Summary
Vi beskriver här ett protokoll för rening och karakterisering av växtproteinkomplex. Vi visar att genom immunoprecipitating ett enda protein i en komplex, så att vi kan identifiera dess post-translationella modifieringar och dess interagerande partners.
Abstract
Växter snabbt anpassa sig till föränderliga miljöer på grund utarbeta perception och signalsystem. Under patogen attack, växter snabbt reagera på infektion via rekrytering och aktivering av immunkomplex. Aktiveringen av immunkomplex är associerad med posttranslationella modifieringar (PTMs) av proteiner, såsom fosforylering, glykosylering, eller ubikitinering. Att förstå hur dessa PTMs är koreograferade att leda till en bättre förståelse för hur motstånd uppnås.
Här beskriver vi en proteinreningsmetod för nukleotid-bindande leucinrik upprepning (NB-LRR)-interagerande proteiner och den efterföljande identifieringen av deras post-translationella modifieringar (PTMs). Med små modifieringar, kan protokollet tillämpas för rening av andra växtproteinkomplex. Metoden är baserad på uttrycket av en epitop-märkt version av proteinet av intresse, som därefter partiellt renad by immunoutfällning och utsätts för masspektrometri för identifiering av interagerande proteiner och PTMs.
Detta protokoll visar att: i). Dynamiska förändringar i PTMs såsom fosforylering kan detekteras genom masspektrometri, ii). Det är viktigt att ha tillräckliga mängder av proteinet av intresse, och detta kan kompensera för bristen på renheten av immunfällningen, iii). För att detektera PTMs av ett protein av intresse, har detta protein som skall immunoutfälldes att få en tillräcklig mängd av protein.
Introduction
Immunvägar gripa olika posttranslationella modifieringar (PTMs) av proteiner för att snabbt omvandla signalerna och aktiverar immunsvar 1. PTMs är snabba, reversibla, och mycket specifika kemiska förändringar av proteinstrukturen som kan påverka proteinkonformation, aktivitet, stabilitet, lokaliserings-och protein-proteininteraktioner 2-4. I växter, har mer än 300 typer av PTMs identifierats inklusive ubiquitinering, sumoylation, sulfate, glykosylering och fosforylering 2,5. En växande mängd bevis belyser vikten av PTMs i olika aspekter av växt immunitet 1,5,6. Protein fosforylering, är reversibel fastsättning av en fosfatgrupp till ett serin-treonin-eller tyrosinrest en regulator av många cellulära funktioner och inte överraskande den mest studerade PTM i växters försvar signaleringskaskader 5-11. Fosforylering-beroende signalering är en integrerad del av anläggningen defense aktivering initieras efter cellulära uppfattning av mikrober av transmembranreceptorer, eller intracellulär erkännande av multidomain motstånds proteiner 5,8.
Vid invaderande växter, mikrober upptäcks av plasmamembranreceptorer som kallas mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS) 12. Kända PRRs är antingen receptorliknande proteiner (RLPs) eller receptorliknande kinaser (RLKs), som båda bär en ligandbindande ektodomänen och en enkelpasstransmembrandomänen. I motsats till RLPs, RLKs har en intracellulär kinasdomän 13-15. Den ektodomän PRRS binder till bevarade mikrob elicitor molekyler som kallas patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) ledande, i fallet med RLKs, till autofosforylering och transfosforylering inom den intracellulära domänen 6, 16. Nedströms uppfattning-inducerade fosforylering av PRRs, efterföljande fosforylering av cytoplasmaproteiner inklusive kinaser 17, 18, ligaser E3 19, mitogen-aktiverade proteinkinaser (MAPK) 20, 21, kalcium-beroende proteinkinaser (CDPK) 22, 23, och transkriptionsfaktorer 24, 25 leder till PAMP triggad immunitet (PTI).
Utöver den extracellulära uppfattning PRRs är intracellulär erkännande av patogener uppnås genom cytoplasmatiska receptorer. Dessa multidomain resistansen (R)-proteiner innehåller en variabel N-terminal domän, en central nukleo-bindande (NB) motiv, och C-terminala leucinrika upprepningar (LRR) och därför kallas NB-LRR proteiner 26, 27. R-proteiner direkt eller indirekt känner igen patogen-härledda virulence molekyler som kallas effektorer, också kända för att rikta PRRs och andra noder i immunsystemet. Erkännande inducerar starka försvar som leder till effektor-utlöst immunitet (ETI) 28-31. NB-LRR proteiner har en requisite ATP-bindande motivet i den NB domän 30, 32, men de saknar en kinasdomän. Fosforylering av konserverade domäner av NB-Lrrs har rapporterats i en storskalig proteomik undersökning 33, men dess relevans för ETI är oklart. Likaså till PTI, aktivering av NB-LRR proteinerna leder till fosforylering av cytoplasmaproteiner inklusive MAPKs 34-37 och CDPKs 38-40. Viktigast kan effektor erkännande leda till fosforylering av tillbehör proteiner som interagerar direkt med NB-LRR proteiner 41. Några exempel RIN4 (Arabidopsis thaliana) och Pto (tomat, Solanum lycopersicum) proteiner som interagerar med NB-LRR proteiner RPM1 42, 43 och Prf 44, respektive. Vid infektion av Pseudomonas syringae bakterier, det effektorprotein AvrB inducerar RIN4 fosforylering, troligen av den receptorliknande kinas RIPK 45,
Dessa exempel visar att identifieringen av immuna komplexa komponenter och deras potentiella PTMs på effektor erkännande kan leda till en bättre förståelse för hur signaler omvandlade från effektor uppfattning till mål nedströms. Här beskriver vi en proteinreningsmetod för NB-LRR-interagerande proteiner och efterföljande identifiering av sina PTMs. Vi använder Nicotiana benthamiana och tomat Prf / Pto komplicerat som en modell, men samma protokoll kan lätt appliceras på RLKs från N. benthamiana och A. thaliana 53 med små ändringar som vi beskriver i protokollet.
