Summary
我々は最近、ハエの好ましい温度が日中に上昇し、夜の間に落ちる新しい ショウジョウバエ 概日出力、温度好みリズム(TPR)を同定した。TPRは、別の概日出力、運動活動から独立して規制されています。ここでは、 ショウジョウバエにおけるTPRの設計と分析について説明します。
Abstract
概日時計は、睡眠、運動活動、体温(BTR)リズム1、2を含む人生の多くの側面を調節します。我々は最近、ハエの好ましい温度が日中に上昇し、夜3の間に落ちる温度好みリズム(TPR)と呼ばれる新しいショウジョウバエ概日出力を同定した。驚くべきことに、TPRおよび運動活動は、別個の概日ニューロン3を介して制御される。ショウジョウバエ・ロコモ運動活性は、よく知られた概日行動の出力であり、多くの保存された哺乳類の概日時計遺伝子および機構4の発見に強い貢献を提供している。したがって、TPRを理解することは、未知の分子および細胞概日メカニズムの同定につながります。ここでは、TPRアッセイの実行および分析方法について説明します。この技術は、TPRの分子および神経機構を解剖するだけでなく、異なる環境信号を統合し、動物の行動を調節する脳機能の基本的なメカニズムに関する新しい洞察を提供する。さらに、最近発表されたデータは、フライTPRが哺乳類のBTR3と特徴を共有していることを示唆している。ショウジョウバエは、体温が典型的に行動的に調節される外因性である。したがって、TPRは、これらのハエの5〜8でリズミカルな体温を生成するために使用される戦略である。ショウジョウバエTPRのさらなる探求は、動物の体温制御の基礎となるメカニズムの特徴付けを促進すると考えています。
Introduction
温度はユビキタスな環境の手掛かりです。動物は、有害な温度を避け、快適なものを求めるために様々な行動を示します。 ショウジョウバエ は、堅牢な温度嗜好行動6,7を示す。ハエが18〜32°Cの温度勾配に放出されると、ハエは暖かく、寒い温度の両方を避け、最終的に朝3で25°Cの好ましい温度を選択します。温温センサは、一組の温度感覚ニューロン、ACニューロン、 ショウジョウバエ 一過性受容体電位(TPR)チャネル、TRPA16,9を発現する。第3アンテナセグメントをアブラブルすると、寒温度回避の欠如が発生するため、冷温センサは第3のアンテナセグメントに位置しています。最近、TRPPタンパク質ブリビド(Brv)が10を同定した。Brvは第3のアンテナセグメントで表現され、コールド検出を媒介するので、Brvは温度嗜好の挙動にとって重要な、可能な冷感感分子である。要するに、ハエは暖かく寒い温度を避け、好ましい温度を見つけるために、これらの2つの温度センサーを使用しています。
哺乳類は体温を調節するために熱を発生させるが、外生は一般的に体温を周囲温度11に適応させる。いくつかのエクトタームは、そのBTR12を調節するためのエクトテアムのための戦略であると考えられている毎日のTPR行動を示すことが知られている。ハエがTPRを示したかどうかを判断するために、24時間のスパンの間に様々な点で温度嗜好挙動解析を繰り返した。ショ ウジョウバエ は、朝は低く、夕方には高く、ヒト13のBTRと同様のパターンに従う毎日のTPRを示すことがわかりました。
ショウジョウバエでは、脳内に約150個のクロックニューロンがあります。運動活動を調節するクロックニューロンは、MとEの発振器と呼ばれます。しかし興味深いことに、MとEのオシレータはTPRを調節せず、代わりに、脳内のDN2クロックニューロンがTPRを調節するが、運動活動は行わないことを示した。これらのデータは、TPRが運動活動とは無関係に規制されていることを示している。特に、哺乳類のBTRは、運動活動から独立して調節される。ラットにおけるアブレーション研究は、BTRが、運動活動14を制御するものとは異なるパラベントリーゾーンニューロンのサブセットを標的とする特定のSCNニューロンを介して制御されることを示している。したがって、我々のデータは、飛行TPRと哺乳類BTRの両方が運動活動から独立して調節される概日時計依存温度リズムを示すので、哺乳類のBTRとフライTPRが進化的に保存される可能性を考慮する。
ここでは、ショ ウジョウバエにおけるTPR行動アッセイの分析方法の詳細を説明する。この方法は、TPRの分子機構と神経回路だけでなく、脳が異なる環境キューと内部生物学的時計をどのように統合するかを調査することを可能にする。
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Protocol
1. ハエの準備
- ライトダーク(LD)実験
