Primær Culture of Human Vestibulær schwannomas

Summary

Vestibulær schwannomas (VSS) er ikke-maligne svulster av Schwann celle (SC) opprinnelse, assosiert med mutasjoner i NF2 tumorsuppressorgen. Vi rapporterer en reproduserbar, effektiv protokoll til primære humane VS cellekultur som gjør det mulig for molekylær-og celle eksperimentell manipulering og analyse og sammenfatter den heterogene natur sykdom hos mennesker.

Abstract

Vestibular schwannomas (VSS) representerer Schwann celle (SC) svulster i vestibular nerve, at det går 10% av alle intrakranielle svulster. VSS oppstå i enten sporadisk eller familiære (Nevrofibromatose type 2, NF2) former, både knyttet til inaktive defekter i NF2 tumor suppressor gen. Behandling for VSS er generelt kirurgisk reseksjon eller radiosurgery, men sykelighet av slike prosedyrer har drevet undersøkelser i mindre invasive behandlinger. Historisk sett har manglende tilgang til ferske vevsprøver og det faktum at schwannoma cellene ikke blir foreviget vesentlig hemmet bruk av primærkulturer for etterforskning av schwannoma tumorigenesis. For å overvinne den begrensede tilførsel av primærkulturer, ble de udødelig HEI193 VS cellelinje generert ved transduksjon med HPV E6 og E7 onkogener. Det onkogene transduksjon innført betydelige molekylære og fenotypiske endringer i cellene, noe som begrenser deres anvendelse som en modell for human schwannoma svulster. Vi derfor illustrere en forenklet, reproduserbar protokoll for kultur av primær menneskelig VS celler. Dette lett mestret teknikken gjør det mulig for molekylære og cellulære undersøkelser som mer nøyaktig rekapitulere kompleksiteten i VS sykdom.

Introduction

Vestibular schwannomas (VSS) representerer Schwann celle (SC) svulster i vestibular nerve, at det går 10% av alle intrakranielle svulster ^1-3. VSS oppstå i enten sporadisk eller familiære (Nevrofibromatose type 2, NF2) former, både knyttet til inaktive defekter i NF2 tumor suppressor gen. Behandling for VSS er generelt kirurgisk reseksjon eller radiosurgery, men sykelighet av slike prosedyrer inkluderer døvhet, ansikts nevropatier, spinalvæske lekkasje, ubalanse, og svulst gjenvekst ^en. I tillegg er ikke alle pasienter er akseptable kirurgisk eller stråle kandidater. En slik betydelig sykelighet samt en mangel på alternative behandlingsformer har drevet etterforskning i den unike molekylærbiologi av VSS i håp om å utvikle nye behandlinger ^3,4.

Cellekultur gir mulighet for raske, lettvinte, og dyptgående analyse av molekylære og cellulære atferd og screening av potensielle terapeutiske compounds. Historisk sett har manglende tilgang til ferske vevsprøver og det faktum at schwannoma cellene ikke blir foreviget vesentlig hemmet bruk av primærkulturer for etterforskning av schwannoma tumorigenesis. For å overvinne den begrensede tilførsel av primærkulturer, ble de udødelig HEI193 VS cellelinje generert ved transduksjon med HPV E6 og E7 onkogener ^5. Det onkogene transduksjon innført betydelige molekylære og fenotypiske endringer i cellene, noe som begrenser deres anvendelse som en modell for human schwannoma tumorer. SC kulturer som stammer fra transgene mus linjer som mangler et funksjonelt NF2-genet representerer et annet alternativ for å undersøke NF2-avhengige SC tumorigenesis in vitro. Disse kulturene derimot ikke klarer å rekapitulere den heterogene natur menneskelig VSS eller konto for menneskelig bestemt atferd. De fleste tidligere VS kultur teknikker som kreves relativt lang saksbehandlingstid og kompliserte selektive kultur teknikker ^6-8.Her presenterer vi en enkel, reproduserbar protokoll for primær VS cellekultur med full prosessering på under tre timer, med 95% tumorcelle renhet som bestemmes av farging.

Protocol

Etikk Uttalelse: bruk av de menneskelige vevsprøver i denne protokollen ble godkjent av University of Iowa Institutional Review Board (IRB).

