنب الخلط بين TG اليسرى (المصابة) وحق TG (لا أو إصابة ضعيفة). احتضان TGS في 20٪ سكروز في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 24 ساعة قبل التضمين.
- تضمين TGS في كتلة واحدة في cryosectioning تضمين المتوسطة وتجميد في -80 درجة مئوية.
- متجر كتل في -80 درجة مئوية حتى باجتزاء.
4. إعداد Cryosection
- قطع بالطول TGS إلى 10 ميكرومتر المقاطع على -20 درجة مئوية ناظم البرد، ووضعها على شرائح ساخنة قليلا (30 ° C) Superfrost. السماح للشرائح تجف لمدة 5-10 دقيقة ثم تجميد وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام ملاحظة: حتى 4-5 أقسام يمكن أن يكون جيش التحرير الشعبى الصينىدائرة الهندسة المدنية على شريحة واحدة، وإذا كان عدد كبير من المقاطع التي سيتم تجهيزها في نفس الوقت. نشرع على النحو التالي: يتم إيداع أقسام المسلسل على 3 سلسلة من الشرائح المسمى A1، B1، C1 و، ثم A2، B2، C2، وهلم جرا. وبالتالي، كل سلسلة الشريحة (A، B، و C) يمكن معالجتها لتلطيخ المختلفة (الموقع التهجين، FISH في، في الموقع PCR، LCM) والبيانات التي تم الحصول عليها باستخدام تقنيات مختلفة يمكن مقارنتها مع العلم أن الشرائح التي تحمل نفس الرقم تتوافق إلى نفس المنطقة من TG.
5. HSV-1 دقق وصفها
وصف بروتوكول الآخرة للكشف عن HSV-1 عن طريق الحمض النووي الجينوم FISH استخدمت بنجاح مع نوعين من تحقيقات. الأول هو CY3 المسمى التحقيق الفلورسنت محلية الصنع والتي هي مناسبة لتحليل غرامة التنظيم النووي داخل الخلايا الفردية، من خلال ارتفاع التكبير المجهري الفلورسنت. والثاني هو تحقيق البيروكسيديز المتاحة تجاريا، والتي يمكن الجمع بيند مع القائم البيروكسيديز إشارة التضخيم لتوفير إشارة مشرق. وهذا الأخير هو مناسبة لتحديد وتقدير من الفيروسات التي تحتوي على الخلايا العصبية في التكبير منخفضة في قسم كامل، وتحليل أنماط الجينوم HSV-1. يجب أن المستخدمين النهائيين تقييم النهج الذي يناسب الهدف من دراستهم. يتم سرد التحقيق المتاحة تجاريا في قسم كاشف، ويوصف إعداد التحقيق محلية الصنع أدناه.
- إعداد الحلول التالية قبل البدء:
HSV-1 الجينوم تحتوي على النواقل (راجع الخطوة 1)
70٪ من الإيثانول، البيولوجيا الجزيئية الصف. - . إعداد cosmids تحتوي على 30 كيلو بايت أجزاء من HSV-1 الجينوم (cosmids عدد 14، 28، و 56 وصفت في إشارة 20 باستخدام أعمدة تنقية مخصصة لناقلات كبيرة ملاحظة: نوع آخر من المكتبات التي تحتوي على HSV-1 الجينوم، مثل الكروموسومات البكتيرية المصطنعة ينبغي تعمل بشكل جيد، طالما يغطي التحقيق آلالدو جزء من الجينوم HSV-1 لإنتاج إشارة كافية 27-29. في أيدينا، لم تحقيقات مصنوعة من العمود الفقري ناقلات cosmid لا تنتج أي إشارة، وكانت تستخدم لمراقبة سلبية. واستخدمت ناقلات cosmid بأكمله وبالتالي تحتوي على HSV-1 تسلسل في دراستنا. ومن الممكن أيضا لقطع تسلسل HSV-1 واستخدامها لإعداد التحقيق.
- . التسمية 2 ميكروغرام لكل cosmid مع CY3-dCTP استخدام عدة نيك الترجمة وفقا لمبادئ توجيهية الصانع ملاحظة: إجراء وضع العلامات مع مزيج رد فعل تحتوي فقط CY3-dCTP ولا غير المسماة dCTP.
- وقف رد الفعل من خلال إضافة 3 ميكرولتر من 0.5 M EDTA في الخليط والتدفئة على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تبرد على الجليد.
- تنقية التحقيق على minicolumn جل G50 الاستبعاد. إضافة 150 ميكروغرام من الحمض النووي السلمون الحيوانات المنوية إلى التحقيق ويعجل التحقيق بواسطة الايثانول هطول الأمطار. وينبغي الوردي بيليه الحمض النووي بسبب CY3 التأسيس. غسل بيليه مع الايثانول 70٪ وإزالة الكثير من الإيثانولممكن مع ماصة. لا تدع بيليه الجافة.
- حل بيليه مع 100 ميكرولتر من الفورماميد منزوع الأيونات (تنبيه: الفورماميد سامة التلاعب تحت غطاء الدخان). تركيز التحقيق لا يمكن قياسها بشكل موثوق به في هذه المرحلة. الكميات المذكورة التحقيق داخل النص الرجوع إلى كمية من الحمض النووي القالب المستخدم لجعل التحقيق. بروتوكول كونها مبنية على 2 ميكروغرام من الحمض النووي القالب، و 100 ميكرولتر من الفورماميد، فهو يعتبر أن تكون 20 نانوغرام / ميكرولتر. المحل في -20 درجة مئوية. المسبار المسمى يمكن تحضير كمية كبيرة وتخزينها مجمدة لعدة أشهر.
6. الحمض النووي FISH
ويبين الشكل 1 لمحة عامة عن الخطوات الرئيسية لبروتوكول الحمض النووي FISH، وكيفية إجراء الحمض النووي FISH كجزء من تجربة متعددة لتلطيخ codetect RNA والبروتين، كما هو موضح في البروتوكولات 7-9.
- إعداد الحلول التالية قبل البدء:
0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1X
2X SSC و0.2x SSC العازلة
100 ملي درجة الحموضة 6.0 العازلة سيترات (10X محلول المخزون) و 10 ملي درجة الحموضة 6.0 العازلة سيترات (الحل العمل)
2X العازلة التهجين (انظر البروتوكول 4) - في يوم 1، ضع الشرائح على حامل الشرائح في درجة حرارة الغرفة، والسماح للأقسام تجف لمدة 10 دقيقة. دائرة الأقسام بالقلم مسعور. ترطيب المقاطع في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة. احتضان المقاطع 20 دقيقة مع 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1X لpermeabilize الأنسجة. غسل 3X 10 دقيقة مع 2X SSC، ونضع في 2X SSC حتى يتم تسخين المخزن المؤقت فضح (انظر أدناه).
- لإماطة اللثام، وإعداد صينية شريحة زجاجية (20 الشرائح القدرات) مليئة 200 مل من 10 ملي العازلة سيترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.0). وضع صينية في وعاء أكبر مملوء 500 مل من الماء المقطر. يسمح هذا الإعداد لتحسين السيطرة على نبضات التدفئة. قبل وضع الشرائح في علبة، سخن المخزن المؤقت في المايكرويف حتى بوffer يصل الغليان (حوالي 8 دقائق في 800 W).
- وضع الشرائح في علبة تحتوي على سترات العازلة مسخن، والتحقق من أنها مغطاة تماما مع العازلة. الحرارة لمدة 20 ثانية حتى تصل إلى المخزن المؤقت الغليان. الحذر، لا تدع المخزن المؤقت أكثر من الغليان، الأمر الذي قد يؤدي إلى تلف الأنسجة. يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. تكرار 6X دورة التدفئة (مجموع 7 دورات التدفئة) *. يبرد 2 دقيقة ونقل الشرائح في 2X SSC ل 5min.