Protocol
Notera: alla steg utföras vid rumstemperatur om ej annat anges.
1. Beredning av växtmaterial och buffertar
- För N. benthamiana
- Väx Agrobacterium tumefaciens-stammar av intresse för transient uttryck (i detta exempel Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG och tom vektor som kontroll) med skakning (200 rpm) i vätskekultur (L-medium med lämpliga antibiotika) vid 28 ° C fram till den stationära fasen.
- Samla och pellets Agrobacteria genom centrifugering (3000 xg under 5 minuter). Kassera supernatanten och suspendera pelleterade Agrobacteria i infiltration buffert.
- Mät mängden Agrobacteria genom erhållande av den optiska densiteten (OD)-värde vid en absorbans av 600 nm (Abs 600 nm). Justera OD av bakterier till 0,1-0,8.
- Infiltrera 4 veckor gamla N. benthamiana växter (22 ° C, 16 timmar ljus) med Agrobacteria av Hand (med en 1-ml spruta utan nål) eller genom vakuum (lägg till 0,02% v / v ytaktivt medel).
Notera: Använd den första nära fullständiga expanderade blad, och de två omedelbart äldre bladen för mest effektiva proteinuttryck. För detektering av ubiquitinerade eller acetylerade proteiner infiltrera blad med 100 nM MG-132 eller 100 ng / ml Trichostatin A, respektive, vid 1 och 2 dagar efter infiltration. - Skörda infiltrerade blad 2-5 dagar efter infiltrering och frysa i flytande kväve. Förvara proven i en -80 ° C frys.
Anm: Bestäm bästa nivån av uttryck av proteinet av intresse i förväg genom att ta prover över ett tidsförlopp för 5 dagar och detektera proteinnivåer genom immunoblotting.
- För A. thaliana stabila transgena linjer
- Grow A. thaliana frön i 6-brunnars plattor med tillsats av 5 ml flytande MS-medium (1% vikt / volym sackaros) per brunn. Sätt 3-5 frön (steriliserade och skiktade) av transgena linjenav intresse eller den otransformerade styrledning per brunn. Skaka vid 200 rpm under två dagar före överföring av plattan till ett odlingsrum och låt stå i 2 veckor (22 ° C, 10 h ljus).
- Harvest prover och frysa i flytande kväve.
Obs: Du kan använda som en kontroll en transgen linje som uttrycker en obesläktad protein med samma tagg som proteinet av intresse.
- Buffertar
- Förbered buffert A. De-gas bufferten för 1-2 tim (för RLKs, andra membranbundna proteiner och nukleära proteiner, tillsätt 1% volym / volym IGEPAL CA-630 53).
Obs: Du kan hålla buffert A vid 4 ° C obestämd tid. Du kan använda 1% v / v Triton istället för IGEPAL CA-360. - Förbered 80 ml kall buffert B minst 1-2 timmar före extraktion.
Anmärkning: Det ideala förhållandet mellan vävnad kontra extraktionsbuffert är 1:04 (vikt / volym).
- Förbered buffert A. De-gas bufferten för 1-2 tim (för RLKs, andra membranbundna proteiner och nukleära proteiner, tillsätt 1% volym / volym IGEPAL CA-630 53).
2. Protein Extraction
- Precis före extraktionen bereda 80 ml kall Buffert C.
- Grind 20 g N. benthamiana vävnad (ca 15 blad) eller A. thaliana-plantor (2-4 g per 6-brunnar) i flytande kväve med användning av en mortel och mortelstöt.
- Tillsätt 80 ml kall buffert C till 20 g mald vävnad, blanda väl, och tina på is.
OBS: Slipa alla prover samtidigt (protein av intresse och kontroll). - Homogenisera med tre skurar av 10 sekunder vardera i full fart med en vävnadshomogenisator (förkyld vid 4 ° C). Filtrera genom ett 22 till 25 | im vävnads och centrifugera vid 30.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C.
Obs: Du kan också homogenisera med en fräsch förkyld mortel. - För blockering och tvättsteg av affinitetsmatrisen, framställa 20 ml av buffert D.
- Block 100 ml av lämplig affinitetsmatris med användning av 500 ml kall buffert D innehållande 1% BSA under 5 min vid 4 ° C.
OBS: Preferred afFinity matriser innefattar anti-FLAG-M2-agaros, Streptavidin agaros, GFP-Trap_A och anti-HA-agaros. - Tvätta 3x med 1 ml kall buffert D.
- Avlägsna supernatanten av bladextrakt och filtrering genom ett 0,45 fim sprutfilter in i ett nytt rör på is.
OBS: Extraktet färg ska vara grön eller gul, om provet har blivit brun, kasta och börja om. - Tag en alikvot av det råa extraktet för immunoblot, tillsätt 5 x SDS-PAGE-laddningsbuffert, vortexa och denatureras genom kokning av proverna under 10 minuter vid 80 till 100 ° C i ett värmeblock.
3. Protein Immunoprecipitation
- Split proteinextraktet i två 50 ml-rör och tillsätt 50 pl av den affinitetsmatris suspenderades i buffert D till varje rör. Inkubera under försiktig rotation under 2 timmar vid 4 ° C.
OBS: Längre inkubationer har inte visat sig öka avkastningen. - Förbered 600 l (6x pärla volym av affinitetsmatris) av eluering buffert genom att lägga tillBuffert D (slutkoncentrationer): 0,5% BSA, 0,25 mg / ml FLAG peptid (för anti-FLAG-M2-agaros) eller 10 mM D-biotin (till streptavidin-agaros).
