人間の前庭神経鞘腫の初代培養

Summary

前庭神経鞘腫（VSS）がNF2腫瘍抑制遺伝子における変異に関連するシュワン細胞（SC）由来の非悪性腫瘍である。私たちは、分子や細胞の実験操作および分析を可能にし、ヒトの疾患の不均一な性質を再現細胞培養VS初代ヒトのための再現可能な、効率的なプロトコルを報告します。

Abstract

前庭神経鞘腫（VSS）は、全ての頭蓋内新生物の10パーセントを損なう、前庭神経のシュワン細胞（SC）の腫瘍を表​​す。 VSSは、両方のNF2腫瘍抑制における不活性化の欠陥に関連する散発性または家族のどちらか（神経線維腫症2型、NF2）の形態で起こる 遺伝子。 、VSSの治療は、しかし、このような手順の罹患率は、低侵襲治療法の調査を推進してきました、一般的には外科的切除や放射線手術である。歴史的に、新鮮な組織試料へのアクセスの欠如、および神経鞘腫細胞は不死化されていないという事実は、有意に神経鞘腫の腫瘍形成の調査のための一次培養物の使用を妨げている。一次培養物の限られた供給を克服するために、不死化VS HEI193細胞株は、HPV E6およびE7癌遺伝子による形質導入により作製した。この発癌性形質導入は、人間のためのモデルとしてのそれらの使用を制限する細胞に重要な分子および表現型変化を導入chwannoma腫瘍。そこで我々は、細胞のVS初代ヒトの培養のための単純化され、再現性のあるプロトコルを示しています。この簡単に習得技術は、より正確に、VS疾患の複雑さを再現分子や細胞の研究が可能になります。

Introduction

前庭神経鞘腫（VSS）は、全ての頭蓋内新生物は^1-3の10％を犠牲にすること、前庭神経のシュワン細胞（SC）の腫瘍を表す。 VSSは、両方のNF2腫瘍抑制における不活性化の欠陥に関連する散発性または家族のどちらか（神経線維腫症2型、NF2）の形態で起こる 遺伝子。のVSの治療は、しかし、このような手順の罹患率は、難聴、顔面神経障害、脊髄液漏出、不均衡、および腫瘍の再増殖¹と、一般的に外科的切除または放射線手術である。さらに、すべての患者が許容できる外科的または放射線の候補ではない。このような重大な病的状態だけでなく、代替療法がないことは、新たな治療^の3,4の開発を期待してのVSのユニークな分子生物学の調査を推進してきました。

細胞培養は、潜在的な治療COMの分子や細胞の挙動やスクリーニング、迅速な容易、かつ詳細な分析が可能にポンド。歴史的に、新鮮な組織試料へのアクセスの欠如、および神経鞘腫細胞は不死化されていないという事実は、有意に神経鞘腫の腫瘍形成の調査のための一次培養物の使用を妨げている。一次培養物の限られた供給を克服するために、不死化VS HEI193細胞株は、HPV E6およびE7癌遺伝子⁵で形質導入によって生成した。この発癌性形質導入は、人間の神経鞘腫のモデルとしてそれらの使用を制限する細胞に重要な分子および表現型の変化を導入しました。官能NF2遺伝子を欠いているトランスジェニックマウス系統由来SC培養物は、 インビトロでNF2依存SC腫瘍形成を調査する別の代替を表す。これらの培養物は、しかし、人間の特定の動作のために、人間のVSSまたはアカウントの不均一な性質を再現することができない。ほとんどの前のVS培養技術は、比較的長い処理時間及び複雑な選択的な培養技術^6-8を必要と^した。ここでは、免疫染色によって決定された95％の腫瘍細胞の純度で、3時間の下に完全に処理した細胞培養VS原発のための簡単​​な、再現性のあるプロトコルを提示する。

