Summary
우리는 동물 모델의 조직 섹션 내의 영속 DNA 바이러스 게놈의 검출을 위해 현장 하이브리드 프로토콜에 형광등을 설치했다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈의 codetection, 자사의 RNA 제품, 단일 세포 내에서 바이러스 또는 세포 단백질에 의해 감염 과정을 연구 할 수 있습니다.
Abstract
유전자의 단일 세포 codetection, 그 RNA 제품 및 세포 조절 단백질의 유전자 발현 조절을 연구하는 것이 중요합니다. 이 바이러스학 분야의 도전, 특히 핵 복제 지속적인 DNA 바이러스에 대한 자신의 연구를위한 동물 모델을 포함하는. 단순 헤르페스 바이러스 1 형 (HSV-1) 말초 신경에있는 평생 잠복 감염을 확립한다. 잠재 바이러스가 재 활성화하고 새로운 포진 에피소드를 유도있는 저수지 역할을합니다. HSV-1 대기 세포 생물학 의한 동물 모델에서 반응계에서 HSV-1 게놈을 검출하는 방법의 부족 부분에서 제대로 이해 남아있다. 우리는 접근 방식이 효율적으로 감염된 동물 모델에서 신경 조직의 섹션 내에서 낮은 복사 바이러스 게놈을 검출하는 현장 하이브리드 화 (물고기)의 DNA 형광을 설명합니다. 이 방법은 열 기반의 항원 마스크 해제에 의존 직접 표시 집에서 만든 DNA 프로브, 또는 상업적으로 이용 가능한 프로브. 우리는 트리플 스테인레스로 개발닝 방법, 각 염색의 요구 사항을 수용하기 위해 과산화 효소 기반의 신호 증폭을 사용하여, RNA-FISH 및 면역과 DNA-FISH를 결합. 주요 개선은 공 초점 현미경과 넓은 필드 종래의 표면 형광에 의해 고해상도로 영상화 할 수있는 10 μm의 조직 섹션, 낮은 배경 신호 내에서 획득 할 수있는 기능입니다. 또한, 트리플 염색은 세포 및 바이러스 단백질에 대한 항체의 다양한했다. 전체 프로토콜은 조직 내에서 항체 프로브의 침투를 수용하기 위해 2.5 일이 소요된다.
Introduction
단순 포진 바이러스 타입 1 (HSV-1)은 복제하고 확산하기 위해 주기적으로 재 활성화되는 말초 신경계의 삼차 신경절 (TG)의 뉴런에서 장기 잠재 감염을 수립, 지속적인 인간의 신경성 바이러스입니다. HSV-1 유전자는 숙주 세포의 게놈 1,2에 통합하지 않는 다중 사본 chromatinized 플라스미드를 유지 호스트 신경 세포의 핵에있는 1백50킬로바이트 dsDNA의 지역화입니다. 대기 시간 동안, HSV-1 증식하는주기 유전 프로그램은 강력하게 억제하고, 유전자 발현이 지연 설립에서 재 활성화 3 개시의 지연에 관련된 성적 증명서 (LAT) 현장에 제한됩니다. LAT는 주요 2킬로바이트 안정 올가미로 처리 긴 8.5 KB 비 암호화 RNA, 그리고 몇 가지의 miRNA 4-7을 생산하고 있습니다. HSV-1 지연 따라서 바이러스 게놈 DNA, LAT의 RNA, 및 검출 증식하는주기 단백질의 부재의 존재에 의해 특징입니다.
"ontent> 동물 모델을 주로 쥐와 토끼, 인간의 대기 시간의 몇 가지 기능을 recapitulating 실험 모델입니다. 그 모델의 주요 관심사 중 하나는 그들이 면역 호스트에서 HSV-1 대기의 생리 학적 측면을 연구 할 수 있다는 것입니다. 지난 수십 년 동안 이러한 유전자 변형 바이러스 및 마우스와 같은 많은 실험 도구, 생리학, 유전학, 동물 조직에서 HSV-1 대기의 세포 생물학을 연구하기 위해 개발되었다. 지금까지 바이러스 게놈 DNA가 검출과 정량 남부 오점으로되었다 해리 TGS에서 qPCR에가. 그러나, 현재 조직 섹션 8. 결과적으로, 대기 시간이 정기적으로 현장 하이브리드의 RNA에 의해 LAT RNA의 검출보다는 통해 조직 학적 섹션에 평가됩니다에 현장 하이브리드 화에 의해 HSV-1 유전자를 검출 할 수있는 방법이 없습니다 바이러스 게놈 검출.는 바이러스 게놈의 존재, 생에 근거 감염된 세포를 특성화하는 것이 불가능했기 때문에의 기술적 한계는 바이러스 게놈 세포 및 바이러스 유전자 발현 또는 숙주 세포 - 매개 면역 반응 9,10 사이의 관계와 같은 호스트 바이러스 상호 작용의 많은 양상의 분석에 중요한 결점이다.가장 중요한 것은, 잠재 감염의 세포 간 이질성이 상대적으로 미개척 남아 있고 마우스와 SCID 마우스에 11-17로 이식 된 인간의 감각 신경절의 신경 세포 지연의 주요 기능이 될 것으로 나타났다. 일반적으로, 그것은 셀 당 HSV-1 유전자의 카피 수는 5에서 수백에 달라 qPCR에 의해 표시되었다. LAT는 대기 시간 및 재 활성화의 중요한 규칙으로 표시되지만, 고립 된 뉴런과 현장 PCR에서의 qPCR 데이터는 잠재적으로 감염된 신경 세포의 서브 세트 만, 낮은 30 %가, LAT 궤적 11,12,18-21을 표현하는 것으로 나타났다. 방법은 숙주 세포와 바이러스 레이턴시 스타일에 티슈 영향 내의 셀룰러 환경바이러스 성 유전자 발현이 불분명하게 남아있다. 여기에서 우리는 동물의 신경 조직 섹션 내에서 낮은 복사 HSV-1 게놈 DNA의 효율적인 검출을위한 현장 하이브리드 화 (물고기) 방식으로 강력한 형광을 설명합니다. 이 방법은 설계 및 숙주 세포 내 핵 부품 (22)과 함께 바이러스 게놈의 상호 작용을 연구하는 데 필요한 고해상도 현미경 이미징에 대한 액세스를 얻기 위해 우리가 사용되었다. 또한, 우리는 바이러스 유전자 발현을 조절 바이러스 호스트 상호 작용을 설명하기위한 유일한 도구이다 RNA 및 단백질과 바이러스 성 DNA의 동시 검출을위한 다수의 염색 방법을 서술. 상기 방법은 또한 다수의 섹션에 감염된 신경 정량화로서 HSV-1 잠상 게놈의 검출을 요구하는 분석의 넓은 범위에 적용될 수있다. 주요 단계는 하이브리드에 바이러스 DNA에 액세스 할 수 있도록 항원 검색 처리를 적용하는 것입니다. 따라서,이 프로토콜은 검출에 효율적입니다동물 조직 내에서 기존의 DNA-FISH 방식에 의해 현재 검출되지 않은 다른 dsDNA 바이러스의.
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Protocol
이 방법은 이전에 22 일 발표 된 연구에 사용되었다. ISH, IF 및 FISH에 대한 일반적인 배경과 기존의 조작의 설명을 위해, 우리는 다음과 같은 사용 가능한 문학 (23)를 제안한다.
1. 동물 감염
실험 동물과 관련된 모든 절차는 비전있는 연구를위한 협회와 안과 연구에서 동물의 사용 (ARVO) 문에서 윤리적 인 문제에 준거하고, 유럽 공동체에 따라 UPR-3296-CNRS의 지역 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 위원회 지침 86/609/EEC. 모든 동물은 음식과 물에 대한 무제한 액세스를 받았다.
HSV-1 아래 설명과 마우스 감염의 방법은 이전에 24 일부터 26 일 발표 된 연구에 이용되고있다.