Anm: Eluering rekommenderas inte i fallet med GFP-Trap_A och anti-HA-matriser, så fortsätta direkt till kokning i 1 x SDS-PAGE-laddningsbuffert, steg 3,11. - Fällning affinitetsmatrisen genom centrifugering vid 4 ° C (5 min vid 1000 xg).
- Tag en alikvot av den obundna extraktet för immunoblot, kassera resten av den överstående vätskan och att lämna ca 500 | il i botten av röret.
- Resuspendera slamlösningen med en bred-borrning spets.
- Överför den blandade lösningen uppslamningen från båda rören till en enskild 1,5 ml rör.
Anm: Från och med nu, använd 1,5 ml låg proteinbindnings mikrofugrör. - Puls 3x för 5 sek med användning av en bordscentrifug för att utfälla affinitetsmatris och avlägsna supernatanten.
- Tvätta 3-5x med 1 ml kall buffert D. Mellan tvättar fälla ut affinitet Matrix såsom tidigare beskrivits och kassera supernatanten. Under den sista tvättningen avlägsna överskott buffert D med nålen hos en spruta.
Anmärkning: En slutlig tvättning med användning av buffert D med 0,1% IGEPAL kan användas för att ytterligare minska ospecifik bindning. - Eluera med 200 l av lämplig elueringsbufferten (för anti-FLAG M2 eller Streptavidin agaros se steg 3.2) 3x, 5 min varje gång med konstant skakning.
- Pool de 3 eluat i ett enda rör. Koncentrera proteinerna genom användning av 30 pl av absorptions-harts. Vortex, låt stå i 5 min och utfälla hartset (2 min vid 10000 x g). Kasta bort supernatanten.
Anm: GFP-Trap_A och anti-HA agaros, hoppa över stegen 3.9 och 3.10. - Tillsätt 50 ul av 1 x SDS-PAGE-laddningsbuffert till den utfällda affinitetsmatris eller absorption harts. Vortex och koka i 10 minuter vid 80-100 ° C i ett värmeblock.
- Centrifugera den kokade affinitetsmatris eller harts i 2 min vid 10000 x g.. Alikvot 5 | il av supernatant för immunoblot, och genomföras med andra fraktioner på en ~ 10 cm lång SDS-PAGE-gel (Figur 2).
- För separering och identifiering av fosforylerade proteiner med masspektrometri, ladda de återstående 45 ul på en ~ 19-cm långa SDS-PAGE-gel om extra separation behövs (Figur 2).
OBS: En tom körfält kan ingå mellan alla prover för att minska kontaminering av proverna.
4. Protein Digestion
- Fläck SDS-PAGE-gel med koUoidal Coomassie Brilliant Blue (CCBB) fläck.
OBS: Minimera hanteringen av gelen för att minska kontaminering med keratiner. Se till att ingen av utrustning eller verktyg har använts för immunoblotting eller andra aktiviteter som kan ha lämnat restförorening protein. - Avfärga gelén med ymnig tvättning i vatten, företrädesvis O / N. Skär det intressanta bandet från gelén med en ren rakblad.
OBS: Rikta in gelen med immunoblot om nödvändigtvisry att hitta rätt område. Eftersom fosforylering kan fördröja migreringen av proteinerna på SDS-PAGE skärs området omedelbart ovanför och nedanför det intressanta bandet. - Skär gelskivan i kuber av 2-4 mm (detta säkerställer att gelén kommer att täckas av lösningar i röret utan att blockera pipettspetsar). Placera i ett rör.
- Uppskatta den volym som krävs för att hålla gelen väl nedsänkt. Använd detta belopp för derivatisering, inkubation med proteas-och peptidutvinning, och sedan använda dubbel till tredubbla volymerna för tvätt.
Anmärkning: I en typisk smälta med ca 100 | il av de skurna gelstycken, använd 500 | il lösning för tvättning 2 x 180 ul för uttorkning, 150 ul för minskning, 120 ul för alkylering, och 120 | il för matsmältningen. - Tvätta gelpartierna 2 x 20 min (eller tills avfärgades) genom tillsats av 50% acetonitril (i 50 mM ammoniumbikarbonat, ABC). Pipettera av lösningen till att inte ta bort gel bitar.
- Torka med 100% acetonitril i 5 minuter och ta bort fri vätska.
OBS: Gelen ska visas krympta och vitt. Om den blå färgen består, inkubera längre i acetonitril / ABC och / eller vid förhöjd temperatur (45-55 ° C). - Minska protein disulfidbindningar genom att lägga till 10 mM DTT i vatten och inkubera i 30-45 minuter vid 56 ° C med skakning. Ta fri vätska.
- Alkylatbensin cysteingrupper genom tillsats av 55 mM kloracetamid (i 50 mM ABC) för 20-30 minuter (rumstemperatur, mörk). Ta fri vätska.
- Tvätta gelpartier 2 x 10 minuter med 50% acetonitril (i 50 mM ABC). Ta fri vätska.
- Dehydrera gelstycken med 100% acetonitril under 5 min och avlägsna fri vätska.
- För tryptiska smälta, tillsätt 40 ìl av trypsin arbetslösning (100 ng av trypsin i matsmältningen buffert: 50 mM ABC, 5% acetonitril för en genomsnittlig Coomassie-färgade band). Låt gelstycken rehydrera i 10 min. Tillsätt tillräckligt med digereringsbuffert för att täcka gelpartierna om nödvändigt. Inkubera vid 37 ° CO / N.
- För att stoppa digerering och extrahera peptiderna från gelén bitar, tillsätt 5% myrsyra (i 50% acetonitril) (lägg till samma volym som uppslutningsvolym). Sonikera under 5-10 min. Överför supernatanten till ett nytt rör. Upprepa extraktionen 3x.
- Torka peptider genom frystorkning (rekommenderas) eller en vakuum koncentrator (t.ex. Speed-Vac eller Savant). Förvara vid -20 º C.