Protocol

倫理声明：このプロトコルでのヒト腫瘍標本の使用は、アイオワ大学施設内倫理委員会（IRB）により承認された。

1。セットアップ腫瘍収穫前日

1. コー​​ト細胞培養プレート：無菌培養フードにおいては、蓋を交換し、ポリスチレン/プラスチック培養ウェル/皿の底を覆うのに十分なポリ-L-オルニチン（0.01％溶液）を添加し、少なくとも室温で放置2時間。ガラススライドまたはカバースリップを画像化を必要とする実験のためのポリスチレンの代わりに用いることができる。
2. 2時間後、吸引しながらポリ-L-オルニチン溶液を除去し、プレートを無菌培養フードで完全に乾燥させます。十分なラミニン液追加（約²で10μg/ mlのを⁺ / Mg ^{2 +}を含まないHBSS [HBSS-/ - ]）は、完全に培養プレートをカバーするために、蓋を交換し、一晩冷却4℃の冷蔵庫で1）どちらかで、または2）少なくとも2時間、37℃のインキュベーター内に置く。もしプレート一晩以上保存され、蒸発/乾燥を防ぐためにプラスチックラップでプレートをラップ。

2。セットアップ腫瘍収穫の日

1. 準備文化メディア：メディアは、腫瘍の収穫と加工の日に新しく作られ、4℃で保存し、直前のメディアの追加/変更内容をインキュベーター内で37℃に加温する。
2. 神経鞘腫培養培地は、0.1 mg / mlのペニシリンおよび0.1 mg / mlのストレプトマイシン（フェノールレッドを含む）（4.5 mg / ml）をDMEM高グルコースであり; N2メディアは、最終希釈1:100を補足;ウシインスリン5μg/ mlの;ウシ胎児血清10％の全量。 0.22μmのフィルターを介してすべてのメディアをフィルタリングします。
3. 検体搬送クーラーを準備します。手術室に^{2 +（HBSS} + / +）のCa ^{2 +} / Mgを25ミリリットルのHBSS、滅菌50mlコニカルチューブ（収穫されるために、腫瘍の量に応じて）1-2氷いっぱいのクーラーを送信腫瘍サンプル移送や輸送のため。
4. 個人ラージヒルを準備しますidual腫瘍解離チューブ - 無菌2ミリリットルを氷上のHBSS + / +および場所の1ミリリットル丸底チューブを埋める。 （チューブ腫瘍サンプルの鋭い切開/解離のために使用される）。
5. 解離のために、採取した組織のあらゆる0.5センチメートル³約1解離のチューブを準備し;例えば、1.0×1.0×1.0センチメートル（1センチメートル^3）を測定する腫瘍標本は2 HBSS + / +解離チューブが必要になります。
6. 紫外線殺菌：場所組織はさみ、小さな鉗子、メスハンドル、1X通常のペトリ皿、P1000ピペット、および無菌培養フード内のピペットチップ、および前腫瘍組織の到着と処理に約15分間、紫外線下のまま。

3。試料の単離と交通

1. 外科的切除によって腫瘍検体を分離します。
2. すぐに患者から取り出した後、可能な限り迅速に氷冷HBSS + / +に腫瘍標本を配置。一度すべてTISSU電子サンプルは、さらなる処理のために実験室に作動劇場​​から、（氷上で）トランスポート·サンプルを収集する。