ملاحظة *: هذه هي واحدة من الخطوات الأكثر أهمية. ينبغي تحديد العدد الأمثل ومدة دورات التدفئة تجريبيا، ويمكن أن تختلف على نوع من الأنسجة أو نوع من التحقيق المستخدمة. يجب أن تبقى الميكروويف، صينية، والحاويات وحجم المخزن المؤقت في علبة والماء في حاوية مماثلة لاستنساخ فضح. الغليان المفرط يمكن أن يؤدي إلى فقدان الأنسجة والخلايا التالفة. لكل نبض التدفئة، وراقب ظهور الغليان بعناية، والحرارةجي ينبغي التوقف عند أول علامات الغليان. مرة واحدة إعداد، يظهر فضح يظهر قوية وقابلة للتكرار. 2A الشكل الذي HSV-1 الجينوم يمكن الكشف عنها بواسطة فضح مع مخازن مختلفة، مشيرا إلى أن الظروف فضح يمكن مواصلة استكشافها. تم العثور على فضح مقرها سترات لتوفير باستمرار إشارة FISH جيدة، والحفاظ على الأنسجة، مع مقاطع من مختلف النماذج المختبرية والحيوان. - احتضان الشرائح في الميثانول: حمض الخليك: PBS مزيج (03:01:04) لمدة 15 دقيقة، ثم في الميثانول: مزيج حمض الخليك (3:1) لمدة 15 دقيقة (تنبيه: حامض الخليك هو تآكل التلاعب تحت الدخان. هود واستخدام حماية كافية. يعد هذا الحل الصحيح قبل الاستخدام).
- يذوى القسم خلال 10 دقيقة متتالية في الحضانة 70٪، ثم 2X 10 دقيقة في الإيثانول بنسبة 100٪. اسمحوا الجافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. الحفاظ على جفاف حتى التحقيق.
- إعداد الحل التحقيق على النحو التالي: إعداد مقدما 20 مل من 2X العازلة الأسهم التهجين المشتركntaining سلفات 20٪ ديكستران (MW 500،000)، والحل 2X دينهارت، 4x وSSC *. قسامة الحل إلى 500 ميكرولتر في microtubes، وتخزينها في -20 درجة مئوية. ل1 الشريحة (ساترة من 22 ملم × 50 ملم)، وخلط 90 نانوغرام من HSV-1 المسبار المسمى CY3 (30 نانوغرام من دقق في كل cosmid)، واستكمال وحدة التخزين إلى 40 ميكرولتر مع الفورماميد. إضافة 40 ميكرولتر من 2X العازلة التهجين. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
ملاحظة *: لتحضير العازلة 2X التهجين، مزيج 4 غرام من كبريتات ديكستران 500،000 ميغاواط في 10 مل من الماء المقطر. فإنه يجعل مزيج لزج التي تذوب على 3-4 ساعات في 70 درجة مئوية. مزيج بانتظام للمساعدة في حل. إضافة 4 مل من 20x وSSC، 400 ميكرولتر من الحل 100X دينهارت. استكمال 20 مل وتخلط جيدا باستخدام الدوامة. - إسقاط 80 ميكرولتر من الحل التحقيق على أقسام المجففة. تغطية مع ساترة 22 مم × 50 مم الزجاج، وتحقق من أن حل يحقق ينتشر أكثركامل سطح ساترة. الحذر: يجب أن يكون هناك أي فقاعات. وجود فقاعات يقلل كفاءة التهجين. ختم ساترة باستخدام الاسمنت والمطاط، واتركها لتجف. الحفاظ على الشرائح في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على الأقل للإشارة التهجين الأمثل في جميع أنحاء الشريحة.
ملاحظة: الاسمنت المطاط مريحة كما أنه يجف بسرعة، هو مقاوم للماء، ويحمي عينة من الجفاف خلال التهجين. كما أنه من السهل أن تقشر لإزالة ساترة بعد التهجين. طلاء الأظافر هو بديل فعال، ولكن الخيار أقل ملاءمة. - المضي قدما تمسخ عن طريق وضع الشرائح على شريحة حاضنة 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك، ضع الشرائح على صينية معدنية وتضع علبة في حمام الماء 80 درجة مئوية (علبة يجب تعويم). ثم نقل بسرعة الشرائح على صينية معدنية توضع على الجليد. يترك لمدة 5 دقائق. نقل الشرائح عند 37 درجة مئوية (سخان الشريحة أو حاضنة) للتهجين بين عشية وضحاها.
ملاحظة: نحن لا ننصح التهجين أقصر، مما يؤدي إلى ضعف أو عدم وجود إشارة. - في يوم 2، وإزالة الاسمنت والمطاط مع ملقط، مع الحفاظ على الشريحة على سخان للحفاظ على القسم عند 37 درجة مئوية. إزالة ساترة بلطف مع غيض من شفرة المشرط.
- غسل 3X مع 2X SSC عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وثلاث مرات مع 0.2x SSC عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يغسل مرة واحدة مع 2X SSC في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق والمضي قدما في تلطيخ DNA وتركيب (انظر البروتوكول 10 أدناه).
ملاحظة: يسمح هذا الأسلوب للكشف عن الأهداف الجيني الخلوية، وذلك باستخدام تحقيقات المقابلة في حل التحقيق مع HSV-1 تحقيقات محددة كما نشرت للالقسيم المركزي وتسلسل pericentromeric 22.
7. المزدوج الحمض النووي RNA FISH
انظر الشكل 1، وصناديق خضراء لمحة عامة.
لعدةتلطيخ الإجراءات بما في ذلك خطوة RNA-FISH، ينصح عموما لأداء أول اكتشاف الحمض النووي الريبي على هذا النحو هدف حساس للتدهور من قبل ريبونوكلياز والمواد الكيميائية. بالإضافة إلى ذلك، يتضمن إجراء الحمض النووي FISH العلاجات التي تقلل من كفاءة تلطيخ الأخرى. لRNA-FISH، اخترنا نهجا يستند الكشف عن انزيم (Tyramide إشارة التضخيم (TSA) باستخدام مجسات البيروكسيديز والبيروكسيديز (HRP) streptavidin جانب). ويستند TSA على ركيزة tyramide الفلورسنت (انظر الجدول كاشف للتفاصيل)، الذي يرتبط تساهميا إلى الأنسجة عن طريق تفاعل البيروكسيداز الأنزيمية. وهكذا حافظ على إشارة RNA-DNA-FISH خلال FISH.
- إعداد الحلول التالية قبل البدء:
ناقلات لفي المختبر النسخ من مكان LAT (pSLAT-2)
برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 2 ملي RVC
0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 2 ملي RVC
3٪ H 2 0 2 في الماء المقطر.
70٪، 80٪، 95٪ من الإيثانول، البيولوجيا الجزيئية الصف.
4x والحمض النووي الريبي حل التهجين (انظر البروتوكول 4) - قبل يوم واحد على الأقل التجربة RNA-FISH، وإعداد FISH التحقيق الحمض النووي الريبي. للكشف عن HSV-1 الإختفاء أسوشيتد نسخة (LAT)، وإعداد البيروكسيديز ريبو مسبار من pSLAT-2 ناقلات 30، أو ناقلات أخرى لفي المختبر النسخ من مكان LAT، كما هو موضح سابقا في إشارة 26. باختصار: يصبح خطي 10 ميكروغرام من pSLAT-2 مع HindIII وتنقية ناقلات هضمها مع مجموعة تنقية الحمض النووي. توليف واحدة حبلا ريبو مسبار من 2 ميكروغرام من هضمها pSLAT-2 مع T7 النسخ في المختبر عدة في وجود البيوتين-16-UTP *. تنقية التحقيق مع مصغرة العمود RNA وquantitate في 260 نانومتر باستخدام مطياف. تمييع التحقيق في 50 نانوغرام / ميكرولتر في الدناز / ريبونوكلياز المياه مجانا وتخزينها في -80 درجة مئوية، في مأخوذة صغيرة لتجنب دورات تجميد ذوبان.
ملاحظة *: والبيوتين-16-UTP: يجب تحديد نسبة UTP تجريبيا. نحن وس اوند نسبة 40:60 لتوفير تحقيقات الكشف بكفاءة عن طريق الحمض النووي الريبي LAT-FISH. - في يوم 1، ضع الشرائح على حامل الشرائح في درجة حرارة الغرفة، والسماح للأقسام تجف لمدة 10 دقيقة. دائرة الأقسام بالقلم مسعور. ترطيب المقاطع في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 2 مجمع ملي ريبونوكليوزيد Vanadyl (RVC) * لمدة 10 دقيقة. احتضان المقاطع لمدة 20 دقيقة مع 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 2 ملي RVC لpermeabilize الأنسجة. غسل 3X 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1X، 2 مم RVC. لإرواء أي نشاط البيروكسيديز الذاتية، واحتضان القسم في 3٪ H 2 O 2 ل2X 10 دقيقة، ثم يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X، 2 مم RVC.