- Skicka in ditt prov för masspektrometri.
OBS: Vi lämnat våra prov till masspektrometri anläggningen vid The Sainsbury Laboratory (Norwich, Storbritannien). Protokoll vid masspektrometri anläggningar varierar mycket, men typiskt peptider kommer att lösas upp i 0,2% trifluorättiksyra med 2% acetonitril innan du lägger på en vätskekromatografisystem kopplat till elektrosprut tandem masspektrometri.
Representative Results
Vi beskriver här ett protokoll för rening av märkta proteiner från stabil transgen A. thaliana linjer eller efter gående uttryck av proteiner i N. benthamiana. Såsom illustreras i figur 1 vid rening av den målsökta proteinet är kopplat med masspektrometri för att möjliggöra identifiering av interagerande proteiner och PTMs av den målsökta proteinet. Protokollet har konstruerats för rening av proteiner som är involverade i växten immunitet och identifiering av deras PTMs men kan tillämpas på rening i något taggat växtprotein.
Som ett exempel använder vi reningen av Prf / Pto komplexet från N. benthamiana. Den transgena N. benthamiana linje 38-12 54, som uttrycker 35S: Pto, transient omvandlas med 35S: PRF-FLAG och komplexet immunoutfälldes med anti-FLAG M2 agaros (Figur 2A). De immunoblottar (IB) i figur 2Aillustrera att det mesta av den riktade protein (Prf) immunutfälldes. Pto och det samverkande effektorprotein AvrPtoB ades copurified med Prf och detekteras med användning av antikroppar och masspektrometrianalys (fig. 2A och 2B). Vi fann att den Pto som copurified med Prf migrerade långsammare på SDS-PAGE-gel när samuttrycks med effektor konstruerar 35S: AvrPto och 35S: AvrPtoB (Figur 2A). Båda effektorproteiner induceras långsammare migrering av Prf-interagerande Pto (Figur 2A). Denna effektor erkännande beroende långsam migration av Pto tidigare skrivs fosforylering eftersom det kan avlägsnas genom behandling med fosfatas 44. För att upptäcka fosforyleringsställena bidrar till den långsamma migrationen av Pto, vi utsätts för Prf copurifying Pto till masspektrometrianalys. Trots den höga uttrycket av Pto och dess lätt upptäckt med immunoblottar vi kunde hämta peptider covering endast 57% av Pto sekvens och vi misslyckades med att identifiera eventuella fosforyleringssäten (Figur 2B).
Därefter bytte vi strategier för att rikta den Pto proteinet med anti-FLAG. N. benthamiana WT växter transient omvandlas med 35S: PRF-3HA och 35S: Pto-FLAG, med eller utan 35S: AvrPto och 35S:. AvrPtoB Den totala mängden Pto protein, som består av både Prf-komplex och de fria formerna, immunprecipiterades med anti-FLAG-M2-agaros och utsattes för SDS-PAGE-fraktionering, i-gel-tryptisk digerering och masspektrometrisk analys (fig 2C). Med detta tillvägagångssätt identifierades vi Pto peptider som spänner över cirka 80% av dess sekvens och en okänd 100 kDa-interagerande protein. Vi identifierade ett antal enkla och dubbla fosforyleringssäten för Pto peptiderna 187-202 och 188-202 (tabell 1). Ser-198 och Thr-199 var de dominerande fosforyleringsställena men andra phosphorylation sajter detekterades också (tabell 1). Viktigast dubbel fosforylering på Ser-198 och Thr-199 identifierades endast i närvaro av antingen effektorprotein (Tabell 1). Vi identifierade nyligen en liknande uppsättning Pto fosforyleringssäten och illustrerade betydelsen av den dubbla fosforylering händelsen för signalering 47. Efter det protokoll som beskrivs här kunde vi identifiera dynamiska förändringar i fosforyleringen tillståndet i målprotein.
Figur 1. Allmänna experimentell design. Målproteinet för immunoprecipitation (IP) är taggad och uttrycks i planta, transient i Nicotiana benthamiana eller stabilt i Arabidopsis thaliana. Efter proteinextraktion denmålproteinet immunutfälldes med en affinitetsmatris. Proteinerna separerades på en akrylamidgel efter elektrofores. Gel-banden skars ut. Proteiner extraheras från gelbanden och utsattes för masspektrometri. Fosforyleringssäten och interagerande proteiner identifieras. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Prf och Pto immunoutfällning. A). Konstruktionen 35S: PRF-FLAG uttrycktes transient i 38-12 linje (35S: PTO) tillsammans med tom vektor (EV), 35S: AvrPto eller 35S: AvrPtoB. Tre dagar efter infiltrering Prf immunutfälldes med användning av anti-FLAG-affinitetsmatris. Immunoblots (IB) för Prf, AvrPtoB och Pto utfördes. Som påpekats av pilarna längst ned i Pto immunoblot panel, AvrPto och AvrPtoB inducera en långsammare migration av Pto. B). Konstruktionen 35S: PRF-FLAG uttrycktes transient i 38-12 linje (35S: PTO) tillsammans med tom vektor (EV), 35S: AvrPto eller 35S: AvrPtoB. Tre dagar efter infiltrering Prf immunutfälldes med användning av anti-FLAG agaros och separerades på SDS-PAGE. Gelén färgades med kolloidalt Coomassie Brilliant Blue (CCBB) och den synliga Prf ades Pto och AvrPtoB proteiner band skars ut från gelén och analyserades genom masspektrometri. Den procentuella peptid täckningen av kraftuttag och pRF sekvenser identifieras med masspektrometri indikeras. C). Konstruktionerna 35S: PRF-3xHA och 35S: Pto-FLAG transient uttrycktes tillsammans med 35S: AvrPtoB, 35S: AvrPto eller tom vektor (EV) i N. benthamiana. Tre dagar efter infiltrering den totala mängden avPto-FLAG immunutfälldes med användning av anti-FLAG agaros och upplöstes på SDS-PAGE. Den synliga Pto och Pto-interagerande proteinband skars ut från gelén och analyserades genom masspektrometri. Pto och 100 kDa-Pto-interagerande protein-bandet är klart synlig på kolloidal Coomassie Brilliant Blue (CCBB) stained-gel, medan Prf är något mindre synligt (såsom anges av pilarna). IP: Immunoutfällning; IB: Immunoblot; CBB: Coomassie Brilliant Blue färgning, CCBB: kolloidal Coomassie Brilliant Blue-färgning. Klicka här för att visa en större bild.