- インキュベーター(25°C/40-60%相対湿度(RH)))でハエを軽い12時間/暗い12時間(LD)サイクルで上げます。インキュベーターの光強度は〜500〜1,000ルクスです。
- 24時間にわたって行動アッセイを完了するためには、2つのインキュベーターが必要です。両方のインキュベーターは、ON OFF機能を備えたプログラム可能なライトを備えている必要があります。また、光に透過性のない固体ドア(ガラス やプレキシガラスなし)を備え付ける必要があります。
注:1つのインキュベーターは「日」インキュベーターを指定し、12時間光と12時間暗いのLDサイクルに設定する必要があります。第2のインキュベーターは「夜」のインキュベーターに指定され、12時間の暗さと12時間の光が続く最初の逆に設定する必要があります。夜間インキュベーターは暗闇の中でアクセス可能な部屋に置かれなければならない、そのような方法で夜間の状態を経験するハエは実験のために容易にアクセスすることができる。 - フライバイアルは昼夜の保育器に入れる。新しく孵化したハエを新鮮なバイアル、アッセイあたり20〜30で収集し、2〜3日間同じインキュベーターに保管してください。
- 2〜3日後、温度嗜好行動アッセイにハエを使用する。
- 日(ツァイトゲバー時間(ZT)0-12)実験のために、日のインキュベーターからハエを収集します。
- 行動実験の直前に、収集したハエバイアルを1日の保育器から取り出します。
- 夜間(ZT 13-24)実験では、夜間インキュベーターからハエを収集します。
- 行動実験の直前に、収集したフライバイアルを夜間保育器から取り出し、アルミホイルで包み、赤いランプの下の暗い部屋の箱に入れます。
注: 夜間実験では温度嗜好行動アッセイが暗闇の下で行われるため、ハエへの光暴露は行動実験が終わるまで防ぐ必要があります。
注: 実験が行われる日にハエを二酸化炭素にさらしてはいけません。
- 定常闇 (DD) 実験
-
DDの日
- DD日の実験には追加のインキュベーターが必要であり、残りの原稿の「遷移」インキュベーターと呼ばれています。遷移インキュベーターは、DD条件を経験するハエが実験のために容易にアクセスできるように、暗闇の中でアクセス可能な部屋に配置されなければならない。遷移インキュベーターのライトスケジュールの例では、午後 1 時から午後 7 時までのライトは ON、午後 7 時から午後 1 時にライト OFF が発生します (図 1)。
- 一日の保育器で育てられたハエを収集します。フライバイアルをトランジションインキュベーターに設置し、ライトが点灯する午後1時から午後7時の間に配置します。このようにして、ハエは午後7時まで適切に光にさらされ、その時点でライトは遮断されます。
- 翌日、午後1時前、暗い条件下で、移行インキュベーターからフライバイアルを取り出し、アルミホイルで包み、箱に入れます。箱を任意のインキュベーターにもう1日保管してください。
-
DDナイト
- 赤いランプの下で暗闇の中で夜の保育器で上げられたハエを収集します。夜間保育器のライトがオンのときにハエを追加収集します。
- ライトがOFFであるときはいつでも暗闇の中でアルミホイルで収集されたバイアルをラップし、箱にバイアルを置きます。任意のインキュベーターに箱をあと2日間保管してください(図1B)。
注: 夜間実験では温度嗜好行動アッセイが暗闇の下で行われるため、ハエへの光暴露は行動実験が終わるまで防ぐ必要があります。
-
DDの日
- コンスタントライト(LL)実験
-
LLの日
- LL日の実験には追加のインキュベーターが必要です。このインキュベーターは、LL条件(25°C、800ルクス)を維持し、ライトはオンにします。
- 一日の保育器で育てられたハエを収集します。フライバイアルを「日中」のいつでもLLインキュベーターに入れます。
-
LLナイト
- 夜間の保育器で育てられたハエを集める。夜間インキュベーターのライトがオンになっている間に、夜間インキュベーターからLLインキュベーターにフライバイアルを移します。
注: たとえば、夜間のインキュベーターでは、午前 7 時にライトが OFF になります。午前7時前に夜間インキュベーターからLLインキュベーターにフライバイアルを移し、さらに4日間LLインキュベーターにバイアルを保管します。
注: LL条件の 4 日目では、Locomotor 活動の振動は15,16で廃止され、TPR は依然として持続3です。
- 夜間の保育器で育てられたハエを集める。夜間インキュベーターのライトがオンになっている間に、夜間インキュベーターからLLインキュベーターにフライバイアルを移します。
-
LLの日
2. 温度嗜好行動アッセイの装置
- プレキシガラスカバー(29cm x 19.2cm)(図4)をアルミニウム板に置きます。