ملاحظة *: طوال الإجراء RNA-FISH، ريبونوكليوزيد معقدة vanadyl (RVC) يضاف إلى مخازن والحلول لمنع تدهور الحمض النووي الريبي. - احتضان 2X 10 دقيقة في 70٪ من الإيثانول. في هذه المرحلة، أقسام يمكن تخزينها في الايثانول 70٪ في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع. يذوى المقاطع من قبل الحضانة في 80٪، 95٪، و 100٪ ETHأنول، 5 دقائق لكل منهما. السماح للقسم الجافة لمدة 10 دقيقة على الأقل.
ملاحظة: في بعض الحالات، يمكن علاج الإيثانول تكون ضارة للكشف عن أهداف أخرى. بروتوكول بديل باستخدام خطوة prehybridization في 50٪ الفورماميد - 2X SSC يمكن استخدامها (انظر أدناه في البروتوكول 9 لمزيد من التفاصيل على تلطيخ الثلاثي). ومع ذلك، والعلاج الإيثانول هو النهج الأكثر تنوعا لRNA-FISH ويوفر أدنى الخلفية. - إعداد الحل التحقيق على النحو التالي: إعداد مقدما 10 مل المخزون من 4X حل RNA التهجين التي تحتوي على 8X SSC، 20x وحل دينهارت، 4 ملي EDTA، 40٪ ديكستران *. قسامة الحل إلى 500 ميكرولتر في microtubes، وتخزينها في -20 درجة مئوية. ل1 الشريحة إعداد 80 ميكرولتر من الحل (ساترة من 22 ملم × 50 ملم)، عن طريق خلط 20 نانوغرام من riboprobe LAT البيروكسيديز، 40 نانوغرام من الحمض الريبي النووي النقال الخميرة، 2 مم RVC، والكامل إلى 20 ميكرولتر مع الماء. إضافة 20 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي حل 4x والتهجين، و 40 ميكرولترمن الفورماميد (50٪ تركيز النهائي). لتسهيل pipetting لوالاختلاط، فمن المستحسن أن prewarm على 4x والحمض النووي الريبي حل التهجين عند 75 درجة مئوية. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات.
ملاحظة *: لتحضير 4X حل RNA التهجين، مزيج 4 غرام من كبريتات ديكستران (MW 500،000) في 3 مل من الماء المقطر و 4 مل من 20x وSSC. فإنه يجعل مزيج لزج أن يذوب عليه 3-4 ساعة على 70 درجة مئوية. مزيج بانتظام للمساعدة في حل. إضافة 2 مل من محلول 100X دينهارت، و 80 ميكرولتر من حل EDTA 0.5 M. إكمال إلى 10 مل مع الماء وتخلط جيدا باستخدام الدوامة. الحذر: لا تستخدم سوى ريبونوكلياز / الدناز المنتجات الخالية. - تفسد التحقيق 10 دقيقة في 75 درجة مئوية. وفي الوقت نفسه، وضع الشرائح على شريحة معينة إلى حاضنة 65 درجة مئوية. إسقاط 80 ميكرولتر من الحل التحقيق على أقسام وبسرعة وضع ساترة على الهبوط. الحذر: يجب أن يكون هناك فقاعة. وجود فقاعات يقلل التهجين ممثل المؤسسةiciency. الحضانة يجب أن تتم في غرفة ترطيب نظرا لعدم وختم ساترة. استخدام إما حاضنة الشريحة التي يمكن أن تعقد المياه (انظر الجدول المادية)، أو إعداد غرفة ترطيب داخل صندوق مغلق ووضعه في الفرن التهجين C ° 65.
- احتضان بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية. ملاحظة: يتم LAT RNA-FISH بها في 65 درجة مئوية لمنع ملزم غير محدد من التحقيق، الذي يتم الاحتفال به في 37 درجة مئوية. يجب أن تحقيقات أخرى كثيرة RNA-FISH يؤدي إلى إشارة جيدة في 37 درجة مئوية.
- في يوم 2، قبل بدء الغسيل، وإعداد الكواشف كشف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للكشف عدة TSA. يتم إجراء الكشف مع TSA طقم الكشف التجارية بما في ذلك البيروكسيداز الفجل (HRP) streptavidin جانب وركيزة الفلورية الخضراء أو الزرقاء.
- الحفاظ على الشرائح على سخان الشريحة عند 65 درجة مئوية. إزالة بعناية ساترة وبسرعة إضافة 1 مل من 50٪ الفورماميد في 2X SSC، prewarmed لر 65 درجة مئوية. الحذر، لا تدع القسم الجافة. يغسل مرتين 10 دقيقة عند 65 درجة مئوية في 50٪ الفورماميد في 2X SSC و 2x 10 دقيقة في 2X SSC عند 65 درجة مئوية. يغسل مرة أخرى مع 2X SSC ووضع الشريحة على الشريحة سخان 37 درجة مئوية.
- المضي قدما في خطوة الكشف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة عدة الكشف TSA. تركيز HRP-streptavidin، وتركيز الركيزة الفلورسنت ووقت رد الفعل يجب أن تحدد تجريبيا *. للكشف عن الحمض النووي الريبي LAT، ونحن تستخدم بشكل روتيني الشرط التالي: HRP-streptavidin المخفف في 1/500، كاشف الفلورسنت في 1/100 لمضان الأزرق و 1/500 مخضر، وفترة رد الفعل من 10 دقيقة. إشارة يمكن التحقق بسرعة مع المجهر الفلورسنت المقلوب دون تصاعد مستمر، وقبل الشروع في الحمض النووي FISH.
ملاحظة *: إن بروتوكول التضخيم يكون التصميم وفقا للأهداف الرئيسية من التجربة. على سبيل المثال، إلى ناعما توطين RNA الهدف، هو الإعلانvised لاستخدام الوقت رد فعل قصيرة. في المقابل، لتحديد عدد الخلايا بسرعة وإيجابية في انخفاض التكبير، ويمكن زيادة وقت رد الفعل لتوليد إشارة مشرق. - لDNA-FISH، اتبع الإجراء المشار إليه أعلاه، بدءا من الخطوة فضح (الخطوة 6.2).
8. FISH-DNA المناعية
انظر الشكل 1، وصناديق الأرجواني لمحة عامة.
على نحو مماثل لRNA-DNA-FISH، وينصح لأداء أول المناعي، لأن الحمض النووي FISH من المرجح أن تفسد البروتينات ومنع الكشف عنها من قبل الأجسام المضادة. نوعية إشارة المناعي تعتمد بشكل كبير على خصائص الأجسام المضادة، وينبغي اختبار العديد من الأجسام المضادة كلما أمكن ذلك. يتم تنفيذ فضح حاتمة مرة واحدة قبل المناعي لتحسين كل من الكشف عن البروتين والحمض النووي FISH. للحفاظ على إشارة المناعي على العينة أثناء إجراء الحمض النووي FISH فمن الضروري COVربط alently إلى الأنسجة. نقدم هنا نهجين التي قدمت نتائج جيدة في أيدينا، كشف الأجسام المضادة آخر التثبيت وtyramide أساس (انظر الخطوة 8.5). يجب أن يكون الدافع وراء اختيار عن طريق اختبارات أولية لكل زوج المستهدف / الأجسام المضادة.
- إعداد الحلول التالية قبل البدء:
برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 3٪ مصل الماعز العادي (خ ع).
2٪ PFA في برنامج تلفزيوني 1X (التخفيف من محلول المخزون 4٪) - في يوم 1، والخطوات الأولى هي مطابقة لDNA-FISH، تصل إلى الخطوة فضح (الخطوات 6،1-6،2).
- بعد فضح، واحتضان المقاطع مع برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 3٪ NGS لمدة 1 ساعة.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 3٪ لمدة 24 ساعة NGS. أقل فترة حضانة يمكن استخدامها لتقصير البروتوكول، على الرغم من أننا وجدنا أن الحضانة بين عشية وضحاها النتائج عادة في إشارة أقوى. قد تكون هناك حاجة إلى 48-72 ساعة من الحضانة لانخفاض الأجسام المضادة الأولية تقارب مثل الغلوبولين المناعي.