| Prf | |||
| EO | AvrPto | AvrPtoB | |
| Pto peptid 188-202 | |||
| GTELDQ [p T 195] HLSTVVK | 1 | 0 | |
| GTELDQTHL [p S 198] TVVK | 10 | 7 | 5 |
| GTELDQTHLS [p T 199] VVK | 8 | 3 | 4 |
| G [p T 190] ELDQTHLS [p T 199] VVK | 0 | 1 | 2 |
| GTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK | 0 | 8 | 4 |
| GTELDQTHLSTVVK | 46 | 26 | 48 |
| Pto peptid 187-202 | |||
| KGTELDQ [p T 195] HLS TVVK | 0 | 1 | 0 |
| KGTELDQTHL [p S 198] TVVK | 17 | 17 | 12 |
| KGTELDQTHLS [p T 199] VVK 4 | 2 | 2 | |
| KGTELDQ [p T 195] HLS [p T 199] VVK | 0 | 1 | 1 |
| KGTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK | 0 | 7 | 5 |
| KGTELDQTHLSTVVK | 21 | 37 | 18 |
| Peptider 187-202 och 188-202 | 83 | 88 | 50 |
| Procentandel av peptider med två fosforyleringshändelser | 0% | 26,9% | 11,2% |
| Pto sekvenstäckning | 78% | 79% | 82% |
Tabell 1 Dubbel fosforylering av en Pto-peptid vid aktivering av signalering 35S:.. Prf-3xHA och 35S: Pto-FLAG transient uttrycktes tillsammans med empty vektor (EV), 35S: AvrPto eller 35S: AvrPtoB i N. benthamiana. Tre dagar efter infiltrering den totala mängden av Pto-FLAG-protein immunoutfälldes med användning av anti-FLAG-affinitetsmatris och upplöstes på SDS-PAGE. De synliga band i Pto på kolloidalt Coomassie lysande blå färgade gelen skars ut och analyserades med masspektrometri. Antalet Pto peptider som identifierats med 0, 1 och 2 fosforyleringshändelser indikeras.
| Tabell över buffertar | ||
| L-medium | Trypton | 10 g / L |
| Jästextrakt | 5 g / L | |
| NaCl | 5 g / L | |
| D-glukos | 1 g / L | |
| Agro-infiltration buffert | MgCl2 | 10 mM |
| MES </ Td> | 10 mM | |
| Justera till pH 5,5 | ||
| Acetosyringone (tillval) | 150 pM | |
| Buffert A | Tris-HCl pH 7,5 | 150 mM |
| NaCl | 150 mM | |
| EDTA | 5 mM | |
| EGTA | 2 mM | |
| Glycerol | 5% (volym / volym) | |
| Buffert B | Buffert A | |
| PVPP | 2% (vikt / volym) | |
| Buffert C | Buffert B | |
| Ditiotreitol (DTT) | 10 mM | |
| Plantera proteasinhibitorcocktail | 1% (volym / volym) | |
| Fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) | 0,5 mM | |
| Calyculin A | 50 nM | |
| Natriumfluorid (NaF) | 50 mM | |
| Natriummolybdat (Na 2 MoO 4) | 10 mM | |
| Natriumortovanadat | 1 mM | |
| Okadainsyra | 100 nM | |
| Buffert D | Buffert C utan PVPP | |
| 5x SDS-PAGE-laddningsbuffert | Tris-HCl pH 6,8 | 60 mM |
| SDS | 2% | |
| Glycerol | 0,15% | |
| Bromfenolblått | 0,10% | |
| DTT (lägg strax före användning) | 50 mM |
Tabell 2. Buffert och medie recept.
Discussion
Belysa mekanismen av receptoraktivering av PAMPs och effektenheter kan i hög grad bidra till vår förståelse av växt immunitet. Under de senaste 20 åren, har genetiska och jäst två-hybrid-skärmar varit avgörande för upptäckten av PRRs och NB-LRR proteiner. På senare tid har masspektrometri-baserade protokoll fastställts för identifiering av proteiner regleras differentiellt under immun signalering 55-58, deras PTMs 11,33,59,60, riktar sammansättningen av immunkomplex 61 och effektor 62. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för identifieringen av PTMs reglerar aktiveringen av immunkomplex.
I jämförelse med tidigare beskrivna protokoll, möjliggör detaljerad identifiering av dynamiska förändringar av PTMs detta protokoll. Protokoll av storskaliga proteomik metoder kan identifiera PTMs av proteiner, men kan inte avslöja platsen plasticitet PTMs grund för att begränsaed mängder protein. I fallet med proteinfosforylering, storskaliga proteomik tillvägagångssätt typiskt endast identifiera de dominerande fosforyleringsställen 11,33,59. Den detaljerade karakteriseringen av en proteinfosforylering status kräver en betydande mängd protein som kan uppnås endast genom partiell rening av målproteinet 47. Protokollet som beskrivs här kopplar en proteinrening tillvägagångssätt som ger en avsevärd mängd av målproteinet, med massanalys av det renade proteinet spektrometri. Efter detta protokoll, var den enda fosforylering vid Pto hänföras främst till Ser-198 som tidigare beskrivits 52 men några masspektrometri spektra stödde också en fosforylering händelse på Thr-195 eller Thr-199. När dubbla fosforyleringshändelser av Pto observerades, den dominerande kombinationen av fosforylerade aminosyror var Ser-198 och Thr-199 även om kombinationer på andra webbplatser observerades också (Tabell 1). Dessa resultat visar tydligt den fosforyleringsställe plasticiteten hos proteinkinaser och förmågan hos det beskrivna protokollet för att karakterisera i detalj alla möjliga fosforyleringsställen.