- 시작하기 전에 준비하기 위해 다음과 같은 솔루션을 준비 :
HSV-1 바이러스 원액
솔루션을 마취 - Ketamine-100 ㎎ / kg 자일 라진 및 10 ㎎ / kg - 0.1 μL / 초를 제공 또는 마이크로 펌프 장치에 연결 5 μL 유리 또는 마이크로로 바이러스의 1 μL (10 6 PFU)를 차지 참고 :. 빨간색 기름 사이의 한계를 확인하기 위해 페놀 빨간색 배지에서 바이러스 주식에 resuspend 모세관 및 바이러스 용액에 존재하는 바이러스 접종 부위의 공기 분사를 피하기 위해.
- 그 뒷면이 위로에 마취 된 마우스 (케타민-100 ㎎ / ㎏과 자일 라진 - 10 ㎎ / ㎏)을 놓습니다.
- 양안 입체 현미경으로 마취 된 쥐의 머리를 배치하고 피부 점막 경계에서 왼쪽 윗입술의 피하 층에 바늘을 삽입합니다. 5 초 당 0.5 μL의 속도로 두 단계 (2 회 0.5 μL)에 바이러스 솔루션을 주입 참고 :. 주사 부위에서 흡수하는 바이러스 서스펜션을 사용하려면, 두 개의 0.5 μL 주사 사이에 10 초 일시 정지를 존중합니다.
- 마우스를 놓습니다각성 할 때까지 37 ° C의 배양기.
- 필요한 시간을 복구하는 동물 시설에서 마우스를 남겨 주 :. 마우스 모델에서 HSV-1이 접종의 사이트 등 여러 신경 조직 내에서 10 일 미만 지속 급성 감염라는 차 감염을, 유도 TGS, 접종 장소에 따라 우수한 경추 신경 (SCG)과 후근 신경절 (DRG). 차 감염의 증상은 점차적으로 사라지고 대기가 완전히 이후 대략 28-30 일째 감염 (dpi)로 설립 된 것으로 간주됩니다. 신경 조직은 급성 감염에 대한 연구 4 dpi로에서 일반적으로 수확 및 대기 연구를위한 28 dpi로에서 할 수있다.
2. 마우스 관류 - 수정
- 생리 식염수 버퍼의 50ML를 : 시작하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비
1X PBS의 60 ML
1X PBS에서 갓 준비 4 % 파라 포름 알데히드 150 ㎖
1X PBS의 20 % 자당의 60 ML. <BR /> - 관류 튜브를 준비 연동 펌프에 연결되어있는 모세 혈관에 바늘을 연결합니다.
- (SREP 1.2) 전술 한 바와 같이 마우스를 마취 핀과 네 개의 다리로 연결된 해부 트레이에의 뒷면에 누워.
- 사용 가위 * 목까지 배의 피부를 잘라. 장기를 덮고있는 얇은 조직 층을 떨어져 눈물. 흉골의 한면에 갈비뼈를 절단하여 흉곽을 엽니 다. 찢어하여 피부를 제거합니다. 서로 떨어져 마음을 공개하는 흉곽의 오른쪽과 왼쪽 부분을 이동 참고 :. perfuse - 고정이 불가능하게됩니다 내장, 폐, 큰 혈관 (경동맥과 경정맥)를 절개하지 않도록주의를 기울이십시오.
- * 좌심실에 바늘을 삽입합니다. 가위로 우심방 절개. 심장을 통해 혈관에 생리 식염수 20 ㎖를 주입하여 일어난 과다 출혈로 진행합니다. 트레이에 혈액의 흐름을 보자. 없음테 :이 절차를 수행하는 동안, 심장의 다른 측면을 통해 구멍을 뚫거나하지 않도록주의를 기울이십시오.
- 15 분 * 동안 1X PBS에 4 % PFA 150 ㎖로 Perfuse (주의 : PFA는 독성, 흄 후드 조작). 6 분 동안 1X PBS에 20 %의 슈 크로스 60 밀리리터를 Perfuse. . 그 단계에서 마우스 TG 수확 주에 대한 준비가되어 있습니다 : 10 ㎖ / 분으로 펌프를 설정합니다. 좋은 관류 마우스 꼬리가 경화 할 때, 눈에 띄는 다시 가을 들어 올립니다.
3. TG 수확
- 시작하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 :
1X PBS의 20 % 자당 - 목의 수준에서 머리를 잘라. 코 구멍을 표시하기 위해 단지 앞니 뒤에 코 끝을 잘라. 가위로 두 미각을 절개 및 구개의 각 측면을 멀리 이동 참고 :. TGS, 그냥 입맛 아래에 나타납니다 두 개의 흰색과 직사각형 오른쪽에있는 길이 2 ~ 3 ㎜의 질량 등왼쪽 사이드 및 삼차 신경에 연결되어 있습니다.
- 뇌간에서 TGS를 해제 TGS의 양쪽에있는 삼차 신경의 가지를 잘라. 수술 플라이어 TGS를 제거하고 24 시간 주에 대한 20 %의 자당 무균 용액에 보관 :.를 사용하여 왼쪽과 오른쪽 TGS에 대한 두 개의 서로 다른받는 사람이, 왼쪽 TG (감염)과 오른쪽 TG (하지 나 사이에 혼동을 피하기 위해 약하게) 감염. 삽입하기 전에 24 시간 동안 1X PBS의 20 % 자당에 TGS를 품어.
- C. -80 ° 중간 정지를 포함 저온 절편 제작에서 하나의 블록에 포함 TGS
- 스토어 블록 -80 ° C에서 절편까지.
4. 동결 절단 (Cryosections) 준비
- 에 10 μm의 섹션으로 TGS의 세로로 잘라 -20 ° C의 저온 유지 장치, 약간 가열 (30 ° C) Superfrost 슬라이드 그들을 놓습니다. . 조각은 5 ~ 10 분 후 -80 ° C 사용 주까지에서 동결 및 저장 동안 건조하자 : 최대 4 ~ 5 절은 괞 찮아 할 수 있습니다섹션들의 다수가 동시에 처리 할 경우, 하나의 슬라이드에 세드릭. 우리는 다음과 같이 진행 : 시리얼 섹션 등등 A1, B1 표시된 슬라이드의 3 시리즈에 입금하고, C1, 다음 A2, B2, C2하고 있습니다. 따라서, 각 슬라이드 시리즈 (A, B, 및 C)은 (동일계 PCR, LCM에서 원위치 혼성화 FISH에) 다른 염색을 위해 처리 될 수 있고, 다른 기술을 사용하여 얻어진 데이터는 동일한 번호를 운반 슬라이드 대응한다고 알고 비교 될 수있다 TG의 같은 지역에.
5. HSV-1 프로브 레이블
프로토콜은 DNA FISH에 의한 HSV-1 게놈의 검출을 위해 이하 설명 성공적 프로브의 두 종류로 사용되고있다. 첫번째는 고배율 형광 현미경으로 개별 셀 내의 핵 조직의 미세 분석에 적합한 홈 메이드 Cy3가 표지 된 형광 프로브이다. 둘째는 결합 될 수 시판 바이오틴 프로브이며밝은 신호를 제공하기 위해 퍼 옥시 다제 기반 신호 증폭과 함께 D. 후자는 전체 섹션 저배율에서 뉴런을 포함하는 바이러스의 식별 및 정량화하는 데에 바람직하고, HSV-1 게놈 패턴 분석. 최종 사용자는 자신의 연구의 목표를 가장 잘 맞는 방법으로 평가한다. 시판 프로브 시약 섹션에 나열되고, 집에서 만든 프로브의 제조에 대하여 설명한다.
- 시작하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 :
HSV-1 게놈 포함하는 벡터 (1 단계 참조)
70 % 에탄올, 분자 생물학 등급. - . HSV-1 게놈 30 킬로바이트 부분을 포함하는 코스 미드은 (번호 14, 28 코스 미드, 56 큰 그림에 전념 정화 열을 사용하여 기준 (20)에 설명 된 준비 참고 사항 : 박테리아 인공 염색체로 HSV-1 게놈을 포함하는 라이브러리의 다른 입력해야 한 프로브가 알을 커버로, 잘 작동충분한 신호 27 ~ 29를 생산하는 HSV-1 게놈의 아게 부분. 우리 손에, 코스 미드 벡터 백본에서 만든 프로브는 신호를 생성하지 않았고, 대조군으로 사용 하였다. HSV-1 시퀀스를 포함 따라서 전체 코스 미드 벡터는 우리의 연구에 사용되었다. 이 HSV-1 서열을 잘라 프로브를 제조하는 데 사용하는 것도 가능하다.