- في يوم2، وغسل 3X 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1X.
- بروتوكول مع الأجسام المضادة بعد التثبيت: احتضان 1 ساعة مع الأجسام المضادة الثانوية إلى جانب وجود صبغة الفلورسنت الأخضر، في 1/200 في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 3٪ NGS. يغسل ثلاث مرات 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1X. يتم تنفيذ ما بعد التثبيت مع 2٪ PFA في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة *. غسل 3X 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1X.
بروتوكول مع الكشف TSA: احتضان 1 ساعة مع الأجسام المضادة الثانوية HRP-الديناميكي في 1/250 في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 3٪ NGS. يغسل ثلاث مرات 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1X. المضي قدما في الكشف tyramide وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. كما هو مبين أعلاه (الخطوة 7.9)، كاشف التخفيف وفترة رد الفعل يجب أن تحدد تجريبيا. في معظم الحالات، وقد استند بروتوكول لدينا على 1/500 التخفيف من الركيزة الفلورسنت وفترة رد الفعل 10 دقيقة. غسل 3X 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1X.
ملاحظة *: بعد التثبيت هو خطوة حاسمة في المناعية FISH، ويتطلب حذرا مجموعة المتابعة. أقوى منصب في تثبيت-أفضل إشارة IF، وانخفاض كفاءة الحمض النووي FISH. - المضي قدما في الحمض النووي FISH من الخطوة حمض الخليك الميثانول (الخطوة 6.3). مدة المناعية الحمض النووي FISH هو عادة 3 أيام، مع الضد الأول حضنت بين عشية وضحاها.
9. FISH المزدوج الحمض النووي RNA-مقرونا المناعي
انظر الشكل 1، وصناديق البرتقال لمحة عامة.
يتم تنفيذ RNA-FISH الأولى، تليها المناعي، وأخيرا الحمض النووي FISH. إذا تم الكشف المناعي عن طريق تفاعل tyramide، هو المفتاح لإرواء تماما النشاط HRP من الخطوة RNA-FISH مع H 2 O 2، والتحقق من أن تبريد فعالة. يتم ذلك باستخدام شريحة واحدة كعنصر تحكم "لا الأجسام المضادة الأولية".
بسبب الجفاف القائم على الايثانول هو ضار لبعض البروتينات الحساسة للمذيب، وهذه الخطوة من الحمض النووي الريبي-FISH يمكن أن تمنع المناعي. إذا كان الأمر كذلك، RNA-FISH لا يمكن أن يؤديها ثإيث بروتوكول بديل، كما هو مفصل أدناه في stpe 9.3.
- إعداد الحل التالية قبل البدء:
50٪ الفورماميد في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 2 ملي RVC - في يوم 1، وإعداد لجنة التحقيق RNA-FISH والمضي قدما على النحو RNA المزدوج ل-FISH، وصولا إلى H 2 O 2 خطوة التبريد (الخطوة 7.2).
- حالة 1، يعمل تلطيخ المناعي بعد الإيثانول الجفاف: المضي قدما RNA-FISH كما هو مبين أعلاه في الخطوات 7،3-7،9. ثم انتقل إلى الخطوة 9.6 أدناه.
- حالة 2، يتم منع تلطيخ المناعي عن طريق العلاج الإيثانول: ضع الشرائح في غرفة ترطيب على سخان الشريحة تعيين إلى 65 درجة مئوية واحتضان لمدة 1.5 ساعة في محلول يحتوي على 50٪ prehybridization الفورماميد، برنامج تلفزيوني 1X، و 2 ملي RVC. استنزاف الحل prehybridization وإسقاط 80 ميكرولتر من محلول التهجين كما هو مبين في الخطوات 7.4 و 7.5. ثم المضي قدما في تهجين الحمض النووي الريبي-FISH والكشف كما أشارت اعلاهه في الخطوات 7،6-7،9 (يوم 2 و 3).
- في يوم 2، بعد اكتمال RNA-FISH، والمضي قدما مع المناعية الحمض النووي FISH بدءا من الخطوة فضح (انظر الخطوة 6.2). ثم اتبع بروتوكول الحمض النووي المناعية FISH كما هو مبين أعلاه في الخطوات 8،2-8،6.
10. تركيب الشريحة والتصوير
- إعداد الحل التالية قبل البدء:
هويشت 33342 عند 0.5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني 1X - نوى وصمة عار لمدة 10 دقيقة مع دابي أو هويشت 33342 * عند 0.5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة. غسل 3X 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1X.
ملاحظة *: تنبيه إذا أحد أنظمة الكشف يستخدم صبغة الفلورسنت الأزرق، لا تستخدم دابي أو هويشت. بدلا من ذلك، استخدام الأصباغ الحمض النووي الفلورسنت مع أطياف الانبعاثات ضمن الطول الموجي الحمراء بعيدة مثل Topro3. - استنزاف أكبر قدر ممكن من السائل الشريحة. إسقاط 80 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة التي تحتوي على عامل antifading على واحدة من نهاية الشريحة. تغطية الأجزاء مع جودة بصرية عاليةساترة (رقم 1.5 الزجاج). السماح للساترة تنخفض ببطء عن طريق الحفاظ عليه في نهاية واحدة مع ملقط، من أجل السماح للانتشار المتوسطة المتزايدة على القسم دون فقاعات.
- ختم بطلاء الأظافر وتخزينها في 4 درجة مئوية في خانة الشريحة الظلام.
- الملاحظة المباشرة للإشارة الحمض النووي FISH كامنة HSV-1 الجينوم يتطلب التكبير الهدف 40X أو أعلى الغمر النفط، مع الفتحة العددية عالية (على سبيل المثال 40X NA 1.1، 60X 63X-NA 1.4، 100X NA 1.3) ومصدر ضوء الإثارة من أي ما يعادل على الأقل إلى مصباح الزئبق 100 واط. نحن ننصح باستخدام مجهر نقل عالية الكفاءة مثل تلك المقدمة من قبل الشركات المصنعة في السنوات ال 5 الماضية (انظر الجدول المعدات). يوفر المجهري متحد البؤر الأدوات اللازمة لجمع الصور مع انخفاض الخلفية نظرا لصناعة السيارات في مضان من الأنسجة، مثل باجتزاء رقيقة أو التصوير الطيفي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد عدة شهور من التجارب واسعة النطاق، اكتشفنا أن فضح الكيميائية القائمة على الحرارة الكامنة جعلت HSV-1 الجينوم المتاحة لفلوري التهجين في الموقع. خلال هذه العملية، حاولنا مختلف الإجراءات إماطة اللثام، والعلاجات فقط على أساس الحرارة (أي تسخين أقسام تصل إلى درجة حرارة الغليان الفرعية في فرن الميكروويف) ظهرت كفاءة. نحن بعد اختبار العديد من مخازن الملح التي يتم استخدامها بشكل روتيني في المناعية (IHC) والمجهر الإلكتروني لاسترداد الحواتم 31،32، بما في ذلك 0.01 M الرقم الهيدروجيني 6.0 السيترات العازلة (التي استخدمناها في كل دراساتنا)، برنامج تلفزيوني 1X، 1MM EDTA، 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4 والماء المقطر. في حين مخازن EDTA تميل إلى تلف الأنسجة، وكانت جميع مخازن أخرى مناسبة لHSV-1 الكشف، الذي يظهر بقع واحد كما أو متعددة داخل نواة الخلايا العصبية (الشكل 2A، لاحظ أن هذه الأنسجة هي غاية لصناعة السيارات في فلوري، الذي يظهر في بعض الصور كإشارة متجانسة في cytopالطب الاجتماعي الأمريكي اللاتيني). في أيدينا، ظهرت العازلة سيترات باستمرار لتوفير إشارة جيدة دون الإضرار الأنسجة وبالتالي تم اختياره لبروتوكول الروتينية لدينا.