4。組織解離と粉砕して

1. 次の層流フード内の標準無菌、培養フードへの腫瘍検体とコニカルチューブを持参し、チューブおよび腫瘍50Xを反転させた試料を洗う。断片はチューブの底に落としておくことができ、その後、HBSS + / +を削除してください。 30ミリリットルのHBSS + / +を補充し、50Xが再び反転/攪拌する。 4Xの合計反転/メディアの削除を繰り返します。
2. 再懸 ​​濁30ミリリットルのHBSS + / +における腫瘍断片最後に、その後0.5センチメートル³グループにsterile100ミリメートルペトリ皿に混合物を注ぐと、独立した腫瘍。大きな腫瘍断片が発生した場合は、より小さな断片に切断するために、組織のはさみや小刀（＃11または＃15ブレード）を使用します。
3. 個々のHBSSが+ / +いっぱいに0.5センチメートル³組織グループを配置するために鉗子を使用し、2ミリリットルの丸底円錐すべての氷の上のAl管。 「スノーグローブ」の外観（ 図1）を有するべきでサブ1ミリメートル断片-懸濁液中に腫瘍断片をミンチするために組織のはさみを使用してください。フラグメントの大半はサブ1ミリメートルであるだけになるまで腫瘍をミンチ。腫瘍サンプルではありません 'オーバーミンチ」を行う。氷の上に戻って完全に組織細片チューブを配置し、すべての追加の試料管を繰り返します。
4. シングル15ミリリットルコニカルチューブにすべての断片化された腫瘍サンプルを転送します。カット/変更された無菌の先端とP1000ピペットは、このステップに適しています。 /必ず全ての腫瘍サンプルは15mlチューブに集めてきたように2ミリリットル解離管をすすぐフラッシュするために余分なHBSS + / +を使用してください。 5分間73×gで、23℃で遠心分離器で混合をスピンダウン。
5. 細胞ペレットを残し、HBSS + / +をオフに吸引する。 0.25％トリプシンとの1:1混合物中で再懸濁断片（HBSS-/に溶かし - ） - 0.2％コラゲナーゼタイトのsuに腫瘍断片を維持するためにちょうど十分な投稿spension。スクリュートップを交換し、そして30分間37℃のインキュベーター内の場所。懸濁液中の断片を保つために、インキュベーション中に少なくとも1回細胞混合物を攪拌する。このときにも、それを暖めるためにインキュベーターに神経鞘腫の培養培地を配置します。
6. インキュベーション後、23°C、5分間73×gでトリプシンを不活性化するために各チューブに100μlのFBSを追加し、遠心分離試料。ピペットを用いて、慎重に細胞ペレットを乱すことなく、できるだけ多くの上清を吸引する。腫瘍断片を1mlがある場合に温めた2mlに加える、例えば培養培地（1:2腫瘍断片の最終比に腫瘍断片に温めた培養培地（N2/insulin/5％FBS）を追加メディア）。
7. 約1〜2の直径にP1000のピペットチップの外先端部を切断することにより、腫瘍のチュレーションの準備をします。あなたが簡単にunaltを通じてソリューションをピペットでできるようになるまで、ゆっくりと、徐々に小さくしてより小さな直径のピペットチップを使用して、細胞懸濁液を粉砕するエーP1000ピペットチップ。上のサンプルを粉砕するはありません - あなたは簡単にチップを通して腫瘍ソリューションをピペットでできるようになると、すぐに小さく、先端に移動します。コニカルチューブの底にピペットチップをタップチュレーション時の組織ブロック吸引の単一のより大きな部分は、多くの場合、継続的なチュレーションすることができます。

5。細胞播種

1. 組織の一つ0.5ミリメートル³断片を1×100 mmディッシュ、または4×8-well/4-wellスライドをシードするのに十分です。直前のメディア/細胞混合物を追加するには、培養プレートからラミニン液を除去するが、プレートを乾燥させないでください。
2. 各100mmの皿のために10mlの温めた培養培地中の腫瘍断片を溶解する。
3. 4ウェルスライドの各ウェルについて、750μL温めた培養培地（全体スライドの3ミリリットル）を使用します。
4. 8ウェルスライドの各ウェルについて、400μlの温めた培養培地（全体スライドの3.2ミリリットル）を使用します。
5. 37＆で文化をインキュベート＃160;°C、湿度100％、6％CO _2。少なくとも36時間一人での文化のままにして、解決策は（酸性）黄ばんであれば、メディアを変更してください。そうしないと、その後2〜3日ごとに、またはメディアが酸性になると、72時間後にメディアを変更。メディアは連続で数日間毎日酸性になる場合、これは一般に、潜在的な細菌または酵母汚染の指標である。