- プレートとカバーの間の空気温度を監視します。6つの温度プローブは、1つの車線内のカバーの内側の様々な位置に取り付けられています(図2)。
注: プローブがアルミニウム板またはプレキシガラスカバーに接触していないことを確認してください。気温は18~32°Cの勾配に設定する必要があります。 - 25°C/65-75%RHに維持された環境室に装置を置きます。この部屋は、外の光から遮断する必要があります。環境室は、通常、一定の温度と湿度を維持するためにファンが装備されています。
注: ファンからの空気は、装置上の安定した温度勾配を乱す可能性があります。これを防ぐために、装置の周囲を覆う透明シートを使用します。 - 温度計と湿度計を用意して、環境室の温度と湿度を確認します。
注: 光はショ ウジョウバエ3の温度設定に影響を与えます。同じ強度の光を装置に均一に供給する必要があります。環境室の照明の強度は約800ルクスです。
注意:動作実験が行われたら、CO2 タンクから接続されたチューブを配置するか、装置の上部の穴の近くに供給して、ハエを麻酔して取り除きます。
3. 使用装置の準備
- プレートの表面に温度勾配を正しく設定するために、装置を30分以上オンにする(図3)。
- ハエがカバーの壁や天井を登るのを防ぐために、行動装置のカバーに撥水剤を塗ります。余分な撥水剤を拭き取り、蓋を25〜30分間放置して乾燥させます。
- アルミニウム板の結露を取り除きます。プレキシガラスカバーをアルミニウムプレートに置き、6つのCクランプで固定します(図2)。
注:必要に応じて、カバーがうまく密封されることは非常に重要です。 - カバーは少なくとも15分間放置します。アルミニウム板とカバーの間の空気温度勾配は18-32 °Cから作成される。
4. 温度設定挙動アッセイ
- フライを、カバーの各車線の中央にある小さな穴を通して、装置のアルミニウム板とプレキシガラスカバーとの間の空間に積み込む(図2 および 図4)。ハエが逃げるのを防ぐためにカバースリップで穴を覆います。
- 暗い状態の場合は、環境室のすべてのライトをオフにします。赤いランプは、ハエが装置に置かれたときに使用することができます。動作実験が完了するまで、ハエが赤いランプ以外のライトにさらされないようにします。
- 各試験では、20〜25個の成体ハエを使用してください。行動アッセイは30分間行われる。フラッシュの有無にかかわらず、いくつかの写真を撮ります。実験中に多くの音や突然の動きをしないように注意してください。
- 装置上の6つのプローブの温度をすべて記録します。室温と湿度をメモしてください。
- 二酸化炭素ガスで装置内のハエを麻酔し、クランプを緩め、プレキシガラスカバーを取り外し、プレートからハエを取り除きます。各実験の後、ハエは廃棄されます。プレートから凝縮や水分を拭き取ります。プレートのカバーを交換し、次の実験に備えてクランプで締めます。
- 1 日を通して温度の好みの表現を持つために、24 時間の期間は 8 つのタイム ゾーン、4 つの時間帯、日の 4 つ、夜の 4 つに分割されます。たとえば、これらのZTまたはCT 1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、16-18、19-21、22-24を使用します。
注: マスキング効果によって生じる表現型の変化は、ライトがON(ZT0)またはOFF(ZT12)になった直後に予想されるため、これらの時間(ZTまたはCT 0-1、11.5-13および23.5-24)の間の温度の好みの挙動は調べません。結果を統計的に健全にするには、各タイムゾーンで少なくとも5回の試行を行う必要があります。
5. データ分析
- 温度勾配を次のように計算する:プレキシガラスカバーの上面と下側の端に配置された2つの定規に基づいて、温度プローブが配置される場所を決定します(図2A)。
- 温度プローブ間の温度勾配は線形であると推定される。温度プローブの位置と、それに対応する記録された温度に基づいて、写真上の適切な位置の温度の各程度を表す線を描きます。各度間隔で見つかったハエの数を数えます。壁やカバーの天井にハエを除外します。
- 各車線の各温度範囲におけるハエの割合を計算します。平均優先温度は、次に示すように、各区間のハエと温度の割合の積を合計して計算されます。
ハエx 18.5 °C +ハエの18.5 °C +%x 19.5 °C + ハエの%x 20.5 °C...+ハエx 31.5 °C +ハエx 32.5°Cの% - 各タイムゾーンでの平均優先温度を計算する:温度優先動作は、各タイムゾーン(ZT 1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、16-18、19-21、および22-24)の間に>5回実行されます。各時間帯における平均好ましい温度を算出するために、各試験の平均好ましい温度を一緒に平均した。s.e.m. エラー バーは、試行間の誤差と同じです。