استخدام المسمى مباشرة تحقيقات CY3 الحمض النووي (مصنوعة من أجزاء من HSV-1 الجينوم المستنسخة في cosmids) يقدم نتائج قوية وقابلة للتكرار. ومع ذلك، فإنه يتطلب وجود الوصول إلى HSV-1 مكتبات الجينوم. وبالتالي فإننا التحقق من أن لدينا بروتوكول ستعمل على أي شخص بعد الوصول فقط إلى تحقيقات تجارية. ويبين الشكل 2B HSV-1 الكامنة الكشف عن الجينوم بواسطة الحمض النووي FISH باستخدام عموم HSV-1 مسبار البيروكسيديز تم الحصول عليها من انزو الكيميائية الحيوية. على طول هذه الخطوط، ونحن اختبار ما إذا كان بروتوكول الحمض النووي FISH يمكن استخدامها من قبل العلماء باستخدام نماذج حيوانية أخرى HSV-1. يوضح الشكل 3A الكشف عن HSV-1 الجينوم على عينات من الفأرة والأرنب، المصابين ثلاث سلالات شائعة الاستخدام، SC16، 17syn + وMcKrae، في مرحلة إما حادة أو كامنة من العدوى، داخل أقسام ز مثلث التوائمأنجليا. في جميع الحالات تظهر HSV-1 الجينوم كإشارة متقطعا، من السطوع وكثافة التي تختلف من خلية إلى أخرى. أخيرا، ونحن تمديد تطبيق بروتوكول لدينا لدورة تنسخي من HSV-1، عن طريق إجراء الحمض النووي FISH على أنسجة الفئران من يخضع لعدوى الهربس العامة. في هذه الحيوانات يمكن أن يتم الكشف عن المجاميع الكبيرة ومشرق من HSV-1 الجينوم في الأنسجة المختلفة بما في ذلك الدماغ والنخاع الشوكي، العينين والظهرية العقد الجذرية (الشكل 3B).
لا تزال يفهم العديد من HSV-1 كمون جوانب سيئة، مثل كيفية تنظيم HSV-1 التعبير الجيني من خلال تفاعلاته مع بنية النووية 33-35، سواء مجموعة فرعية معينة من الخلايا العصبية ويفضل خلايا المضيف لإنشاء الكمون وتنشيط 13 ، 14،36،37، أو كيف الترصد المناعي يحدث في العقد وفقا لحمولة الفيروس أو فيروس التعبير الجيني 9،10. سوف بروتوكول الموصوفة هنا مساعدة في معالجة هذه الأسئلة، من خلالcodetection من HSV-1 الجينوم والرنا والبروتينات الفيروسية أو الخلوية. الشكل 4 يوضح codetection من HSV-1 الجينوم جنبا إلى جنب مع HSV-1 LAT الحمض النووي الريبي (أرقام 4A و 4C)، مع البروتينات الخلوية مثل القسيم المركزي البروتين CENP-A (الشكل 4B، IF تليها PFA بعد التثبيت)، أو لونين وحزب الرابطة الاسلامية-NB بروتين يرتبط ATRX (الشكل 4C، IF تليها الكشف TSA القائمة). يوضح الشكل 4C البيانات من التجربة تلطيخ الثلاثي تظهر HSV-1 الحمض النووي ( الأحمر)، LAT منتجاتها الحمض النووي الريبي (الازرق) والبروتين التنظيمية مرشح، ATRX (الخضراء). مزيج من بروتوكول لدينا الحمض النووي FISH والكشف المباشر أو الانزيم المستندة إلى RNA-FISH وإشارة المناعي، تمثل مجموعة متنوعة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع من الأدوات لاستكشاف العلاقة في الموقع الفيروس في استضافة على مستوى الخلية والأنسجة.
الشكل 1. نظرة عامة على بروتوكول الحمض النووي FISH والاندماج متعددة تلطيخ الهدف. وتتمثل الخطوات الرئيسية لبروتوكول الحمض النووي FISH والاتصال مع بروتوكولات لcodetection من الرنا والبروتينات تخطيطي. يشار إلى خطوات حاسمة من قبل علامات التحذير. الخطوات الرئيسية الحمض النووي FISH هي الإماهة، permeabilization، فضح، العلاج حامض الخليك والميثانول التهجين. ضمن الإجراء، إماطة اللثام هو خطوة حاسمة، والتي يجب أن يكون بعناية انشاء واحتراما. الاثنان الخطوات الحاسمة الأخرى التي تعتمد على الإجراءات الفنية متوافقة مع الأجسام المضادة المستخدمة لمناعي. وهذه تؤثر على الإجراء RNA-FISH لتلطيخ الثلاثي، وعلى استراتيجية كشف المناعي. Cلعق هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. . أعدت الكشف عن HSV-1 الجينوم الكامنة بعد فضح مستضد أقسام A. TG من 28 نقطة في البوصة الفئران المصابة كما هو مبين في القسم البروتوكول. تم تجهيز أقسام TG-FISH لDNA كما هو مبين في الشكل 1، وكان القائم على فضح الحرارة أداء باستخدام المخزن المؤقت المشار إليه على رأس كل صورة. وصفت الخطوط العريضة للنواة كخط متقطع. ومن المقرر أن صناعة السيارات في مضان من الأنسجة إشارة لوحظ في السيتوبلازم. أقسام B. TG أعد كما في A. تم تجهيزها لDNA-FISH باستخدام الحصول تجاريا البيروكسيديز HSV-1 التحقيق. تم الكشف عن التحقيق المهجنة باستخدام TSA وsubstra المسمى اليكسا فلورالشركة المصرية للاتصالات (الأخضر). تم counterstained النوى مع هويشت 33352 (الأزرق). ويرد على الصورة التي تم اقتصاصها الموسع في العمود الأيمن. يتم عرض نوعين من HSV-1 نمط الجينوم لتوضيح نموذجي HSV-1 التعريب داخل النواة. تم جمع كافة الصور على المجهر epifluorescence واسعة المجال. شريط المقياس 5 ميكرون. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. الكشف عن HSV-1 الجينوم في عدة نماذج. A. تم تطبيق بروتوكول الحمض النووي FISH القياسية لأقسام TG من أصول مختلفة. SC16 المصابين الماوس أعدت أقسام TG كما هو موضح في قسم البروتوكول. وقدمت 17syn + أقسام الماوس المصابة وMcKrae أقسام الأرانب المصابة التي كتبها العقيدlaborators. وقد تم جمع الصور على المجهر epifluorescence واسعة المجال. شريط المقياس 5 ميكرون. تم التضحية ب SC16 الفئران المصابة تمر عدوى الهربس العامة في 6 نقطة في البوصة، وجمعت العديد من الأنسجة، ومقطوع المجمدة. تم تطبيق بروتوكول الحمض النووي FISH القياسية كما هو مبين في الشكل 1. وقد تم جمع الصور على المجهر epifluorescence واسعة المجال. شريط النطاق هو 10 ميكرون. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 4. Codetection من HSV-1 الحمض النووي الجيني والرنا والبروتينات على أقسام واحد. تمت معالجة SC16 الماوس المصابة أقسام TG لFISH الحمض النووي RNA، DNA-FISH المناعية أو stainin الثلاثيز كما هو مبين في الشكل 1. A. FISH RNA-DNA باستخدام HSV-1 الجينوم CY3 المسبار المسمى (الحمراء) والبيروكسيديز ريبو مسبار-RNA LAT (الخضراء). تم الكشف عن الحمض النووي الريبي التحقيق LAT باستخدام TSA والركيزة المسمى اليكسا فلور 488. تم counterstained النوى مع هويشت 33352 (الأزرق) FISH B. المناعي الحمض النووي باستخدام مضاد للCENP-A الأجسام المضادة (الخضراء) وHSV-1 الجينوم CY3 المسبار المسمى (الحمراء). كانت الأجسام المضادة 10min بعد ثابت مع 1٪ PFA في برنامج تلفزيوني قبل تشغيل الحمض النووي FISH. تم counterstained النوى مع هويشت 33352 (الأزرق). C. المناعية RNA-DNA-FISH باستخدام الحمض النووي الريبي LAT البيروكسيديز ريبو مسبار (الأزرق)، والأجسام المضادة لمكافحة ATRX (الخضراء) والجينوم HSV-1 CY3 المسبار المسمى ( الحمراء). تم الكشف عن الحمض النووي الريبي باستخدام مسبار LAT الكشف tyramide والأزرق ركيزة fluorescently المسمى، وتم الكشف عن مكافحة ATRX والأجسام المضادة الثانوية من خلال الكشف tyramide والأخضر الركيزة fluorescently المسمى. تم جمع كافة الصور على الميدان واسعة epifluorescence مicroscope. شريط المقياس 5 ميكرون. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يسمح للكشف عن HSV-1 الجينوم الكامنة داخل الخلايا العصبية من الماوس أقسام الأنسجة العصبية. وقد فهمنا من مسارات تنظيم التعبير الجيني الفيروسي محدودة بسبب عدم وجود طريقة للكشف عن HSV-1 الحمض النووي الجيني في الموقع الطبيعي داخل الأنسجة العصبية. وجاءت المعلومات عن الجينوم في عدد النسخ ونسبة من الخلايا العصبية المصابة أساسا من تحليل PCR على الخلايا العصبية فصلها 11،12. في توضيح دور البنية النووية الخلية المضيفة على HSV-1 كمون، وضعنا لتحديد توطين الكامنة HSV-1 الجينوم بواسطة الحمض النووي FISH، داخل نواة الخلايا العصبية من الفئران المصابة خفية. اختبرناها مجموعة واسعة من بروتوكولات الحمض النووي FISH وعلاجات الأنسجة، وجدت القائم على الحرارة "فضح حاتمة" كخطوة أساسية من الفيروسات الكشف عن الحمض النووي FISH. ويستخدم هذا العلاج بشكل روتيني للكشف عن البروتين حاتمة داخل أقسام البارافين جزءا لا يتجزأ من لالمناعية. على الرغم من أنها تستخدم عالميا تقريبافي علم الأمراض، لم يتم استخدامه تقليديا في الحمض النووي FISH. في حين تدعم العديد من الدراسات أن هذا الأسلوب يحافظ على التشكل من الأنسجة على المستوى المجهري الخفيفة، وينبغي للمستخدم النهائي وتشمل الضوابط المناسبة للتحقق من صحة هذه النقطة في نظامه بيولوجية معينة 38. في أيدينا، لم فضح إجراءات أخرى مثل العلاج البروتيني لا تسمح HSV-1 الكشف عن الحمض النووي، في حين فضح القائم على الحرارة باستخدام مختلف مخازن مصنوعة باستمرار HSV-1 الحمض النووي الجيني الكامن المتاحة لتحقيقات FISH (الشكل 2). ويعتقد القائم على فضح الحرارة للقضاء على جزء من crosslinks بين البروتينات، مشيرا إلى أن HSV-1 الحمض النووي يرتبط بإحكام على البروتينات. وهذا يتفق مع المظاهرة الأخيرة التي يرتبط HSV-1 الجينوم الكامنة والتحللي مع الهستونات الخلوية 2،39،40. لأن ترتبط جينوم فيروس الهربس أخرى مع الهستونات: VZV 41؛ HCMV 42،43؛ EBV 44-46؛ KHSV 47-49، والبروتوكول الاضافيocol الموصوفة هنا يمكن تطبيقها للكشف عن فيروس الهربس من هذه الجينوم فضلا عن العديد من الآخرين، ولكن ربما أيضا للكشف عن الفيروسات النووية الثابتة الأخرى مثل فيروس الورم الحليمي، وفيروس التهاب الكبد B، والفيروسات القهقرية. ومن المثير للاهتمام، فإن استخدام البروتوكول الحالي على إعدادات مختلفة التجريبية (الأنسجة من الفئران والأرانب المصابة، أقسام مختلفة أعدت من قبل مختبرات، واستخدام مختلف HSV-1 سلالات) لا تتطلب إضافية مجموعة المتابعة للكشف عن HSV-1 الجينوم. لتطبيق بروتوكول لالنظم البيولوجية الأخرى، ونحن نتوقع أن الإجراء تثبيت المستضد وتقنيات الاسترجاع يمكن أن تكون مجالات مزيد من التطوير.
النهج التقليدي في تقييم HSV-1 كمون هو للكشف عن وجود الحمض النووي الريبي LAT مجتمعة لغياب الكشف عن المنتجات التحللي دورة الجينات في الخلايا العصبية. ومع ذلك، أشارت الدراسات التي تعتمد على PCR في الموقع وQPCR على الخلايا العصبية معزولة عن نماذج الماوس من الكمون أن عدد العصبونات المصابةكان عصبونات (الخلايا العصبية الإيجابية أي HSV-1 الجينوم) 02:58 الوقت أعلى من LAT معربا عن الخلايا العصبية 12،18. باستخدام الحمض النووي الريبي DNA-FISH، وأكد أنه في نموذج الفأر لدينا 20-30٪ من HSV-1 الحمض النووي الخلايا العصبية الإيجابية هي أيضا إيجابية للRNA LAT 22. استخدام الحمض النووي FISH وcodetection من الحمض النووي الفيروسي والخلوية، ومكونات الحمض النووي الريبي والبروتينات توفير مجموعة جديدة من الأدوات لتوصيف مسارات تنظيم HSV-1 الكامنة التعبير الجيني. بالإضافة إلى ذلك، ومن المعروف HSV-1 كمون أن يكون ظاهرة غير متجانسة كما يحدث في طائفة واسعة من الأنواع الفرعية الخلايا العصبية، ويتميز عدم التجانس في الجينوم عدد نسخ الحمض النووي الريبي والتعبير في LAT 12،22. وهناك فائدة كبيرة من الحمض النووي FISH هو لتوفير الوصول إلى تحليل خلية واحدة داخل تعقيد الأنسجة، وبالتالي أن تأخذ في الاعتبار تباين HSV-1 كمون. على سبيل المثال، ونحن ربطت التعبير عن LAT الحمض النووي الريبي مع وفرة من HSV-1 الجينوم في الخلايا العصبية الفردية 22. في الإعلانdition، قد يكون هذا الأسلوب ينطبق أيضا على تقييم الوضع من الجينوم الفيروسي باستخدام نماذج في المختبر زراعة الخلايا وكذلك النماذج الحيوانية باستخدام العقدة الإنسان زرعها في الفئران SCID 13-17. وسوف تطبيقها في المستقبل لدينا بروتوكول الحمض النووي FISH تكون إمكانية لتوصيف HSV-1 كمون من خلال عدد من HSV-1 جينوم الخلايا العصبية الإيجابية. هذا يمكن تنفيذها باستخدام تحقيقات البيروكسيديز وكشف القائم على tyramide، التي تنتج إشارة قوية بما فيه الكفاية ليتم الكشف عن تضخم منخفضة. يرصد هذا التطبيق ممكنا بفضل خلفية منخفضة للغاية التي تم إنشاؤها بواسطة نظام الكشف tyramide. وصفت CY3 HSV-1 تحقيقات وصفها في هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم كذلك ولكن يتطلب المراقبة في أعلى التكبير، والتي ستكون غاية لقراءة عدد كبير من أقسام تستغرق وقتا طويلا.