De mest kritiska stegen i detta protokoll är: 1) tillräcklig utvinning av proteiner, 2) skydda PTMs, och 3) tillräcklig mängd målprotein. Först för tillräcklig extraktion av proteiner, är det viktigt att mala vävnaden i flytande kväve och därefter att använda en vävnadshomogenisator såsom beskrivet i protokollet. Om en vävnadshomogenisator inte är tillgänglig, kan användas av en mortel och mortelstöt. Det är också viktigt att använda ett förhållande av 02:59 (eller fyra) av gram vävnad till volym extraktionsbuffert. Denna vävnad för att buffra förhållande och hög styrka buffert som vi föreslår kommer att se till att pH kommer att förbli neutralt under extraheringen. Vi fann att detta är särskilt viktigt för A. thaliana och tomat extrasfunktione r 52. Skydd av PTMs kan uppnås genom att ta med i samtliga buffertar lämpliga inhibitorer av enzymer som kan avlägsna PTMs. Det är även kritiskt för att utföra samtliga steg vid 4 ° C och till prechill buffertar och instrument. Högre utbyten av målproteinet kan uppnås genom att använda växter som uttrycker proteinet i tillräckliga mängder och genom användning av höga mängder av vävnad (ca 20 g). Det mest avgörande steget för att få tillräckliga mängder av målprotein koncentrerar målproteinet genom direkt immunoutfällning. Betydelsen av detta steg markeras av vårt misslyckande att identifiera PTMs av Pto efter en Prf immunoutfällning på grund av den begränsade mängden coimmunoprecipitated Pto (Figur 2B). I motsats därtill direkt immunoutfällning av Pto gav väsentligt mer mätbara peptider (figur 2C) som leder till ca 80% täckning av den proteinsekvens och identifiering av PTMs (tabell 1). Vi också strongly rekommendera användning av epitop-taggar för proteinimmunfällning. I jämförelse med antikroppar riktade mot nativa proteiner epitop-taggar affinitetsmatris kan ge större mängder av partiellt renat protein. Genom användning av en antikropp som tagits fram mot nativt Pto protein 51 (Figur 2A) för immunoutfällning, kunde vi identifiera bara enstaka fosforylering av de två dominerande fosforyleringsställen av Pto.
Detta protokoll har främst utvecklats för partiell rening av N. benthamiana cytoplasma protein och efterföljande identifiering av deras fosforyleringssäten. Men med hjälp av de ändringar som beskrivs här, detta protokoll kan enkelt anpassas för A. thaliana-proteiner och membranbundna proteiner. Det huvudsakliga syftet med detta protokoll är att ge tillräckliga mängder av målproteinet för identifiering av PTMs och inte för att uppnå högsta renhet av komplexet. Om högre renhetav komplexet krävs ett andra reningssteg kan läggas till i detta protokoll 52. I detta fall kommer ett första steg tillåta eluering av målproteinet från affinitetsmatrisen utan användning av höga salterna eller-syra och efterföljande steg kan innebära en matris, som kräver hårda elueringsbetingelser. Det är viktigt att betona att vi endast har testat detta protokoll för identifiering av fosforyleringssäten och att vi för närvarande testar sin förmåga för detaljerad identifiering av ytterligare PTMs.
Våra representativa resultat visar klart fosforyleringssätet plasticiteten hos proteinkinaser och förmågan hos det beskrivna protokollet för att karakterisera fosforyleringsställen. Viktigast är att belysa de att identifiera fosforyleringsställen förlitar sig i låg mängd av proteiner genom masspektrometri och genom enstaka punktmutationer av auto-fosforyleringsställen kan ge förvirrande resultat. Vi visar här och tidigare 47 47,63 visat att enstaka punktmutationer av Ser-198 och Thr-199 till alanin, som förhindrar fosforylering på dessa platser, har förmåga att signalera vilket tyder på att fosforylering av dessa platser är inte en förutsättning för komplex aktivering . Dessa resultat kan nu förklaras genom fosforylering av den sekundära platsen Thr-195. Liknande inblick i fosforyleringssätet plasticitet av andra proteinkinas kan erhållas efter detta protokoll. Dessutom, ett kombinerat tillvägagångssätt och använda fosforyleringsställen punktmutationer, proteiner som kan hämma specifika kinaser (manipulatorer) i kombination med protein immunoprecipitation och masspektrometrianalys kommer att leda till en bättre förståelse av den evolutionära betydelsen av fosforyleringssätet plasticitet av proteinkinaser.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen (ekonomiska eller andra).