- . 라벨 제조 업체의 지침에 따라 흠 변환 키트를 사용하여를 Cy3 - dCTP 각 코스 미드의 2 μg 참고 :를 Cy3 - dCTP없이 레이블이없는 dCTP를 포함하는 반응 혼합물에 라벨을 수행합니다.
- 10 분 동안 70 ° C에서 혼합물을 가열 0.5 M EDTA의 3 μl를 추가하여 반응을 중지합니다. 얼음에 냉각.
- G50 겔 제외 minicolumn에 프로브를 정화. 프로브에 연어 정자 DNA 150 μg을 추가하고 에탄올 침전에 의해 프로브를 침전. DNA 펠렛 인해 Cy3에 혼입에 핑크되어야한다. 70 % 에탄올로 펠렛을 씻고 많은 에탄올을 제거피펫 가능한. 펠릿 건조하게하지 마십시오.
- 탈 포름 아미드 100 μL로 펠렛을 용해 (주의 : 포름 아미드는 독성 흄 후드에서 조작 할 수 있습니다.). 프로브 농도는 확실하게이 시점에서 측정 될 수 없다. 텍스트에서 언급 된 프로브 수량은 프로브를 만드는 데 사용되는 템플릿 DNA의 양을 참조하십시오. 프로토콜은 DNA 템플릿과 포름 아미드 100 μL의 2 μg를 기반으로하기 때문에, 그것은 20 NG / μL로 간주됩니다. -20 ° C.에 저장 표지 프로브는 대량 제조 및 수개월 냉동 저장 될 수있다.
6. DNA-FISH
그림 1은 DNA-FISH 프로토콜 및 방법 프로토콜 7-9에 설명 된대로, RNA 및 단백질을 codetect하기 위해 여러 염색 실험의 한 부분으로 DNA-FISH를 수행하는 방법의 주요 단계에 대한 개요를 보여줍니다.
- 시작하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 :
1X PBS 0.5 % 트리톤 X-100
2X SSC와 0.2 배의 SSC 버퍼
100 mM의 pH를 6.0 구연산 버퍼 (배 원액)와 10 mM의 pH를 6.0 구연산 버퍼 (작업 용액)
2X 하이브리드 화 버퍼 (프로토콜 4 참조) - 1 일에, 실온에서 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓고 섹션 10 분 동안 건조하자. 소수성 펜 부분을 동그라미. 10 분 1X PBS의 섹션을 재수. 조직을 투과하는 1X PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100 부 20 분 배양한다. 세척 배 10 배 SSC로 분하고, 마스크를 제거하는 버퍼가 가열 될 때까지 (아래 참조) 2X SSC 유지.
- 마스크 제거, 10 mM의 시트르산 나트륨 완충액 (pH 6.0) 200 ㎖로 채워진 유리 슬라이드 트레이 (20 슬라이드 용량)을 제조. 증류수 500 ㎖로 가득 찬 큰 용기에 용지함을 놓습니다. 이 설정은 가열 펄스의 더 나은 제어 할 수 있습니다. 트레이에 슬라이드를하기 전에, BU 때까지 전자 레인지에 버퍼를 예열ffer는 (800 W에서 8 분 정도) 끓는점에 도달한다.
- 예열 된 구연산 버퍼 함유 트레이에 슬라이드를 배치하고 그들이 완전히 버퍼에 포함되어 있는지 확인합니다. 가열은 대략 20 초 동안 버퍼는 비점에 도달 할 때까지. 주의, 조직에 손상을 줄 수있는 종기를 통해 버퍼를하게하지 마십시오. 2 분 동안 실온에서 냉각. 가열 사이클 6X (7 가열 싸이클 총) *을 반복한다. 2 분 냉각과 5 분에 2 배 SSC에 슬라이드를 전송합니다.
* 참고 : 이것은 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 가열 사이클의 최적의 수와 재생 시간은 경험적으로 결정되어야하고, 조직의 유형 또는 사용되는 프로브의 종류에 따라 변할 수있다. 전자 레인지, 트레이, 컨테이너와 컨테이너의 트레이와 물에 버퍼의 볼륨 마스크 해제의 재현성 동일한 보관해야합니다. 과도한 비등 조직 손실 및 손상된 세포가 발생할 수 있습니다. 각 가열 펄스의 경우, 비등의 모양을주의 깊게 지켜, 열됩니다ING는 끓는의 첫 번째 징후를 중지해야합니다. 설정이 완료되면, 마스크를 제거하는 강력하고 재현. 그림 2A는 마스크 해제 조건이 더 탐구 할 수 있음을 나타내는, HSV-1 유전자가 다른 버퍼를 폭로하는 감지 할 수 있다는 것을 보여줍니다 나타납니다. 구연산 기반 마스크 해제는 지속적으로 다양한 실험과 동물 모델에서 부분으로, 좋은 FISH 신호 및 조직 보존을 제공하는 것으로 밝혀졌다. - 초산 : 메탄올의 슬라이드를 품어 15 분 동안 PBS 믹스 (3시 1분 4초를) 다음 메탄올 : 15 분 (주의에 대한 아세트산 혼합 3:1 : 아세트산 부식성 연기에서 조작 할 수 있습니다. 후드 및 적절한 보호를 사용합니다.) 바로 사용하기 전에이 솔루션을 준비합니다.
- 70 %에 연속 10 분 배양을 통해 섹션을 탈수 한 후 100 % 에탄올에 10 분을 2 배. 10 분 동안 실온에서 건조하자. 프로빙 할 때까지 건조하게 유지.
- 다음과 같이 프로빙 솔루션을 준비 : 사전에 2 배 하이브리드 버퍼 공동 20 밀리리터를 준비20 % 덱스 트란 황산 (MW 500,000), 배 덴 하르트 솔루션, 배의 SSC *를 ntaining. -20 ° C에서 500 마이크로 튜브에 μL 및 저장소로 솔루션을 나누어지는 1 슬라이드 (X 50mm 22mm의 coverslip에) 들어, HSV-1 Cy3로 표지 된 프로브 (각 코스 미드에 대한 프로브의 30 NG)의 90 NG를 혼합하고, 포름 아미드 40 μL 볼륨을 완료합니다. 2X 하이브리드 화 버퍼 40 μl를 추가합니다. 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 잘 섞는다.
* 참고 : 2X 하이브리드 화 버퍼를 준비 증류수 10 ㎖에 50 만 MW 덱스 트란 황산 4 g을 혼합합니다. 그것은 70 ℃에서 3~4시간에 용해 점성 혼합한다 용해하기 위해 정기적으로 섞는다. 20 배 SSC, 100 배 덴 하르트 용액 400 μL의 4 ML을 추가합니다. 20 ㎖에 완료하고 소용돌이를 사용하여 잘 섞는다. - 건조 섹션에 솔루션을 프로빙의 80 μl를 삭제합니다. 22mm X 50mm 유리 커버 슬립 커버 및 프로빙 솔루션을 통해 확산되었는지 확인커버 슬립의 전체 표면. 주의 : 기포가 없어야합니다. 거품의 존재는 하이브리드의 효율을 감소시킨다. 고무 시멘트를 사용하여 커버 슬립을 밀봉하고, 건조 할 수 있습니다. 슬라이드에 걸쳐 최적의 혼성화 신호에 대해 적어도 2 시간 동안 실온에서 어두운 곳에서 슬라이드 유지.
참고 : 빠르게 건조로 고무 시멘트 편리, 방수 및 하이브리드 동안 건조 샘플을 보호합니다. 그것은 하이브리드 후 커버 슬립을 제거 벗겨도 간단합니다. 매니큐어 효율적인 대안입니다, 그러나 더 적은 편리한 옵션. - 5 분 동안 80 ° C의 슬라이드 인큐베이터에 슬라이드를 배치하여 변성을 진행합니다. 또한, 금속 트레이에 슬라이드를 배치하고 (트레이가 떠 있어야합니다) 80 ° C의 물을 욕조에 트레이를 배치합니다. 그런 다음 신속하게 얼음에 배치 금속 트레이에 슬라이드를 전송합니다. 5 분 동안 둡니다. 하룻밤 하이브리드 37 ° C (슬라이드 히터 인큐베이터)에 슬라이드를 전송합니다.