ربما الصفات الرئيسية للبروتوكول الحمض النووي FISH الموصوفة هنا هي براعة ومتانة، مما يجعلها متوافقة مع رانه codetection كل من الحمض النووي الريبي والبروتينات. بل وجدنا أن جميع العلاجات اللازمة للكشف عن الحمض النووي الريبي أو البروتين، أو كليهما، لا تغير من جودة وسطوع إشارة الحمض النووي FISH. RNA-FISH لا يمكن أن يؤديها قبل الحمض النووي FISH، وذلك باستخدام إما الإيثانول أو الجفاف prehybridization القائم على الفورماميد. نوصي بروتوكول المستندة إلى الإيثانول، مما يؤدي في أقل خلفية مع TSA الكواشف الكشف. وينبغي أن تستخدم بروتوكول المستندة إلى الفورماميد عندما يتبع RNA-FISH بواسطة المناعي مع الأجسام المضادة التي لا تعمل على عينات الإيثانول المعالجة. عند تنفيذ المناعية الحمض النووي FISH، ربط التساهمية للإشارة المناعي لا يمكن أن يؤديها من خلال الكشف على أساس tyramide (الذي تضخيم الإشارة)، أو عن طريق تثبيت آخر، للحفاظ على تفاصيل نمط البروتين التعريب. لتحسين تثبيت آخر، بروتوكول المناعي ينبغي أولا انشاء الحصول على إشارة قوية، وينبغي أن تحدد أقوى إجراء آخر التثبيت، مما يسمح للإشارة جيدة الحمض النووي FISH. هذا فيلل توفير مجموعة من الشروط التي ضمن أفضل حل وسط بين الحفاظ المناعي وإشارة الحمض النووي FISH يمكن الحصول عليها. كما لأي طريقة أخرى كشف القائم على الأجسام المضادة، وجودة الإشارة وأفضل البروتوكول تعتمد بشكل كبير على الأجسام المضادة نفسها. بروتوكول لدينا ليست استثناء ولقد لوحظ أن بعض الأجسام المضادة تعمل بشكل جيد جدا مع أي من بروتوكول الموصوفة هنا (على سبيل المثال لمكافحة حزب الرابطة الاسلامية ماب استنساخ 36.1) والبعض الآخر بحاجة إلى اختبار كبير. عموما، اكتشفنا بنجاح معظم هدفنا المقصود (كان استثناء البروتين SP100)، بما في ذلك حشوية وغشاء البروتينات، والبروتينات النووية المرتبطة المجالات النووية المختلفة (الكروماتين HP1، القسيم-CENP-A، CENP-B-، حزب الرابطة الاسلامية النووية هيئات الرابطة الاسلامية، Daxx، ATRX). على أساس تجاربنا ونحن نتوقع أن لدينا بروتوكول الحمض النووي FISH تكون متوافقة مع المناعية codetection من بنيات مراسل (β-غالاكتوزيداز، البروتينات الفلورية ...) التي تستخدم عادة لتحليل الترويجيالنشاط ثالثا من الجينوم الفيروسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر N. ساوتيل (الأطفال في سينسيناتي المركز الطبي في مستشفى سينسيناتي، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية)، S. افستاتيو (جامعة كامبريدج، المملكة المتحدة) وجيمس هيل (مركز العلوم الصحية LSU، نيو أورلينز، الولايات المتحدة الأمريكية) لتقديم عينات من HSV-1 الفئران والأرانب المصابة، على التوالي، وللمواد؛ H. ماسوموتو (معهد بحوث Kazusa الحمض النووي، شيبا، اليابان) وS. Khochbin (معهد ألبرت Bonniot، غرونوبل، فرنسا) لإجراء مناقشات مفيدة.
وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المركز الوطني للبحوث العلميه (CNRS) (برنامج ATIP، إلى PL، http://www.cnrs.fr)، والوكالة الفرنسية القومي للبحوث (وكالة الاستخبارات الوطنية) (ANR-05-MIIM- 008-01، CENTROLAT، http://www.agencenationale-recherche.fr )، ومؤسسة FINOVI ( http://www.finovi.org/:fr:start )، وLabEX DEVweCAN (ANR-10-LABX-61 ) من جامعة دي ليون، في إطار برنامج "Investissemenنهاية الخبر كوت أفينير "(ANR-11-0007-آيدكس) التي تديرها وكالة الاستخبارات الوطنية ( http://www.agence-nationale-recherche.fr )، أنا لا تصب جمعية بحوث السرطان مناهضة جنيه (ARC-ARC-7979 و 4910، http://www.arc-cancer.net )، الدوري الفرنسي الوطني كونتر جنيه السرطان (هروب، http://www.ligue-cancer.net )، والإنكا (برنامج EPIPRO، http://www.e -cancer.fr ). FC وPL هم باحثون CNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice | Janvier, France | 6 week-old females | |
| HSV-1 strains | SC16 strain (wild type) | See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation. | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma | K2753 | Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg) |
| Xylazine hydrochloride | Sigma | X1251 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood. |
| Physiological Saline | Sigma | 07982-100TAB-F | |
| 1x PBS, pH 7.4 (sterile) | Life Technologies | 10010-015 | |
| Sucrose | Sigma | 84100 | Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS. |
| Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound | SAKURA | 4583 | |
| Large vector DNA purification kit | Qiagen | 12462 | To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C |
| Nick translation kit | Roche Applied Sciences | 10 976 776 001 | |
| Cy3-dCTP | GE Healthcare | PA53021 | Protect from light |
| 0.5 M EDTA | Sigma | E6758 | |
| G50 Mini spin column | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Salmon sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| Ethanol molecular biology grade | Sigma | 87047 | Prepare a 70% solution |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| Formamid Molecular biology grade | Sigma | F9037 | Caution. Manipulate under fume hood. |
| HSV-1 biotinylated commercial probe | Enzo Life Sciences | ENZ-40838 | |
| ImmEdge hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| 20x Saline Sodium Citrate (SSC) | Sigma | S6639 | Prepare a 2x SSC solution in ddH20. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use. |
| 10 mM Sodium citrate pH 6.0 | Sigma | S1804 | Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use. |
| Acetic Acid | Sigma | 320099 | |
| Methanol, molecular biology grade | Sigma | 322415 | |
| Dextran sulfate - MW 500,000 | Euromedex | EU0606-A | |
| Denhardt's solution (100x) | Euromedex | 1020-A | |
| Rubber Cement "FixoGum" | Marabut | 290110000 | |
| DNA purification kit - Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| T7 in vitro transcription kit | Ambion Life Technologies | AM1314 | |
| Biotin-16-UTP | Roche Applied Sciences | 11388908910 | |
| RNA purification minicolumn | Qiagen | 73404 | |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | New England Biolabs | S1402S | |
| H2O2 | Sigma | H3410 | Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light. |
| Yeast tRNA | Invitrogen | 15401011 | prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| Primary antibodies | any supplier | The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology) | |
| Secondary fluorescent antibodies | Invitrogen Life Technologies | The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001) | |
| Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence) | Invitrogen Life Technologies | #T20937 | TSA kits are also available from Perkin Elmer |
| Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence) | Invitrogen Life Technologies | #T20932 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen Life Technologies | H3570 | Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution. |
| 22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glass | Electron Microscopy Sciences | 72204-04 | |
| Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science |
| Superfrost glass slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| Equipment/Material | Company | Reference | Note |
| Needle for infection | Glass micropipette hot drawn. Custom made. | ||
| Dissection equipment | Moria, France | Microsurgical scissors and forceps | |
| Peristaltic pump | Cole Palmer Instruments | Easyload Masterflex | |
| Microsyringe pump device (Nano Pump) | kdScientific | KDS310 | |
| Cryostat | Leica France | CM 1510-1 | |
| -80 °C freezer | Sanyo | Ultra Low -80 °C | |
| Domestic microwave oven | |||
| Dry block heater | Eppendorf | 022670204 | |
| Incubator Slide moat | Boekel Scientific | 240000 | |
| Coplin Jar | Dominique Dutscher | 68512 | |
| Staining glass container | Dominique Dutscher | 68506 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series |
References
- Knipe, D. M., Cliffe, A. Chromatin control of herpes simplex virus lytic and latent infection. Nat. Rev. Microbiol. 6 (3), 211-221 (2008).
- Bloom, D. C., Giordani, N. V., Kwiatkowski, D. L. Epigenetic regulation of latent HSV-1 gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 3-4 (2010).
- Stevens, J. G., Wagner, E. K., Devi-Rao, G. B., Cook, M. L., Feldman, L. T. RNA complementary to a herpesvirus alpha gene mRNA is prominent in latently infected neurons. Science. 235 (4792), 1056-1059 (1987).
- Zwaagstra, J., Ghiasi, H., Nesburn, A. B., Wechsler, S. L. In vitro promoter activity associated with the latency-associated transcript gene of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 70, 2163-2169 (1989).
- Farrell, M. J., Dobson, A. T., Feldman, L. T. Herpes simplex virus latency-associated transcript is a stable intron. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (3), 790-794 (1991).
- Umbach, J. L., Kramer, M. F., Jurak, I., Karnowski, H. W., Coen, D. M., Cullen, B. R. MicroRNAs expressed by herpes simplex virus 1 during latent infection regulate viral mRNAs. Nature. 454 (7205), 780-783 (2008).
- Jurak, I., Kramer, M. F., et al. Numerous conserved and divergent microRNAs expressed by herpes simplex viruses 1 and 2. J. Virol. 84 (9), 4659-4672 (2010).