Representative Results

正しい腫瘍の断片化は、組織培養皿で播種し、最適な成長（ 図1）に必須である。めっき後の最初の日の間に神経鞘腫細胞の同定は、細胞残屑および赤血球の量を不明瞭に、しばしば困難である。 4 ^回目か5 ^日目では、付着性の腫瘍断片近いセルの拡張機能は、残骸の中からパターンを「レーシング」に認識が作成されます。その後のメディアの変更は、一般的に第二週で非接着細胞の大部分を除去。この方法を用いて、90％のコンフルエンスの前ミンチめっき密度に対する腫瘍断片の初期活力（ 図2）に応じて、7〜14日の間で予測することができる。前述したように、神経鞘腫培養物は、接着性腫瘍断片^9,10の小断片から外側に成長するように見える。このような伸長は、最初の週の終わりまでに検出可能である。 図2は、Bを示しています右下に赤枠単一の腫瘍断片から神経鞘腫細胞伸長のrightfieldイメージング。 図3は、2つの異なる腫瘍フラグメントの間で発生する「橋渡し」の伸長は、培養ウェル中のポリクローナルウサギ抗-S100抗体を用いて免疫染色を示す。我々は、日常的に培養物の純度を確認し、正（ 図4）分析のために神経鞘腫細胞を同定するために抗-S100または抗のp75 ^NTR抗体で培養物を免疫染色。これらの方法でこれらの培養中の細胞の95>％以上が神経鞘腫細胞を表す。神経鞘腫細胞はまた、他のマーカー¹¹のうち、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）およびErbB2とラベル

図1（A）の前及び後方の両方に同じ腫瘍サンプルとの比較ER（B）ミンチサンプルは2.0ミリリットルの丸底コニカルチューブ中のフェノールレッドで1.5ミリリットルのHBSS + / +で作成。

図2。明視野顕微鏡での文化の典型的な外観。Spindled神経鞘細胞の伸長は、腫瘍断片から放射、培養10日目に撮影された画像。スケールバー=100μmである。

図3。抗S100抗体は、典型的な文化や細胞形態を実証するとともに、一次前庭神経鞘腫培養の免疫染色。めっきされた腫瘍断片、培養14日目。スケールバー=200μmである。BからA）の低消費電力を見る説明伸長）は、より高いPOWspindled形態、培養14日目で神経鞘腫細胞のERビュー。スケールバー=100μmである。

図4は、培養細胞の純度および同一性を確認するための一次前庭神経鞘腫培養物の免疫染色。 A）培養物を抗-S100抗体で免疫染色した。核をDAPIで標識されている。抗P75 ^NTR抗体を用いて免疫染色し、スケールバー=100μmである。B）文化。核をDAPIで標識されている。 = 100ミクロンスケールバー。

Discussion

in vitroでの神経鞘腫の文化の歴史

体外神経鞘腫培養で確立するための努力は、最初の聴神経腫のオープン外科的切除は1894 ¹²に発生したわずか数十年後に始まった。最初に記録文化が1920年代にKredelであったが、失敗した「ハンギングドロップ法^」12に刻まれた腫瘍を成長しようとした人。その後、博士。マレーとスタウトは、凝固したヒト血漿上に成長させたneurilemomasとのインビトロ培養の経験を発表した。興味深いことに、この技術はアントニAとアントニ·B特異的フラグメントは寒天液化¹³のユニークな細胞形態と差動速度で、別々に成長したことを明らかにした。 CraviotoとLockwoodはカバーガラススリップローラーチューブに鳥の塊に聴神経腫瘍培養のさらなる観測を発表した。それらはまた、腫瘍増殖のタイムラプス撮影するためのローズチャンバーを使用した最初の10の「一括し'成長の間の成長の違いを調べた。バウアーもラミニンコーティング培養プレート⁹の分裂促進効果を示した「アンブロック」と彼女の出版物での単層のアプローチを組み合わせる。ほとんどのその後の公開されたプロトコルは、私たち自身のように、荷電アミノ酸（ポリ-L-オルニチン、ポリ-L-リジン）およびラミニンの準備⁸で処理された培養表面上に刻んだ腫瘍断片を播種する同様のプロトコルを利用する。私たちは、顔面、三叉神経、迷走、同様の結果と脊髄神経から生じる培養神経鞘腫にこれと同じ方法を使用している。

前庭神経鞘腫初代培養のメリット

人間の神経鞘腫の腫瘍形成の研究は、多くの場合、均質な不死化細胞株およびトランスジェニックマウスモデルを使用しています。このようなツールは有益であるが、DO正確に遺伝子型、表現型、およびヒト疾患の複雑さを反映していない。対照的に、初代培養は、おそらく、より現実的なモデルを提供する。彼らは、より忠実にヒト腫瘍¹⁵に関連するゲノムや分子の状態の不均一性を再現。