참고 : 우리는 짧은 약한 결과 하이브리드, 또는 신호가 사용하지 않는 것이 좋습니다. - 37 ° C에서 섹션을 유지하기 위해 히터에 슬라이드를 유지하면서 2 일에, 집게와 고무 시멘트를 제거 메스 블레이드의 끝으로 부드럽게 커버 슬립을 제거합니다.
- 5 분, 5 분, 37 ° C에서 0.2 배의 SSC 3 회 37 ° C에서 2 배 SSC로 세척 배. 5 분 동안 실온에서 2 배 SSC 한 번 씻고 DNA 염색하고 설치를 진행합니다 (아래 프로토콜 10 참조).
참고 :이 방법은 중심 소체와 pericentromeric 시퀀스 22 일 발표 한 HSV-1의 특정 프로브와 함께 프로빙 솔루션에 해당 프로브를 사용하여, 세포의 게놈 대상의 탐지 할 수 있습니다.
7. 이중 RNA-DNA 물고기
그림 1, 개요 녹색 상자를 참조하십시오.
복수를 위해RNA-FISH의 단계를 포함하는 절차를 염색, 그것은 일반적으로 최초의 대상으로 RNA의 검출을 수행하는 것이 좋습니다는 RNAse가 화학 물질에 의한 열화에 민감합니다. 또한, DNA-FISH 절차는 다른 염색의 효율성을 줄이는 치료를 포함한다. RNA-FISH를 위해, 우리는 (바이오틴 프로브와 퍼 옥시 다제 (HRP) 결합 된 스트렙 타비 딘을 사용하여 Tyramide 신호 증폭 (TSA)) 효소 기반 탐지 방식을 선택했다. TSA는 공유 결합 퍼 옥시 다제 효소 반응에 의해 조직에 연결된 형광 tyramide 기판 (상세 시약 표 참조)에 근거한다. RNA-FISH 신호 따라서 DNA-FISH 동안 보존됩니다.
- 시작하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 :
벡터 LAT 현장의 시험 관내 전사들 (pSLAT-2)
1X PBS는 2 ㎜ RVC를 포함
2 ㎜ RVC를 함유하는 1X PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100
3 % H 증류수 2 0 2.
70 %, 80 %, 95 % 에탄올, 분자 생물학 등급.
배속 RNA 혼성화 용액 (프로토콜 4 참조) - 적어도 하루 RNA-FISH 실험 전에 RNA의 FISH 프로브를 준비합니다. 이전 기준 26에 설명 된대로, HSV-1 대기 시간 관련 증명서 (LAT)을 감지 pSLAT-2 벡터 (30), 또는 LAT 궤적의 시험 관내 전사의 또 다른 벡터에서 바이오틴 리보 프로브를 준비합니다. 간단히 : HindIII에 함께 pSLAT-2의 10 μg을 선형화 DNA 정제 키트와 함께 소화 벡터를 정화. 비오틴-16-UTP의 존재하에 T7 시험 관내 전사 키트 *로 분해 pSLAT-2의 2 μg으로부터 단일 가닥 리보 프로브를 합성. RNA 미니 열이 프로브를 정화하고 분광 광도계를 사용하여 260 nm에서 정량. 냉동 - 해동주기를 피하기 위해 작은 분량 씩, -80 ° C에서 DNA 분해 효소 / RNAse가없는 물과 가게에서 50 NG / μL에서 프로브를 희석.
참고 * : 비오틴-16-UTP : UTP 비율은 경험적으로 결정해야합니다. 우리 Found 40:60 비율은 효율적으로 RNA-FISH에 의해 LAT를 검출하는 프로브를 제공합니다. - 1 일에, 실온에서 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓고 섹션 10 분 동안 건조하자. 소수성 펜 부분을 동그라미. 10 분 동안 2 ㎜ 리보 바나 딜 단지 (RVC) *을 포함하는 1X PBS의 섹션을 재수. 조직을 투과하는 2 ㎜ RVC를 함유하는 1X PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100으로 20 분간 부화 섹션. 1X PBS, 2 ㎜ RVC로 3 배 10 분 씻으십시오. 어떤 내인성 과산화 효소 활성을 해소 배 10 분 동안 3 % H 2 O 2의 섹션을 배양하고 1X PBS, 2 ㎜ RVC 한 번 씻어.
* 참고 : RNA-FISH 절차 전반에 걸쳐, (RVC) 리보 바나 딜 단지는 RNA 저하를 방지하기 위해 버퍼 및 솔루션에 추가됩니다. - 70 % 에탄올에 2 배 10 분 알을 품다. 이 단계에서, 섹션은 몇 주 동안 -20 ° C에서 70 % 에탄올에 저장 될 수 있습니다. 80 %의 배양, 95 % 및 100 % ETH으로 섹션을 탈수anol, 5 분마다. 적어도 10 분 동안 부분 건조 보자.
참고 : 어떤 경우에는, 에탄올 치료는 다른 대상의 탐지를위한 유해 할 수 있습니다. 50 %의 포름 아미드의 예비 혼성화 단계를 사용하여 다른 프로토콜 - 2X SSC는 (트리플 염색에 대한 자세한 내용은 프로토콜 9 아래 참조)를 사용할 수 있습니다. 그러나, 에탄올 치료는 RNA-FISH를위한 가장 다양한 방법입니다 가장 낮은 배경을 제공합니다. - 다음과 같이 프로빙 솔루션을 준비 : 사전에 준비 10 ㎖ 8 배 SSC, 20 배 덴 하르트 용액, 4 mM의 EDTA, 40 % 덱스 트란 *을 포함하는 배 RNA 하이브리드 솔루션의 주식. -20 ° C에서 500 마이크로 튜브에 μL 및 저장소로 솔루션을 나누어지는 1 슬라이드 20 바이오틴 LAT riboprobe의 NG, 효모 tRNA의 40 NG, 2 ㎜ RVC, 물 20 ㎕의 완전한 혼합하여, 솔루션 (X 50mm 22mm의 coverslip에) 80 μl를 준비합니다. 배 RNA 하이브리드 용액 20 μL, 40 μl를 추가합니다포름 아미드 (50 % 최종 농도)의. 쉽게 피펫과 혼합의 경우, 75 ℃에서 4 배의 RNA 하이브리드 솔루션을 prewarm하는 것이 좋습니다 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 잘 섞는다.
* 참고 : 배 RNA 하이브리드 용액을 제조 증류수 3 ㎖ 및 20 배 SSC 4 ㎖에 덱스 트란 황산 4 G (MW 500,000)를 혼합합니다. 그것은 70 ℃에서 3 ~ 4 시간에 용해 점성 혼합한다 용해하는 데 도움이 정기적으로 섞는다. 100 배 덴 하르트 용액 2 ㎖ 및 0.5 M EDTA 용액 80 μl를 추가합니다. 물 10 ㎖에 완료하고 소용돌이를 사용하여 잘 섞는다. 주의 : 이는 RNAse / DNase의 제품을 무료로 사용할 수 있습니다. - 75 ° C에서 프로브 10 분 변성 한편, 65 ° C로 설정 슬라이드 인큐베이터에 슬라이드를 배치 섹션에 프로브 솔루션의 80 μl를 삭제하고 신속하게 드롭에 커버 슬립을 배치합니다. 주의 : 아무 거품이 없어야합니다. 거품의 존재는 하이브리드 EFF의 감소iciency. 배양은 coverslip에 밀봉되지 않기 때문에 가습 실에서 개최한다. (자료 표 참조) 물을 보유하거나, 밀폐 된 상자 안에 가습 실을 준비하고 65 ° C의 하이브리드 오븐에 배치 할 수있는 슬라이드 인큐베이터 하나를 사용하십시오.
- 65 ° C. 주에서 밤새 품어 : LAT RNA-FISH는 37 ℃에서 관찰되는 프로브의 비특이적 결합을 방지하기 위해 65 ° C에서 수행된다 다른 많은 RNA-FISH 프로브는 37 ° C에서 좋은 신호가 발생한다
- 2 일에, 세척을 시작하기 전에, TSA 검출 키트의 제조 업체의 지침에 따라 검출 시약을 준비합니다. 검출은 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)에 결합 된 스트렙 타비 딘과 녹색 또는 파란색 형광 기판과 상용 TSA 검출 키트와 함께 수행됩니다.