- Wagner, E. K., Bloom, D. C. Experimental investigation of herpes simplex virus latency. Clin. Microbiol. Rev. 10 (3), 419-443 (1997).
- Held, K., Junker, A., et al. Expression of herpes simplex virus 1-encoded microRNAs in human trigeminal ganglia and their relation to local T-cell infiltrates. J. Virol. 85 (19), 9680-9685 (2011).
- Held, K., Eiglmeier, I., et al. Clonal expansions of CD8⁺ T cells in latently HSV-1-infected human trigeminal ganglia. J. Neurovirol. 18 (1), 62-68 (2012).
- Sawtell, N. M. Comprehensive quantification of herpes simplex virus latency at the single-cell level. J. Virol. 71 (7), 5423-5431 (1997).
- Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation. J. Virol. 72 (7), 5343-5350 (1998).
- Bertke, A. S., Swanson, S. M., Chen, J., Imai, Y., Kinchington, P. R., Margolis, T. P. A5-positive primary sensory neurons are nonpermissive for productive infection with herpes simplex virus 1 in vitro. J. Virol. 85 (13), 6669-6677 (2011).
- Bertke, A. S., Ma, A., Margolis, M. S., Margolis, T. P. Different mechanisms regulate productive herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 infections in adult trigeminal neurons. J. Virol. 87 (11), 6512-6516 (2013).
- Kobayashi, M., Kim, J. Y., et al. A primary neuron culture system for the study of herpes simplex virus latency and reactivation. J. Vis. Exp. (62), (2012).
- Kim, J. Y., Mandarino, A., Chao, M. V., Mohr, I., Wilson, A. C. Transient reversal of episome silencing precedes VP16-dependent transcription during reactivation of latent HSV-1 in neurons. PLoS Pathog. 8 (2), (2012).
- Zerboni, L., Che, X., Reichelt, M., Qiao, Y., Gu, H., Arvin, A. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J. Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Mehta, A., Maggioncalda, J., et al. In situ DNA PCR and RNA hybridization detection of herpes simplex virus sequences in trigeminal ganglia of latently infected mice. Virology. 206 (1), 633-640 (1995).
- Chen, X. -P., Mata, M., Kelley, M., Glorioso, J. C., Fink, D. J. The relationship of herpes simplex virus latency associated transcript expression to genome copy number: a quantitative study using laser capture microdissection. J. Neurovirol. 8 (3), 204-210 (2002).
- Proenca, J. T., Coleman, H. M., Connor, V., Winton, D. J., Efstathiou, S. A historical analysis of herpes simplex virus promoter activation in vivo reveals distinct populations of latently infected neurones. J. Gen. Virol. 89, 2965-2974 (2008).
- Nicoll, M. P., Proença, J. T., Connor, V., Efstathiou, S. Influence of herpes simplex virus 1 latency-associated transcripts on the establishment and maintenance of latency in the ROSA26R reporter mouse model. J. Virol. 86 (16), 8848-8858 (2012).
- Catez, F., Picard, C., et al. HSV-1 Genome Subnuclear Positioning and Associations with Host-Cell PML-NBs and Centromeres Regulate LAT Locus Transcription during Latency in Neurons. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
- Solovei, I., Grasser, F., Lanctôt, C. FISH on Histological Sections. CSH Protoc. , (2007).
- Labetoulle, M., Kucera, P., et al. Neuronal propagation of HSV1 from the oral mucosa to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (9), 2600-2606 (2000).
- Labetoulle, M., Maillet, S., Efstathiou, S., Dezelee, S., Frau, E., Lafay, F. HSV1 latency sites after inoculation in the lip: assessment of their localization and connections to the eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (1), 217-225 (2003).
- Maillet, S., Naas, T., et al. Herpes simplex virus type 1 latently infected neurons differentially express latency-associated and ICP0 transcripts. J. Virol. 80 (18), 9310-9321 (2006).
- Tanaka, M., Kagawa, H., Yamanashi, Y., Sata, T., Kawaguchi, Y. Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo. J. Virol. 77 (2), 1382-1391 (2003).
- Gierasch, W. W., Zimmerman, D. L., Ward, S. L., Vanheyningen, T. K., Romine, J. D., Leib, D. A. Construction and characterization of bacterial artificial chromosomes containing HSV-1 strains 17 and KOS. J. Virol. Methods. 135 (2), 197-206 (2006).
- Nagel, C. -H., Döhner, K., et al. Nuclear egress and envelopment of herpes simplex virus capsids analyzed with dual-color fluorescence HSV1(17). J. Virol. 82 (6), 3109-3124 (2008).
- Arthur, J., Efstathiou, S., Simmons, A. Intranuclear foci containing low abundance herpes simplex virus latency-associated transcripts visualized by non-isotopic in situ hybridization. J. Gen. Virol. 74, 1363-1370 (1993).
- Pileri, S. A., Roncador, G., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J. Pathol. 183, 116-123 (1997).
- Saito, N., Konishi, K., Takeda, H., Kato, M., Sugiyama, T., Asaka, M. Antigen retrieval trial for post-embedding immunoelectron microscopy by heating with several unmasking solutions. J. Histochem. Cytochem. 51 (8), 989-994 (2003).
- Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J. Cell Biol. 134 (4), 815-826 (1996).
- Sourvinos, G., Everett, R. D. Visualization of parental HSV-1 genomes and replication compartments in association with ND10 in live infected cells. EMBO J. 21 (18), 4989-4997 (2002).
- Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J. Virol. 81 (20), 10991-11004 (2007).
- Margolis, T. P., Imai, Y., Yang, L., Vallas, V., Krause, P. R. Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) establishes latent infection in a different population of ganglionic neurons than HSV-1: role of latency-associated transcripts. J. Virol. 81 (4), 1872-1878 (2007).
- Imai, Y., Apakupakul, K., Krause, P. R., Halford, W. P., Margolis, T. P. Investigation of the mechanism by which herpes simplex virus type 1 LAT sequences modulate preferential establishment of latent infection in mouse trigeminal ganglia. J. Virol. 83 (16), 7873-7882 (2009).
- Shi, S. -R., Shi, Y., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades. J. Histochem. Cytochem. 59 (1), 13-32 (2011).
- Lu, X., Triezenberg, S. J. Chromatin assembly on herpes simplex virus genomes during lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 217-222 (2010).
- Placek, B. J., Berger, S. L. Chromatin dynamics during herpes simplex virus-1 lytic infection. Biochim. Biophys. Acta. 1799 (3-4), 223-227 (2010).
- Eshleman, E., Shahzad, A., Cohrs, R. J. Varicella zoster virus latency. Future Virol. 6 (3), 341-355 (2011).
- Paulus, C., Nitzsche, A., Nevels, M. Chromatinisation of herpesvirus genomes. Rev. Med. Virol. 20 (1), 34-50 (2010).
- Nitzsche, A., Paulus, C., Nevels, M. Temporal dynamics of cytomegalovirus chromatin assembly in productively infected human cells. J. Virol. 82 (22), 11167-11180 (2008).
- Zhou, J., Chau, C. M., et al. Cell cycle regulation of chromatin at an origin of DNA replication. EMBO J. 24 (7), 1406-1417 (2005).
- Day, L., Chau, C. M., Nebozhyn, M., Rennekamp, A. J., Showe, M., Lieberman, P. M. Chromatin profiling of Epstein-Barr virus latency control region. J. Virol. 81 (12), 6389-6401 (2007).
- Arvey, A., Tempera, I., Lieberman, P. M. Interpreting the Epstein-Barr Virus (EBV) Epigenome Using High-Throughput Data. Viruses. 5 (4), 1042-4254 (2013).
- Lu, F., Day, L., Gao, S. -J., Lieberman, P. M. Acetylation of the latency-associated nuclear antigen regulates repression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus lytic transcription. J. Virol. 80 (11), 5273-5282 (2006).
- Günther, T., Grundhoff, A. The epigenetic landscape of latent Kaposi sarcoma-associated herpesvirus genomes. PLoS Pathog. 6 (6), (2010).
- Toth, Z., Maglinte, D. T., et al. Epigenetic analysis of KSHV latent and lytic genomes. PLoS Pathog. 6 (7), (2010).
