Se describe aquí un protocolo para la purificación y caracterización de complejos de proteínas vegetales. Demostramos que por immunoprecipitating una sola proteína dentro de un complejo, para que podamos identificar sus modificaciones posteriores a la traducción y sus socios que interactúan.
Las plantas se adaptan rápidamente a los cambios del entorno, debido a la elaboración de la percepción y señalización. Durante el ataque de patógenos, las plantas responden rápidamente a la infección a través del reclutamiento y la activación de complejos inmunes. La activación de los complejos inmunes se asocia con modificaciones post-traduccionales (PTMs) de proteínas, tales como la fosforilación, glicosilación, ubiquitinación o. La comprensión de cómo son coreografiados estos PTM dará lugar a una mejor comprensión de cómo se logra la resistencia.
Aquí se describe un método para la purificación de proteínas con repeticiones ricas en leucina-nucleótidos vinculante (NB-LRR)-que interactúan las proteínas y la posterior identificación de sus modificaciones post-traduccionales (PTMs). Con pequeñas modificaciones, el protocolo se puede aplicar para la purificación de otros complejos de proteínas de la planta. El método se basa en la expresión de una versión epítopo de etiquetado de la proteína de interés, que posteriormente se purificó parcialmente By la inmunoprecipitación y se somete a espectrometría de masas para la identificación de proteínas que interactúan y PTM.
Este protocolo demuestra que: i). Los cambios dinámicos en PTM tales como la fosforilación pueden ser detectados por espectrometría de masas; ii). Es importante tener cantidades suficientes de la proteína de interés, y esto puede compensar la falta de pureza de la inmunoprecipitado; iii). Con el fin de detectar PTM de una proteína de interés, esta proteína tiene que ser inmunoprecipitada para obtener una cantidad suficiente de proteína.
Vías inmunes se basan en diferentes modificaciones post-traduccionales (PTMs) de proteínas para transducir señales rápidamente y activar respuestas inmunes 1. Las PTM se alteraciones químicas rápidos, reversibles, y altamente específicos de la estructura de proteínas que pueden afectar a la conformación de proteínas, la actividad, la estabilidad, la localización, y las interacciones proteína-proteína 2-4. En las plantas, se han identificado más de 300 tipos de PTM incluyendo ubiquitinación, la sumoilación, sulfatación, glicosilación, fosforilación y 2,5. Un creciente cuerpo de evidencia pone de relieve la importancia de la PTM en diferentes aspectos de la inmunidad planta 1,5,6. La fosforilación de proteínas, la unión reversible de un grupo fosfato a una serina, treonina o tirosina es un regulador de muchas funciones celulares y no es sorprendente el más altamente estudió PTM en defensa de la planta cascadas de señalización 5-11. De señalización dependientes de la fosforilación es una parte integral de DEFE plantaactivación NSE inició después de la percepción extracelular de microbios por los receptores transmembrana, o el reconocimiento intracelular por proteínas de resistencia multidominio 5,8.
Tras la invasión de las plantas, los microbios son detectados por receptores de membrana de plasma llamados receptores de reconocimiento de patrones (RRP) 12. Parentales conocidos son o bien proteínas similares a receptor (RLP) o quinasas de tipo receptor (RLKs), tanto que lleva un ectodominio de unión a ligando y un dominio transmembrana de paso único. En contraste con los RLP, RLKs tienen un dominio de quinasa intracelular 13-15. El ectodominio de PRRS se une a moléculas con inductor microbio conservadas llamados patógenos-patrones moleculares asociados (PAMP) que conduce, en el caso de RLKs, a la autofosforilación y transfosforilación dentro del dominio intracelular 6, 16. Aguas abajo de la fosforilación inducida por la percepción de derechos y responsabilidades parentales, posterior fosforilación de las proteínas quinasas citoplasmáticas incluyendo 17, </sup> 18, E3 ligasas 19, activadas por mitógenos proteína quinasa (MAPK) 20, 21, dependientes de calcio proteínas quinasas (CDPK) 22, 23, y los factores de transcripción 24, 25 lleva a la inmunidad producida PAMP (PTI).