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Representative Results
温度設定リズムの例を図5に示します。行動手順が正常に行われた場合、ハエは朝の低温と夕方の高温を好むTPRを示す必要があります。日中の温度嗜好の中で〜1〜1.5°Cの上昇は、一日の間に観察されるべきであり、遺伝的背景に関係なく、w1118、ywおよび広東Sハエが昼間3の間に同様の温度嗜好を示していることを示した。
図 1.DDの日のフライ準備の模式図。 (A) DD昼間実験の例。ライトは午後1時から午後7時まで点灯し、遷移インキュベーターでは午後7時から午後1時まで消灯します。一日の保育器で育てられたハエを収集します。フライバイアルを午後1時から午後7時の間に移行インキュベーターに入れます。翌日の午後1時前に、暗闇の中で遷移インキュベーターからフライバイアルを取り出し、アルミホイルで包んで箱に入れます。(B) DD夜間実験の例。午前7時から午後7時の暗闇の中で、または午後7時から午前7時の間に光の中で夜間保育器で上げられたハエを収集します。午前7時から午後7時の間に暗闇の中で夜の保育器からフライバイアルを取り出し、アルミホイルで包んで箱に入れます
図 2.温度嗜好行動装置。(A) トップビュープレキシガラスカバーは6つのCクランプとアルミニウム板の上に置かれる。6つの温度プローブは、1つの車線内のカバーの内側の様々な位置に取り付けられています。2 つのルーラーは、プレキシガラスカバーの上と下にエッジに沿って配置され、温度勾配を決定します。(B)サイドビュー。4つのペルチェデバイスはアルミニウム板(44 cm x 22 cm)の下に置かれる。各ペルチェデバイスは、低温または高温を発生する温度コントローラに接続されています。ペルティエの過熱を防ぐために、コンピュータ冷却システムは水管、空冷ファン、電源に接続されています。温度プローブは、アルミニウム板の端に埋め込まれ、温度コントローラに接続され、アルミニウム板の温度を直接制御します。現在の装置では、冷たい側と熱い側面はそれぞれ12°Cおよび36°Cに設定される。
図 3.装置の図である。温度プローブは、アルミニウム板の温度を読み取るフィードバック制御として採用されています。ペルチェデバイスは温度コントローラに接続されています。ペルチェの過熱を防ぐために、液体クーラーはペルチェの下に直接置かれます。4つの液体冷却器はポンプおよびラジエーターに接続する水管によって接続される。ラジエーターには、水の温度を冷却する2つのファンがあります。ポンプおよびラジエーターは電源に接続される。
図 4.プレキシガラスカバーの計画。これはプレキシガラスで作られたカバーのための計画です。カバーは4レーンを3つの0.2 cmの厚さの仕切りで割り、直径0.7cmの穴は各車線の上部パネルの中央に位置する(図2A)。
図 5.TPR 動作データの例。 w1118のTPRは24時間を飛びます。好ましい温度は、温度嗜好挙動実験におけるハエの分布を用いて計算した。データは、各時間帯における平均優先温度として示される。数字はアッセイの数を表す。アノバ、P < 0.0001.ツキークレイマーテストと比較すると、ZT1-3、***P < 0.001、**P < 0.01または*P<0.05です。このTPR表現型の図は、金子らから適応される。許可を得て3。
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Discussion
ここでは、温度嗜好動作装置の詳細とTPR動作の分析を図示する。 ショウジョウバエ は、クロック制御TPRの顕著で堅牢で再現性の高い機能を発揮します。しかし、我々のデータは、少なくとも2つの要因、周囲光と年齢がTPR行動性の型を著しく乱していることを示唆している。
我々は光がショ ウジョウバエの温度の好みに大きく影響することを観察する。LDに保たれた w1118 ハエはDDに保たれたものよりも昼間より高い温度を好むという事実と一致しているが、好ましい温度のリズミカルな変化はLDおよびDD3の下でまだ維持されている。したがって、光は概日時計とは無関係に、フライの温度設定に影響を与えます。光強度がどれくらい必要で、どのメカニズムがこの光依存温度の好みを調節するかは明らかではないので、実験中に同じ光強度(〜500〜1,000ルクス)を使用して再現可能な結果を得ています。