- 65 ° C에서 슬라이드 히터에 슬라이드를 유지 조심스럽게 커버 슬립을 제거하고 신속하게 2X SSC에서 50 %의 포름 아미드 1 mL를 넣고 데워진t 65 ° C. 주의 섹션을 건조시키지 않는다. 65 ° C에서 2 배 SSC에서 50 %의 포름 아미드에 65 ° C에 두 번 10 분 씻어 배 SSC의 2 배 10 분 2X SSC로 다시 한 번 세척하고 37 ° C의 슬라이드 히터의 슬라이드를 놓습니다.
- TSA 검출 키트 제조 업체의 지시에 따라 검출 단계를 진행합니다. HRP-스트렙 타비 딘의 농도는, 형광 기질의 농도와 반응 시간은 경험적으로 결정되어야한다 *. 1 / 500으로 희석 한 HRP-스트렙 타비 딘, 파란색 형광 녹색 형광 1 / 500 1 / 100에 형광 시약, 10 분의 반응 시간 : LAT RNA 검출을 위해, 우리는 정기적으로 다음과 같은 조건을 사용했다. 신호를 신속하게 DNA-FISH를 진행하기 전에, 설치하지 않고 거꾸로 형광 현미경으로 확인할 수 있습니다.
* 참고 : 증폭 프로토콜은 실험의 주요 목표에 따라 디자인 될 것입니다. 예를 들어, 미세 대상 RNA를 집중, 그것은 광고입니다짧은 반응 시간을 사용할 vised. 대조적으로, 신속하게 식별하고 저배율에서 양성 세포를 세어, 반응 시간은 밝은 신호를 생성하기 위해 증가 될 수있다. - DNA-FISH를 들어, 마스크를 제거하는 단계 (6.2 단계)에서 시작하여, 전술 한 바와 절차를 따르십시오.
8. 면역 DNA 물고기
그림 1, 개요 보라색 상자를 참조하십시오.
마찬가지로 RNA-DNA-FISH에, 그것은 DNA-FISH는 단백질을 변성 및 항체에 의해 자신의 탐지를 방지 할 가능성이 있기 때문에, 먼저 면역을 수행하는 것이 좋습니다. 면역 형광 신호의 품질은 항체의 특성에 매우 의존적이며, 몇개의 항체는 가능할 때마다 테스트되어야한다. 에피토프는 마스크 해제 단백질 검출 및 DNA-FISH를 모두 개선하는 면역 전에 한 번 수행된다. DNA-FISH가 진행되는 동안 샘플에 대한 면역 형광 신호를 보존하기는 COV 할 필요가있다alently 조직에 연결합니다. 우리는 여기에 우리의 손에 좋은 결과를 제공하는 두 가지 방법, 항체 후 고정 및 tyramide 기반 탐지 (단계 8.5 참조)를 제시. 선택은 각 대상 / 항체 쌍의 예비 시험에 의해 구동되어야한다.
- 시작하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 :
1X PBS 3 % 정상 염소 혈청 (NGS)을 함유.
1X PBS의 2 % PFA (4 % 원액의 희석) - 1 일에 첫 번째 단계는 (6.1-6.2 단계) 마스크 해제 단계까지, DNA-FISH와 동일합니다.
- 마스크를 해제 한 후, 1X PBS가 1 시간 동안 3 % NGS를 포함와 섹션을 품어.
- 24 시간 동안 3 % NGS를 함유하는 1X PBS에 희석 차 항체와 함께 배양한다. 우리는 밤새 인큐베이션 통상 강한 신호가 발생하였습니다 비록 니더 배양 시간은 프로토콜을 단축 할 수있다. 배양의 최대 48 ~ 72 시간은 IgM이 낮은 친화력 차 항체해야 할 수 있습니다.
- 날2, 1X PBS로 3 배 10 분 세척.
- 항체 후 고정과 프로토콜 : 3 % NGS를 포함 1X PBS의 1 / 200에 녹색 형광 염료와 결합 된 이차 항체로 1 시간을 품어. 1X PBS로 3 시간 10 분을 씻으십시오. 후 고정은 10 분 *에 1X PBS에 2 % PFA로 수행됩니다. 1X PBS로 3 배 10 분 씻으십시오.
TSA의 탐지 프로토콜 : 3 % NGS를 포함 1X PBS의 1 / 250의 HRP-결합 된 이차 항체와 1 시간을 품어. 1X PBS로 3 시간 10 분을 씻으십시오. 제조업체의 지침에 따라 tyramide 검출을 진행합니다. (단계 7.9), 시약 희석 반응 시간 상기 한 바와 같이 경험적으로 결정해야합니다. 대부분의 경우에, 우리는 프로토콜 형광 기판의 1 / 500 희석하고 10 분 반응 시간을 기반으로되었다. 1X PBS로 3 배 10 분 씻으십시오.
* 참고 : 후 고정은 면역 FISH에서 중요한 단계이며,주의 셋업이 필요합니다. 후 고정 강한더 IF 신호, 및 더 낮은 DNA-FISH 효율. - 메탄올 - 아세트산 단계 (6.3 단계)에서의 DNA-FISH를 진행합니다. 면역 DNA-FISH 기간은 하룻밤 배양 최초의 항체로, 통상적으로 3 일입니다.
9. 면역 형광과 결합 이중 DNA-RNA의 FISH
그림 1, 개요, 오렌지 상자를 참조하십시오.
RNA-FISH는 먼저 수행 면역 다음에, 그리고 마지막으로 DNA-FISH된다. 면역 형광은 tyramide 반응에 의해 검출되는 경우에, H 2 O 2를 가진 RNA-FISH 단계에서 완전히 HRP 활성을 급냉하고, 그 냉각이 효율적으로 확인 키이다. 이것은 하나의 슬라이드를 "아니오 차 항체"컨트롤로 사용하여 수행됩니다.
에탄올 기반의 탈수 일부 용매에 민감한 단백질 해로운 때문에, RNA-FISH의이 단계는 면역을 억제 할 수 있습니다. 그렇다면, RNA-FISH는 w를 수행 할 수 있습니다STPE 9.3 아래에 설명 된대로 i 번째 다른 프로토콜.
- 시작하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 :
2 mM의 RVC를 포함 1X PBS에서 50 %의 포름 아미드 - 1 일에, RNA-FISH 프로브를 준비하고 H 2 O 2 냉각 단계 (단계 7.2)까지, 이중 RNA-FISH도 진행합니다.
- 사례 1은 면역 형광 염색 에탄올 탈수 후 작동 단계 7.3-7.9에서 상술 한 바와 같이 RNA-FISH를 진행합니다. 그런 다음 아래 9.6 단계로 진행합니다.
- 케이스 2는, 면역 형광 염색법을 에탄올 처리에 의해 방지된다 : 65 ° C로 설정 슬라이드 히터 가습 챔버에 슬라이드를 넣고 50 % 포름 아미드, 1X PBS와 2 ㎜ RVC 함유 예비 혼성화 용액에서 1.5 시간 동안 배양한다. 예비 혼성화 용액을 배수하고 단계 7.4 및 7.5에 나타낸 바와 같이 하이브리드 솔루션의 80 μl를 놓습니다. 그런 다음 표시 어 보브 반도체와 같은 RNA-FISH 하이브리드 및 탐지 진행단계 7.6-7.9 (하루에 2, 3)에 전자.
- RNA-FISH이 완료된 후 2 일에서, 분석기, DNA-FISH는 마스크를 제거하는 단계 (단계 6.2 참조)를 시작으로 진행합니다. 그런 다음, 단계 8.2-8.6에서 상술 한 바와 같이 면역 DNA-FISH 프로토콜을 따릅니다.
10. 슬라이드 장착 및 이미징
- 시작하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 :
1X PBS에 0.5 ㎍ / ml로 훽스트 33342 - DAPI 또는 훽스트 33342 * 10 분 1X PBS에 0.5 ㎍ / ml로 10 분 동안 얼룩 핵. 1X PBS로 3 배 10 분 씻으십시오.