Además de la percepción extracelular por PRRS, el reconocimiento intracelular de patógenos se logra a través de receptores citoplasmáticos. Estos multidominio resistencia (R), las proteínas contienen un dominio variable N-terminal, una unión de nucleótidos-(NB) motivo central, y repeticiones ricas en leucina C-terminal (LRR) y por lo tanto denominan proteínas NB-LRR 26, 27. R proteínas directa o indirectamente reconocen moléculas de virulencia derivados de patógenos llamados efectores, también conocidos a los parentales y otros nodos del sistema inmune. Reconocimiento induce fuertes defensas que conducen a la inmunidad efectora activada por (ETI) 28-31. Proteínas NB-LRR tienen una requisiciónTE motivo de unión a ATP en el dominio NB 30, 32, pero carecen de un dominio de quinasa. La fosforilación de los dominios conservados de NB-LRR se ha informado en un estudio de proteómica a gran escala de 33, pero su relevancia para el IET no está claro. De manera similar a PTI, la activación de las proteínas NB-LRR conduce a la fosforilación de proteínas citoplásmicas incluyendo MAPKs 34-37 y 38-40 CDPKs. Lo más importante, el reconocimiento efector puede llevar a la fosforilación de proteínas accesorias que interactúan directamente con las proteínas NB-LRR 41. Algunos ejemplos incluyen RIN4 (Arabidopsis thaliana) y Pto. (tomate, Solanum lycopersicum) proteínas que interactúan con proteínas NB-LRR, RPM1 42, 43 y FRP 44, respectivamente. Durante la infección por bacterias Pseudomonas syringae, la proteína efectora AvrB induce RIN4 fosforilación, lo más probable por el receptor de la quinasa RIPK 45, <sup> 46. Del mismo modo, en la P. de tomate syringae efectores AvrPto y AvrPtoB inducen la fosforilación de Pto 47. En contraste con RIN4 que carece de un dominio quinasa y debe ser trans-fosforilado, PTO es una quinasa activa capaz de auto-fosforilación 48 y trans-fosforilación de los sustratos 49, 50. Mientras Pto requiere su actividad quinasa para la iniciación efector dependiente de la señalización, los mutantes Pto-quinasa muertos siguen siendo capaces de señalar de manera efector independiente 51. Le explicamos recientemente estas observaciones al demostrar que el complejo Prf / Pto es oligomérica, que contiene múltiples Prf y Pto moléculas de 52 y que las moléculas Pto dentro del mismo complejo se trans-fosforilar entre sí 47. Hemos propuesto un modelo en el que una molécula de Pto (sensor) interactúa con las proteínas efectoras, provocando un cambio en la conformación de la proteína NB-LRR (PRF), que a su vez activa una segunda molécula Pto (ayudante) ingeniohin complejo. Posteriormente, el ayudante Pto molécula de trans-fosforila el sensor Pto conduce a la activación completa de la resistencia compleja 47.
Estos ejemplos demuestran que la identificación de los componentes de complejos inmunes y sus posibles PTM a partir del reconocimiento de efectos puede conducir a una mejor comprensión de cómo las señales son transducidas de la percepción de efector a objetivos de abajo. Aquí se describe un método de purificación de proteínas por proteínas NB-LRR-que interactúan y la posterior identificación de sus PTM. Utilizamos Nicotiana benthamiana y el complejo de tomate Prf / Pto como modelo, pero el mismo protocolo se puede aplicar fácilmente a RLKs de N. benthamiana y A. 53 thaliana con pequeñas modificaciones como se describe en el protocolo.
Elucidar el mecanismo de la activación del receptor por el PAMP y efectores puede contribuir en gran medida a nuestra comprensión de la inmunidad de las plantas. En los últimos 20 años, híbrido de dos pantallas genéticas y levaduras han sido fundamentales para el descubrimiento de derechos y responsabilidades parentales y las proteínas NB-LRR. Más recientemente, los protocolos basados en espectrometría de masas se han establecido para la identificación de proteínas reguladas diferencialmente durante inmune de señalización 55-58, sus PTM 11,33,59,60, la composición de los complejos inmunes 61 y efector se dirige a 62. Aquí se describe un protocolo sencillo para la identificación de PTM que regulan la activación de los complejos inmunes.