Acknowledgments
VN stöds av Royal Society. JPR är en Australian Research Council Future Fellow (FT0992129). Vi tackar Dr Miriam Gifford för kritiskt läsa manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | toxic - 1 M stock in DMSO |
| Syringe 1 ml sterile | Terumo | ||
| Syringe needle | Terumo | NN-2525R | |
| Silwet L-77 (surfactant) | Lehle Seeds | VIS-01 | toxic |
| MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) | Sigma | C2211 | 1 M stock in DMSO, store at -80 °C |
| MS salts | Sigma | M5524 | oxidizing, toxic |
| Sucrose | Sigma | 16104 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer |
| NaCl | Sigma | S3014 | 5 M stock |
| EDTA | Sigma | E6758 | toxic - 0.5 M stock |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Glycerol | National Diagnostics | EC-606 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | corrosive |
| PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) | Sigma | P5288 | do not confuse with PVP |
| DTT (DL-dithiothreitol) | Sigma | 43815 | toxic - 1 M stock, store at -20 °C |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | do not freeze/thaw too many times |
| PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | corrosive, toxic |
| Calyculin A | Cell Signaling Technology | 9902 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | Sigma | S7920 | toxic - 1 M stock |
| Sodium Molybdate (Na2MoO4) | Sigma | S6646 | 0.5 M stock |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | 450243 | toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1 N NaOH or 1 N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 min). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. |
| Okadaic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-3513 | |
| Kinematica Polytron tissue homogeniser | Fisher Scientific | 08-451-320 | |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855-1R | |
| anti-FLAG M2 agarose | Sigma | A2220 | this matrix is recommended |
| Streptavidin-agarose | Thermo-Scientific | 20347 | this matrix is recommended |
| GFP-Trap_A | Chromotek | gta-20 | this matrix is recommended |
| Anti-HA-Agarose | Sigma | A2095 | this matrix is recommended |
| 0.45 μm filter | VWR | 513-1902 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | |
| D-biotin | Sigma | 47868 | |
| StrataClean resin | Agilent | 400714 | this absorption resin is recommended for protein precipitation |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | ||
| PROTEAN II XL Cell | Biorad | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | this stain is recommended |
| Protein low-binding tubes (LoBind) | Eppendorf | 0030 108.116 | these tubes are recommended |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Sigma | 9830 | toxic |
| Acetonitrile | VWR | 83639 | toxic, flammable |
| 2-chloroacetamide | Sigma | 22790 | toxic |
| Trypsin | Promega | V5280 | irritant, sensitizing |
| Formic acid | Sigma | 14265 | toxic, corrosive |
| Water-bath sonicator | Ultravawe | Ultra BT Ultrasonic Bath | |
| LTQ-Orbitrap XL | Thermo-Scientific | ||
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | toxic |
References
- Jones, A. M., Monaghan, J., Ntoukakis, V. Editorial: Mechanisms regulating immunity in plants. Front. Plant Sci. 4, 64 (2013).
- Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 33-41 (2004).
- Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation-a 25 year update. Trends Biochem. Sci. 25, 596-601 (2000).
- Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 156-163 (2009).
- Stulemeijer, I. J., Joosten, M. H. Post-translational modification of host proteins in pathogen-triggered defence signalling in plants. Mol. Plant Pathol. 9, 545-560 (2008).
- Park, C. J., Caddell, D. F., Ronald, P. C. Protein phosphorylation in plant immunity: insights into the regulation of pattern recognition receptor-mediated signaling. Front. Plant Sci. 3, 177 (2012).
- van Bentem, S. D., Hirt, H. Using phosphoproteomics to reveal signalling dynamics in plants. Trends Plant Sci. 12, 404-411 (2007).
- Peck, S. C. Early phosphorylation events in biotic stress. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 334-338 (2003).
- Thurston, G., Regan, S., Rampitsch, C., Xing, T. Proteomic and phosphoproteomic approaches to understand plant-pathogen interactions. Physiol. Mol. Plant P. 66, 3-11 (2005).
- Xing, T., Ouellet, T., Miki, B. L. Towards genomic and proteomic studies of protein phosphorylation in plant-pathogen interactions. Trends Plant Sci. 7, 224-230 (2002).
- Nuhse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. Plant J. 51, 931-940 (2007).
- Boller, T., Felix, G. A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors. Ann. Rev. Plant Biol. 60, 379-406 (2009).
- Wang, G., et al. A genome-wide functional investigation into the roles of receptor-like proteins in Arabidopsis. Plant Physiol. 147, 503-517 (2008).
- Wang, G. D., et al. The Diverse Roles of Extracellular Leucine-rich Repeat-containing Receptor-like Proteins in Plants. Crit. Rev. Plant Sci. 29, 285-299 (2010).
- Schwessinger, B., Ronald, P. C. Plant innate immunity: perception of conserved microbial signatures. Ann. Rev. Plant Biol. 63, 451-482 (2012).
- Schulze, B., et al. Rapid heteromerization and phosphorylation of ligand-activated plant transmembrane receptors and their associated kinase BAK1. J. Biol. Chem. 285, 9444-9451 (2010).
- Lu, D., et al. A receptor-like cytoplasmic kinase, BIK1, associates with a flagellin receptor complex to initiate plant innate immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 496-501 (2010).
- Zhang, J., et al. Receptor-like cytoplasmic kinases integrate signaling from multiple plant immune receptors and are targeted by a Pseudomonas syringae effector. Cell Host Microbe. 7, 290-301 (2010).
- Lu, D., et al. Direct ubiquitination of pattern recognition receptor FLS2 attenuates plant innate immunity. Science. 332, 1439-1442 (2011).
- Asai, T., et al. MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature. 415, 977-983 (2002).
- Rasmussen, M. W., Roux, M., Petersen, M., Mundy, J. MAP Kinase Cascades in Arabidopsis Innate Immunity. Front. Plant Sci. 3, 169 (2012).
- Boudsocq, M., et al. Differential innate immune signalling via Ca2+ sensor protein kinases. Nature. 464, 418-422 (2010).
- Dubiella, U., et al. Calcium-dependent protein kinase/NADPH oxidase activation circuit is required for rapid defense signal propagation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8744-8749 (2013).
- Ishihama, N., Yamada, R., Yoshioka, M., Katou, S., Yoshioka, H. Phosphorylation of the Nicotiana benthamiana WRKY8 transcription factor by MAPK functions in the defense response. Plant Cell. 23, 1153-1170 (2011).
- Mao, G., et al. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by two pathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 1639-1653 (2011).
- Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
- Eitas, T. K., Dangl, J. L. NB-LRR proteins: pairs, pieces, perception, partners, and pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 13, 472-477 (2010).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444, 323-329 (2006).
- Boller, T., He, S. Y. Innate immunity in plants: an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science. 324, 742-744 (2009).
- Bonardi, V., Dangl, J. L. How complex are intracellular immune receptor signaling complexes. Front. Plant Sci. 3, 237 (2012).
- Bonardi, V., Cherkis, K., Nishimura, M. T., Dangl, J. L. A new eye on NLR proteins: focused on clarity or diffused by complexity. Curr. Opin. Immunol. 24, 41-50 (2012).
- Takken, F. L., Albrecht, M., Tameling, W. I. Resistance proteins: molecular switches of plant defence. Curr. Opin. Plant Biol. 9, 383-390 (2006).
- Nakagami, H., et al. Large-scale comparative phosphoproteomics identifies conserved phosphorylation sites in plants. Plant Physiol. 153, 1161-1174 (2010).
- del Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. MAPKKKalpha is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease. EMBO J. 23, 3072-3082 (2004).
- Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
- Romeis, T., et al. Rapid Avr9- and Cf-9 -dependent activation of MAP kinases in tobacco cell cultures and leaves: convergence of resistance gene, elicitor, wound, and salicylate responses. Plant Cell. 11, 273-287 (1999).
- Zhang, S., Klessig, D. F. Resistance gene N-mediated de novo synthesis and activation of a tobacco mitogen-activated protein kinase by tobacco mosaic virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 7433-7438 (1998).
- Romeis, T., Piedras, P., Jones, J. D. G. Resistance gene-dependent activation of a calcium-dependent protein kinase in the plant defense response. Plant Cell. 12, 803-815 (2000).
- Romeis, T., Ludwig, A. A., Martin, R., Jones, J. D. G. Calcium-dependent protein kinases play an essential role in a plant defence response. EMBO J. 20, 5556-5567 (2001).
- Romeis, T. Protein kinases in the plant defence response. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 407-414 (2001).
- Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nat. Rev. Genet. 11, 539-548 (2010).
- Grant, M. R., et al. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance. Science. 269, 843-846 (1995).
- Mackey, D., Holt, B. F. 3rd, Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cell. 108, 743-754 (2002).
- Mucyn, T. S., et al. The tomato NBARC-LRR protein Prf interacts with Pto kinase in vivo to regulate specific plant immunity. Plant Cell. 18, 2792-2806 (2006).
- Chung, E. H., et al. Specific threonine phosphorylation of a host target by two unrelated type III effectors activates a host innate immune receptor in plants. Cell Host Microbe. 9, 125-136 (2011).
- Liu, J., Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. A receptor-like cytoplasmic kinase phosphorylates the host target RIN4, leading to the activation of a plant innate immune receptor. Cell Host Microbe. 9, 137-146 (2011).
- Ntoukakis, V., et al. The Tomato Prf Complex Is a Molecular Trap for Bacterial Effectors Based on Pto Transphosphorylation. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Sessa, G., D'Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 3157-3157 (2000).
- Ntoukakis, V., et al. Host Inhibition of a Bacterial Virulence Effector Triggers Immunity to Infection. Science. 324, 784-787 (2009).
- Zhou, J. M., Loh, Y. T., Bressan, R. A., Martin, G. B. The Tomato Gene Pti1 Encodes a Serine/Threonine Kinase That Is Phosphorylated by Pto and Is Involved in the Hypersensitive Response. Cell. 83, 925-935 (1995).
- Wu, A. -J., Andriotis, V. M. E., Durrant, M. C., Rathjen, J. P. A Patch of Surface-Exposed Residues Mediates Negative Regulation of Immune Signaling by Tomato Pto Kinase. Plant Cell. 16, 2809-2821 (2004).
- Gutierrez, J. R., et al. Prf immune complexes of tomato are oligomeric and contain multiple Pto-like kinases that diversify effector recognition. Plant J. 61, 507-518 (2010).
- Ntoukakis, V., Schwessinger, B., Segonzac, C., Zipfel, C. Cautionary notes on the use of C-terminal BAK1 fusion proteins for functional studies. Plant Cell. 23, 3871-3878 (2011).
- Rommens, C. M., Salmeron, J. M., Oldroyd, G. E., Staskawicz, B. J. Intergeneric transfer and functional expression of the tomato disease resistance gene Pto. Plant Cell. 7, 1537-1544 (1995).
- Jones, A. M., et al. Specific changes in the Arabidopsis proteome in response to bacterial challenge: differentiating basal and R-gene mediated resistance. Phytochemistry. 65, 1805-1816 (2004).
- Widjaja, I., et al. Combining subproteome enrichment and Rubisco depletion enables identification of low abundance proteins differentially regulated during plant defense. Proteomics. 9, 138-147 (2009).
- Keinath, N. F., et al. PAMP (pathogen-associated molecular pattern)-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
- Elmore, J. M., Liu, J., Smith, B., Phinney, B., Coaker, G. Quantitative proteomics reveals dynamic changes in the plasma membrane during Arabidopsis immune signaling. Mol. Cell. Proteom. 11, (2012).
- Benschop, J. J., et al. Quantitative phosphoproteomics of early elicitor signaling in Arabidopsis. Mol. Cell. Proteom. 6, 1198-1214 (2007).
- Maor, R., et al. Multidimensional protein identification technology (MudPIT) analysis of ubiquitinated proteins in plants. Mol. Cell. Proteom. 6, 601-610 (2007).
- Elmore, J. M., Coaker, G. Biochemical purification of native immune protein complexes. Methods Mol. Biol. 712, 31-44 (2011).
- Win, J., Kamoun, S., Jones, A. M. Purification of effector-target protein complexes via transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods Mol. Biol. 712, 181-194 (2011).
- Sessa, G., D'Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 2257-2269 (2000).