ハエの年齢も温度の好みに影響します。1日目のハエ(孵化後1日)のTPRフェノタイプは可変であるため、1日目のハエの使用は避けます。4日目と古いハエは一定のTPR動作を示していますが、2日または3日齢のハエよりも低い温度を好みます。そのため、幅広い老齢ハエを混ぜないことが非常に重要です。私たちは、日2-3ハエまたは日4-5ハエグループを必要に応じて使用します。
現在のTPR動作法では、温度優先動作を30分間のみ調べています。これは、ハエが温度勾配で>1時間保たれて、より低い温度を好む傾向があるためです。これは、おそらく装置内の食料と水の不足によるものです。したがって、我々は、各30分行動実験の後にハエを捨てる。TPRの挙動を24時間以上、理想的には〜15日間連続的に測定できれば、それは大きな利点となるだろう。この場合、TPR挙動アッセイは、フライバイアルを異なるインキュベーターに移さずに簡単に行われる。さらに重要なことは、TPR表現型は、運動活動などの他の概日行動と比較してより効率的であろう。
動物は環境の小さな変化に非常に敏感です。我々は、ハエの温度嗜好挙動が時計によって調節されるだけでなく、光によって強く影響されることを示した。TPR は、すべての環境キューと内部状態によって統合された動作出力である可能性があります。 ショウジョウバエ は、様々な遺伝子ツール、比較的単純な脳構造、多彩な行動アッセイを用いて脳機能の基本的なメカニズムを解剖する洗練されたモデルシステムです。したがって、温度嗜好行動アッセイを研究することは、脳が異なる情報を統合して最適な行動を生み出す方法の基本的なメカニズムに光を当てる可能性があります。
さらに、最近発表されたデータは、フライTPRが哺乳類のBTR3と特徴を共有していることを示唆している。ハエの睡眠を制御するメカニズムは、哺乳類の睡眠を制御するものに似ているため、ショ ウジョウバエ TPRのさらなる探求は、概日リズムと睡眠行動のより大きな理解に貢献すると考えています。
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Disclosures
開示するものは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、行動装置の最初のバージョンを開発するのを助けたアラビンタン・サミュエル博士とマーク・ガーショー博士と行動装置を変更したマシュー・ベイティに感謝しています。この研究は、シンシナティ小児病院、JST/PRESTO、ダイムズの行進、NIH R01 GM107582からF.N.Hまでのトラスティグラントによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bright Lab Jr. Safelight | Amazon | #B00013J8UY | Red light for dark rooms |
| Rain X | SOPUS products | Water repellent: Apply the plexiglass cover | |
| C-Clamp | Home Depot | ||
| Temperature/hygrometer | Fisher | 15-077-963 | |
| Peltier devices | TE Technology, Inc. | HP-127-1.4-1.15-71P | |
| Thermometer | Fluke | Fluke 52II | |
| Bench top controller | Oven Industries | 5R6-570-15R and 5R6-570-24R | |
| Temperature sensor probe | Oven Industries | TR67-32 | |
| Generic 480 Watt ATX power supply | computer cooling system | ||
| MCR220-QP-RES Dual 120 mm Radiator with reservoir | Swiftech | computer cooling system | |
| MCP350 In-Line 12V DC pump | Swiftech | computer cooling system | |
| MCW50 graphics Card liquid cooler | Swiftech | computer cooling system | |
| Scythe Kaze-Jyuni SY1225SL12SH fan | Crazy PC | computer cooling system |
References
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