En comparación con los protocolos descritos anteriormente, este protocolo permite la identificación detallada de los cambios dinámicos de la PTM. Protocolos de los enfoques de la proteómica a gran escala pueden identificar PTM de proteínas, pero no son capaces de revelar la plasticidad sitio de PTM debido a limitared cantidades de proteína. En el caso de la fosforilación de proteínas, proteómica enfoques a gran escala típicamente sólo identifican los sitios de fosforilación predominantes 11,33,59. La caracterización detallada de un estado de fosforilación de la proteína requiere una cantidad sustancial de proteína que se puede obtener sólo a través de la purificación parcial de la proteína diana 47. El protocolo descrito aquí parejas un enfoque de purificación de proteína que produce una cantidad sustancial de la proteína diana, con el análisis de espectrometría de masas de la proteína purificada. Siguiendo este protocolo, el evento de fosforilación única de Pto se atribuyó principalmente a la Ser-198 como se ha descrito previamente 52, pero algunos espectros de espectrometría de masas también apoyó un solo evento de fosforilación en Thr-195 o Thr-199. Cuando se observaron eventos dobles de fosforilación de toma de fuerza, la combinación predominante de aminoácidos fosforilados fue Ser y Thr-198-199, aunque también se observaron combinaciones en otros sitios (Tabla 1). Estos resultados demuestran claramente la plasticidad sitio de fosforilación de las proteínas quinasas y la capacidad del protocolo descrito para caracterizar en detalle todos los posibles sitios de fosforilación.
Los pasos más importantes de este protocolo son: 1) la extracción suficiente de proteínas, 2) la protección de los PTM, y 3) la cantidad suficiente de proteína diana. En primer lugar, para la extracción suficiente de proteínas, es importante para moler el tejido en nitrógeno líquido y, posteriormente, utilizar un homogeneizador de tejidos tal como se describe en el protocolo. Si un homogeneizador de tejidos no está disponible, un mortero y mano de mortero pueden ser utilizados. También es importante usar una relación de uno a tres (o cuatro) de gramos de tejido a volumen de tampón de extracción. Este tejido para amortiguar relación y el tampón de alta fuerza que sugerimos se asegurará de que el pH se mantendrá neutral durante el proceso de extracción. Encontramos que esto es de particular importancia para A. thaliana y tomate adicionalcciones 52. Protección de PTM se puede lograr mediante la inclusión en todos los búferes de los inhibidores adecuados de enzimas que pueden eliminar PTM. También es fundamental para llevar a cabo todos los pasos a 4 ° C y para preenfriar buffers e instrumentos. Los mayores rendimientos de proteína diana se puede lograr mediante el uso de plantas que expresan la proteína en cantidades suficientes y mediante el uso de altas cantidades de tejido (aproximadamente 20 g). El paso más importante para la obtención de cantidades suficientes de proteína diana está concentrando la proteína diana mediante inmunoprecipitación directa. La importancia de este paso es destacado por nuestra falta de identificación de PTM de Pto después de una inmunoprecipitación Prf debido a la cantidad limitada de coimmunoprecipitated Pto (Figura 2B). En contraste, la inmunoprecipitación directa de Pto. produjo péptidos sustancialmente más mensurables (Figura 2C) que conducen a aproximadamente 80% de cobertura de la secuencia de la proteína y la identificación de PTM (Tabla 1). También strongly recomendar el uso de epítopo-tags para inmunoprecipitación de proteínas. En comparación con anticuerpos producidos contra proteínas de la matriz epítopo de etiquetas de afinidad nativa puede producir cantidades más altas de proteína parcialmente purificada. Mediante el uso de un anticuerpo contra la proteína nativa Pto 51 (Figura 2) para la inmunoprecipitación, hemos sido capaces de identificar sólo la fosforilación único de los dos sitios de fosforilación predominantes de Pto.
Este protocolo ha sido desarrollado principalmente para la purificación parcial de N. benthamiana proteína citoplasmática y la posterior identificación de sus sitios de fosforilación. Sin embargo, el uso de las modificaciones descritas en el presente documento, este protocolo se puede adaptar fácilmente para A. proteínas thaliana y proteínas unidas a la membrana. El principal objetivo de este protocolo es para producir suficientes cantidades de la proteína diana para la identificación de los PTM y no para lograr la máxima pureza del complejo. Si mayor purezade se requiere el complejo una segunda etapa de purificación se puede añadir a este protocolo 52. En ese caso, un primer paso permitirá a la elución de la proteína diana a partir de la matriz de afinidad sin el uso de sales de ácido o altas y la etapa posterior puede implicar una matriz, lo que requiere condiciones de elución duras. Es importante destacar que sólo hemos probado este protocolo para la identificación de sitios de fosforilación y que actualmente estamos probando su capacidad para la identificación detallada de PTM adicionales.