*주의 :.주의 감지 시스템 중 하나가 형광 청색 염료를 사용하는 경우, 또는 훽스트 DAPI를 사용하지 않는다. 대신, 같은 Topro3과 원적외선 파장에서 발광 스펙트럼과 형광 DNA 염료를 사용합니다. - 슬라이드에서 가능한 한 많은 액체를 배출합니다. 슬라이드의 한 쪽 끝에서 antifading 에이전트를 포함하는 설치 매체의 80 μl를 삭제합니다. 높은 광학 품질 섹션을 커버커버 슬립 (N 1.5 유리 °). coverslip에 거품없이 부분에 장착 매체의 확산을하게하기 위하여, 집게로 한쪽 끝을 유지하여 천천히 가자.
- 어두운 슬라이드 상자에 4 ° C에서 매니큐어 및 저장 인감.
- 잠재 HSV-1 게놈의 DNA-FISH 신호의 직접적인 관찰은 높은 개구와 40 배 이상 확대 오일 침지 목표 (예를 들어 40X NA 1.1, 60X-63X NA 1.4, 100X NA 1.3)와 여기 광원의가 필요합니다 100 W 수은 램프 적어도 동등한. 우리는 (장비의 표 참조) 등 지난 5 년 동안 제조 업체에 의해 제공되는 것 같은 고효율 전송 현미경을 사용하여 조언한다. 공 초점 현미경은 얇은 단면 또는 스펙트럼 영상으로 인해 조직의 자동 형광으로 낮은 배경 이미지를 수집 할 수있는 도구를 제공합니다.
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Representative Results
광범위한 테스트의 몇 개월 후, 우리는 열 기반의 화학 마스크 해제는 현장 하이브리드 화에 형광에 대한 잠재 HSV-1 게놈 사용할 것을 발견했다. 프로세스 동안, 우리는 다양한 마스크 제거 절차를 시도하고, 단지 열 기반 치료법 (즉, 전자 레인지에 서브 비등점까지 가열 부) 효율적인 나타났다. 우리는 일상적으로 0.01 M의 pH를 6.0 구연산 버퍼 (우리는 우리의 연구에 사용 된), 1X PBS, 1mM의 EDTA, 0.1 M 등의 항원 결정기 (31, 32)를 검색하기 위해 면역 조직 화학 (IHC)과 전자 현미경에 사용되는 여러 소금 버퍼를 테스트 트리스 - 염산 pH 7.4의 증류수. EDTA 버퍼가 조직을 손상하는 경향이 있지만, 다른 모든 버퍼는 신경 세포의 핵 내에 같은 하나 또는 여러 개의 반점 (그림 2A, 이러한 조직이 고도의 자동 형광 일부에 표시되어 있습니다 나타납니다 HSV-1 검출에 적합한했다 cytop에 균일 한 신호와 이미지LASM). 우리 손에, 시트르산 완충액 끊임없이 조직을 손상시키지 않고 양호한 신호를 제공하고, 따라서 우리의 일상 프로토콜 선택되었다 나타났다.
(코스 미드에서 복제 HSV-1 게놈의 부분에서 만든)에 직접 표시를 Cy3-DNA 프로브의 사용은 강력하고 재현 가능한 결과를 제공합니다. 그러나, HSV-1 게놈 라이브러리에 액세스하는 데 필요하다. 우리는 이렇게 우리의 프로토콜이 사람은 상업 프로브에 액세스하는 데를 위해 일할 것을 확인. 그림 2b는 엔조의 Biochem에서 얻은 팬 HSV-1 바이오틴 프로브를 사용하여 DNA-FISH에 의해 HSV-1 잠재 게놈 검색을 보여줍니다. 이와 더불어, 우리는 DNA-FISH 프로토콜은 잠재적으로. 그림 3a는 일반적으로 사용되는 세 가지 변종에 감염된 쥐와 토끼에서 샘플에 HSV-1 유전자의 검출을 보여 다른 HSV-1 동물 모델을 사용하여 과학자들에 의해 이용 될 수 있는지 여부를 테스트 SC16, 삼차 G의 섹션 내에서 감염의 급성 또는 잠재 어느 단계에서 17syn +와 McKrae,,앵글. 모든 경우에 HSV-1 게놈 밝기와 세포에서 세포로 변화 강도의 여드름 신호로 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 일반적으로 헤르페스 감염을받은 쥐의 조직에서 DNA-FISH를 수행하여, HSV-1의 증식하는주기에 우리의 프로토콜의 적용을 확장했다. 이 동물에서 HSV-1 게놈의 크고 밝은 집계 뇌, 척수, 눈과 후근 신경절 (그림 3B) 등 다양한 조직에서 발견 될 수있다.
HSV-1 대기 시간의 많은 부분은 여전히 저조한 이러한 HSV-1 유전자 발현이 핵 아키텍처 33-35과의 상호 작용을 통해 규제하는 방법으로, 이해하고, 신경 세포의 특정 부분 집합은 지연 시간 설정 및 활성화 (13) 호스트 세포 선호 여부 , 14,36,37, 또는 어떻게 면역 감시 바이러스 부하 또는 바이러스 유전자 발현 9,10에 따라 신경 내에서 일어난다. 여기에 설명 된 프로토콜에 의해, 이러한 질문을 해결하는 데 도움이됩니다HSV-1 유전자 및 바이러스 성 또는 세포의 RNA를 단백질의 codetection은. 4는 중심 소체 단백질 CENP-A와 같은 세포 단백질과 (도 4a 및도 4C), 함께 HSV-1 LAT RNA와 HSV-1 게놈의 codetection을 보여줍니다 그림 또는 크로 마틴과 PML-NB 관련 단백질 ATRX (PFA 후 고정 다음 경우 그림 (b)는 () 그림 4C TSA 기반 탐지 다음 경우). 그림 4C는 (HSV-1 DNA를 보여주는 트리플 염색 실험에서 데이터를 보여줍니다 빨간색)의 RNA 제품 LAT (파란색)과 후보 규제 단백질, ATRX (녹색). 우리의 DNA-FISH 프로토콜과 RNA-FISH 면역 형광 신호를 직접 또는 효소 기반 탐지의 조합은 현장에서 세포 및 조직 수준에서 바이러스 호스트 관계를 탐구하는 도구의 다양하고 광범위하게 적용 세트를 나타냅니다.
그림 1. 여러 대상 염색에 DNA-FISH 프로토콜과 통합의 개요. DNA-FISH 프로토콜과 RNA를 단백질의 codetection에 대한 프로토콜과의 연결의 주요 단계를 개략적으로 표시됩니다. 중요한 단계는 경고 표시로 표시됩니다. DNA-FISH 주요 단계 재수, permeabilization, 마스크 제거, 메탄올 - 아세트산 처리와 혼성화한다. 프로 시저 내에서, 마스크 해제는 신중하게 설정 및 존경해야 할 중요한 단계입니다. 두 개의 다른 중요한 단계는 기술적 인 절차 면역에 사용되는 항체와 호환되는에 따라 달라집니다. 이들은 트리플 염색의 RNA-FISH 절차에 영향을, 그리고 면역.의 검출 전략에합니다 C큰 이미지를 보려면 여기를 핥아.