En. Oppsett dagen før Tumor Harvests

1. Coat Cell Kultur Plater: I en steril kultur hette, legger nok poly-L-ornithine (0,01% løsning) til å dekke bunnen av en isopor / plast kultur godt / parabol, erstatte lokkene, og la sitte i romtemperatur i minst 2 timer. Glass lysbilder eller dekkglass kan erstatte isopor for eksperimenter som krever bildebehandling.
2. Etter to timer, fjerne poly-L-ornithine løsning med sug og la platene tørke helt i en steril kultur hetter. Legg nok laminin løsning (10 mikrogram / ​​ml i Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-free} HBSS [HBSS-/ -]) til å fullstendig dekke petriskåler, bytt lokk, da enten en) plass i kule 4 ° C kjøleskap over natten, eller 2) plassere i 37 ° C inkubator for minst 2 timer. Hvis platenevil bli lagret over natten eller lenger, pakk platene i plastfolie for å hindre fordamping / uttørking.

2. Oppsett Day of Tumor Harvests

1. Forbered Kultur Media: Media er gjort frisk på dagen for svulst høsting og foredling, lagret ved 4 ° C, og varmet til 37 ° C i inkubator umiddelbart før media tillegg / endringer.
2. Schwannoma kulturmedier er høy-glukose (4,5 mg / ml) DMEM (med fenolrødt) med 0,1 mg / ml penicillin og 0,1 mg / ml streptomycin; N2 media supplere endelig fortynning 1:100; Bovint insulin 5 ug / ml; Fetal Bovine Serum til 10% totalt volum. Filtrere alle medier gjennom 0,22 mikrometer filter.
3. Forbered Transport av prøver Cooler: Send en is fylt kulere med 1-2 (avhengig av mengden av svulst som skal høstes) sterile 50 ml koniske rør med 25 ml HBSS med Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} (HBSS + / +) til operasjonsstuen for tumorprøve overføring og transport.
4. Forbered individual svulst dissosiasjon slanger - fylle sterile 2 ml rund bunn rør med en ml HBSS + / + og legg på is. (Rør vil bli brukt for skarp disseksjon / dissosiasjon av tumorprøver).
5. For dissosiasjon, forberede omtrent en dissosiasjon tube for hver 0,5 cm ³ av høstet vev; for eksempel, vil en tumorprøve som måler 1,0 x 1,0 x 1,0 cm (1 cm ³⁾ krever to HBSS + / + dissosiasjon rør.
6. Ultrafiolett lys sterilisering: Place vev saks, små tang, skalpell håndtak, 1x normal petriskål, P1000 pipette, og pipetter i en steril kultur hette, og la under ultrafiolett lys for ~ 15 minutter før ankomst og behandling av svulstvev.

Tre. Prøve Isolering og Transport

1. Isoler med vevsprøver ved kirurgisk reseksjon.
2. Umiddelbart plassere vevsprøver inn i iskald HBSS + / + så raskt som mulig etter fjernelse fra pasienten. Når alt tissue prøver er samlet inn, transportere prøver (på is) fra den operative anlegget til laboratoriet for videre behandling.