Nuestros resultados representativos demuestran claramente la plasticidad sitio de fosforilación de las proteínas quinasas y la capacidad del protocolo descrito para caracterizar sitios de fosforilación. Lo más importante, ponen de relieve que la identificación de sitios de fosforilación que confían en baja cantidad de proteínas por espectrometría de masas y por mutaciones puntuales de sitios auto-fosforilación puede dar resultados confusos. Mostramos aquí y anteriormente 47 </sup> Que la doble fosforilación de Pto. en Ser y Thr-198-199 se asocia con la activación del complejo PRF / Pto. En contraste, los resultados publicados anteriormente 47,63 han demostrado que las mutaciones de un solo punto de Ser-198 y Thr-199 a alanina, que impiden la fosforilación en estos sitios, son capaces de señalización lo que sugiere que la fosforilación de estos sitios no es un requisito previo para la activación compleja . Estos resultados pueden explicarse ahora por la fosforilación del sitio secundario Thr-195. Visión similar a la plasticidad sitio de fosforilación de otra proteína quinasa puede obtenerse siguiendo este protocolo. Además, un enfoque combinado usando sitios de fosforilación de mutaciones puntuales, las proteínas que pueden inhibir quinasas específicas (efectores), junto con la inmunoprecipitación de proteínas y análisis de espectrometría de masa dará lugar a una mejor comprensión de la importancia evolutiva de la plasticidad sitio de fosforilación de las proteínas quinasas.
The authors have nothing to disclose.
VN es apoyada por la Royal Society. JPR es un Fellow futuro Consejo de Investigación Australiano (FT0992129). Damos las gracias a la Dra. Miriam Gifford para la lectura crítica del manuscrito.
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
MES | Sigma | M8250 | |
Acetosyringone | Sigma | D134406 | toxic – 1 M stock in DMSO |
Syringe 1mL sterile | Terumo | ||
Syringe needle | Terumo | NN-2525R | |
Silwet L-77 (surfactant) | Lehle Seeds | VIS-01 | toxic |
MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) | Sigma | C2211 | 1 M stock in DMSO, store at -80 °C |
MS salts | Sigma | M5524 | oxidizing, toxic |
Sucrose | Sigma | 16104 | |
Trizma base | Sigma | T1503 | adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer |
NaCl | Sigma | S3014 | 5 M stock |
EDTA | Sigma | E6758 | toxic – 0.5 M stock |
EGTA | Sigma | E4378 | |
Glycerol | National Diagnostics | EC-606 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | corrosive |
PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) | Sigma | P5288 | do not confuse with PVP |
DTT (DL-dithiothreitol) | Sigma | 43815 | toxic – 1 M stock, store at -20 °C |
Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | do not freeze/thaw too many times |
PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | corrosive, toxic |
Calyculin A | Cell Signaling Technology | 9902 | |
Sodium Fluoride (NaF) | Sigma | S7920 | toxic – 1 M stock |
Sodium Molybdate (Na2MoO4) | Sigma | S6646 | 0.5 M stock |
Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | 450243 | toxic – Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. |
Okadaic acid | Santa Cruz Biotechnology | sc-3513 | |
Kinematica Polytron tissue homogeniser | Fisher Scientific | 08-451-320 | |
Miracloth | Merck Millipore | 475855-1R | |
anti-FLAG M2 agarose | Sigma | A2220 | this matrix is recommended |
Streptavidin-agarose | Thermo-Scientific | 20347 | this matrix is recommended |
GFP-Trap_A | Chromotek | gta-20 | this matrix is recommended |
Anti-HA-Agarose | Sigma | A2095 | this matrix is recommended |
0.45 μm filter | VWR | 513-1902 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
FLAG peptide | Sigma | F3290 | |
D-biotin | Sigma | 47868 | |
StrataClean resin | Agilent | 400714 | this absorption resin is recommended for protein precipitation |
Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | ||
PROTEAN II XL Cell | Biorad | ||
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | this stain is recommended |
Protein low-binding tubes (LoBind) | Eppendorf | 0030 108.116 | these tubes are recommended |
Ammonium bicarbonate (ABC) | Sigma | 9830 | toxic |
Acetonitrile | VWR | 83639 | toxic, flammable |
2-chloroacetamide | Sigma | 22790 | toxic |
Trypsin | Promega | V5280 | irritant, sensitizing |
Formic acid | Sigma | 14265 | toxic, corrosive |
Water-bath sonicator | Ultravawe | Ultra BT Ultrasonic Bath | |
LTQ-Orbitrap XL | Thermo-Scientific | ||
Trichostatin A | Sigma | T8552 | toxic |