그림 2. 프로토콜 절에 나타낸 바와 같이 항원 마스크 제거 후의 HSV-1 잠상 게놈의 검출. 28 dpi로 감염된 마우스에서 A. TG 섹션을 준비 하였다. TG 부분은도 1에 나타낸 바와 같이 DNA-FISH 위해 가공하고, 열 - 기반 마스크 제거는 각 화상의 상부에 표시되어 버퍼를 이용하여 수행되었다 하였다. 핵의 윤곽이 점선으로 도시된다. 세포질에서 관찰 된 신호는 조직의 자동 형광에 기인한다.에서와 같이 제조 B. TG 부. 시중에서 얻어진 비오틴 HSV-1 프로브를 사용하여 DNA-FISH에 대한 처리되었습니다. 혼성 프로브는 TSA와 알렉사 플 루어 표시 substra를 사용하여 검출 하였다TE (녹색). 핵은 훽스트 33352 (파란색)과 대조되었다. 확대 자른 이미지가 오른쪽 열에 표시됩니다. HSV-1 게놈 패턴의 두 가지 유형의 전형적인 HSV-1 핵내 현지화을 설명하기 위해 표시됩니다. 모든 이미지는 광 시야 표면 형광 현미경 상에 수집 하였다. 스케일 바는 5 μm의 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 여러 모델에서 HSV-1 유전자의 검출. A. 표준 DNA-FISH 프로토콜은 다양한 기원에서 TG 섹션에 적용되었다. SC16에서는 프로토콜 절에 설명 된대로 TG 부 제조 하였다 마우스를 감염. 17syn + 감염된 마우스 섹션과 McKrae 감염된 토끼 섹션 (COL)에 의해 제공되었다laborators. 이미지는 광 시야 표면 형광 현미경 상에 수집 하였다. 스케일 바는 5 μm의 수 있습니다. 일반적으로 헤르페스 감염을 겪고 B. SC16 감염된 마우스는 6 dpi로 희생 된 여러 조직이 냉동, 수집 및 단면했다. 도 1에 나타낸 바와 같이 표준 DNA-FISH 프로토콜이 적용되었다. 이미지는 광 시야 표면 형광 현미경 상에 수집 하였다. 스케일 바는 10 ㎛이다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. HSV-1 게놈 DNA와 단일 섹션에 RNA를 단백질의 Codetection은. SC16 감염된 마우스 TG 부분은 RNA-DNA 물고기, 면역 DNA 물고기 또는 트리플 stainin에 처리 된G는. A. RNA-DNA 물고기는 HSV-1 유전자를 Cy3를 사용하여 그림 1에 나타낸 바와 같이 프로브 (적색) 및 RNA-LAT 바이오틴 리보 프로브 (녹색)로 표시. LAT RNA 프로브는 TSA와 알렉사 플 루어 488 레이블이 기판을 사용하여 검출되었다. 핵은 반대로 CENP-A 항체 (녹색)를 사용하여 훽스트 33352 (파란색) B. 면역 DNA 물고기 대조와 HSV-1 유전자를 Cy3 프로브 (적색)로 표시 하였다. 항체는 DNA-FISH를 실행하기 전에 PBS에 1 % PFA로 포스트 고정 10 분이었다. 핵은 훽스트 33352 (파란색). C. 면역 RNA-DNA-FISH RNA-LAT 바이오틴 리보 프로브 (파란색)를 사용하여, 항 ATRX 항체 (녹색), Cy3에 프로브를 표시 HSV-1 게놈 (과 대조했다 빨간색). LAT의 RNA 프로브는 tyramide 탐지 및 파란색 형광 표지 된 기판을 사용하여 검출하고, 반대로 ATRX 및 보조 항체 tyramide 탐지 및 녹색 형광 표지 기판에 의해 발견되었다. 모든 이미지는 넓은 필드 표면 형광 m에 수집 된icroscope. 스케일 바는 5 μm의 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 쥐 신경 조직 섹션의 뉴런 사이 HSV-1 잠상 게놈의 검출을 허용한다. 바이러스 유전자 발현을 조절하는 경로에 대한 우리의 이해는 신경 조직 내에서 동일 반응계에서 HSV-1 게놈 DNA를 검출하는 방법의 부족에 의해 제한되었다. 게놈 복사 번호 감염된 신경 세포의 비율에 대한 정보는 해리 신경 세포 (11, 12)에 대한 PCR 분석을 주로했다. HSV-1 대기의 역할에 호스트 세포의 핵 구조를 해명에서, 우리는 잠재적으로 감염된 쥐의 신경 세포의 핵 내에 DNA-FISH에 의한 잠재 HSV-1 게놈의 현지화를 결정하기 위해 설정합니다. 우리는 DNA-FISH 프로토콜 및 조직 치료의 다양한 테스트 및 바이러스 DNA-FISH 검출의 필수 단계로 열 기반 "에피토프 마스크 해제"를 발견했다. 이러한 치료는 정기적으로 면역 조직 화학 염색을 위해 파라핀 섹션 내에서 단백질 항원을 표시하는 데 사용됩니다. 그것은 거의 보편적으로 사용되지만병리, 그것은 종래 DNA-FISH에서 사용되지 않습니다. 많은 연구가이 기술은 광학 현미경의 규모 조직의 형태를 보존 지원하는 반면, 최종 사용자는 자신의 특정 생물 학적 시스템 (38)이 점을 확인하기위한 적절한 컨트롤을 포함해야한다. 여러 버퍼를 사용하여 열을 기반 마스크 해제가 지속적으로 FISH 프로브에 사용할 수 HSV-1 잠재 게놈 DNA (그림 2) 한 동안 우리의 손에, 같은 단백질 분해 효소 처리 등의 다른 마스크 해제 절차는 HSV-1 DNA 검출을 허용하지 않았다. 열 기반 마스크 제거는 HSV-1 DNA 단단히 단백질에 연결되어 있음을 나타내는 단백질 사이의 가교 부분을 제거하는 것으로 생각된다. 이 HSV-1 잠재 성 및 용해성 게놈이 세포 히스톤 2,39,40과 관련된 최근의 시위와 일치합니다. ; HCMV 42, 43, EBV 44 ~ 46, 47 ~ 49 KHSV, 제자 VZV 41 : 다른 헤르페스 바이러스의 게놈은 히스톤과 관련되어 있기 때문에여기에 설명 ocol는 파필, B 형 간염 바이러스 및 레트로 바이러스와 같은 다른 영구 핵 바이러스를 검출하는 것도 아마도 이러한 헤르페스 바이러스의 게놈뿐만 아니라 많은 다른 인식 만 적용 할 수있다. 흥미롭게도, 다른 실험 (감염된 쥐와 토끼에서 조직, 다른 실험실에서 준비 섹션 및 다른 HSV-1 균주 사용) 설정에 대한 현재의 프로토콜의 사용은 HSV-1 유전자의 검출을위한 추가적인 셋업이 필요하지 않았다. 다른 생물학적 시스템에 프로토콜을 적용하기 위해, 우리는 고정 절차 및 항원 검색 기술이 발전 지역이 될 수 있다고 기대하고 있습니다.
HSV-1 대기 시간을 평가하는 방법은 고전 뉴런 용균 사이클 유전자 산물의 검출의 부재에 결합 LAT RNA의 존재를 검출하는 것이다. 그러나, 지연의 마우스 모델에서 고립 된 뉴런에 현장 PCR 및 qPCR에에서 기반 연구는 지적이 감염된 노의 수RONS (즉, HSV-1 게놈 신경 세포)는 LAT가 뉴런에게 12, 18, 20, 22을 표현하는 것보다 2-3 시간 더 높았다. RNA-DNA-FISH를 사용하여, 그것은 우리의 마우스 모델에서 HSV-1 DNA 신경 세포의 20 ~ 30 %도 LAT RNA 22 긍정적 인 것이 확인되었다. DNA-FISH 바이러스 성 및 세포 DNA의 codetection의 사용은 RNA와 단백질 구성 요소는 HSV-1 잠재 유전자 발현을 조절하는 경로를 특성화하는 새로운 도구 세트를 제공합니다. 또, HSV-1 레이턴시는 신경 세포 아형의 다양한 수행됨 불균일 현상으로 알려져 있으며, 이는 게놈 카피 수와 LAT RNA 발현 12,22에서 이질성 특징으로한다. DNA-FISH의 주요 이점은 조직의 복잡성 내 단일 세포 분석에 대한 액세스를 제공하고, 따라서 고려 HSV-1 대기의 이질성을 취할 것이다. 예를 들어, 우리는 각각의 뉴런 22 HSV-1 게놈의 풍부한 LAT RNA의 발현을 연결했다. 광고에dition,이 기술은 또한 시험 관내 세포 배양 모델에서 사용뿐만 아니라 SCID 생쥐 13-17 주입 인간 신경절을 이용하여 동물 모델 바이러스 게놈의 상태를 평가에 적용 할 수도있다. 우리의 DNA-FISH 프로토콜의 미래 응용 프로그램은 HSV-1 게놈 신경 세포의 수를 통해 HSV-1 대기의 특성을 할 수있는 가능성이 될 것입니다. 이 비오틴 화 프로브 및 저배율에서 감지 될 수있을 정도로 강한 신호를 생성 tyramide 기반 검출을 사용하여 수행 될 수있다. 이러한 애플리케이션은 tyramide 검출 시스템에 의해 생성 된 매우 낮은 배경에 의해 가능하게된다. Cy3에 잘하지만 매우 시간이 많이 소요되는 부분의 큰 숫자를 읽는 것보다 높은 배율로 관찰을 필요로이 프로토콜에 설명 된 HSV-1 프로브가 사용할 수있는 표시.