4. Tissue Dissosiasjon og Utgnidning

1. Etter standard steril teknikk i en laminær strømningshette, bringe konisk rør med tumorprøve inn i hetten kultur, og vaskeprøver ved å snu røret og tumor 50x. Tillat fragmenter til å falle til bunnen av røret, og deretter fjerne HBSS + / +. Påfyll med 30 ml HBSS + / +, og agitere / invertere 50x igjen. Gjenta inversjon / media fjerning for totalt 4x.
2. Re-suspendere tumor fragmenter i 30 ml HBSS + / + for siste gang, og hell blandingen i en sterile100 mm petriskål, og separat svulst i 0,5 cm ^tre grupperinger. Dersom større svulst fragmenter er oppstått, bruker vevet saks eller skalpell (# 11 eller # 15 blad) til kuttet i mindre stykker.
3. Bruk pinsett for å plassere de 0,5 cm ³ vev grupper i det enkelte HBSS + / + fylt, 2 ml rundbundet koniskal-rør, alt på is. Bruk vev saks for å hakke tumor fragmenter i sub-1 mm fragmenter-suspensjonen bør ha en 'snøkule "utseende (figur 1). Hakk tumor bare inntil mesteparten av fragmentene er sub-1 mm; ikke "over-kjøttdeig 'kreftprøver. Plasser helt hakket vev røret tilbake på isen, og gjenta med alle tilleggs prøverør.
4. Overfør alle fragmenterte tumorprøver i et enkelt 15 ml konisk rør. En P1000 pipette med et kutt / modifisert steril tipset fungerer godt for dette trinnet. Bruk ekstra HBSS + / + til å spyle / skylle de to ml dissosiasjon rør for å sørge for at alle svulst prøven er samlet inn i 15 ml tube. Spinn ned blandingen i sentrifuge ved 23 ° C, ved 73 x g i 5 min.
5. Suges av HBSS + / +, slik at cellepelleten. Re-suspendere fragmenter i 1:1 blanding av 0,25% trypsin: 0,2% collagenase (oppløst i HBSS-/ -) - legger akkurat nok til å holde kreft fragmenter i tett suspension. Bytt skrue-top, og plasser i 37 ° C inkubator for 30 min. Rør celleblanding i det minste en gang i løpet av inkuberingen for å holde fragmentene i suspensjon. Plasser schwannoma kultur media inn i kuvøse for å varme det på denne tiden også.
6. Etter inkubering, tilsett 100 ul FBS til hvert rør for å inaktivere trypsin, og deretter sentrifugeprøve ved 23 ° C, 73 x g i 5 min. Ved hjelp av en pipette, forsiktig suging av så mye supernatant som mulig uten å forstyrre cellepelleten. Tilsett varmet kulturmedia (N2/insulin/5% FBS) til tumorfragmenter til et sluttforhold på 01:02 tumorfragmenter: kulturmedia (for eksempel hvis det er en ml av tumorfragmenter, tilsett i 2 ml varmet media).
7. Forbered svulst utgnidning ved å kutte tuppen av av en P1000 pipette tips til en diameter på ca 1-2 mm. Sakte Triturer cellesuspensjonen med gradvis mindre og mindre diameter pipetter, til du lett kan pipetter løsningen gjennom en unaltEred P1000 pipettespissen. Umiddelbart flytte til en mindre tips når du enkelt kan pipette svulsten løsning gjennom spissen - ikke over Triturer prøven. Hvis en enkelt større stykke vevsblokker aspirasjon under utgnidning, å peke pipettespissen på bunnen av det koniske røret tillater ofte fortsatt triturering.

5. Cell Plating

1. En 0,5 mm ³ fragment av vev er nok til frø 1 x 100 mm fatet, eller 4 x 8-well/4-well lysbilder. Like før du legger media / celleblandingen, fjerne laminin løsning fra kultur plater, men ikke la platene tørr.
2. For hver 100 mm fatet, oppløse svulsten fragment i 10 ml varmet kultur media.
3. For hver brønn av en 4-godt lysbilde, bruke 750 mL varmet kultur media (3 ml for hele lysbilde).
4. For hver brønn av en åtte-brønns lysbildet, bruker 400 mL varmet kultur media (3,2 ml for hele lysbilde).
5. Inkuber kulturer i 37 &# 160; ° C, 100% fuktighet, 6% CO _2. La kulturer alene i minst 36 timer, og deretter endre medie hvis oppløsningen er gulnet (surt). Endre Ellers media på 72 timer, deretter hver 2-3 dager eller når media blir surt. Hvis mediet blir surt daglig i flere dager på rad, er dette vanligvis en indikasjon på potensiell bakteriell eller gjær forurensning.