神経鞘腫の文化の純度

一次組織培養の課題は、標的細胞の純度を維持している。神経鞘腫が圧倒的に腫瘍性シュワン細胞⁶から構成され、しかし、文化は、線維芽細胞汚染からの免疫ではありません。歴史的には、三つのカテゴリーに神経鞘腫細胞の純度低下を最適化する方法：化学的に明確な培地および特定の増殖因子、1）選択;磁気ビーズ細胞選別⁷ 2）免疫精製（ 例えば 、）、3）前述の方法の両方の組み合わせ。我々の経験では線維芽細胞または他の非神経鞘腫細胞は一般cultu中の細胞の5％未満を含むにかかわらず、患者の特性（年齢、性別）、散発またはNF2関連腫瘍、原発性または二次腫瘍切除、または固形腫瘍タイプVS嚢胞の再。線維芽細胞は文化を引き継ぐように見える場合は、1〜2メディアの交換のための血清の除去はかなり不利神経鞘腫細胞の生存に影響を与えることなく、この集団が減少します。ラミニンとの細胞培養表面を前処理はまた、神経鞘腫細胞の成長^9を容易にする。文化の最小限の継代は、不要な細胞の汚染を減少させるのに役立ちます - 低温貯蔵は、最高の最初の2培養継代以内に完了し、培養実験は、通路4-5を越えてお勧めしません。培養実験が非cryostored細胞と継代1-2が完了したときに私たちは、最適な結果を見つける。

我々は免疫染色（抗-S100、DAPI）と私たちの神経鞘腫培養における品質管理対策として、細胞および核形態の顕微鏡像の両方を使用します。時折さらに培養純度^9を検証するために、単球（CD68）または線維芽細胞特異的マーカーのための文化のサブセットを免疫染色すると便利です。細胞の挙動（ 例えば 、増殖または細胞死）の実験的な分析の間に、我々は常に調査結果は、特定の神経鞘腫細胞であることを確認するために、抗S100または抗P75 ^NTR抗体で免疫染色。

文化の形態と成長パターン

神経鞘腫培養は通常、アントニA（厳密に整理高い細胞密度、Verocayボディ形成の兆候）を連想させる独特な成長パターンを表示させず、めったにアントニ·Bの（比較的まばらな核、豊富な細胞過程、より少ない組織）切除した神経鞘腫の組織病理で見られたパターン腫瘍は^16。ほぼすべての神経鞘細胞は、しかし、他の細胞モルフォシュワンと神経鞘腫細胞^6,17の両方に関連した古典的な長い、spindled、双極細胞形状を表示するlogiesは、Cravioto（アメーバミクログリア様細胞、紡錘状の細胞、ラケット形状のセル、およびカイト、形状のセル）に記載されているように、時々 ^14を発生する。全体的に、細胞の成長および増殖は、我々の基本培地（DMEM/10％FBS/Insulin/N2サプリメント）で非常に遅い。このようなフォルスコリン及びβ1-ニューレグリンのような既知の分裂促進因子の添加が大幅に細胞増殖¹⁸増加^します。

重要なプロトコルステップ

私たちの神経鞘腫の組織培養プロトコルは、シンプルでかなり寛容である。しかし成功を確実にするいくつかの重要なステップがあります。まず、正しい腫瘍取り扱いが非常に重要です。腫瘍は、すぐに一度、患者から取り出し可能な限り氷冷HBSS + / +に直接配置されたときに最良の結果を期待しています。次いで、これをケースの端部に病状の処理のための凝集体組織を送信滅菌生理食塩水で切除腫瘍を収集する通常の外科的慣行に反する。第二に、組織SAMPを保つ処理中に、できるだけ涼しいレ。これは、切除された腫瘍が氷の寒さを保つことが不可欠であり、その処理は、取り外し後、可能な限り便宜的に発生します。だけでなく、氷の上で、可能な限り組織処理の多くを実行します。第三に、積極的に腫瘍サンプルを洗う。これは細菌や酵母の汚染のリスクを減らすことができます。第四に、オーバーミンチ腫瘍標本にはありません。腫瘍粉砕して、より小さな直径P1000ピペットチップを続行するかの半主観的な評価に依存します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components