아마 여기에 설명 된 DNA-FISH 프로토콜의 주요 특성은 t와 호환 만드는하고, 다양하고, 견고하다그는 RNA와 단백질 모두의 codetection. 실제로, 우리는 RNA 또는 단백질, 또는 둘 모두를 검출하기 위해 필요한 모든 처리가, DNA-FISH 신호의 품질과 밝기를 변경하지 않는 것을 발견했다. RNA-FISH 에탄올 탈수 또는 포름 아미드 계 예비 혼성화를 사용하여, DNA-FISH 전에 수행 될 수있다. 우리는 TSA 검출 시약 적은 배경 결과 에탄올 기반의 프로토콜을 추천합니다. RNA-FISH 에탄올 처리 샘플에서 작동하지 않는 항체와 면역 뒤에 때 포름 아미드 기반의 프로토콜이 사용되어야한다. 면역 DNA-FISH를 수행 할 때, 면역 형광 신호의 공유 링크는 단백질 지역화 패턴의 내용을 보존하기 tyramide 기반 검출 (신호를 증폭하여), 또는 포스트 - 고정 기준에 의해 수행 될 수있다. 후 고정을 최적화하기 위해, 면역 형광 프로토콜 먼저 강한 신호를 얻기 위해 - 설정해야하고, 좋은 DNA-FISH 신호를 허용하는 강력한 후 고정 절차가 결정되어야한다. 이 줘야 해L은 면역 보존 및 DNA-FISH 신호 간의 최상의 절충을 얻을 수있는 조건 내에서의 범위를 제공한다. 다른 항체 기반의 검출 방법은, 신호의 품질 및 유용한 프로토콜은 항체 자체에 매우 의존적이다. 우리의 프로토콜도 예외가 아니다 우리는 몇 가지 항체 (예를 들어 안티 PML 단클론 항체 클론 36.1) 및 몇몇 다른 사람이 중요한 테스트를 필요로 여기에 설명 된 프로토콜 중 하나와 매우 잘 작동하는지 관찰했다. 전반적으로, 우리는 성공적으로 다양한 핵 도메인 (염색질-HP1-, 중심절-CENP-A, CENP-B-, PML과 관련된 세포질과 세포막 단백질, 핵 단백질을 포함, (예외가 SP100 단백질했다) 우리의 의도 된 목표의 대부분을 검출 원자력기구-PML, Daxx의, ATRX-). 우리의 테스트에 근거하여 우리는 우리의 DNA-FISH 프로토콜은 기자 구조의 면역 codetection와 호환 될 것으로 예상 (β-갈 락토시다 아제, 형광 단백질 ...)이 일반적으로 프로모션을 분석하는 데 사용됩니다바이러스 게놈에서 타 활동.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 HSV-1에서 샘플을 제공 N. 사우 (신시내티 아동 병원 의료 센터, 신시내티, 오하이오, 미국), S. Efstathiou (영국 케임브리지 대학)와 제임스 힐 (LSU 건강 과학 센터, 뉴 올리언스, 미국) 감사 각각 생쥐와 토끼를 감염 및 시약, 도움이 토론 H. 마스 모토 (카즈 사 DNA 연구소, 치바, 일본)와 S. Khochbin (문화원 알버트 Bonniot, 그르노블, 프랑스).
이 작품은 (PL, http://www.cnrs.fr에 ATIP 프로그램) 센터 국립 드 라 공들인 Scientifique (CNRS)에서 교부금, 프랑스의 국립 연구 기관 (ANR) (ANR-05-MIIM -에 의해 투자되었다 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr ), FINOVI 재단 ( http://www.finovi.org/:fr:start ), LabEX DEVweCAN (ANR-10-LabX에-61 ) Université 드 리옹, 프로그램 내에서 "InvestissemenTS 디 Avenir에서 "(ANR-11-IDEX-0007) ANR에 의해 운영 ( http://www.agence-nationale-recherche.fr ), L' 협회 라 공들인 contre 르 암 (ARC-7979과 ARC를 부어 4910, http://www.arc-cancer.net ), 라 리그 국립 Contre 르 암 (LNCC, http://www.ligue-cancer.net ), 잉카 (EPIPRO 프로그램 http://www.e - cancer.fr ). FC와 PL은 CNRS의 연구원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice | Janvier, France | 6 week-old females | |
| HSV-1 strains | SC16 strain (wild type) | See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation. | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma | K2753 | Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg) |
| Xylazine hydrochloride | Sigma | X1251 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood. |
| Physiological Saline | Sigma | 07982-100TAB-F | |
| 1x PBS, pH 7.4 (sterile) | Life Technologies | 10010-015 | |
| Sucrose | Sigma | 84100 | Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS. |
| Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound | SAKURA | 4583 | |
| Large vector DNA purification kit | Qiagen | 12462 | To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C |
| Nick translation kit | Roche Applied Sciences | 10 976 776 001 | |
| Cy3-dCTP | GE Healthcare | PA53021 | Protect from light |
| 0.5 M EDTA | Sigma | E6758 | |
| G50 Mini spin column | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| Salmon sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| Ethanol molecular biology grade | Sigma | 87047 | Prepare a 70% solution |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| Formamid Molecular biology grade | Sigma | F9037 | Caution. Manipulate under fume hood. |
| HSV-1 biotinylated commercial probe | Enzo Life Sciences | ENZ-40838 | |
| ImmEdge hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| 20x Saline Sodium Citrate (SSC) | Sigma | S6639 | Prepare a 2x SSC solution in ddH20. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use. |
| 10 mM Sodium citrate pH 6.0 | Sigma | S1804 | Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use. |
| Acetic Acid | Sigma | 320099 | |
| Methanol, molecular biology grade | Sigma | 322415 | |
| Dextran sulfate - MW 500,000 | Euromedex | EU0606-A | |
| Denhardt's solution (100x) | Euromedex | 1020-A | |
| Rubber Cement "FixoGum" | Marabut | 290110000 | |
| DNA purification kit - Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| T7 in vitro transcription kit | Ambion Life Technologies | AM1314 | |
| Biotin-16-UTP | Roche Applied Sciences | 11388908910 | |
| RNA purification minicolumn | Qiagen | 73404 | |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | New England Biolabs | S1402S | |
| H2O2 | Sigma | H3410 | Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light. |
| Yeast tRNA | Invitrogen | 15401011 | prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| Primary antibodies | any supplier | The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology) | |
| Secondary fluorescent antibodies | Invitrogen Life Technologies | The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001) | |
| Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence) | Invitrogen Life Technologies | #T20937 | TSA kits are also available from Perkin Elmer |
| Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence) | Invitrogen Life Technologies | #T20932 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen Life Technologies | H3570 | Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution. |
| 22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glass | Electron Microscopy Sciences | 72204-04 | |
| Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science |
| Superfrost glass slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| Equipment/Material | Company | Reference | Note |
| Needle for infection | Glass micropipette hot drawn. Custom made. | ||
| Dissection equipment | Moria, France | Microsurgical scissors and forceps | |
| Peristaltic pump | Cole Palmer Instruments | Easyload Masterflex | |
| Microsyringe pump device (Nano Pump) | kdScientific | KDS310 | |
| Cryostat | Leica France | CM 1510-1 | |
| -80 °C freezer | Sanyo | Ultra Low -80 °C | |
| Domestic microwave oven | |||
| Dry block heater | Eppendorf | 022670204 | |
| Incubator Slide moat | Boekel Scientific | 240000 | |
| Coplin Jar | Dominique Dutscher | 68512 | |
| Staining glass container | Dominique Dutscher | 68506 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series |
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