Representative Results

Riktig tumor fragmentering er viktig for optimal såing og utvekst i vevkulturskåler (figur 1). Identifisering av schwannoma celler i løpet av de første dagene etter plating er ofte vanskelig på grunn av obscuring mengder av celle-debris, og røde blodceller. Ved ^4. eller ^5. dag, vil celle utvidelser nærheten heft tumor fragmenter skape gjenkjennelige 'snøring' mønstre blant vrakrestene. Påfølgende medier endringer generelt fjerne mesteparten av ikke-adherente celler fra den andre uken. Ved hjelp av denne fremgangsmåten, kan 90% sammenløp forventes mellom 7-14 dager, avhengig av den opprinnelige vitalitet av tumor-fragment før male og plette tetthet (Figur 2). Som tidligere beskrevet, schwannom kulturer synes å vokse utover fra små fragmenter av adherente tumorfragmenter ^9,10. Slik utvekst er synlig ved slutten av den første uken. Figur 2 viser brightfield avbildning av schwannoma celleutvekst fra en enkelt svulst fragment, skissert i rødt i nedre høyre hjørne. Figur 3 illustrerer 'bridging' utvekst som oppstår mellom to ulike tumor fragmenter, i kulturbrønner immunostained med polyklonale kanin anti-S100 antistoff. Vi rutinemessig immunostain kulturer med anti-S100-eller anti-p75-antistoffer ^NTR å kontrollere renheten av kulturer og positivt identifiserer schwannoma celler for analyse (figur 4). Med disse fremgangsmåter enn> 95% av cellene i disse kulturene representerer schwannoma celler. Schwannoma celler også merke med glial fibrillary surt protein (GFAP) og ErbB2, blant andre markører ^11.

Figur 1. Sammenligning av samme tumorprøven både før (B) og akteruteh (B) hakking. Sample utarbeidet i 1,5 ml HBSS + / + med Fenol Red i 2,0 ml rund bunn konisk tube.

Figur 2. Typisk utseende av kulturer på lysfelt mikroskopi. Spindled schwannoma celleutvekst stråler fra tumor fragment, bilde tatt på kultur dag 10. Scale bar = 100 mikrometer.

Figur 3.. Immunostaining av primære vestibulære schwannoma kulturer med anti-S100 antistoffer demonstrere typisk kultur og celle morfologi. A) Lavt strømforbruk skisse som viser utvekst fra belagt tumor fragmenter, kultur dag 14 Scale. Bar = 200 mikrometer. B) Høyere poweh utsikt schwannoma celler med spindel morfologi, kultur dag 14. Scale bar = 100 mikrometer.

Figur 4. Immunostaining av primære vestibulære schwannoma kulturer å bekrefte renhet kultur og celle identitet. A) Kulturer immunostained med anti-S100-antistoffer. Nuclei er merket med DAPI. Scale bar = 100 mikrometer. B) Kulturer immunostained med anti-p75 ^NTR antistoffer. Nuclei er merket med DAPI. Scale bar = 100 mikrometer.

Discussion

Historie av in vitro schwannoma kulturer

Arbeidet med å etablere in vitro schwannoma kulturer begynte bare et par tiår etter den første Vestibularisschwannom åpen kirurgisk reseksjon skjedde i 1894 ^12. Den første registrerte kulturer var ved Kredel på 1920-tallet, som uten hell forsøkt å vokse hakket svulsten ved "hengende slipp-metoden" ¹² . Senere, Drs. Murray og Stout publisert sin in vitro kultur erfaring med neurilemomas dyrket på levret humant plasma. Interessant, denne teknikken avslørte at Antoni A og Antoni B spesifikke fragmenter vokste annerledes, med unike mobilnettet morfologi og differensial priser av agar LNG ^13. Cravioto og Lockwood publisert ytterligere observasjoner av Vestibularisschwannom kulturer i avian propper på dekkglass slips og rulle rør. De var også de første til å bruke Rose kamre for time-lapse avbildning av tumorvekst 10. Baur kombinert den "en bloc" og monolayer tilnærminger i sin publikasjon, som også demonstrerte mitogene effekter av Laminin-belagt petriskåler ^ni. De etterfølgende publiserte protokoller, som vår egen, benytte en lignende protokoll for såing hakket tumorfragmenter på en kulturoverflate behandlet med en ladet aminosyre (poly-L-ornitin, poly-L-lysin) og laminin preparat ^8.. Vi har brukt den samme metoden til kultur schwannomas som kommer fra ansiktsbehandling, trigeminal, vagus, og spinal nervene med lignende resultater.

Fordeler med Vestibulær schwannoma primærkulturer

Studier av menneskelig schwannoma tumorigenesis bruker ofte homogene foreviget cellelinjer og transgene mus modeller. Slike verktøy er gunstig, men do ikke nøyaktig gjenspeiler genotypene, fenotyper, og kompleksiteten av menneskelig sykdom. I motsetning til dette primærkulturer sannsynlig gi en mer realistisk modell. De mer trofast rekapitulere heterogenitet av genomisk og molekylær status forbundet med menneskelige svulster ^15.

Purity of schwannoma kulturer

En utfordring for primær vevskultur er å opprettholde målcellen renhet. Schwannomas overveldende bestå av neoplastiske Schwann celler ^6, men kulturer er ikke immune mot fibroblast forurensning. Historisk metoder for å optimalisere schwannoma celle renhet faller inn i tre kategorier: 1) valg av kjemisk definerte medium og spesifikke vekstfaktorer; 2) immunorensing (f. eks, med magnetiske kuler cellesortering ^7), 3) en kombinasjon av begge de foregående metoder. Etter vår erfaring fibroblaster eller andre ikke-schwannoma celler generelt utgjør mindre at 5% av cellene i Culture, uavhengig av pasientens egenskaper (alder, kjønn), sporadiske eller NF2-forbundet svulster, primær eller sekundær svulst reseksjon, eller cystisk vs solide tumortyper. Hvis vises fibroblaster som skal ta over kulturen, vil fjerning av serum for 1-2 medieendringer redusere denne populasjonen uten negativ innvirkning schwannoma celle overlevelse. Forbehandling av cellekultur overflater med laminin forenkler også schwannoma cellevekst ^ni. Minimal aging av kulturer bidrar også til å redusere uønsket cellular forurensning - cryostorage er best ferdig i løpet av de to første kultur passasjer, og kultur eksperimentering er ikke anbefalt utover passasje 4-5. Vi finner optimale resultater når kultur eksperimentering er gjennomført av passasjen 1-2 med ikke-cryostored celler.

Vi bruker både farging (anti-S100, DAPI) og mikroskopisk utseende av cellulære og kjernefysisk morfologi som kvalitetskontroll tiltak i våre schwannoma kulturer. Av og til deter nyttig å immunostain en undergruppe av kulturer for monocytter (CD68) eller fibroblast spesifikke markører for å ytterligere verifisere kultur renhet ^ni. Under eksperimentelle analyser av celle atferd (f.eks, spredning eller celledød), vi alltid immunostain med anti-S100 eller anti-p75 ^NTR antistoffer for å bekrefte at funnene er schwannoma celle spesifikke.

Kultur morfologi og vekstmønster

Schwannoma tumor kulturer vanligvis vise unike vekst mønstre som minner om Antoni A (høy celletetthet, tett organisert, indikasjoner på Verocay kroppsformasjoner) og sjelden av Antoni B (relativt sparsom kjerner, rikelig cellulære prosesser, mindre organisasjon) mønstre sett i histopatologi av resected schwannoma svulster ^16. Nesten alle schwannoma celler vise den klassiske lange, spindel, bipolar celle formen forbundet med både Schwann og schwannoma celler ^6,17 men andre celle morphologies, som beskrevet av Cravioto (amoeboid Microglia-lignende celler, spindel-formet Cells, Racket-Shaped Cells, og Kite-Shaped Cells) noen ganger oppstå ^14. Overall, cellevekst og spredning er svært treg i vår base medium (DMEM/10% FBS/Insulin/N2 supplement). Tilsetning av kjente mitogene faktorer som forskolin og β1-neuregulin signifikant øker celleproliferasjon ^18.

Kritiske Protocol Steps

Vår schwannoma vev kultur protokollen er enkel og ganske tilgivende; men det er flere viktige tiltak som sikrer suksess. For det første er korrekt tumorbehandling kritisk. Expect beste resultater når tumoren er plassert direkte inn i iskald HBSS + / + så snart som mulig etter fjernet fra pasienten. Dette står i motsetning til den vanlige praksis med å samle kirurgisk reseksjon av tumoren i sterilt saltvann og deretter sende summen vev for behandling i patologi ved slutten av saken. For det andre, holde vev SAMPles så kjølig som mulig under bearbeidingen. Det er viktig at resected svulst holdes iskald, og at behandlingen skjer så hensiktsmessig som mulig etter fjerning. Gjøre så mye av vevet behandling som mulig på is i tillegg. Tredje, aggressivt vaske tumorprøver. Dette bidrar til å redusere risikoen for bakteriell eller gjær-forurensning. Fjerde, ikke over-kjøttdeig vevsprøver. Tumor trituration avhenger av en semi-subjektiv vurdering av når vi skal fortsette med en mindre diameter P1000 pipettespissen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components